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标题: 【求助】定量PCR测定DNA中基因拷贝数的一个问题 [打印本页]

作者: superboy 时间: 2016-1-7 16:59 标题: 【求助】定量PCR测定DNA中基因拷贝数的一个问题

近来一直在用定量PCR测定小鼠DNA中基因的拷贝数，据某些质粒上显示每套小鼠的基因组DNA大约为3pg左右。我的定量PCR模板量为100ng左右，按照上面的数据推算SRY的拷贝数应该在3×10^4左右，但是我的结果基本上都在10^6左右。是不是书上给出的数据不准呢？
我现在做绝对定量时是将要扩增的目的片段克隆在T载体上，而后用分光光度计测定质粒浓度，按照浓度×6.02×10^23/质粒分子量的公式来计算标准品拷贝数，这一方法是否正确，请各位指教。谢谢！
我是用TaqMan MGB探针做的定量PCR。

作者: guagua 时间: 2016-1-7 17:00

近来一直在用定量PCR测定小鼠DNA中基因的拷贝数，据某些质粒上显示每套小鼠的基因组DNA大约为3pg左右。我的定量PCR模板量为100ng左右，按照上面的数据推算SRY的拷贝数应该在3×10^4左右，但是我的结果基本上都在10^6左右。是不是书上给出的数据不准呢？
我现在做绝对定量时是将要扩增的目的片段克隆在T载体上，而后用分光光度计测定质粒浓度，按照浓度×6.02×10^23/质粒分子量的公式来计算标准品拷贝数，这一方法是否正确，请各位指教。谢谢！
我是用TaqMan MGB探针做的定量PCR。

作者: whitesheep 时间: 2016-1-7 17:00

那我做出来的拷贝数怎么会与资料上给出的数据推算出来的差别这么大呢？请指教。

作者: guagua 时间: 2016-1-7 17:00

不太明白你说的，但是你的公式没有错，如果需要，检查一些小地方，比如质粒分子
量加没加目的基因，浓度推算是否正确。你的标准曲线是以反应中的决对拷贝数为
X轴，还是浓度即COPIES/UL。很多细小的地方很容易出错的。
再一点，你的模板是GENOME DNA吗？

作者: superboy 时间: 2016-1-7 17:01

我用的机器和主任一样也是RG3000，模板是基因组DNA。我的标准品质粒测定好浓度后用上面的公式将其换算为拷贝数/ul，实验时加入5ul，那么每个点的标准品绝对拷贝数也就知道了。然后再测定样品的浓度，将其稀释到大约20ng/ul，加入5ul。测出的就应该是100ng DNA中的基因拷贝数。
换算公式具体是浓度（单位为ng/ul）×6.02×10^23/（分子量×10^9）。分子量是用DNAMAN计算的，3Kb多长的质粒分子量大约为2×10^6。
另外再请问如果测定基因组中外源基因的绝对拷贝数时（即某条染色体上整合了几个拷贝的外源基因）在测定该基因的同时用什么内参比较好。谢谢了！

作者: summerxx 时间: 2016-1-7 17:09

有一个问题你注意到了没有？用Genomic DNA和质粒DNA做模板时的PCR效率是不一样的。因此严格地说，检测genomic DNA应该用Genomic DNA做标准品，除非你优化你的RT-PCR反应并证明他们的反应效率是一样的。
有个简单的方法可以检测：
你看看质粒标本中，相差10倍浓度的样品的Ct值应该差3-5左右。看看genomic DNA相差10倍浓度的样品的Ct值相差是多少？应该会比质粒的要大。所以那质粒做标准曲线检测基因组的copy数，应该首先考虑这个问题。许多文献用这样的方法，是否正确，值得斟酌。

作者: superboy 时间: 2016-1-7 17:09

那我用一个内参的基因作为对照同时来扩增的话是不是就能克服上面所说的质粒与基因组DNA之间PCR效率的差别呢？

作者: summerxx 时间: 2016-1-7 17:10

好像没有用，设内参的目的只是证明参加反应的DNA一样。而并不能影响PCR反应本身。

作者: 49888 时间: 2016-1-7 17:10

我正在做定量PCR,相差10倍浓度(原浓度4.3*10的7次方copies/反应管)的样品的Ct值分别为20.944,25.286,28.208,30.060,33.105,35.608,35.688,6#-7#个稀释度的数据很相近,做了标准曲线R2=0.966,请问是否太低了,有说服力吗?SadSad
另外,我觉得用重组质粒定量是可行的,因为在提取基因组核酸时干扰比较多,可能提取的核酸相对不纯,用于定量不稳定,而细菌质粒提取方便,也较纯吧,我是初学者,不知是否正确.
另外不知DNAMAN网上能否下载?谢谢!!

作者: taoshengyijiu 时间: 2016-1-7 17:10

做复孔或三孔，取均值会好些。

作者: woshi 时间: 2016-1-7 17:11

对做三个重复取平均值,以前遇到过从第1-5个稀释度,很规律,第6个ct=40,第7,8,9分别为35-40之间,开始考虑是模半板没稀释好,没混匀,后来想每个的稀释度中的模板怎麽也不会比前个稀释度高,这种情况遇到过很多次,

作者: taoshengyijiu 时间: 2016-1-7 17:11

有没有遇到这样的情况,模板在做剃度稀释的时候,CT值会在一个范围内忽高忽低,尤其是连续的少量模板倍比稀释情况更严重,有没有什么号的连续剃度稀释的好方法

作者: TNT 时间: 2016-1-7 17:11

实时定量PCR方法的优点在于其高灵敏度，对于少量copies也能检出荧光值。
但是在摸索方法的时候，需要确定出此种方法的检测下限，即最低检出量。如果对于少量模板的稀释出现CT值变化无规律，重复几次也如此，就应该认为此浓度不在检测的范围内。
前面谈到我做的前6个梯度R2=0.966，从7开始波动CT值最小的也大于36，我就认为从7开始的浓度不能检出。
梯度稀释时要小心，我也觉得100 microliter的总体积容易混匀

作者: yizhi 时间: 2016-1-7 17:11

按照浓度×6.02×10^23/质粒分子量的公式来计算标准品拷贝数???
我不是那样做的，根据公式(ab*0.5)/(3X109)
有什么差别吗？

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