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标题: [求助]谁能告诉我rt-pcr的过程? [打印本页]

作者: 功夫张CJ 时间: 2011-10-12 10:37 标题: [求助]谁能告诉我rt-pcr的过程?

[求助]谁能告诉我rt-pcr的过程?

来国外有板有3个月了,研究员突然问我过成,我没做过实验,什么都不知道,我想知道这个过程,最好有动画什么的,个种酶的浓度,都起什么做用,谢谢,能快点回复最好了！

作者: 箭头儿 时间: 2011-10-12 10:38

那不是很简单的吗？RT就是反转录了，在反转录酶的作用下把RNA反转录成
cDNA，再取cDNA做PCR就是了。

作者: 鲁西西 时间: 2011-10-12 10:38

refer to the URL and you may find it useful to your research,
particularly when you use PCR frequently for cloning, genotyping,
characterization, etc.
cuturl('http://www.pcrlinks.com/index.html')

作者: one 时间: 2011-10-12 10:38

建议看分子克隆（第三版），有很详细的介绍啊！

作者: one 时间: 2011-10-12 10:39

是在上册936页

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 10:40

不好意思，本来很好的一篇文章，我又不知道怎么传上去，你就先凑合看一下，感觉好的话我用邮箱给你传过去
第一章 PCR和RT-PCR基础
PCR基础
聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分（表1）。模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA聚合酶。这种酶适用于常规扩增，但是使用其他热稳定聚合酶会改善结果。扩增反应还包括缓冲液，三磷酸脱氧核苷及镁离子。镁离子浓度影响酶的活性、引物退火、模板和PCR产物的熔点（Tm），忠实性以及引物二聚体的形成等。在随后的章节中将讨论这些成分、循环参数以及其他参与作用的因子相互间各种作用对于成功PCR的影响。
表1. 反应成分

Component  Final Concentration
Template  10^4-10^6 copies of DNA template
Primer 1  0.1-0.5µM
Primer 2  0.1-0.5µM
10X Reaction buffer  1X
Magnesium  1.0-3.0mM
dNTP mix  200 mM each dNTP
Thermostable DNA polymerase  1-4 units/100 ml reaction

RT-PCR基础
RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。
RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下，在一只管中顺次进行。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 10:43

图1. RT-PCR概图
这本指南阐述了成功RT-PCR和PCR的关键。高灵敏性（从小量样品中得到足量结果）和高特异性（选择性地仅得到所需的产物）是成功PCR的标志。可以通过仔细的实验设计（如选择恰当的酶，设计最理想的引物，使用不同的缓冲液和添加剂，确定循环参数及制备高质量的模板等）以获得最佳的RT-PCR和PCR。

第二章增加RT-PCR灵敏度
分离高质量RNA
成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。Trizol试剂法（见下图）将一步法加以提高，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。
TRIzol®试剂步骤略图

一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA。不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA，都可以检测到扩增结果（图2）。另外，分离poly(A)+ RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化，从而使信息的检出和定量产生偏差。然而，当分析稀有mRNA时，poly(A)+ RNA会增加检测的灵敏度。

图2. 总RNA和poly(A)+ RNA在RT-PCR中的比较
以5或1μg Hela细胞总RNA（分别为泳道1和2）或500ng和50ng Hela细胞poly(A)+ RNA（分别为泳道3和4）。使用oligo(dT)引物和SuperScriptⅡ逆转录酶合成cDNA。扩增对象为DNA聚合酶εmRNA 5'端377bp片段和复制酶A mRNA的643bp片段，两者都为中等丰度。将1/10的cDNA合成反应产物使用Taq DNA聚合酶扩增30个循环。

为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA，对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA，在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA，在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaCl至0.2M及4倍体积的乙醇，室温放置3-5分钟，10,000×g离心5分钟。
在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量。RNase抑制剂要在第一链合成反应中，在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入，因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性，从而释放结合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A，B，C对RNA的降解，并不能防止皮肤上的RNase，因此尽管使用了这些抑制剂，也要小心不要从手指上引入RNase。
使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶
逆转录酶催化RNA转化成cDNA。不管是M-MLV还是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有内源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链，并降解RNA：DNA复合物中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的产量和长度。因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益。
SuperScriptⅡ逆转录酶，RNaseH- 的MMLV逆转录酶及ThermoScript逆转录酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全长的cDNA（图3）。RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响。ThermoScript比AMV的灵敏性强得多（图4）。RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力，尤其是克隆较大的cDNA时。同MMLV相比，SuperScripⅡ显著提高了长RT-PCR产物的产量（图5）。RNaseH- 的逆转录酶同时增加了热稳定性，所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 10:43

图3 逆转录酶对cDNA第一链产量的影响
在建议的合成条件下，使用oligo(dT)引物和10μCi的[α- P]dCTP。第一链的总产量使用TCA沉淀法计算。全长cDNA使用在碱性琼脂糖胶上将大小分类的条带切除并计数的方法分析。


图4 逆转录酶对RT-PCR灵敏度的影响    图5 逆转录酶对长模板RT-PCR灵敏度的影响
以oligo(dT)为引物，使用ThermoScriptⅡ或AMV，在50℃下由Hela细胞总RNA合成cDNA。使用Platinum® Taq DNA聚合酶和人DNA聚合酶ε引物进行35个循环。    人tuberous scherosis ⅡmRNA（5.3kb）和人DNA聚合酶εmRNA的全长cDNA的合成由SuperScriptⅡ和MMLV催化。利用oligo(dT)为引物，由5μg Hela细胞总RNA合成cDNA。样品使用RNaseH处理，然后使用ELONGASE? Enzyme Mix将1/10的cDNA合成反应产物扩增35个循环。

RNaseH产生的障碍
RNaseH对第一链cDNA的影响。RNaseH在cDNA合成期间降解RNANA复合体中的RNA。红色箭头代表潜在的酶切位点。

提高逆转录保温温度
较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开，增加了反应的产量。对于多数RNA模板，在没有缓冲液或盐的条件下，将RNA和引物在65℃保温，然后迅速置于冰上冷却，可以消除大多数二级结构，从而使引物可以结合。然而某些模板仍然会存在二级结构，即使热变性后也是如此。对这些困难模板的扩增可以使用ThermoScript逆转录酶，并将逆转录反应置于较高温度下进行以改善扩增（图6）。较高的保温温度也可以增加特异性，尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时（见第三章）。如果使用GSP，确保引物的Tm值与预计的保温温度相同。不要在高于60℃时使用oligo(dT)和随机引物。随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟。除了使用较高的逆转录温度外，还可以通过直接将RNA/引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度，并加入预热的2×的反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）。这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度切换。

图6 温度对不同模板的影响
使用ThermoScript或AMV，以18S rRNA基因特异性引物，由10ng大豆总RNA在所示温度合成cDNA。将1/10的cDNA反应产物使用高保真Platinum Taq DNA聚合酶进行40个PCR反应循环。

表2. 逆转录保温温度

Reverse Transcriptase Incubation Temperature
AMV  37°C-45°C
M-MLV  37°C
SuperScript™II RT  37°C-50°C
ThermoScript™ RT  42°C-65°C
RNA在高于65℃时开始水解，对于≤1kb的RNA第一链合成温度可以为70℃，对于＞1kb的RNA则需要＜65℃。

Tth热稳定聚合酶在Mg 存在条件下作为DNA聚合酶，在Mn 存在条件下作为RNA聚合酶。它可以在最高65℃条件下保温。然而，PCR过程中Mn 的存在会降低忠实性，这使得Tth聚合酶不太适合用于高精确度的扩增，如cDNA的克隆。另外，Tth的逆转录效率较低，这会降低灵敏度，而且，既然单个酶就可以进行逆转录和PCR，那么没有逆转录的对照反应就不能用来将cDNA的扩增产物同污染的基因组DNA的扩增产物区分开来。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 10:44

促进逆转录的添加剂
包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中，可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构，最多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影响SuperScriptⅡ或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性。为了在SuperScriptⅡ逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度，可以加入10％的甘油并在45℃保温。如果1/10的逆转录反应产物加入到PCR中，那甘油在扩增反应中的浓度为0.4％，这不足以抑制PCR。
RNaseH处理
在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度。对于某些模板，据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合，在这种情况下，RNaseH处理可以增加灵敏度。一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时，RNaseH处理是必需的，比如低拷贝的tuberous scherosisⅡ（图7）。对这种困难模板，RNaseH的处理加强了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所产生的信号。对于多数RT-PCR反应，RNaseH处理是可选的，因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA：DNA复合物中的RNA水解掉。

图7 RNaseH处理对RT-PCR的影响
使用SuperScriptⅡ（S）、M-MLV（M）或AMV（A），由5μg Hela RNA合成人tuberous sclerosisⅡmRNA（5.3kb）的全长cDNA，反应产物的一半使用RnasH处理30分钟，使用ELONGASE Enzyme Mix对相当于起始RNA 0.5％的经处理及未处理逆转录产物进行35个循环的扩增。

小量RNA检测方法的提高
当仅有小量RNA时，RT-PCR尤其具有挑战性。在RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量。可以在加入Trizol的同时加入无RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以辅助随后的沉淀。对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品，无RNase糖元的建议浓度为250μg/ml。
在使用SuperScriptⅡ的逆转录反应中加入乙酰化BSA可以增加灵敏度（图8），而且对于小量RNA，减少SuperScriptⅡ的量并加入40单位的RnaseOut核酸酶抑制剂可以提高检测的水平。如果在RNA分离过程中使用了糖元，仍然建议在使用SuperScriptⅡ进行逆转录反应时加入BSA或RNase抑制剂。

图9 一步法RT-PCR的灵敏度
使用SuperScriptⅡOne-Step RT-PCR System从0，0.1，1，10，102，103pg Hela总RNA（分别为泳道1-6）扩增β-actin片段。反应在50℃保温30分钟；94℃2分钟；然后94℃15秒，55℃30秒，68℃90秒进行40个循环；随后在68℃保温5分钟。反应中包含200 nM正义和反义引物。

一步法同两步法RT-PCR的比较
两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点（表3）。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增（图9）。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成。
表3. 一步法和两步法RT-PCR的比较

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 10:44

两步法步骤  一步法步骤
起始第一链cDNA合成使用：  起始第一链合成使用
Oligo(dT)  GSP引物
随机六聚体
GSP引物
优点  优点
•灵活  •方便
引物选择扩增酶同逆转录酶预先混合
扩增酶的选择转管步骤少，减少污染可能性
•困难RT-PCR的优化能力  •高灵敏度
同Platinum®酶结合提高特异性  •适用于大量样品分析
同Platinum Pfx Taq DNA聚合酶结合提高忠实性  •适用于定量PCR
•适用于在单个样品中检测几个mRNA
关于扩增酶和产物大小应注意：
•对于小于4kb的产物使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶

•对于小于12kb的产物使用Platinum Pfx Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity
•对于大于12kb的产物使用ELONGAE® Enzyme Mix
•对于一步法RT-PCR，如果产物小于3.5kb，使用Taq DNA聚合酶或Platinum Taq DNA聚合酶；如果产物小于9kb，使用Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。

图9 一步法RT-PCR的灵敏度
使用SuperScriptⅡOne-Step RT-PCR System从0，0.1，1，10，102，103pg Hela总RNA（分别为泳道1-6）扩增β-actin片段。反应在50℃保温30分钟；94℃2分钟；然后94℃15秒，55℃30秒，68℃90秒进行40个循环；随后在68℃保温5分钟。反应中包含200 nM正义和反义引物。

第三章增加RT-PCR特异性
起始cDNA合成
第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。
随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 10:45

Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数真核细胞mRNA 3'端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。
基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计（见第五章）。GSP可以同与mRNA3'最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行RT-PCR，需要设计多于一个反义引物，因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。建议在20μl的第一链合成反应体系中使用1pmol反义GSP。
提高逆转录保温温度
为了充分利用GSP特异性的全部优点，应该使用有较高热稳定性的逆转录酶。热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性。比如，如果一个GSP退火温度为55℃，那么如果使用AMV或M-MLV在低严谨性的37℃进行逆转录，GSP所带有的特异性就没有完全利用。然而SuperScripⅡ和ThermoScript可以在50℃或更高进行反应，（表2）这就会消除较低温度时产生的非特异性产物（图10）。为获得最大的特异性，可以将RNA/引物混合物直接从65℃变性温度转移到逆转录保温温度，并加入预热的2×反应混合液（cDNA合成热启动）。这有助于防止低温时分子间碱基配对。使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度转换。
图10. 逆转录温度对RT-PCR特异性的影响
使用ThermoScript™和设计用来同人DNA聚合酶εmRNA退火的GSP，由1μg Hela RNA合成cDNA。Thermoscript加入到预热的反应混合液中，使用Platinum Taq DNA聚合酶对1/10的cDNA进行35个循环的PCR。

减少基因组DNA污染
RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA。使用较好的RNA分离方法，如Trizol Reagent，会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA。为了避免产生于基因组DNA的产物，可以在逆转录之前使用扩增级的DNaseⅠ对RNA进行处理以除去沾染的DNA。将样品在2.0mM EDTA中65℃保温10分钟以终止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合镁离子，防止高温时所发生的依赖于镁离子的RNA水解。
为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开，可以设计分别同分开的外显子退火的引物。来源于cDNA的PCR产物会比来源于沾染的基因组DNA的产物短。另外对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照实验，以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNA。在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 10:46

第四章 RT-PCR应用
5' 和3' RACE
RACE（cDNA末端快速扩增，Rapid Ampliphication of cDNA Ends）是一种获得转录本5'或3'未知序列的方法。不象普通RT-PCR那样使用两个序列特异性的引物，RACE使用一个序列特异性的引物和或者mRNA的poly(A)尾（3' RACE）或者加到cDNA末端的多聚同聚体（5' RACE）（图11）。RACE已经被用于扩增和克隆稀有mRNA。RACE的产物可以用来克隆，直接测序，制备探针或连接在一起得到全长cDNA。其中一个连接5' 和3' RACE产物的方法是使用由5' 及3' RACE得到的序列信息设计新的引物，以扩增全长的cDNA。使用RNaseH-的逆转录酶和高保真的热稳定聚合酶可以对较长的序列进行高保真的扩增，从而得到全长cDNA克隆。
5' RACE步骤概要

  第一链引物，GSP1，同mRNA退火
  使用SuperScriptⅡ将mRNA转录成cDNA
  使用RNase混合物降解RNA
  使用GlassMAX® Spin Cartridge纯化cDNA
  使用dCTP和TdT对纯化的cDNA加尾
  使用简并的锚定引物和巢式GSP2 PCR扩增带有dC尾的cDNA
  使用AUAP，UAP和巢式GSP重新扩增初步PCR产物。

图11. 5' RACE步骤概要
5' RACE比RT-PCR更具有挑战性，特异性也较低，因为只有一个引物是基因特异性的。5' RACE的产物可能是单一产物、多个产物，甚至是不能分辨的连续条带。结果的质量取决于用来合成第一链和扩增的GSP的特异性、扩增所使用锚定引物的特异性、目的mRNA的复杂度和丰度及产物的长度。使用巢式引物扩增（最多可以三轮巢式扩增），并在连续几轮扩增中使用长度选择性的扩增产物作为模板可以增加5' RACE的特异性（见第五章，巢式PCR）。增加逆转录保温温度和PCR退火温度，并降低扩增反应中的镁离子浓度可以促进特异性。
5' RACE的灵敏度受所使用的逆转录酶和cDNA 3' 末端抑制cDNA加尾（tailing）的二级结构影响。cDNA的不完全合成降低了全长产物的产量，并导致某些模板产生连续条带。因为SuperScriptⅡ产生更多的全长cDNA，所以可以提高5' 末端序列检测的水平，尤其是对于小于1kb的转录本。双链3' 末端和发卡结构会通过减少用于加尾的3' 羟基而破坏cDNA的加尾。cDNA的起始保温温度在94℃并随后在冰上冷却有助于破坏二级结构。一些困难模板可能需要加入DMSO辅助加尾（图12）。加尾酶末端脱氧核苷转移酶可以耐受最多20％的DMSO。
  图12. 5'RACE
在45℃使用SuperScriptⅡ从5μg Hela总RNA合成cDNA。10μl纯化的cDNA在10％DMSO中加尾。使用人tuberous scleosis的引物和ELONGASE® Enzyme Mix（初步PCR 2.8kb；泳道1）对1μl加尾反应产物直接扩增40个循环。在2.8kb条带周边移取10μl的凝胶。使用1μl限定大小的PCR产物进行巢式PCR（巢式PCR 2.7kb；泳道2）。凝胶使用SYBR® GreenⅠ染色。

巢式PCR后如果看不到产物或仅观察到连续条带，可以使用Southern印迹检测产物。这需要了解序列内部信息以制备探针。
仅扩增全长cDNA末端的高级RACE方法
为了获得全长的cDNA 5'及3'末端序列，许多研究人员使用称之为cDNA末端快速扩增，或RACE的方法。传统的RACE方法得到的PCR产物含有全长及断裂的cDNA产物。GeneRacerTM试剂盒确保只得到含有全长cDNA末端的完整序列，使您得到更高效的结果并节省时间。
GeneRacer™的优点
确定一个基因的全长序列对于研究异源转录起始和得到用于蛋白表达的开放阅读框至关重要。GeneRacer™是一种高级RACE技术，提高了扩增全长cDNA末端序列的效率。使用GeneRacerTM试剂盒，可以得到
•  完整序列
  克隆基因片段的全长5'和3'末端以构建完整的cDNA序列
•  灵敏
  得到每个细胞中拷贝数低至30的稀有转录本的全长5'和3'末端
•  长度
  可以由转录本得到长度至少为9kb的cDNA

仅通过一轮PCR反应就可以得到这些结果。一般不需进行巢式PCR。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 10:46

全长5'末端选择
传统的RACE会得到多个PCR结果，因为其所使用的cDNA来源于断裂及全长mRNA。研究人员必须鉴定每一个 PCR 产物以获得带有全长5′末端序列的产物。GeneRacer™ 只针对全长的5′加帽mRNA，从而节省了花费在筛选大量PCR产物上的时间。图13 示意GeneRacerTM 的工作原理。RNA样品经CIP和TAP处理，保证GeneRacer™ 寡聚RNA仅同全长转录本连接。然后使用SuperScriptⅡ逆转录酶对这些转录本逆转录，得到的cDNA做为PCR的模板。GeneRacer™ 寡聚RNA序列做为GeneRacerTM 5′引物结合位点，这样，只有具有全长5′末端的cDNA才会被扩增。使用GeneRacer™ 步骤及高保真度Platinum® Taq DNA聚合酶，就可以确保得到最高效的实验结果。
图13 GeneRacer™步骤

图14 稀有转录本和长转录本的扩增结果

3.5mg Hela总RNA经GeneRacer™步骤处理，利用GeneRacer™的Oligo dT引物和SuperScriptⅡ™得到cDNA，然后使用GeneRacerTM 5′引物和基因特异性的引物PCR扩增。基因经过30-35个循环的一轮PCR扩增。50ml PCR扩增产物中的15ml在1.2％E-Gel® 琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外光下观察。
泳道1: HPRT（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶），1.3kb，30拷贝/细胞
泳道2:  SMAP（胸腺激素受体共激活蛋白），3.1kb
泳道3:  Cleavage and polyadenylation specificity factor，4.5kb
泳道4:  TFRC（转铁蛋白受体），5.0kb
泳道5:  IGFⅡR（类胰岛素生长因子Ⅱ受体），9kb，5′末端GC含量90%

敏感性和扩增长度
为了说明GeneRacer™试剂盒获取全长5′末端的能力，我们扩增了带有已知转录起始位点的基因的5′末端。使用总RNA，遵循GeneRacer™步骤，我们扩增了一个长转录本（9kb）和一个浓度为0.01%，即30拷贝/细胞的稀有mRNA。
长度超过GenBank序列
除了可以获得已知转录起始位点基因的全长5′末端，GeneRacer™还可以获得未知转录起始位点基因的5′末端。将GeneRacer™所得到的序列同GenBank列出的mRNA序列相比较，GenBank的序列一般来源于使用传统方法构建的文库中的cDNA，这导致末端核苷酸的缺失。从表4可以明显看出，使用GeneRacer™得到的5′cDNA末端要比GenBank中列出的序列长16到116碱基。
Gene  GenBank Number(mRNA)  Size(kb)  GeneRacer™ Sequence Beyond GenBank
Heterogeneous nuclear ribonuclear protein complex K protein(hnRNP K) S74678  2.3  +62
Subunit for coatomer complex  X70476  3.1  +38
Muscle phosphofructokinase(PFKM)  M26066  2.8  +16
ADP-ribosylation factor 4(ARF4)  M36341.1  1.5  +116
Isoleucil-tRNA synthetase  U04953  4.5  +49
Putative tumor suppressor(LUCA 15)  U23946.1  2.6  +81
Thyroid hormone receptor coactivating protein(SMAP)  NM_006696.1  3.1  +52
Cleavage and polyadenylation specificity factor  U37012.1  4.5  +57
Human insulin-like growth factor 2 receptor  NM000876  9.0  +44

表4说明
列出的基因使用GeneRacer™步骤扩增。PCR产物使用S.N.A.P.凝胶回收柱回收并克隆至pCR®4-TOPO®载体（Invitrogen）。对每一个基因都随机挑选了12个克隆并测序。序列同GenBank数据库中的序列相比较，确定5′末端超出的序列。使用每个基因所获得的最长序列比较统计超出GenBank序列第一个碱基的超出碱基的数目。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 10:47

获得全长的cDNA序列
GeneRacer™试剂盒确保您成功获得mRNA转录本的全长5′和3′序列。每个GeneRacer™试剂盒中包含CIP、TAP、RNA连接酶、SuperScriptⅡ™ 逆转录酶等酶类及其缓冲液，GeneRacer™寡聚RNA，GeneRacer™ Oligo dT引物，GeneRacer™ PCR引物及RNase抑制剂。同时试剂盒中还包括S.N.A.P.凝胶纯化柱以纯化PCR产物，还有TOPO Cloning® 试剂盒以进行下游测序。使用GeneRacerTM 试剂盒，您可以高效地得到全长的cDNA 5′和3′末端序列，而不必浪费时间筛选部分缺失或断裂的序列。
mRNA表达定量
mRNA表达定量是一种挑战性的RT-PCR，但是提供了超越传统RNA分析方法的优点。RT-PCR比Northern印迹或核酸酶保护分析更灵敏，需要的RNA量及序列信息较少。但是RT-PCR涉及两个酶反应，这会导致RT-PCR产物量的波动。RNA转化成cDNA的量会影响产量，但定量PCR的主要困难是PCR的指数增长的特点，样品间很小的差异会被转化成产物产量间很大的差异。两个常用的mRNA丰度定量方法是竞争性定量PCR和实时PCR。
在竞争性PCR中，逆转录之前加入一个外源的RNA转录本（内部标准RNA）作为样品间差异的对照。内部标准RNA被逆转录并同目的模板一起扩增，作为cDNA转化和扩增效率差异的对照。通过将特异性的目的序列同已知浓度的内部标准RNA一起扩增进行定量。通过比较由内部标准获得的信号和目的模板所获得的信号可以确定目的模板的丰度。
内部标准RNA同目的模板有同样的引物识别位点。有几种现行的方法可以得到内部标准。最简单的方法是使用PCR在非特异性的spacerDNA上建立引物识别位点。产物可以克隆至带有T7或SP6 RNA聚合酶启动子的载体上，或者将RNA启动子序列加到正向引物，从而可以通过PCR构建序列。然后可以通过体外转录得到RNA标准。竞争性定量PCR可以使用GSP在一步法RT-PCR中进行，或使用GSP或oligo(dT)在两步法RT-PCR中进行。可以向反向引物中加入poly(dT)序列得到oligo(dT)序列。
竞争性RT-PCR是一种终点分析法，需要目的模板和内部标准的扩增效率相同。需要预先了解起始目的模板的部分信息以建立内部标准的浓度范围。为了精确定量，需要进行内部标准比目的模板多及少的反应。
实时RT-PCR是非竞争性的，在产物形成的同时就进行了检测。几种探针可以用于产物量的分析，如荧光标记的5'核酸酶探针和Molecular Beacon。第一种方法基于Taq DNA聚合酶的5'核酸酶活性，其可以切除延伸过程中在分支点的杂交探针。分析使用两种荧光标记的探针，一种染料作为报告基团，另外一种在探针被切除时淬灭信号。
Molecular Beacon包含一个5' flurophore和3' quencher。这些探针设计有一个带有荧光的发卡结构和紧邻的quencher以淬灭荧光。主干结构包括5到7个核苷且富含GC。外层环状结构包含15到30个核苷且同把序列互补。当存在靶序列时，molecular beacon同靶序列结合，发卡结构松散开，从而产生荧光。
对于两种探针，使用与光激发检测装置耦联的PCR仪，在PCR的每个循环实时检测荧光。发出的荧光的量同PCR产物的量成正比。当释放的荧光的量超出了一个制定的荧光基线，这个循环称为阈循环或CT。CT同起始目的模板的量成反比。因此，高拷贝数的样品会有一个低的CT值，而低拷贝数对应高CT值（图15）。
图15. 眼癌mRNA的实时PCR定量

使用Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step System（在60℃进行cDNA合成）对Hela总RNA的相同两份样品进行PCR。在ABI Prism® 7700上使用FAM标记的Molecular Beacon探针（400nM）进行检测。A组. PCR期间两份样品的相对荧光密度。B组. 标准曲线。

为了对mRNA进行绝对定量，可以使用体外转录RNA得到标准曲线。通过不同浓度的体外转录RNA可以确定CT值。然后CT值可以同RNA浓度作图得到标准曲线，以定量未知样品的表达水平（图15，B组）。
实时RT-PCR提供了超越竞争性RT-PCR的优点。通过对大范围目的模板浓度进行线性剂量响应（图15），荧光监测高度灵敏，高度精确。样品不需要进行扩增后分析，仅需要预先知道很少的目的模板的丰度信息。可以使用两步法RT-PCR对一个RNA样品中的多个mRNA定量，在处理大量样品时，为了方便，可以使用一步法。
脱颖而出的定量RT-PCR
Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统整合了最好的逆转录和PCR技术，提供了全方位的高品质。其产量、特异性和灵敏度都卓尔不群。您会得到mRNA最精确的实时定量。
如您所需

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 10:50

怎样做才能得到最好的定量RT-PCR（qRT-PCR）结果？把实时定量的逆转录和PCR的领先技术结合在一起就可以了。使用了Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统，您就拥有了两种高品质的酶，ThermoScript™逆转录酶和Platinum® Taq DNA聚合酶，以预先混合的方式，为精确可靠的扩增反应而优化。
高效的cDNA合成
ThermoScript™逆转录酶，一种克隆的鸟类RNase H-逆转录酶，通过基因工程处理，可以在最高65℃进行高特异性的cDNA合成，其最适温度为50℃。因为降低了RNase H活性，ThermoScript™逆转录酶增加了全长cDNA的产量。因为其较高的热稳定性，可以克服高GC含量和RNA二级结构的障碍，在较高温度下进行高效的cDNA合成（图16）。
图16 带有延伸二级结构的富GC RNA的RT-PCR得到高产量

使用ThermoScript™逆转录酶或AMV逆转录酶，根据生产厂商的建议，由10 ng 总RNA合成cDNA。将反应产物的1/10使用高保真Platinum® Taq DNA聚合酶扩增。圈出的带（414bp）表示核糖体大亚基RNA 5'端（84％ GC）含量的扩增。

高产量和特异性
在ThermoScript™逆转录酶后，您会用到Platinum® Taq DNA聚合酶，其在PCR一步中提供了抗体介导的自动热启动功能（图17）。这项技术明显减少了错误配对和非特异性扩增，在高特异性的同时提供了高产量。cDNA合成和扩增的优异结果一起成为成功qRT-PCR的基础。
图17 室温条件下DNA聚合酶活性的完全抑制

对Taq DNA聚合酶和Platinum® Taq DNA聚合酶的活性分析在37℃进行5个小时。

一步得到高灵敏度
Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统提供的步骤可以高灵敏度地检测起始物质。仅需在反应混合物中加入总RNA或poly(A)＋，基因特异性逆转录和扩增引物及荧光探针，然后就可以开始实验了。您可以精确定量到最低10个目的RNA分子或从1pg总RNA（图18）。除了高特异性外，一步法步骤减少了反应变量，降低了污染可能性，适合高通量应用。
图18 一步法RT-PCR

β-actin mRNA的定量。使用Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统扩增六份不同量的Hela总RNA，然后在ABI PRISM® 7700上，使用6-FAM标记的TaqMan®探针检测。使用了TAMRA做为报告信号（Rn）均一化的被动参考。

超越竞争对手
总而言之，领先的逆转录和PCR技术同一步法整合在一起会尽您所需，产量、特异性和灵敏度，得到高水平的qRT-PCR。图19将使用Platinum®Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统与使用竞争者系统得到的结果做了比较。Platinum®系统表现出更低的Ct（阈循环）和更高的产量，使其对于检测低拷贝的mRNA转录本更敏感。
图19 使用Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统获得高产量

使用Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统（蓝点）或竞争对手P的Quantitative One-Step RT-PCR系统（红点），按生产厂商的建议，对145bp的β-actin片段进行qRT-PCR分析。起始RNA从5μg到50fg按10倍递增变化。使用TAMRA做为被动参考收集均一化的相对荧光（Rn）。图版A：线性量扩增图。图版B：标准曲线图。

获得一步法的成功

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 10:58

Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™ One-Step系统提供了实时定量中领先的逆转录和PCR技术。

第五章增加PCR特异性
引物设计
细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点：
*  典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。
*  选择GC含量为40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。
*  设计5'端和中间区为G或C的引物。这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性。
*  避免引物对3'末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。
*  避免3'末端富含GC。设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。
*  避免3'末端的错误配对。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
*  避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。

目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。当计算引物Tm值时并不包括这些序列，但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测。
有时候，仅有有限的序列信箱可供用于引物设计。比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物。简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。不要在引物的3'端使用简并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。
引物退火温度
引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）。这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度。Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
设定Tm有几种公式。表5列出确定引物Tm最常用的两种方法。第一个公式来源于高盐溶液中的杂交，适用于小于18碱基的引物。第二个公式根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。
表5. 估算Tm的公式

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 10:58

根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃。或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。
递减PCR
递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm 5℃。只有同同源性最高的目的模板会被扩增。这些产物在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非特异性产物排挤出去。递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法较为有用，如AFLP DNA指纹分析。
引物浓度
引物的浓度会影响特异性。最佳的引物浓度一般在0.1到0.5μM。较高的引物浓度会导致非特异性产物扩增。为了确定引物浓度，可以在260nm（OD260）测量光密度值。然后使用光吸收值和微摩消光系数的倒数（nmol/OD），通过Beers法则（公式1）计算引物浓度。微摩消光系数可以使用公式2计算。与大分子双链DNA可以使用平均消光系数不同，确定引物的精确浓度必须使用计算的消光系数。这是因为引物较短，碱基组成差异很大。在Gibco/BRL定制引物的质检报告中包含了消光系数（OD/μmol）和消光系数的倒数（μmol/OD）。另外，不要使用寡聚核苷酸作为标准，在EB染色的胶上估算引物浓度，因为引物和标准的染色能力根据序列不同而差异很大。
公式1

公式2

引物纯度和稳定性
定制引物的标准纯度对于大多数PCR应用是足够的（表6）。使用Invitrogen™ Parallel Array Synthesis™技术，不必除盐。同其他方法相比，在Parallel Array Synthesis™技术中，通过脱盐而除去的苯甲酰基和异丁酰基很少，因此不会干扰PCR。部分应用需要纯化，以除去在合成过程中的任何非全长序列。这些截断序列的产生是因为DNA合成化学的效率不是100％。这是个循环过程，在每个碱基加入时使用重复化学反应，使DNA从3'到5'合成。在任何一个循环都可能失败。较长的引物，尤其是大于50个碱基，截断序列的比例很大，可能需要纯化。
表6. 用于PCR应用的引物最低建议纯度

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 10:59

Application  Minimum Suggested Purity
PCR  Standard
First-strand cDNA synthesis for RT-PCR  Standard
AFLP® technology  Standard
PCR using primers with 5' sequences(restriction endonuclease sites,RNA polymerase promoter sites,etc)  Cartridge
PCR primers > 50bases  PAGE
Cycle sequencing  Standard
Isothermal sequencing  Desalted
Site-directed mutagenesis  Cartridge
CFLP™ techmology  Desalted

引物产量受合成化学的效率及纯化方法的影响。Invitrogen?以一个最小OD单位确保总寡核苷的产量（表7）。定制引物以干粉形式运输。最好在TE重溶引物，使其最终浓度为100μM。TE比去离子水好，因为水的pH经常偏酸，会引起寡核苷的水解。
表7. 各种纯化方法的最低寡核苷酸产量

  Minimum Yield(OD) for Different Primer Purities*
Number of Bases  Synthesis Scale  Standard/Desalted  Cartridge  HPLC  PAGE
大于20  50nmole  2  2  NA  NA
  200nmole  8  8  3  1
  1µmol  20  20  10  3
  10µmol  200  NA  100  30
大于等于20  50nmole  5  2  NA  NA
  200nmole  20  10  3  1
  1µmol  50  25  15  5
  10µmol  500  NA  150  50

Note:For primers > 50 bases, PAGE purification is recommended and HPLC is not an option.
NA is not available.
*These Yields are seen with the following 5' modifications: biotin, fluorescein(FITC), rhodamine, primary amines(NH2), phosphate(PO4), HEX, TET, FAM, and phosphorothioates(S-Oligos), Other modifications may have slightly lower yields.

引物的稳定性依赖于储存条件。应将干粉和溶解的引物储存在-20℃。以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月，但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周。干粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月。
热启动
热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。尽管Taq DNA聚合酶的最佳延伸温度在72℃，聚合酶在室温仍然有活性。因此，在进行PCR反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物。这些非特异性产物一旦形成，就会被有效扩增。在用于引物设计的位点因为遗传元件的定位而受限时，如定点突变、表达克隆或用于DNA工程的遗传元件的构建和操作，热启动PCR尤为有效。
限制Taq DNA聚合酶活性的常用方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪。这种方法简单便宜，但并不能完全抑制酶的活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。
热启动通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度。包括延缓加入Taq DNA聚合酶在内的大部分手工热启动方法十分烦琐，尤其是对高通量应用。其他的热启动方法使用蜡防护层将一种基本成分，如镁离子或酶，包裹起来，或者将反应成分，如模板和缓冲液，物理地隔离开。在热循环时，因蜡熔化而把各种成分释放出来并混合在一起。象手动热启动方法一样，蜡防护层法比较烦琐，易于污染，不适用于于高通量应用。
Platinum DNA聚合酶对于自动热启动PCR来说方便高效（图20）。Platinum Taq DNA聚合酶的成分为复合有抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体的重组Taq DNA聚合酶。抗体在PCR配制以及在室温的延时保温过程中抑制酶的活性。Taq DNA聚合酶在变性步骤的94℃保温过程中被释放到反应中，恢复了完全的聚合酶活性。同经化学修饰用于热启动的Taq DNA聚合酶相比，Platinum酶不需要在94℃延时保温（10到15分钟）以激活聚合酶。使用Platinum Taq DNA聚合酶，在94℃进行2分钟就可以恢复90％的Taq DNA聚合酶活性。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 11:00

图20. 使用Platinum® Taq DNA聚合酶增加特异性
A组. 人基因组DNA内克隆的HIV DNA的检测。带有HIV gag区域的1000个质粒DNA拷贝同100ng的基因组DNA混合，使用gag区域的引物进行扩增。泳道1. 使用Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。泳道2. 使用Taq DNA聚合酶，通过在94℃加入酶而手工热启动。泳道3. 使用Platinum Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。B组. 由100ng人基因组DNA扩增4.1kb的人β-球蛋白。泳道1. 使用Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。泳道2. 使用Taq DNA聚合酶，在冰上配制反应液并放置在预热（80℃）的PCR仪。泳道3. 使用Platinum Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。

镁离子浓度
镁离子影响PCR的多个方面，如DNA聚合酶的活性，这会影响产量；再如引物退火，这会影响特异性。dNTP和模板同镁离子结合，降低了酶活性所需要的游离镁离子的量。最佳的镁离子浓度对于不同的引物对和模板都不同，但是包含200μM dNTP的典型PCR起始浓度是1.5mM（注意：对实时定量PCR，使用3到5mM带有荧光探针的镁离子溶液）。较高的游离镁离子浓度可以增加产量，但也会增加非特异性扩增，降低忠实性。为了确定最佳浓度，从1mM到3mM，以0.5mM递增，进行镁离子滴定。为减少对镁离子优化的依赖，可以使用Platinum Taq DNA聚合酶。Platinum Taq DNA聚合酶能够在比Taq DNA聚合酶更广的镁离子浓度范围内保持功能，因此仅需较少的优化（图21）。

图21. 使用Platinum® Taq DNA聚合酶拓宽镁离子浓度范围
由100ng人基因组DNA扩增人β-球蛋白基因的2.8kb区域。A组，使用Taq DNA聚合酶，在冰上配制反应液并放置在预热（80℃）的PCR仪。B组，使用Platinum Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。

促进PCR的添加剂
退火温度，引物设计和镁离子浓度的优化足以对大多数模板进行高特异性的扩增，但是，某些模板，包括高GC含量的模板，需要其他的措施。影响DNA熔解温度的添加剂提供了提高产物特异性和产量的另外一种方法（图22）。为获得最好的结果需要模板的完全变性。另外，二级结构会阻止引物结合和酶的延伸。PCR添加剂，包括甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱以及PCRx Enhancer Solution可以增强扩增。它们可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。PCRx Solution还有其他优点。在同Platinum Taq DNA聚合酶（图22）和Platinum Pfx DNA聚合酶一起使用时，基本上不需要优化镁离子浓度。这样，将Platinum技术同添加剂结合，增强了特异性，同时减少了第三种方法-镁离子优化的依赖。为获得最佳结果，应优化添加剂的浓度（图23），尤其是会抑制Taq DNA聚合酶的DMSO，甲酰胺和甘油。

图22. 使用PCRx Enhancer Solution提高特异性
使用Platinum® Taq DNA聚合酶，由100ng人基因组DNA扩增一条156bp的片段（GC含量62％）。使用标准PCR缓冲液（A组）或带有1×PCRx Enhancer Solution的PCRx Amplificaton Buufer（B组），测试不同的MgCl2浓度（泳道1到4分别为1.0，1.5，2.0，2.5mM）。循环在94℃ 30秒，60℃ 30秒，68℃ 1分钟进行35个循环。

图23. 测试PCRx Enhancer Solution的不同浓度
在带有不同量PCRx Enhancer Solution（0到4×）的1×PCRx Amplificaton Buufer中，使用Platinum® Taq DNA聚合酶，对包含三核苷重复的149bp序列（GC含量78％）进行扩增。

巢式PCR
使用巢式引物进行连续多轮扩增可以提高特异性和灵敏度。第一轮是15到20个循环的标准扩增。将一小部分起始扩增产物稀释100到1000倍加入到第二轮扩增中进行15到20个循环。或者，也可以通过凝胶纯化将起始扩增产物进行大小选择。在第二轮扩增中使用一套巢式引物，其可以同第一套引物内侧的靶序列结合。巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同两套引物都互补的靶序列很少。而使用同样的引物对进行总数相同的循环（30到40）会扩增非特异性靶位点。巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5' RACE）的特异性。

第六章增加PCR灵敏度
模板质量
模板的质量会影响产量。DNA样品中发现有多种污染物会抑制PCR。一些在标准基因组DNA制备中使用的试剂，如SDS，在浓度低至0.01％时就会抑制扩增反应。分离基因组DNA较新的方法包括了DNAZol，一种胍去垢剂裂解液，以及FTA Gene Guard System，其可以同基质结合，在血液及其他生物样品中纯化贮存DNA（表8）。
表8. 基因组DNA分离方法

Method  Description
Proteinase K/phenol extraction  Classic method
DNAzol® Reagents  Fast, phenol-free DNA isolation

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 11:01

模板浓度
起始模板的量对于获得高产量很重要。对大多数扩增满意，104到106个起始目的分子就足以在溴化乙锭染色胶上观察到。所需的最佳模板量取决于基因组的大小（表9）。举例说，100ng到1μg的人类基因组DNA，相当于3×104到3×105个分子，对于足以检测到单拷贝基因的PCR产物。质粒DNA比较小，因此加入到PCR中的DNA的量是pg级的。
表9. 基因组大小和分子数目的比例

Genonic DNA  Size(bp)*  Target Molecules/µg of Genomic DNA  Amount of DNA(µg) for -10^5 Molecules
E. coli  4.7×10^6  1.8×10^8  0.001
Saccharomyces cerevisiae  2.0×10^7  4.5×10^7  0.01
Arabidopsis thaliana  7.0×10^7  1.3×10^7  0.01
Drosophila melanogaster  1.6×10^8  6.6×10^5  0.5
Homo sapiens  2.8×10^9  3.2×10^5  1.0
Xenopus laevis  2.9×10^9  3.1×10^5  1.0
1.0Mus musculus  3.3×10^9  2.7×10^5  1.0
Zea mays  1.5×10^10  6.0×10^4  2.0
pUC 18 plasmid DNA  2.69×10^3  3.4×10^11  1×10^(-6)
*Haploid genome size

酶的选择
除了使用高质量模板DNA，聚合酶的选择也会影响产量（见第十三章，PCR聚合酶的比较）。Platinum聚合酶比其他聚合酶产量高，因为它防止了PCR反应配制过程中的非特异性扩增（图24）。对长片段（最大到12kb）的高灵敏度PCR，应选择酶混合物，最好是Platinum形式，如Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity。这种酶结合了Platinum技术和酶混合物（Taq DNA聚合酶同带有校正功能的聚合酶混合物）的优点。

第七章提高忠实性
带有校正功能的酶
包括克隆和效率分析，PCR产物表达或定点突变在内的PCR应用都需要高忠实性的PCR。Taq DNA聚合酶被看做是低忠实性的聚合酶，因为其缺少3'到5'外切核酸酶（校正）活性。使用带有3'到5'外切核酸酶活性的热稳定聚合酶可以提高忠实性。但是这些聚合酶的产量比Taq DNA聚合酶低。Platinum Pfx DNA聚合酶明显比Taq DNA聚合酶忠实性高，而且带有Platinum产品产量和特异性高的优点（图25）。

图25. Platinum® Pfx Taq DNA聚合酶的高灵敏度和特异性
使用人thrombospondin的1.1kb片段的探针对基因组DNA（泳道1到6分别为100，50，10，5，1和0ng）扩增35个循环。A组，使用1单位Platinum Pfx Taq DNA聚合酶，在室温配制反应液。B组，使用2.5单PfuTurbo™ DNA聚合酶，在冰上配制反应液。C组，使用1单位Taq DNA聚合酶，在冰上配制反应液。

酶混合物
将Taq DNA聚合酶同带有3'到5'外切核酸酶活性第二种聚合酶混合在一起可以获得比单独Taq DNA聚合酶高的忠实性，并可以得到高产量及扩增长模板。Gibco BRL高保真酶混合物，Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity忠实性是单独Taq DNA聚合酶的6倍，并可以最高扩增到12kb。
其他参数
除了酶，高浓度的dNTP或镁离子会降低忠实性。将dNTP的浓度从200μM降低到25-50μM可以增加精确度。如果四种核苷的浓度不同，忠实性会受影响。进行较少的PCR循环也会有助于增加忠实性，因为增加循环数目和产物长度就会增加突变可能性。

第八章其他需要考虑的事情
扩增长目的片段
当扩增大于5kb的目的片段时，可以使用用于超长PCR的酶或酶混合物以获得最佳产量（参见第十三章，PCR聚合酶的比较和图24）。Taq DNA聚合酶并不能有效扩增较长目的片段（大于5kb），可能是因为其缺少3'-5'外切核酸酶活性，不能纠正dNTP错误掺入。错误配对的延伸几率大大降低，减少了较长产物的产量。将Taq DNA聚合酶同带有3'-5'外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶混合，可以扩增最高为30kb的目的片段。Platunum Pfx DNA聚合酶（带有3'-5'外切核酸酶活性）也可以扩增较长产物（≤12kb）。
除了选用正确的热稳定DNA聚合酶，较长产物的扩增还需要改变标准步骤的延伸时间、变性时间、缓冲液pH。按1分钟/kb增加延伸时间使聚合酶完成合成。一般对于有效的超长PCR，延伸温度会低至68℃。因为延伸时间较长，对于20kb的模板高达20分钟，所有使用较高起始pH的缓冲液。如果pH将至低于pH7.0，DNA会脱嘌呤。为了防止模板损伤，在每个循环将94℃变性时间减少到30秒或更短，将在扩增前温度增加到94℃变性温度的时间限制为小于等于1分钟。引物使用标准方法所使用的同样的方法设计，使用18到24个碱基得到较好的产量。
防止残余（Carry-over）污染

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 11:02

PCR易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染。这称之为残余污染。从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源。
可以在PCR过程中使用良好的实验步骤减少残余污染。使用抗气雾剂移液管的阻止气雾剂进入eppendorf管内。为PCR样品配制和扩增后分析设计隔离的区域，在准备新反应前更换手套。总是使用不含有模板的阴性对照检测污染。使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。
一种防止残余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。这种酶（也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在扩增过程中将脱氧尿嘧啶替换为胸腺嘧啶使得可以把前面的扩增产物同模板DNA区分开来。因为前面的扩增产物对UDG敏感，所有可以在PCR前对新配制的反应用UDG处理以破坏残余产物。
PCR产物纯化
残余反应成分包括抑制克隆，测序和标记反应的引物，核苷和热稳定聚合酶。因此，一般在进一步操作之前需要纯化PCR产物。包括多次酚：氯仿抽提及随后的PEG沉淀或异丙醇沉淀的纯化步骤虽然有效，但是耗费时间，且会丢失产物。Maligen Rapid PCR Purification System在10分钟内从反应成分中纯化PCR产物。它对80bp到10kb很大范围的PCR片段都有效，有效回收95％的原有样品（图26）。
  图26. 扩增后PCR片段的纯化
  使用1.2μg引物（泳道1）或3.5μg引物（泳道2）。峰值包含约1μg扩增产物的完整PCR体系。引物36到40碱基长。将峰值反应纯化，对纯化前（泳道A）和纯化后（泳道B）的洗脱液水相使用琼脂糖凝胶电泳分析。

部分PCR产物可能需要通过凝胶电泳，和影响克隆和测序的非特异性PCR产物分离纯化出来。使用Maligen Gel Extraction System将目的产物从琼脂糖中纯化出来，这是一种基于硅土的，从凝胶中快速纯化DNA片段的技术

第九章 PCR应用
多重PCR
在多重PCR中，同时使用多对引物扩增几个不同的位点。这种复杂的PCR一般会导致低产量，而且需要高浓度的Mg2+。如果没有正确优化，容易出现假阳性。Platinum Taq DNA聚合酶经改良，可以适应广谱浓度的Mg2+，从而提高多组反应成功的可能性（图27）。

图27. 对于多重PCR，Platinum® Taq DNA聚合酶提供了更好的灵敏度
使用Taq DNA聚合（A组）酶或Platinum Taq DNA聚合酶（B组），利用5个不同的引物对，从人基因组DNA对dystrophin基因进行多重PCR。使用所示引物和模板浓度，从人基因组DNA中得到268bp到547bp范围的扩增产物。

使用双核苷重复标记物确定基因型
确定扩增的双核苷重复区域的大小较难，因为Taq DNA聚合酶经常在PCR产物中加入非模板核苷。在扩增反应中包含一个多余核苷的产物部分决定于序列和引物，并且差异很大。但Platinum GenoTYPE Tsp DNA聚合酶表现出最小的非模板核苷掺入，有助于增加等位基因长度决定的精确度（图28），仅需要用Platinum GenoTYPE Tsp DNA聚合酶替换在这些反应中所使用的Taq DNA 聚合酶就可以。

图28. DNA聚合酶对双核苷重复标记进行基因定型的比较
使用Taq DNA聚合酶或Platinum GenoTYPE DNA聚合酶对拟南芥nga 106位点的扩增结果

检查多态性的工具
AFLP技术是一种用来对植物和微生物基因组DNA进行指纹分析的技术（图29）。RFLP、AP-PCR和RAPD也是同样的DNA指纹分析技术。RFLP是一种基于杂交的技术，其费时费力并需要大量基因组DNA。AP-PCR和RAPD是较快的，基于PCR的方法，但是都对反应条件很敏感，从而影响可重复性。
图29. AFLP分析系统图解

AFLP技术结合了RFLP的可信性和基于PCR的指纹分析技术的简便性，从而使其成为一种易于获取信箱的方法。用AFLP技术得到的指纹分析可以作为鉴定DNA样品或分析样品间相似性的工具（图30）。
  图30. 典型的AFLP指纹分析
  使用AFLP系统Ⅰ和EcoRⅠ+ACC及Mse+CAA选择性引物对大豆生态型多态性进行分析。泳道1到9分别为生态型：Holladay; Morgan; Hytest; Essex; Bass; T135; P88; P188788; P83; P183495; P90; P190763。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 11:02

很多参数会影响AFLP的结果，包括引物中选择性核苷的数目。当选择性核苷增加时，扩增条带的数目就会减少。较大的基因组需要较多的选择性核苷，以扩增恰当数量的DNA，因为酶切较大的基因组DNA会得到更多的限制性酶切片段。
模板质量也会影响AFLP结果。模板质量差会抑制限制性内切酶，从而导致不完全酶切而在凝胶上看到很少的扩增条带。AFLP可以适应模板浓度的变化，使用100ng到5μg的DNA之间观察不到差异。
高产量，特异和灵活的定量PCR试剂体系
Platium® Quantitative PCR SuperMix-UDG（qPCR）同竞争对手的定量PCR体系相比提供了更优异的结果。使用这种产品，您可以在您的PCR中得到更好特异性和更高的灵敏度，同时可以灵活地选择您所喜欢的扩增条件，检测方法和设备。
实时定量PCR是快速增长的PCR方法，它可以精确、可重复地定量起始物质。Platium® Quantitative PCR SuperMix-UDG是一种方便使用的反应混合液，为定量分析进行了优化。它包含了PCR所必须的成分（如缓冲液，核苷酸，聚合酶）。只需加入您的模板，扩增引物和荧光标记探针。您就可以得到实时qPCR所需的特异性和灵活性。
高产量和特异性的扩增
Platium® Quantitative PCR SuperMix-UDG提供了强大的PCR扩增，可以使用多个模板组。所使用的Platium® Taq DNA聚合酶具有抗体介导的热启动特性。这极大地降低和消除了错误配对和非特异性扩增，使您得到较高产量，并增加特异性。整合的UDG（尿苷酸DNA糖基化酶）防止残余污染的能力防止了非模板DNA的扩增，从而降低了假阳性，使结果更可靠
超越竞争者
在产量和灵敏度方面，Platium® Quantitative PCR SuperMix-UDG都超越了竞争对手。在ABI Prism® 7700上，Platium® SuperMix-UDG比Universal MasterMix的灵敏度高2Ct（阈循环）。您可以更精确地定量低拷贝的基因，并在较宽的目的浓度范围内检测线性剂量反应（图31）。

图31. 使用Platium® Quantitative PCR SuperMix-UDG得到更高的产量和灵敏度
利用竞争对手的Unviersal PCR Master Mix（蓝点）或Platium® Quantitative PCR SuperMix-UDG（红点），使用200nM的各种引物和100nM TaqMan®探针对人类基因组DNA（1pg-1μg）扩增。在室温下配制反应体系。在50℃进行UDG保温2min。PCR反应在95℃ 10min，50℃ 2min，然后95℃ 15s和60℃ 1min进行50个循环。

高度灵活性
除了灵敏度和特异性外，Platium® Quantitative PCR SuperMix-UDG在分析设置，检测方法和设备上给你提供了较高的自由度。使用Platium® SuperMix-UDG，您可以：
对扩增的不同模板优化镁离子浓度，由于提供了附加的氯化镁，所以您可以方便地配置SuperMix体系。
可以在多种设备上使用，如ABI Prism® 7700, ABI GeneAmp® 5700和Bio-Rad的I-Cycler。
可以利用多种检测方法的优点，包括TaqMan®探针和Molecular Beacon，您不必局限于特定的试剂盒。

第十一章 PCR扩增产物表达的快速方法
使用Directional TOPO表达试剂盒把克隆基因转入到表达载体，将节省你大量时间。这些试剂盒具有快速，高效的特点，Directional TOPO克隆技术结合高效的pET和pcDNA3.1载体中，使你从PCR中立即得到表达结果。
• 成熟的技术
Directional TOPO克隆技术将平整末端的单向克隆的PCR产物转入pET或pcDNA3.1载体，使用Directional TOPO克隆表达试剂盒将使你：
节省时间——TOPO克隆PCR产物只需要5分钟。
得到高质量的克隆结果——大于90%的重组克隆表达出正确的排列。
完成高水平表达——载体携带强大的表达启动子。

• 节省工作时间
Directional TOPO克隆试剂盒用拓朴异构酶Ⅰ代替了连接酶，传统的限制性内切酶过夜孵育的克隆方法被只需5分钟的拓朴异构酶介质连接的方法代替，这样大缩短了你的工作时间。pET和 pcDNA3.1试剂盒和Directional TOPO试剂盒提供了线性的和无需介质就具有活性的拓朴异构酶I的载体。Directional TOPO试剂盒的全部克隆程序，只有三步并且90%以上的重组克隆表达出正确的排列。省略了克隆和筛选的步骤，大大加快了实验步伐。
图33 Directional TOPO® Cloing

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 11:13

1. 用CACC设计引物5’端(引物3’端不用改动)
2. 用有校正功能的聚合酶扩增基因

3. 用Directional TOPO连接载体与PCR产物混合并转移到E.coli和平板

• E.coli(大肠杆菌)表达的快速方法
在短时间内你就可以从PCR中得到E.coli的表达子， Directional TOPO克隆连接了三个pET载体：pET100/D-TOPO，pET101/D-TOPO，pET102/D-TOPO（图34）。
图34 Directional TOPO连接的pET载体

高效的pET载体：
三个Directional TOPO pET载体都使用强的IPTC诱导的T7/lac启动子调节在E.coli中的高表达。另外，每个pET载体都提供了简单的蛋白检测和提纯方法或提高蛋白产量的方法（表11）。
表1 Directional TOPO™连接的pET载体的融合配对

载体  位置融合标签优点
pET100/D-TOPO  N-端  Xpress™,6xHis  分离检测和提纯标记
pET101/D-TOPO  C-端  V5, 6xHis  检测和提纯
pET102/D-TOPO  N-端  Xpress™, thioredoxin  分离标记提高蛋白转移浓度
  C-端  V5, 6xHis  检测和提纯

经证实的pET表达：
使用Directional TOPO试剂盒连接pET载体，你能够得到和最初的pET载体相同的表达检测结果。与不使用TOPO的对照相比较证实表达结果来自于这些载体。（图35表示表达水平相同）。
图35 Directional TOPO连接的pET载体的表达

用Directional TOPO克隆试剂盒将lacz基因转入到pET100/D-TOPO, pET101/D-TOPO, pET102/D-TOPO并且用限制性消化的方法将克隆连接到没有被连接的pET15b和pET32a的载体上，将载体转移到BL21Star（DE3）E.coli，把每个菌落移植到1ml含有100μg氨苄青霉素的LB培养基中，加入1mM IPTG测OD值，OD600=0.5。测OD值1.5--2小时后将培养物离心，沉淀用300μl样品缓冲液重悬，每个样品取10μl用4-20%Novex?® Tris-Glycine凝胶分析1和2 pET15b/lacz3和4 pET101D-TOPO/lacz5和6 pET100D-TOPO/lacz7和8 pET102D-TOPO/lacz9和10 Pet32a/laczU=Uninduced I=Induced

快速进入哺乳动物细胞的表达
广泛应用的pcDNA3.1载体连接到Directional TOPO克隆上提供了进行哺乳动物表达实验的快速途径。
强大和可信赖的载体：
强大和可信赖的载体 pcDNA3.1在过去的5年一直被成功的使用，并且它在哺乳动物细胞中一直具有高表达结果。如果你使用Directional TOPO连接pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体, 你将得到同样满意的结果。另外Directional TOPO克隆pcDNA3.1/V5-His-TOPO（图36）将提供：
1.  人巨细胞病毒起动子高表达。
2.  简化检测和蛋白提纯方法融合编码的载体C端V5组氨酸标记。
3.  用GENETICIN选择高效的稳定的转染哺乳动物细胞。

图36 Directional TOPO连接的pcDNA3.1载体

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 11:40

可信赖的结果：
使用pcDNA3.1D/V5-His-TOPO产生的表达结果与没有Directioanl TOPO连接的配对物相同。（图37）
图37 pcDNA3.1D/V5-His-TOPOβ-半乳糖苷酶的表达

PCR扩增LacZ基因并且用TOPO克隆试剂盒转入到pcDNA3.1D/V5-His-TOPO。将质粒用标准方法扩增，提纯。然后用磷酸钙的方法将质粒转染到7.5×10^4 COS-7细胞中转染后58小时，收获细胞。将总量10μg的蛋白加到SDS-PAGE凝胶上，用抗β-半乳糖苷酶抗体通过Western blot方法分析表达结果1. 模拟转染（阴性对照）2. pcDNA3.1/V5-His-TOPO/lacz3. pcDNA D/V5-His –TOPO/lacz

快速克隆高水平表达
Directional TOPO试剂盒给你提供了一个将克隆转入E.coli和哺乳动物表达载体的快速方法。将用少量的时间得到大量的表达结果。每个试剂盒有克隆平端PCR产物所需的所有试剂，包括足够的E.coli。

第十二章疑难解答
问题  可能原因  建议解决方法
RT-PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物  RNA被降解  在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。
  RNA中包含逆转录抑制剂  通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。可以加入糖元（0.25μg到0.4μg/μl）以帮助小量样品RNA的恢复。逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，亚精胺，甲酰胺和胍盐。将对照RNA同样品混合，同对照RNA反应比较产量以检验抑制剂。
  多糖同RNA共沉淀  使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。
  用于合成cDNA第一链合成的引物没有很好退火  确定退火温度适合您的引物。对于随机六聚体，建议在反应温度保温之前先在25℃保温10分钟。对于基因特异性引物（GSP），可以试一下其他GSP，或换用oligo(dT)或随机六聚体确定GSP是反义序列。
  起始RNA量不够  增加RNA量。对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。
  RNA模板二级结构太多  将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。
  引物或模板对残余的RNA模板敏感  在PCR前用RNaseH处理。
  靶序列在分析的组织中不表达  尝试其他靶序列或组织
  PCR没有起作用  对两步法RT-PCR，不要在PCR步骤中使用超过1/5的逆转录反应产物
PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物  PCR引物设计较差  避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。
  DNA含有抑制剂  诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNA
  富含GC的模板  对于GC含量＞50％的模板，使用PCRx Enhancer Solution。
  模板浓度太低  使用10^4拷贝的靶序列，以在25到30个循环中获得信号。
  镁离子浓度太低  从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。注意：对实时定量PCR，使用3mM到5mM的镁离子浓度。
  退火温度太高  使用表4的公式估算Tm，把退火温度设定为低于Tm 5℃。因为这些公式只是估算Tm值，所有真正的退火温度实际会高些或低些。
PCR灵敏度：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物  引物浓度太低  最佳引物浓度介于0.1μM到0.5μM之间。为了精确确定引物浓度，在260nm测量光密度，然后使用光吸收值和消光系数计算浓度。（见公式1，2）
RT-PCR特异性：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带  引物和模板非特异性退火  在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。
  GSP设计较差  遵循用于扩增引物设计的同样原则
  RNA中沾染了基因组DNA  使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。
  形成引物二聚体  设计在3'端没有互补序列的引物。
  引物和模板非特异性退火  以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。使用Platinum Taq DNA进行自动热启动PCR。避免在引物3'端含有2到3个dG或dC。
  镁离子浓度太高  对于每一个模板和引物组合优化镁离子浓度。
  因为扩增复杂模板导致引物错误起始  使用巢式PCR或递减PCR。
  沾染外源DNA  使用抗气雾剂的吸头和UDG（见第八章）。
  因为二级结构导致引物结合位点无法接近  对于GC含量＞50％的模板，使用（1×-3×）PCRx Enhancer Solution。
PCR忠实性：PCR在产物序列中引入了错误  聚合酶忠实性低  使用带有校正活性的热稳定聚合酶，如Platinum Pfx DNA聚合酶。
  循环数太多  降低循环数。
  四种dNTP的浓度不同  制备新的dNTP混合物，保证四种核苷浓度相同。使用预混合物。
定量RT-PCR无扩增产量相对荧光信号小于等于背景或没有模板对照  无cDNA合成
  cDNA合成温度太高  降低保温温度
  反转录cDNA产物被二级结构封闭  提高保温温度。重新设计引物
  RNA被损害或降解  必要的话更换RNA
  RNAse污染  维持无菌条件；加入RNase抑制剂
  荧光探针无功能  确保探针设计的有效性和fluorophore和quencher的存在。用DNase处理TaqMan探针，校验荧光是否增强。必要的话设计和合成探针。

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 11:41

灵敏度低须在比预期更高的循环中检出产物  初始模板RNA不充分  增加模板RNA的浓度；使用10ng-1µg的总RNA
  RNA被损害和降解  必要的话更换RNA
  RNAse污染  维持无菌条件；加入RNase抑制剂
  无效的cDNA  通过增加70％乙醇清洗的次数来去除制备RNA过程中的抑制剂
  无效的PCR扩增  注意：反转录的抑制剂包括SDS、EDTA、胍盐、甲酰胺、磷酸钠和亚精胺调整cDNA合成温度或引物设计
信号高于预期在低于预期的循环中即可检出产物  反应中加的样品太多  降低模板的浓度
  模板或PCR残余污染  隔离污染来源，更换试剂使用专用的精致移液器。在无DNA区域准备反应，使用抗气溶胶的吸头。
电泳后出现意外的条带  RNA被基因组DNA污染  用DNase I预处理RNA
  用于第一链合成的寡聚dT或随机引物  使用基因特异性引物
  PCR的低特异性  优化PCR条件

第十三章相关产品
PCR聚合酶的比较

产品  产物长度  产量  特异性  忠实性
Taq DNA Polymerase  ＜5kb  ●  ●  ●
Taq PCRx DNA Polymerase  ＜5kb  ●  ●*  ●
PCR SuperMix  ＜5kb  ●  ●  ●
Platinum® Taq DNA Polymerase  ＜5kb  ●●  ●●  ●
Platinum® Taq PCRx DNA Polymerase  ＜5kb  ●●  ●●  ●
Platinum® PCR SuperMix  ＜5kb  ●●  ●●  ●
Platinum® Quantitative PCR SuperMix-UDG  ＜5kb  ●●  ●●  ●
Platinum® Taq DNA Polymerase  ＜5kb  ●●  ●●  ●
Platinum® Pfx DNA Polymerase  ＜12kb  ●●  ●●*  ●●●●
Platinum® PCR SuperMix High Fidelity  ＜12kb  ●●  ●  ●●●
Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity  ＜12kb  ●●●  ●●  ●●●
Platinum® GenoType Tsp DNA Polymerase  ＜0.5kb  ●  ●●  ●
ELongase® Enzyme Mix  ＜30kb  ●●  ●  ●●
*包含PCRx Enhancer System，对于高GC含量或其他有问题的模板较为理想。

PCR酶

产品  货号  规格
Taq DNA Polymerase，Native  18038-01818038-04218038-067  100单位500单位1500单位(3×500单位)
Taq DNA Polymerase，Recombinant  10342-05310342-01210342-020  100单位250单位500单位
Platinum® Taq DNA Polymerase  10966-01810966-02610966-034  100单位250单位500单位
Platinum® Pfx DNA Polymerase（包括Platinum® Pfx DNA Polymerase，PCRx Enhancer Solution，10×Pfx Amplification Buffer和MgSO4）  11708-01311708-02111708-039  100单位250单位500单位
Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity  11304-01111304-029  100单位500单位
Taq PCRx DNA Polymerase（包括Taq DNA Polymerase，PCRx Enhancer Solution，10×PCR Buffer和MgCl2）  11508-017  500单位
Platinum® Taq PCRx DNA Polymerase（包括Taq DNA Polymerase，PCRx Enhancer Solution，10×Platinum PCR Buffer和MgCl2）  11509-015  500单位
Platinum® GenoType Tsp DNA Polymerase  11448-02411448-04011448-032  250单位500单位2500单位
Platinum® Taq抗体  10965-01010965-028  100单位250单位
PCR SuperMix  10572-014  100反应
Platinum® PCR SuperMix  11306-016  100反应
PCR SuperMix High Fidelity  10790-020  100反应
Platinum® Quantitative PCR SuperMix-UDG  11730-01711730-025  100反应500反应
PCR Reagent System  10198-018  100反应
ELongase Amplification System  10481-018  100反应
ELongase Enzyme Mix  10480-01010480-028  100反应500反应
Accuprime Taq DNA Polymerase System  12339-01612339-024  200反应1000反应

RT-PCR

产品  货号  规格
SuperScriptⅡRNase H- Reverse Transcriptase  18064-01418064-02218064-071  4×1000单位2000单位4×1000单位
SuperScriptⅡRNase H- Reverse Transcriptase  18053-017  10000单位
SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR（包括oligo(dT)12-18，random hexamers，SuperScriptⅡRT，RNaseOUT RNase Inhibitor，10×RT buffer，Mg solution，10mM dNTP mix，E.coli RNase H，control RNA和primers以及DEPC treated water）。  11904-018  50反应

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 11:41

SuperScript One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase（包括SuperScriptⅡRT/Platinum Taq DNA Polymerase mix，2×reaction buffer，MgSO4）  10928-03410928-042  25反应100反应
SuperScript One-Step RT-PCR System for Long Templates（包括SuperScriptⅡRT/Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity mix，2×reaction buffer，MgSO4）  11922-01011922-028  25反应100反应
ThermoScript RT-PCR System（包括ThermoScript RT，5×cDNA Synthesis Buffer，Mg solution），oligo(dT)20，random hexamers，0.1M DTT，10mM dNTP mix，RNaseOUT RNase Inhibitor，DEPC treated water以及E.coli RNase H）。  11146-02411146-016  25反应100反应
ThermoScript RT-PCR System and Platinum Taq DNA Polymerase  11146-05711146-032  25反应100反应
ThermoScript RT-PCR System and Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity  11146-040  100反应
Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript One-Step System  11731-01511731-023  100反应500反应
M-MLV Reverse Transcriptase  28025-01328025-021  40000单位200000单位
RT-PCR Primer and Control Set（包括Hela RNA和β-actin primers）。  10929-016  20反应
Ribonuclease H  18021-01418021-071  30单位120单位
DNaseⅠ，Amplification Grade  18068-015  100单位
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor  10777-019  5000单位
DEPC-treated Water  10813-012  4×1.25ml
5' RACE System for Rapid Amplification of cDNA End，Version 2.0  18374-058  10反应
3' RACE System for Rapid Amplification of cDNA End  18373-019  20反应
GeneRacer™Kit with SuperScript™ⅡRT and TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing  L1502-01  1kit*
GeneRacer™Kit with SuperScript™ⅡRT and Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit for Sequencing  L1502-02  1kit*
Plantinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity  11304-011  100单位
*Includes sufficient reagents for 5 cDNA, 50 PCR, and 10 cloning reactions, and 1 control reaction.

反应成分

产品  货号  规格
Invitrogen Custom Primers  请询价
10mM dNTP Nucleotide Mix  18427-013  100μl
100mM dNTP Nucleotide Set  10297-018  4×250μl

核酸纯化

产品  货号  规格
TRIzol® Reagent  15596-02615596-018  100ml200ml
TRIzol LS Reagent  10296-01010296-028  100ml200ml
DNAzol® Reagent  10503-02710503-035  100ml200ml
DNAzol BD Reagent  10974-020  100ml
Concert™ Plant RNA Reagent  12322-012  100ml
Concert™ Cytoplasmic RNA Reagent  12323-010  100ml
Concert™ Micro-to-Midi RNA Purificatior Reagent  12183-018  50rxns
Concert™ Homogenizer  12183-026  50rxns
Buffered-Saturated Phenol  15513-03915513-047  100ml400ml
Proteinase K  25530-01525530-031  100mg5g
Proteinase K (Liquid)  25530-049  5ml
Marligen Rapid PCR Purification System  11458-01511458-023  50反应250反应
Marligen Rapid Gel Extraction System  11456-01911456-027  50反应250反应

定量PCR和定量RT-PCR

产品  货号  规格
Platinum Quantitative PCR Super Mix-UDG  11730-01711730-025  100rxns500rxns
RUX Reference Dye  12223-012  500rxns
Platinum® Quantitative RT-PCR ThermoScript™  11731-01511731-023  100rxns500rxns
ROX Reference Dye*  12223-012  500rxns

其他应用产品

产品  货号  规格
AFLP® Analysis SystemⅠ(基因组介于5×10^8到6×10^9之间）（包含AFLP Core Reagent Kit和AFLP Starter Primer Kit）  10544-013  each
AFLP?® Analysis SystemⅡ(基因组介于1×10^8到5×10^8之间）（包含AFLP Core Reagent Kit和AFLP Small Genome Primer Kit）  10717-015  each
AFLP® System for Microoranisms（为细菌和真菌设计）  11352-010  each

PCR相关产品

产品  货号  规格
100bp DNA Ladder  15628-01915628-050  50μg250μg
1kb Plus DNA Ladder  10787-01810787-026  250μg1000μg
0.6-1.77 Kb RNA Ladder  15623-010  75μg
0.24-9.5 Kb RNA Ladder  15620-016  75μg
Silicone Oil  10890-010  4ml
Uracil DNA Glycosylase  18054-015  100单位

PCR产物克隆

产品  货号
TOPO TA Cloning® Kit  K4500-01K4550-01K4560-01
TOPO TA Cloning® Kit Dual Promoter  K4600-01K4650-01K4660-01
TOPO TA Cloning® Kit for Sequencing  K4575-01
Original TA Cloning® Kit  K2000-01K2030-01
Original TA Cloning® Kit Dual Promoter  K2050-01K2060-01
Various  All the TOPO Exp. Kits
Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit  K2800-20
Zero Blunt® TOPO® PCR C

作者: 椰子叶子 时间: 2011-10-12 11:42

呵呵，是invitrogen的中文focus
原文在这里
cuturl('http://www.invitrogen.com.cn/Focus/Focus24/Focus24.chm')

作者: #甜# 时间: 2011-10-12 11:42

我做过的，一步法，简单，效果还可以。我用的是Promega公司的反转录试剂盒，以olig(dT)为引物对总RNA进行反转录，合成cDNA。试剂盒里有：
MgCl2，RT 10xbuffer，4xdNTP，Rnase inhibitor，AMV，Olig(dT)15，
RNase-free water以及阳性对照和质控。按说明加好样品后，42度温浴1小时，99度5分钟，迅速插入冰水中5分钟逆转录合成cDNA.

作者: tieshazhang 时间: 2011-10-12 11:44

１.标本的保存：　全血冻存／单个核细胞／RNA？最长保存时间？
２.有核细胞分离：淋巴细胞分离液／红细胞裂解液？

谢了先！

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