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标题: [求助]请问有谁用过生工自产的trizol？好用吗？ [打印本页]

作者: @STAR@ 时间: 2011-10-11 11:29 标题: [求助]请问有谁用过生工自产的trizol？好用吗？

[求助]请问有谁用过生工自产的trizol？好用吗？

请问有谁用过生工自产的trizol？好用吗？
我觉得它的说明书就只有一张小小的卡片，而且上面将组织RNA的抽提步骤讲的太简，我实在不放心用。

作者: @STAR@ 时间: 2011-10-11 11:30

还有，用异丙醇沉淀和无水乙醇沉淀有什么区别吗？我见有同学用无水乙醇（他用的是invitrogen的）

作者: 131415 时间: 2011-10-11 11:31

我们用的就是生工的柱式试剂盒，从组织提RNA，用它直接来匀浆效果不好，我们自己配置了变性液来匀浆，然后吸出匀浆液适量加入TRIZOL进一步变性，75%乙醇沉淀即可，无水乙醇也可，但考虑到用DEPC水配置乙醇更好，所以我们用75%乙醇DEPC水配。另外我们提的RNA一直有DNA污染，不知道是试剂盒的原因还是我们自己配液的问题，不敢给你肯定答复。
关于沉淀，你看一下其他方法（比如一步法试剂盒）对比一下就可知道，异丙醇是沉淀RNA，乙醇沉淀DNA，如果你用TRIZOL，乙醇沉淀时见有白色沉淀，那是DNA，我们用此沉淀跑过电泳，是一条很亮的DNA带。

作者: @STAR@ 时间: 2011-10-11 11:31

我用的trizol不是柱式的，（货号sk1312），价格比我的同学买的要便宜2/3，而且操作步骤还很省时间（按说明书上），加氯仿后无需静置，每步的离心时间只要5min；我正在模索看到底好不好用，如果好用倒可以推荐给大家了。不好用的话，我大概只有重新买了。

作者: 911 时间: 2011-10-11 11:32

我刚刚用过一次,100mg组织用了1mlTRIzol,得到total RNA经定量有大约200ug,ratio1.67,而且做了RT,beta-actin内参PCR没有问题
感觉还可以
生工的TRIzol是无色的,Invitrogen的带有指示剂是粉红色的

作者: 晶晶亮 时间: 2011-10-11 11:33

我们一直用的是生工的TRIZOL，效果一直都还可以。唯一的是生工的业务员实在是太面了，让人的信任度大减！！！

作者: 豆荚 时间: 2011-10-11 11:33

上海申工的TRIZOL我这里有一个学生用过，感觉不太好。使用方法和同济医学院编的研究生实验指南上基本一致，估计其配方可能就是酸性酚加上异硫氰酸胍的混合液，不过效果似乎还可以。
我们实验室一般都是用进口的，国际标准，比较可靠。其实大可不必用说明书上推荐的量，单纯做RT需要的
量很少，可以用0.5ml或更少的TRIZOL，当然，组织也要相应地减少。

作者: @STAR@ 时间: 2011-10-11 11:34

不好意思，再请教各位高手一个问题：
你是如何知道你提的RNA内混有DNA的，你打算如何去除这些DNA呢？不去除肯定会影响下一步的RT-PCR，导致将基因组片断PCR出来就失去RT的原意了，如果用不含rna酶的dna酶处理，也怕残留的dna酶会影响PCR；如果采用进一步提纯的方法，不知该怎样操作？
我觉得我提的RNA好像也混有DNA，但我不能肯定，因为我不知道怎样确定。只是我的RNA电泳有三条带，相当于5s那条明显较后面两条要宽。我不能肯定这是降解还是混有DNA

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8678

作者: 雪原 时间: 2011-10-11 11:35

生工的TRIZOL不好用，总是有些降解，而且混的DNA也很多。如果三条带有拖尾那肯定是部分降解了。

作者: 嘉年华 时间: 2011-10-11 11:36

DNA酶处理完了用酚抽氯仿抽不久可以了
当然如果用trizol可以用它抽
我用生工的感觉很差，总是降解，但是有人用的没事情，正反面的信息我都听说过，所以如果手头宽裕建议不要用

作者: 头发很短 时间: 2011-10-11 11:36

关于沉淀，你看一下其他方法（比如一步法试剂盒）对比一下就可知道，异丙醇是沉淀RNA，乙醇沉淀DNA，如果你用TRIZOL，乙醇沉淀时见有白色沉淀，那是DNA，我们用此沉淀跑过电泳，是一条很亮的DNA带。

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错误的说法，希望大家不要轻信，自己查一下分子克隆上的异丙醇和乙醇的区别。我凭记忆：两者都可以沉淀核酸（DNA和RNA），只不过所用体积不一样，异丙醇所用体积小，是和上清等体积，乙醇要2或2.5倍，而且分之克隆上我似乎记得还说异丙醇容易沉淀盐，在没有体积限制时，一般不用，而用乙醇，TRIZOL提取过程中似乎没多少盐离子在里面。也许你跑的电泳有问题，我们跑RNA有时变性不好而且有杂质时，电泳图上就会显示孔里很亮，变性好了，同样的RNA样品就出现了明显的28S、18S带。另外，你提的RNA一直有DNA污染，可能TRIZOL的pH值有问题，DNA在酸性条件下易溶于有机相，这是TRIZOL提取过程中加氯仿离心后DNA在中间相和下层有机相中，但是理论上和实际上上层水相都是有DNA的，只不过很少（pH对的情况下）。要真正去DNA污染，就要加RNase free 的DNase，这是很多论文里写的。

作者: #甜# 时间: 2011-10-11 11:37

我也用了生工的Trizol提过肾脏的RNA，每次都能提出来，但是每次都有降解，一开始以为是自己陪液体的错，后来重新配了液体又重新消毒了玻璃器皿，虽然跑电泳都能有三条带，但是每次降解都挺多的。
另外，小妹也有几个问题想请教：
1、在跑电泳的时候怎样才可以知道有没有DNA污染？
2、是不是一定要测OD值
3、同意个标本可以分别提取好多次，每次提取后的RNA经过跑电泳后发现均没有降解时能不能混在一起；前面有个高手说要测定质量后才混，这个质量时什么，是没有降解还是要OD值相同才能相混。
4、如果需要作realtime RT-PCR，反转录前要不要测定什么，譬如OD值怎么的来保证可比性。
谢谢

作者: @STAR@ 时间: 2011-10-11 11:37

两者都可以沉淀核酸（DNA和RNA），只不过所用体积不一样，异丙醇所用体积小，是和上清等体积，乙醇要2或2.5倍，而且分之克隆上我似乎记得还说异丙醇容易沉淀盐，在没有体积限制时，一般不用，而用乙醇，TRIZOL提取过程中似乎没多少盐离子在里面。
提的RNA一直有DNA污染，可能TRIZOL的pH值有问题，DNA在酸性条件下易溶于有机相，这是TRIZOL提取过程中加氯仿离心后DNA在中间相和下层有机相中，但是理论上和实际上上层水相都是有DNA的，只不过很少（pH对的情况下）。要真正去DNA污染，就要加RNase free 的DNase

写的比较明白了，我们实验室里就有人从来不用异丙醇，也提得很好，但问他原理到底和乙醇在用法上有何区别，他说不太懂。这回偶懂了，再次感谢！

作者: @STAR@ 时间: 2011-10-11 11:38

向大家汇报一下我用生工自产的trizol提的RNA做RT-PCR的情况，（RNA的电泳图我贴在上面8楼了）测A260/280为2.21

我用这样的RNA往下做（用takara的ver3.0RT-PCR试剂盒，内含AMV反转录酶、EX Taq热启动版本）

开始的5对引物跑的很顺，都出来了跟目的片断大小一致的单一条带..........实验如此顺，我就有点担心会不是假阳性？（我认为RNA内若有DNA污染肯定会导致假阳性的结果，也就是说某段基因组序列可能根本就不会转录、翻译，但是却被我扩出来了，这样岂不失去了我想了解某段基因表达情况的意义了？）

近来又用另外的3对引物跑，结果跑出的单一条带远比我预计的大得多，由此我更加怀疑我以前做的可能都是假阳性了。（我觉得条带比计划的大得多，大概是引物跨了内含子导致的，我正在查找求证）

以上新问题还望各位帮忙解答，在此先谢了！我自己也在找问题出在哪里

作者: 小葵 时间: 2011-10-11 11:38

我提取RNA主要用来做RT-PCR，完全没有问题。从一般的琼脂糖电泳来看，是有降解，做甲醛变性琼脂糖电泳估计会好的多。我正打算做体外转录，要做甲醛变性琼脂糖电泳，到时看效果如何。一步法提取的RNA中混有少量的基因组DNA可能性非常大，有时RT-PCR时出现非特异性条带就是因为基因组DNA的存在，用DNase消化就是，若仅仅为了消除由此引起的非特异性条带，也可尝试改变引物。
Good luck！

作者: qiangren789 时间: 2011-10-11 11:39

建议大家不要用生工的trizol了。后来我总出问题，到处找原因，也没用；后改用invitrogen的就完全好了！我的真实经验。

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