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标题: 【求助】请教目的基因多少bp [打印本页]

作者: 泡泡 时间: 2016-1-7 10:40 标题: 【求助】请教目的基因多少bp

各位路过的仁兄和大侠，我从一篇外文查到pubmed核酸编号为NM_012750的mRNA（Genbank提供详细序列见附件），参考文献，PCR引物设计为：
F: 5’-AGTT CTAT GAAG CTTC CCCC-3’
R: 5’-CACT CTTC TTCC ATGT TCCC-3’
由于文中未写出反应条件和目的基因大小，敢请诸位指导一二，究竟应该是多少bp?
万分感谢！

作者: ALALA 时间: 2016-1-7 10:40

总长度应为643bp,见附件,两个红色的是引物序列,其中下游引物要简单处理一下,即写出其反向互补序列,然后再从word中查找!
祝顺利!

作者: 泡泡 时间: 2016-1-7 10:41

今天跑了电泳，图片如下
从MARKER数起，靠近MARKER的两条就是slytjiaofei兄帮忙分析的目的基因的电泳结果
似乎原位不动？还是根本不是DNA条带？？
最右边的条带是非特异性条带么？我的目的基因位置理论位置为250bp,似乎隐约可见，但其他位置的条带更粗更亮，反应条件还是引物问题？请各位不吝赐教！
附注：MARKER从下往上依次对应：100bp、200、300、400、500、600、700bp......

图片附件: 11043020.jpg (2016-1-7 10:41, 8.79 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=40255

作者: ALALA 时间: 2016-1-7 10:41

靠近MARKER的两条和你的目的条带均没有特异扩增产物,看来是需要在摸摸条件,建议作个梯度PCR,如果仅仅是PCR的话,用25ul体系就可以了,没必要用50ul的体系,退火温度从50-60度,每2度为一个梯度,另外酶可以换好一些的,如takara的ex Taq酶,最后就是模板DNA了,你可以用别人扩增效果不错的引物先做以一下,如果扩增效果好的话就可以排除模班的问题了.

作者: 泡泡 时间: 2016-1-7 10:41

我做的是RT-PCR，现已逆转录为cDNA，这几天对其进行PCR扩增。
引物是北京三博远志公司提供，Tm是57.8度，两条目的条带是分别是54度32循环、56度30循环
具体条件如下:
94度5min
94度45s
54(56)度30s
72度1min
30(32)循环
72度延伸10min
请问如果做梯度，以上条件有什么可以优化，能减少样本耗损是我要兼顾的
由于我做的是骨髓干细胞培养，样本量少，确实是个难题

作者: ALALA 时间: 2016-1-7 10:41

RT的体系一般都是20ul,你可以一分为二或取出1/4,将其稀释1-2倍来摸条件.你给出的循环条件首先我认为延伸时间有些长,我感觉30-45秒足够了,因为基本上1kb对应延伸时间为1min,另外就是引物Tm值,其实不同软件计算出的数目相差很大,所以我还是建议你再摸摸退火温度!

作者: 泡泡 时间: 2016-1-7 10:49

QUOTE:

原帖由 ALALA 于 2016-1-7 10:41 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

RT的体系一般都是20ul,你可以一分为二或取出1/4,将其稀释1-2倍来摸条件.你给出的循环条件首先我认为延伸时间有些长,我感觉30-45秒足够了,因为基本上1kb对应延伸时间为1min,另外就是引物Tm值,其实不同软件计算出的数 ...

多谢多谢，看来我确实要摸摸条件才行
我用的是上海申能博彩生物科技有限公司的RT-PCR试剂盒，说明书用法：
RT是20ul系统没错，PCR给出的是50ul加样顺序和量
PCR要求加cDNA为1-5ul，我加的是4ulcDNA
“可以一分为二或取出1/4,将其稀释1-2倍来摸条件”我不是很理解，脑子呆啊
您的意思是取10ulcDNA或者5ul稀释进行PCR扩增？好像太多了？
见笑了

作者: @STAR@ 时间: 2016-1-7 10:49

QUOTE:

原帖由泡泡于 2016-1-7 10:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

多谢多谢，看来我确实要摸摸条件才行
我用的是上海申能博彩生物科技有限公司的RT-PCR试剂盒，说明书用法：
RT是20ul系统没错，PCR给出的是50ul加样顺序和量
PCR要求加cDNA为1-5ul，我加的是4ulcDNA
“可以一分为二或取出1/4, ...

你的意思是让你稀释模板.比如你现在在用4ul,那么可以取4ulcDNA然后加入4ul无菌无酶双蒸水稀释再取4ul做,然后把剩余的再加入4ul双蒸水稀释,再取4ul作为模板.依次稀释.其实就是梯度稀释模板.
看了你的电泳图和PCR条件.
1.如果你非常信任那篇文献的话.退火温度得摸索,做大跨度的摸索,52~64度.每2度一管.
2.根据你的反转录试剂盒上的公式计算你的cDNA产量.然后确定模板量.不要盲目加模板.
为什么没有看到你P内参呢?那也可以大概估计你的模板加入量.
3.提高循环数试试,延伸72度1min的确有点长,终延伸10分钟可以不要.
4.检查下你的dNTP的质量,中间没有出孔的两道很像是dNTP失效后的PCR图.
继续交流联系!

作者: 泡泡 时间: 2016-1-7 10:50

QUOTE:

原帖由 @STAR@ 于 2016-1-7 10:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

你的意思是让你稀释模板.比如你现在在用4ul,那么可以取4ulcDNA然后加入4ul无菌无酶双蒸水稀释再取4ul做,然后把剩余的再加入4ul双蒸水稀释,再取4ul作为模板.依次稀释.其实就是梯度稀释模板.
看了你的电泳图和PCR条件 ...

谢谢你的解答！您说的如果我还是用50ul体系的话，可以采用梯度稀释模板法，真是个好主意！
因为说明书只说用1-4ul的cDNA并没有什么具体的量，也没有具体计算公式，郁闷！请问常用量是多少？（按20或者50ul体系算的话）
dNTP MIX 是 10mM的，50 ul体系用1ul，如果dNTP有问题，内参应该没有那么好－－
我内参做了，条带尚满意，见下图所示

图片附件: 68515566.jpg (2016-1-7 10:50, 1.96 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=40256

作者: @STAR@ 时间: 2016-1-7 10:53

QUOTE:

原帖由泡泡于 2016-1-7 10:50 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢你的解答！您说的如果我还是用50ul体系的话，可以采用梯度稀释模板法，真是个好主意！
因为说明书只说用1-4ul的cDNA并没有什么具体的量，也没有具体计算公式，郁闷！请问常用量是多少？（按20或者50ul体系算的话）
dNTP MIX 是 10m ...

1.一般是反转录的时候用1ug的总RNA或(0.1ug mRNA),20ul反转录体系.然后在PCR时加入2~3ul模板cDNA即可.可以根据产物的量适当调整.
2.你的内参不错,挺好的.那么dNTP应该没问题.建议使用时dNTP稀释到2.5mM.加入4ul.比加入1ul的10mM的准确.
3.那么还是在退火温度,大概是RT中最重要的了.排除下引物的稀释时是否标准操作.
等再次做后把图发上来再一起分析.

作者: 泡泡 时间: 2016-1-7 10:54

参考各位的意见，今天进行了退火温度的摸索：
94度 5min
94度 45s
**度 30s
72度 1min
共32循环
72度延伸10min
目的基因1：TM为58度，退火温度摸索：52、54、58、60
目的基因2：TM为64度，摸索温度：58、60、62、64
目的基因3：TM为57.8度，退火温度摸索：52、54、58、60
加样：
cDNA稀释2倍后，加样4ul
dNTP加4ul(*2.5mM)
按50ul体系加样后，平分4管进行PCR（为了省样本和试剂，一个师姐教的方法），即：12.5ul，加上12.5ul石蜡油，Ependorf 的PCR仪器（有热盖功能），循环设置如上所列。
电泳：25ml的琼脂，90V电泳约30min
附图注释：从MARKER(每100bp为一亮带)数起，每四条带对应目的基因1、2、3
头四条带（目的基因1）似乎见到条带，却不是我要的（目的位置为436bp)
中间4带（目的基因2），似乎是所谓的非特异性条带（目的位置应该是252bp），拖尾非常严重（同前相比，连MARKER也似乎拖尾了，琼脂糖问题？我用的是1.5％的浓度）
右边4带（目的基因3），什么都没有（我要的是643bp的条带）
恳请各位给个看法和判断，那些方面还可以改进的
万分感谢！

图片附件: 39402397.jpg (2016-1-7 10:54, 10.06 KB) / 该附件被下载次数 14
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=40257

作者: 泡泡 时间: 2016-1-7 10:54

看了你的电泳图,说下我的个人见解:
1.基本上除了1~4道似乎还能看到点像是目的基因1.目的基因2和3算是完全没有扩出来.杂带太多或者是根本就没有带.
2.现在目的基因1和2的退火温度已经摸了52~60度,看来P的效果也很不好.那么再尝试下到64度.如果还不出结果的话.考虑下是不是引物的问题.你的Mg2+是单加的还是和Buffer混合在一起的?试着调调Mg2+浓度,不过估计不会有太大改观.
3.目的基因3的TM值比较高,在64度,没有扩增出,甚至杂带.那么我建议你再提高到72度.也就是可以将退火和延伸温度都设置为72度.如果还是没有任何条带.考虑问题同上.
4.你的基因片段数都在500bp左右,建议用2.0%的琼脂胶.电泳的时候先设置低电压3V/cm,待产物出孔一段后再设置较高电压5V/cm.电泳液没过胶1~2mm即可.
5.加样的顺序为:无酶双蒸水,10*Buffer,dNTP,Mg2+,引物A,引物B.模板,Taq酶.不知道你是不是这样加的.
6.退火温度时间建议延长到45S.引物与模板结合时间可能过短,尤其是目的基因3.延伸温度建议45S足够了.目的基因3的循环数还可以调到36个看看.
7.PCR的样本可以加到模板后再分装到PCR管中,这样既节省Tip头也能保证各PCR管中试剂均一,既在一个0.5ml的EP管中把4管的试剂依次加好(4倍加入),然后分装,最后加酶.一点点小经验.可以试试.
有了热盖.为什么还加石蜡油呢?为了节省cDNA,那个方法倒是可以.不过P的时候需要设置体系数目为25ul.体系越小,PCR仪对温度的调节越不好控制.所以如果模板多的话,最好还是用标准体系.
希望还有其他热心战友为ctyw708帮忙分析.谢谢.

作者: 泡泡 时间: 2016-1-7 10:54

你的分析很详细，谢谢！
补充几点：
1、Mg2+是Buffer自带的，浓度未知
2、加样顺序，说明书提供如下：
1－5ul firsr strand cDNA
5ul 10×PCR Buffer
1ul dNTP MIX (10mM)
2ul 25uM Primer Forward(自备)
2ul 25uM Primer Reverse(自备)
**ul水（使总体积为49ul)
1ul Taq DNA polymerase
与您所说的不同，不知可否（内参这样做，似乎没有问题，条带图见上面帖子）
3、我加的水是高压时间比较久的了，估计达不到无酶，甚至无菌也不敢保证，是否会有影响？
4、引物事北京三博远志合成的，质量不知如何（内参还可以）
5、所有引物都是参考国外同一篇文献，选择理由：引物条件和位置说明的都很详细
是否太轻率
自己不会用Blast，很被动啊
6、我的PCR设置Tube 是0.2ml ,体系数目竟然设为13ul! 而不是您说的25ul！天哪l
呜呜......

作者: @STAR@ 时间: 2016-1-7 10:55

2ul 25uM Primer Forward(自备)
2ul 25uM Primer Reverse(自备)
**ul水（使总体积为49ul)
你的引物加的过量了.
一般在50ul的体系里,引物终浓度是400nM.
即引物的物质的量为20pmol.(一般10pmol~20pmol)
所以是20uM的Primer加1ul即可.
你的超过了一倍多.呵呵
修改为:
1ul 20uM Primer Forward(自备)
1ul 20uM Primer Reverse(自备)
**ul水（使总体积为49ul)

作者: moonlight 时间: 2016-1-7 11:05

首先声明我是菜鸟，我做的时候用的是HiFiMix，高保真的，效果挺好的，觉得如果楼主资金充足，不如买个用用，总比这样摸索来的舒服，还节省时间，节省样品。个人愚见。

作者: 泡泡 时间: 2016-1-7 11:07

参考了大家的意见，今天再次PCR
目的基因1：TM为58度，退火温度摸索：58、60、62、64
目的基因2：TM为57.8度，退火温度摸索：58、60、62、64
1、三蒸水重新高压
2、引物重新配制，改为20mM,加样1ul
3、cDNA按1：2稀释后，加稀释液3ul
4、退火温度见上，时间延长为45s
5、72度延伸时间缩短至45s
6、循环数目增加到36cycles
7、加样顺序依然为：cDNA, pcr buffer, dNTP, primer 1 ang primer 2 ,水
最后加Taq酶
体系为50ul,最后平分为4管，即12.5ul，加入12.5ul 石蜡油
8、体系数目更改为25ul
9、琼脂糖浓度为2.0％，90V 30min
如图，似乎什么都没有了
个人觉得原因：
1、条件不对
2、引物特异性问题
3、引物质量问题（除外内参）
4、没有目的基因表达
各位大侠，还有什么可以指教的么？
谢谢！（目的基因1、2从左到右，各跑4条带）

图片附件: 62017894.jpg (2016-1-7 11:07, 3.4 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=40262

作者: moonlight 时间: 2016-1-7 11:07

图不太清楚
不过看上去是没什么东西.
由于不在现场,我建议你试试其他人的PCR体系,仅用你的cDNA和引物(可以排除下你的体系问题).或换贵一点的酶,比如Taq-plus.(Taq+puf)
还有就是如果你的模板(样本)比较珍贵,那么可以先提取有你需要的目的基因表达的其它组织(细胞)做.条件摸好了再用你的样本做.到时候只需要调整模板量就可以了
多查文献,找找是否有别人做过,到底表达吗?还是低表达?或者有没有人做你的目的基因的Western.若有Western结果,那么一定有表达的.
引物可以尝试换家合成公司(生工),或者新设计.
你的条件做的也比较多了,再做可能会有“PCR是魔鬼！”的感觉.
多查资料吧,会找到原因的.

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