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标题: 【求助】高GC含量PCR困难，求助 [打印本页]

作者: 中国特色 时间: 2016-1-7 10:25 标题: 【求助】高GC含量PCR困难，求助

各位大虾：
本人PCR两月有余，尚无结果。
我的目的片段是SERT（5－HT转运体）基因的启动子区，要做多态性研究，该片段GC含量70％多，共500bp左右，我用的是TaKaRa的LATaq酶加GC BufferI或II，总共扩出两次，余均未能扩出来。参看文献是用的同样的酶，请各位大虾帮忙分析一下，还有什么办法可试试！我用的PCR条件是按试剂盒说明书，退火温度用梯度摸出1次，因随后多次未成功，故重新再梯度均未做出来！模板是人的外周血基因组DNA。
急！
谢谢各位！

作者: ladyhuahua 时间: 2016-1-7 10:25

你可以试着加点辅助剂,如甘油,四甲基桠枫.
good luck

作者: misswu61 时间: 2016-1-7 10:27

我也准备批一个GC67%,530bp的基因。师兄做了几次，用的是TaKaRa的LATaq酶没带GC buffer的，令人难解的是他是在前10个循环50度退火，后32个循环53度退火的怪异条件下多次批出。当然代价就是许多非特异带。我也买了一支TaKaRa的LATaq酶带GC BufferI，II的，准备优化一下条件。非常理解dguagua的烦闷，不过我想你已经批出一次就应该有希望，加之我们的目的基因虽然GＣ高，但是片段小，总比那些被大片段高gc折磨的战友好些吧。对了，希望你把摸出的条件和体系附上，大家伙探讨一下，或许有办法！good luck

作者: txwuyan 时间: 2016-1-7 10:27

加DMSO吧。我设计的一个片段370，CG74.5%。多次未能扩出，加DMSO 5%出来啦。同时提高退火温度和变性温度。祝你好运。

作者: summerxx 时间: 2016-1-7 10:28

TaKaRa的LATaq酶加GC BufferI或II中已加DMSO和甲酰胺等辅助试剂,并已经按体系优化,因此没有必要额外加DMSO.dguagua 战友所提到的共批了约50次，成功5次,可以肯定是模板质量不一致所至, 你可以比较你的模板质量.如果把模板浓度调一致,看是否可以得到改善? 对于PROMOTOR区的扩增, 由于高GC含量,可以尝试热启动, 降落PCR, 乃至更换引物. 类似发帖本版块很多,可以搜索一下

作者: 中国特色 时间: 2016-1-7 10:29

诸大虾，我想 TaKaRa的LATaq酶加GC BufferI或II中应该已加DMSO了吧，不过我会加点DMSO再试试。另外请教，目前共批了约50次，成功5次。同样的体系同样的条件，为何仅偶有成功，是否是因模版基因组不同的关系？但模版基因组采用宝生物试剂盒抽提，且每次都由电泳确认的。以下为体系及条件，请各位大虾提供宝贵意见，是否存在问题，需进一步调整：
水2.5－5ul
GCbuffer 1或2 12.5ul
dNTP 4ul
引物各 0.5ul
TaKaRa的LATaq酶 0.25ul
模版 5－2.5ul
总共25ul体系。
PCR：96C x 2min
94C x 30s
61.5C x 30s
72 C x 2min
72C x 10m
中间三步循环35次
每次PCR均有二聚体，成功的几次也有。引物按照文献设计，经NCBI确认符合。请指教！！谢谢！！

作者: zhenxin 时间: 2016-1-7 10:29

TaKaRa的LATaq酶加GC BufferI或II中已加DMSO和甲酰胺等辅助试剂,并已经按体系优化,因此没有必要额外加DMSO.dguagua 战友所提到的共批了约50次，成功5次,可以肯定是模板质量不一致所至, 你可以比较你的模板质量.如果把模板浓度调一致,看是否可以得到改善? 对于PROMOTOR区的扩增, 由于高GC含量,可以尝试热启动, 降落PCR, 乃至更换引物. 类似发帖本版块很多,可以搜索一下

作者: whitesheep 时间: 2016-1-7 10:30

我前几天用TaKaRa的LATaq酶GC BufferI做了一次,条件如下:
94 度 4分
94度 30秒
53度30秒
72度1分
2----4步35循环
72度5分
也是25微升的体系,加样总体和dguadua兄的差不多,模板只加了2微升。结果内参和目的基因均可见，当然有许多非特异带，我准备提高退火温度试试。我觉得楼主的退火温度似乎太高了，我的引物的Tm分别是67，69。可是鉴于我师兄的既往经验，设高Ta很难得到目的带。一点建议，请指正。

作者: redbutterfly 时间: 2016-1-7 10:30

5% DMSO or 10% glycerol

作者: yayya 时间: 2016-1-7 10:30

我用的也是LATAK和GC buffer,目的片段544bp，GC含量71％，扩增时效果非常理想。我采用的方法是第一步PCR20个循环，然后用此PCR产物做模板进行第二次PCR .dguagua 的反应体系中为什么dNTP加4ul？我每次都是加1ul，10pmol引物各加1ul。还有如果是基因组DNA做模板，变性温度可以提高到98度

作者: caihong 时间: 2016-1-7 10:31

重新设计引物。可以提高退火温度， 96 5m 95 45s.

作者: okhaha 时间: 2016-1-7 10:31

你好，我们目的基因有相似之处，同样用的LATAK带GC buffer。我帮回答你的提问。所以加dNTP，4ul是按照说明书上推荐的，不知道对不对，请指正。
请问你两个问题：1，不知你为何只加1ul dNTP，是25ul体系中吗，效果如何？ 2，你所采用的方法是在以前20循环产物为摸板，再从新批吗？如果是稀释吗？重复性好吗？不知能否贴上你的体系，大家共同学习！！！

作者: 中国特色 时间: 2016-1-7 10:32

谢谢诸位的热诚帮助，这几天加了点DMSO试试，结果效果不明显。楼上同道提出的4uldNTP问题，正如“贵在坚持”所答，按照说明书上推荐，当然我想楼上所言有道理的，LA Taq可能考虑需要扩长片段，因此dNTP推荐量比较充足，而我的片段较短，也许4ul有些浪费了，呵呵！
此外，这几天仍间有扩出，成功率有所提高（与DMSO无关），条件、体系未变。其中一次因LA Taq用完，用普通酶扩3个标本，其中有1个成功。不过如此速度不知要何时结束。我想既然在此体系、条件间有成功，那么是否能说明我的条件、体系没有问题？
是模版的问题？但有的模版第一次扩不出，第二次能扩出。有时同时扩5个模版，一个也不成功。而已扩出的模版也未必第二次能扩出。
是PCR仪器加样孔的问题？虽然仪器有的孔可能有问题，但我现在一般都放在已扩成功的孔上再扩的。
是我加样技术有问题？经多次重复操作，我想还是比较正规、熟练的。而且也请其他同事操作过，也未成功。
另外请教，为何想到用PCR产物再P,这与多几个循环有何区别。
请各位帮助分析原因，提供建议，接下来我准备降低退火温度再试试。我想集思广议，总有方法能解决问题的！

作者: bling 时间: 2016-1-7 10:35

其实重点只有一个：马上用GC buffer！

作者: seagate 时间: 2016-1-7 10:35

你好，我用的就是TAKALA的2.5mM的dNTP，25ul体系中只加1ul，PCR产物产量很高，我一直都是这样用的。
2GC buffer I  12.5
dNTPs 1
10umol/L 引物  1/ 1
模板 1
LA Taq (5U/l)  0.3l
加 ddH2O 至  25l
反应条件：
96℃ 2min
98℃ 10sec，70℃ 5min，20cycles
72℃ 10min
一扩产量低时，可以将一扩产物稀释后做模板进行2扩，我做的时候是将一扩稀释10倍后，再取1ul做模板，二扩也选择20个循环。其实此法更适合以cDNA为模板扩增那些表达量低的基因的ORF

作者: ujne 时间: 2016-1-7 10:37

你好，刚看到你的问题。不知道你现在是否已经解决了上述问题？
因为对你的具体实验不太了解，所以只能谈谈我的想法，不知道对你能否有帮助。第一，不能排除你模板的问题，因为你做的是多态，所以扩出和未扩出的模板一定是不同的，所以你应该首先验证你的模板质量，一般来说应该选择一个管家基因如actin,GADPH做内对照，如果扩出内对照而你的目的片段未出，则证明是模板的问题。做多态设一内对照是必须的。第二，引物的特异性，因为不知道你的多态是哪一种，所以不知道是不是涉及到引物了，如果没有，是不是引物能形成二聚体或内部的茎环而影响扩增？第三，PCR做的MIX是否充分混匀，这点很重要，一定是要先离心，再涡旋再离心，然后均分到各管中。另外你的移液器是否精确，也会影响到实验结果。
2005-06-09 18:56

作者: ujne 时间: 2016-1-7 10:38

第四，二次PCR的优点是避免了一次PCR循环数过多而造成taq酶的失活，所以效率更高。不过看你的实验好像是有和没有的问题，估计对你不太适用。第5，反应条件中变性温度提高到98度试试，因为基因组DNA难打开，用高温较合适。
此外，你还要考虑到是否模板溶的不好，这样每次吸上来的模板质量就不同。PCR仪的问题估计不大。祝你好运

作者: bhka 时间: 2016-1-7 10:38

你好！看到你的体系和条件，感觉有些疑惑，因为我对pcr不精通，现在郁闷的扩增中，所以请你理解我的一再追问并且不吝赐教，在此感谢了！
1，如果我没有搞错，LA Taq需要相对较高浓度的mg， GC buffer I里的mg高含量正适应了这需求，高mg必然要求高的dNTPs，1ul够吗？
2，两步法适宜于引物退火温度较高，接近70的情况，你的引物退火温度设计的很高吗？是依据软件得到的，还是4（G+C）+2（A+T）公式算出吗？我的目的基因与另一基因同源性高达99%，所以设计的引物不可避免会扩增出非目的带，两步法也可以采用吗？
3，利用pcr产物作摸板，可能会使突变的发生率增高，你的实验过程中有这样的情况吗？

作者: ujne 时间: 2016-1-7 10:38

1、我觉得你可以根据自己的模板、引物、反应体系来适当调节DNTP的量。我用1ul是很成功的。其间也有师弟用2.5UL扩的也不错，后来我告诉他试试1ul，结果他也扩的很好。你可以试试，4ul也未尝补可，就是有点浪费了。
2、因为我的引物GC含量都很高，我是用GENERUUNOR软件来分析的，结果显示退火温度都超过85度。引物合成回来后我主要参照合成单上的引物退火温度来摸适宜的退火温度。当然，这个条件也摸索了很长时间，touchdown也试过，效果不好。双温我最低做过65度，效果也不错。我不知道你PCR的目的是什么，如果只是想得到目的片段，那有非特异带也无所谓，跑胶后你可以把目的带切下来，回收纯化，再以纯化产物做模板再扩，效果也不错，我师弟就是用这种方法做的表达连接。
3÷二扩确实存在这个问题，但是，这要根据你实验的具体要求来定，如果做连接，测序就可以排除突变，并总会找到未突变的片段。你可以把你的实验具体讲讲，我再帮你分析一下，OK?

作者: bhka 时间: 2016-1-7 10:39

是我昨天看到你的帖子就不会用你的条件试一次了,没想到你的引物退火温度如此高,怪不得嫁接过来没结果。
我的目的就是为了得到目的基因，我正在准备回收酶切连接，可是我必须为连不上做准备，所以必须将pcr条件尽量优化。
说道引物退火温度，我就我的引物问过数位高手，相互之间的计算方法都不太一样，都给我说这只是估计，关键是自己摸，圆内对如何计算退火也没有统一的意见，所以我觉得pcr没有一个相对模式化的方案，非常不好。我也曾给本版高手eeflying发过信，第一封回了，让我把目的基因和引物发过去，我发了两次，以后就没有音讯了。

作者: kuaizige 时间: 2016-1-7 10:39

各位高手：
一本人设计的引物加入kozak序列，酶切位点，保护基因后TM极高达到80－90多。不知这么高的TM值是否可以？
二ATG前面就有15个碱基，那后面与模板结合部分是多少好呢？这种情况总长度还是20－30吗？
盼回信，多谢！

作者: ujne 时间: 2016-1-7 10:39

你的基因序列和引物序列我已看过.基因全长ORF只有460多个碱基,而且GC含量将近60%也不算太高,因此感觉上不应该太难扩.你的引物我是在gene ruuner里看了一下,虽然引物内部能够形成二级结构,但是也不能说这对引物不好.一般说来3`端的二级结构挺讨厌的.我的师妹也遇到和你一样的问题,cDNA和引物都找不到问题就是扩不出来,后来没办法就换题了.
另外我觉得你的引物最低的退火温度也应该在60度左右.你在52度扩出来的目的带很可能也是非特异带,我那个师妹就是这样,根据引物序列和合成单上给的退火温度,至少应该65度退火,可是她只在56度有带,当然还有很多非特异带,跑胶回收去测序,结果不是,建议你也可以先测序验证一下.
还有,你要确认一下在你提RNA的组织中这个基因是不是高表达的,如果表达量很少,那你成功的机会就低.祝顺利

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