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标题: 【分享帖】分享 [打印本页]

作者: PCR 时间: 2016-1-5 15:56 标题: 【分享帖】分享

之前写过一个小软件，辅助设计miRNA荧光定量PCR茎环引物，现在拿出来跟大家分享一下。
以hsa-mir-224（CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU）为例写一下茎环引物设计方法：
我采用的茎环序列是：5' GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC3'
pcr通用下游引物: 5' CAGTGCGTGTCGTGGAGT 3'输入hsa-mir-224序列及茎环序列，茎环尾加长度一般为7或8，点击确定，如下图所示：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=40131

作者: PCR 时间: 2016-1-5 15:56

下一步设计PCR上游引物，我利用的是primer 3.0在线引物设计软件，网址为：cuturl('http://primer3.ut.ee/')
将模板序列的第一条序列、miR-224浅红色序列及2个深红色碱基序列、通用下游引物复制粘贴至进去，如下图所示

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=40132

作者: PCR 时间: 2016-1-5 15:57

需要注意的是，上游引物与尾加序列重叠长度不能超过2个碱基，以防止上游引物直接跟残留的逆转录引物结合并扩增
修改参数：

图片附件: 88625056.jpg (2016-1-5 15:57, 23.97 KB) / 该附件被下载次数 15
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=40133

作者: PCR 时间: 2016-1-5 15:58

点击“Pick Primers”按钮

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=40134

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=40135

作者: PCR 时间: 2016-1-5 15:58

提示上游引物Tm太低，我们可以在引物5'端增加GC含量来增加Tm，如下图所示增加四个g，增加gc时以不产生发卡结构为准

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=40136

作者: PCR 时间: 2016-1-5 15:59

然后点击“Pick Primers”按钮

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=40137

作者: PCR 时间: 2016-1-5 15:59

这样上游引物就可以使用了，即：ggggCAAGTCACTAGTGGTT

作者: yonger 时间: 2016-1-5 16:00

试着用楼主的软件用了一下，很有用。只是还有些问题（因为是新手，所以有些问题没有办法处理）：
1、引物5'端增加GC含量来增加Tm，但加了6个G才出现合适的TM值？最多可以加多少？
2、WARNING: Left primer is unacceptable: Unacceptable GC content/Long poly-X，该怎么处理？
3、有的引物Tm too HIGH，该怎么处理？
望指导！谢谢！

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:00

QUOTE:

原帖由 yonger 于 2016-1-5 16:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

试着用楼主的软件用了一下，很有用。只是还有些问题（因为是新手，所以有些问题没有办法处理）：
1、引物5'端增加GC含量来增加Tm，但加了6个G才出现合适的TM值？最多可以加多少？
2、WARNING: Left primer is unacceptable: Unaccep ...

1、最多可以无限加
2、有时候受限于miR的序列无法设计成完美的引物，可以直接取miR序列做引物即可，不过要去掉外部与逆转录引物互补的7个碱基序列
3、加AT

作者: wawa 时间: 2016-1-5 16:00

楼主你好！你这个帖子的茎环序列，我在你其他帖子中也看到了，想必你们实验室用该序列效果是挺好的了。请问你用该茎环做的是什么物种？

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:01

人，其它物种也可以使用，与物种无关

作者: ns5fan 时间: 2016-1-5 16:01

楼主，我想请问下，你的这个茎环序列是怎么确定的呢。你的这个反转录用的内参是哪个，U6吗？GAPDH可以用吗？因为是新手，所以好多问题都不太清楚。

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:02

QUOTE:

原帖由 ns5fan 于 2016-1-5 16:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主，我想请问下，你的这个茎环序列是怎么确定的呢。你的这个反转录用的内参是哪个，U6吗？GAPDH可以用吗？因为是新手，所以好多问题都不太清楚。 ...

序列是文献报道的，当然你也可以自己设计
可以用U6。GAPDH是mRNA的内参

作者: duchy 时间: 2016-1-5 16:02

谢谢，楼主，内参U6的引物需要怎么设计

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:03

QUOTE:

原帖由 duchy 于 2016-1-5 16:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢，楼主，内参U6的引物需要怎么设计

文献中找现成的，无需设计

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:03

太多了，自己去PubMed找

作者: mogu 时间: 2016-1-5 16:03

最近设计引物，用到楼主的小软件，很方便，赞一个！
想请教一个问题。由于miRNA序列的特异性，为避免引物二聚体的ΔG过大，茎环尾加长度需要设为9。请问，你有没有使用过这么长的茎环尾加长度？你估计这样设计行得通不？

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:04

QUOTE:

原帖由 mogu 于 2016-1-5 16:03 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
最近设计引物，用到楼主的小软件，很方便，赞一个！
想请教一个问题。由于miRNA序列的特异性，为避免引物二聚体的ΔG过大，茎环尾加长度需要设为9。请问，你有没有使用过这么长的茎环尾加长度？你估计这样设计行得通不？ ...

一般尾部加8个，9个也可以。

作者: 6327555 时间: 2016-1-5 16:07

之前写过一个小软件，辅助设计miRNA荧光定量PCR茎环引物，现在拿出来跟大家分享一下。
以hsa-mir-224（CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU）为例写一下茎环引物设计方法：
我采用的茎环序列是：5' GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGAC3'
pcr通用下游引物: 5' CAGTGCGTGTCGTGGAGT 3'输入hsa-mir-224序列及茎环序列，茎环尾加长度一般为7或8，点击确定，如下图所示：
下一步设计PCR上游引物，我利用的是primer 3.0在线引物设计软件，网址为：cuturl('http://primer3.ut.ee/')
将模板序列的第一条序列、miR-224浅红色序列及2个深红色碱基序列、通用下游引物复制粘贴至进去，如下图所示

需要注意的是，上游引物与尾加序列重叠长度不能超过2个碱基，以防止上游引物直接跟残留的逆转录引物结合并扩增
修改参数：

点击“Pick Primers”按钮

提示上游引物Tm太低，我们可以在引物5'端增加GC含量来增加Tm，如下图所示增加四个g，增加gc时以不产生发卡结构为准
然后点击“Pick Primers”按钮

这样上游引物就可以使用了，即：ggggCAAGTCACTAGTGGTT
附件是上面提到的小软件，欢迎下载，该软件免费、免安装
......

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楼主，首先非常感谢，最近正在做血浆miRNA的定量检测，qPCR跑出来效果都不是很理想，估计与引物设计有关，请问：1.如果用你的软件设计的引物Tm值太低时，G与C的顺序与各自的数量是随便加的吗，加的怎么防止发卡结构（不是很懂）；2.如果是引物Tm值太高，加A与T各自的碱基数也是随便加的吗？也是在5'端加吗？3.前向与反向引物的GC含量一般保持在多少最合适，一定要相差很近吗？在线等您的回答，谢谢！

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:07

QUOTE:

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之前写过一个小软件，辅助设计miRNA荧光定量PCR茎环引物，现在拿出来跟大家分享一下。
以hsa-mir-224（CAAGUCACUAGUGGUUCCGUU）为例写一下茎环引物设计方法：
我采用的茎环序列是：5' GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGG ...

1、比如miRNA序列中连续的CCC比较多，那么你就不能再在5‘端增加GGG，而是增加CCC；你增加CG后如果有发卡结构，软件也会提示的
2、可以加，只能在5’端加
3、主要看TM值，两个引物接近为主
但是有时候难以设计出非常理想的引物，即使primer 3.0提示引物存在问题，照样可以扩增的

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:17

1、比如miRNA序列中连续的CCC比较多，那么你就不能再在5‘端增加GGG，而是增加CCC；你增加CG后如果有发卡结构，软件也会提示的
2、可以加，只能在5’端加
3、主要看TM值，两个引物接近为主
但是有时候难以设计出非常理想的引物，即使primer 3.0提示引物存在问题，照样可以扩增的
......

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非常感谢您的回复，神速啊，你的回复很有用，已经摸索一个多月了效果还是不好，有两个目的基因扩增不出来，主要原因可能还是血浆miR浓度太低，不知楼主有没有做过血浆的miR定量，有没有好的指导方法？跪谢~

作者: 555444 时间: 2016-1-5 16:17

QUOTE:

原帖由 PCR 于 2016-1-5 16:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
1、比如miRNA序列中连续的CCC比较多，那么你就不能再在5‘端增加GGG，而是增加CCC；你增加CG后如果有发卡结构，软件也会提示的
2、可以加，只能在5’端加
3、主要看TM值，两个引物接近为主
但是有时候难以设计出非常理想的引物，即 ...

我没有做过血浆中miR

作者: 49888 时间: 2016-1-5 16:18

QUOTE:

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我没有做过血浆中miR

楼主，刚设计遇到麻烦，miR引物序列为：GGUGGCCCGGCCGUGCCUGAGG ；由于GC含量太高，无法使Tm值降至60左右，加AT好像要加很多很多，有没有更好的办法？

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:28

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楼主，刚设计遇到麻烦，miR引物序列为：GGUGGCCCGGCCGUGCCUGAGG ；由于GC含量太高，无法使Tm值降至60左右，加AT好像要加很多很多，有没有更好的办法？

像这个引物也没有好办法，直接用5'端的miR序列也是可以的，虽然提示TM偏高

作者: 49888 时间: 2016-1-5 16:29

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原帖由 PCR 于 2016-1-5 16:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

像这个引物也没有好办法，直接用5'端的miR序列也是可以的，虽然提示TM偏高

你意思是直接用5'端miR序列，除掉后面3'端8个碱基吗？如果是去掉后面2个暗红色碱基，直接用前面的序列，Tm值变成61了，可以这样吗？

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:29

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你意思是直接用5'端miR序列，除掉后面3'端8个碱基吗？如果是去掉后面2个暗红色碱基，直接用前面的序列，Tm值变成61了，可以这样吗？

可以

作者: 3N4G 时间: 2016-1-5 16:29

楼主你好，正在学习你的经验，想请问你的通用下游引物是怎样确定的，看不懂，谢谢啦

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:30

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楼主你好，正在学习你的经验，想请问你的通用下游引物是怎样确定的，看不懂，谢谢啦

是设计这个茎环的人设计的

作者: 3N4G 时间: 2016-1-5 16:30

QUOTE:

原帖由 PCR 于 2016-1-5 16:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

是设计这个茎环的人设计的

嗯，懂了，可是按这些输入进去出现这种结果是怎么回事呢？谢谢！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=40139

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:30

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嗯，懂了，可是按这些输入进去出现这种结果是怎么回事呢？谢谢！

序列没有输对
你把输入的模板序列及引物序列的截图发一个

作者: 3N4G 时间: 2016-1-5 16:31

QUOTE:

原帖由 PCR 于 2016-1-5 16:30 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

序列没有输对
你把输入的模板序列及引物序列的截图发一个

是的

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:31

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是的

茎环序列明显跟我的不同，当然不能用我给出的通用引物

作者: 3N4G 时间: 2016-1-5 16:31

那这个通用下游引物需要怎样设计呢

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:33

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原帖由 3N4G 于 2016-1-5 16:31 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

那这个通用下游引物需要怎样设计呢

你想多了，茎环序列和通用下游引物直接拿来用就可以，用成熟的序列即可，别自己设计，除非你认为自己很牛掰

作者: 莲花白 时间: 2016-1-5 16:33

楼主好，U6内参的引物怎么设计？是否也需要设计stem loop的反转录引物？

作者: 莲花白 时间: 2016-1-5 16:33

那这个通用下游引物需要怎样设计呢

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你用什么茎环结构，你可以把序列放到网上搜一下，一般会出来别人已经总结好的文档，里面会有你用的茎环结构用的通用引物。

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:34

楼主好，U6内参的引物怎么设计？是否也需要设计stem loop的反转录引物？

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U6 用
5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′
5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′
逆转录时用下游引物逆转录

作者: 莲花白 时间: 2016-1-5 16:34

楼主好，U6内参的引物怎么设计？是否也需要设计stem loop的反转录引物？

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问题已解决，cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/topic/19900488?from=recommend')

作者: nut6694 时间: 2016-1-5 16:35

两个问题，楼主，1、你的通用引物是下游引物吗？可以直接拿你的序列去合成吗，合成的引物所有的mir扩增时都可以用是吧？2、在设计的时候可以使用你的茎环序列码？应该可行吧？

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:35

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原帖由 nut6694 于 2016-1-5 16:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

两个问题，楼主，1、你的通用引物是下游引物吗？可以直接拿你的序列去合成吗，合成的引物所有的mir扩增时都可以用是吧？2、在设计的时候可以使用你的茎环序列码？应该可行吧？ ...

用这个茎环就可以用这个通用下游引物，通用下游引物是茎环序列的一部分
这个茎环可以直接使用

作者: nut6694 时间: 2016-1-5 16:35

楼主好人，我还是不懂：1、我使用的是加A尾扩增的，出现了较多非特异扩增，就是溶解曲线效果差，加A尾这种方法进行PCR的时候是要加上下游引物的，我想问一下要是使用茎环引物是不是不需要添加下游引物？2、我使用加A尾合成第一股链cDNA的，那应该不能用茎环引物进行PCR了吧，如果我要用茎环引物进行PCR那么逆转录这一步我应该怎么办呢（比如说买哪个试剂）？

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:36

QUOTE:

原帖由 nut6694 于 2016-1-5 16:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

楼主好人，我还是不懂：1、我使用的是加A尾扩增的，出现了较多非特异扩增，就是溶解曲线效果差，加A尾这种方法进行PCR的时候是要加上下游引物的，我想问一下要是使用茎环引物是不是不需要添加下游引物？2、我使用加A尾合成第一股 ...

1、所有PCR都要加上下游引物；
2、不能，用茎环逆转录引物进行逆转录，用最便宜最普通的逆转录试剂即可
原理搞懂了才能分析问题，多去了解下检测原理

作者: ffaa 时间: 2016-1-5 16:37

楼主，您好！谢谢您的分享！
我用了您的方法设计之后，设计>hsa-miR-155-5p MIMAT0000646
UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU 的引物，上游和尾加的序列重合度很高，怎么解决呢？

作者: ffaa 时间: 2016-1-5 16:37

楼主：请问您的引物序列是找哪家公司合成的？谢谢！！！

作者: PCR 时间: 2016-1-5 16:37

上海生工
逆转录引物长度较长，对合成技术要求比较高，建议找好点的公司，之前找了家本地的公司，合成效果不佳

作者: yizhi 时间: 2016-1-5 17:43

有一个问题想请教一下您，我使用U6做内参的，检测血浆中的miRNA表达情况，但是U6一般在26-28，（U6值在试验组之间，实验组和对照组之间，对照组之间有的甚至还相差超过3-4），请问我这个还能继续做下去吗，因为我的论文是要盲审的，所以有点害怕，希望不吝赐教。

作者: ffaa 时间: 2016-1-5 17:45

首先很感谢楼主的分享，对于引物的设计特别有用。但是我在设计的时候有一个目的基因的序列本身就很容易配对，用您的方法改过之后，Tm可以达到要求，但是存在发卡结构，这样的情况该怎么处理呢。非常期望您能给予指导，在此先谢过。

图片附件: 83408865.png (2016-1-5 17:45, 16.41 KB) / 该附件被下载次数 7
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作者: woshi 时间: 2016-1-5 17:45

左侧的cgc改成ggg试下，其实有发卡结构也没有关系，很难设计出非常完美的引物，毕竟miR序列只有25nt左右，软件只是理论上预测下，即便有发卡结构对pcr影响也不会太大，何况最后软件也告诉你了：ok 1

作者: nn255 时间: 2016-1-5 17:46

非常感谢您的回复，如此神速，已经按照您的方法设计好了引物，打算找公司合成一下看看，之前用了很多时间都没搞清楚引物设计的问题，今天终于明白啦，特别感谢楼主！

作者: 66+77 时间: 2016-1-5 17:46

您好，我用您的软件设计的时候总是出现hairpin太高，这个应该怎么解决呢？

图片附件: 66081278.png (2016-1-5 17:46, 14.79 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=40144

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