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标题: 【求助】总RNA提取不出来 [打印本页]
作者: 乌贼老弟    时间: 2016-2-8 21:40     标题: 【求助】总RNA提取不出来

各位大虾!
本人准备做椎间盘的髓核的水通道蛋白的相关研究,但是组织的总RNA老是提不出来!要不就是总的NG数达不到要求,要不就是OD值达不到!跑的胶是一片空白什么东西也没有!我用了TRIZOL也达不到要求!
请帮忙分析一下原因!!!!谢谢
作者: baidukk    时间: 2016-2-8 21:42

个人认为提取RNA要注意几点：1）快速 尽管不要求你象百米赛跑一样快，但是也不能慢条斯理的，我们实验室的提取RNA的时候凡是离心的时候都是小跑进行的（因为离心机和操作台不在一个实验室），从取组织加液氮研磨开始到电泳检测条带都要快，最主要的目的当然还是尽量防止RNA的降解了。2）组织充分研磨 要使组织尽量研磨碎，匀浆化，这样更有利于细胞的裂解。为了尽量缩短时间，可以先用锤子先将组织锤碎，然后赶快加液氮，研磨，然后尽快加裂解液。匀浆化后室温静置的时间要足够，这样核蛋白复合物才能完全解离。3）操作要严格 尽量戴好口罩、帽子，每次操作的时候都尽量戴上手套，下一步操作的时候换一个手套，这样最大程度地避免RNA酶的污染。4）尽量离心都在低温离心机操作，但是如果你的操作够快，个人觉得也可以在常温离心机中操作，有段时间我们实验室低温离心机坏了就经常在常温离心机中提取RNA，一样能提取的很好，还有就是操作的时候也没必要在超净台中操作，就在一般的台子上就可以了，最好在离心机旁边，这样能最大程度的节约时间。5）时间要安排合理 比如在离心的时候就要准备好下一步用的东西，在提RNA之前就要倒好胶，在最后一步离心时就要准备好电泳的loading buffer，电泳时间最好15分钟内，电压高一点170v，总之是最大程度的避免RNA的降解了，祝你成功！
作者: bring    时间: 2016-2-8 21:44


我的两点建议：首先，除试剂盒有特别说明的步骤外，整个过程应该尽量保证在冰上进行。其次，组织研磨过程我以为很重要，一定要快，而且要尽量避免此过程中标本温度升高。所以，选择一种最合适的研磨工具和步骤是很必要的。
作者: 乌贼老弟    时间: 2016-2-8 21:44

谢谢!
操作应该没问题的啊!我请人家做过!还是没结果!用人家的TRIZOL还是没什么结果!真的很郁闷!!
作者: 乌贼老弟    时间: 2016-2-8 21:45

请问用液氮研磨有什么特别要求吗?
我以前用的是匀浆器,可是组织不能完全研磨碎!
作者: 乌贼老弟    时间: 2016-2-8 21:47


是不是用液氮研磨后还得用匀浆器匀浆?我用液氮研磨后已经是粉态的了!
作者: viviwang1987    时间: 2016-2-8 21:47


我们的程序是加了trizol低温浸泡一段时间，然后用匀浆机在冰上匀浆。还有最后用洗RNA的时候一定要小心，很可能RNA丢失
作者: cbou876    时间: 2016-2-8 21:49


用液氮研磨后就可以了，目的是使组织块变小，便于后一步加trizol使核蛋白体完全分解。加入trizol后，要确保trizol中的组织不能成团，有结团的话要吹打均匀。另外，加异丙醇反应这一步，要混匀使rna与异丙醇充分反应，使其沉淀。我之前有过深刻的教训，因为没混匀，白白浪费了一个多月，最后才找到是这个原因。还有可能就是rna出来后，加入75%乙醇这一步，要注意先加750ul乙醇，后加250ulDEPC水。
作者: 乌贼老弟    时间: 2016-2-8 21:50


谢谢各位！
我已经严格按说明书操作了，怎么还是提不出来啊！各位大侠有人用过ＰＲＯＭＥＧＡ的ＧＶ-total RNA isolution这个试剂盒吗？ＯＤ值为什么会出现负数啊？
等待各位的解答！！！
作者: standbyme    时间: 2016-2-8 21:51


我说几点建议：
1.液氮研磨时，要随时加入液氮，我们磨一个样本要加3-4次液氮，并且要快速研磨。最好能有个人帮助加液氮！
2.OD值出现负值……有可能是调零时没洗好吧！
3.怀疑一下，你的样品保存中没出现什么问题吧？比如说融化了什么的，那样RNA就降解了，虽然这种错误很少有人犯，但是，不排除可能性啊!
4.实验前的灭酶处理很重要，我们当时进行了好几天，剪刀镊子，研钵，饭盒，水，枪头，离心管……都用DEPC水泡了，然后高压，烘干，当时感觉可繁琐了，事实证明，前期工作做好了，后面会很省力的。
我也是第一次做，一步步很谨慎的走，希望你能成功！
作者: standbyme    时间: 2016-2-8 21:51

用液氮研磨后就可以了，目的是使组织块变小，便于后一步加trizol使核蛋白体完全分解。加入trizol后，要确保trizol中的组织不能成团，有结团的话要吹打均匀。另外，加异丙醇反应这一步，要混匀使rna与异丙醇充分反应，使其沉淀。我之前有过深刻的教训，因为没混匀，白白浪费了一个多月，最后才找到是这个原因。还有可能就是rna出来后，加入75%乙醇这一步，要注意先加750ul乙醇，后加250ulDEPC水。

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为何要先加750ul乙醇，后加250ulDEPC水？有什么讲究么？
作者: yyaxw84    时间: 2016-2-8 21:53


我觉得你应该把你的详细步骤说出来让大家分析，既然你用别人的trizol和别人帮你做都没有做出来，我怀疑是不是你取材的时候没有注意，就是你在做实验之前，RNA已经降解了。如果是后面的实验步骤有些问题一般最后电泳都会看到降解的条带，不会什么都看不到。
作者: standbyme    时间: 2016-2-8 21:54


我觉得你应该把你的详细步骤说出来让大家分析，既然你用别人的trizol和别人帮你做都没有做出来，我怀疑是不是你取材的时候没有注意，就是你在做实验之前，RNA已经降解了。如果是后面的实验步骤有些问题一般最后电泳都会看到降解的条带，不会什么都看不到。
我这段时间提RNA 也是什么都没有,我的是霉菌,我想问一下,如果实验之前RNA已经降解了,电泳就什么都看不到吗?还是有降解带?谢谢
作者: yyaxw84    时间: 2016-2-8 21:54

一般做实验的过程只有1小时，如果你用新鲜的组织在一个小时里基本不会降解为单个的核苷酸，所以跑电泳还能明显看出5s或更小的亮带。要是你用保存不好的组织，有时候你的组织放在冰箱很长时间了，所以只要有RNA酶，一般就会降解成单个核苷酸了。这样跑电泳就什么都看不到了。
作者: hold住    时间: 2016-2-8 21:56

我是提细胞里的RNA，每次离心配平的时间都很长，是不是这段时间里RNA就给分解了？我用的是DEPC水配的酒精，高压之后用来洗RNA，行吗？
作者: yyaxw84    时间: 2016-2-8 21:58



QUOTE:
原帖由 hold住 于 2016-2-8 21:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我是提细胞里的RNA，每次离心配平的时间都很长，是不是这段时间里RNA就给分解了？我用的是DEPC水配的酒精，高压之后用来洗RNA，行吗？

自己养的细胞应该还比较好提RNA，至少在你提之前它是活的。收集细胞的时候应该不会降解，因为你的细胞还在你的培养基里面，它还是有活性的。洗RNA的只要用DEPC水配就好了（但是乙醇最好是新开的），可以不用高压灭菌。
作者: xueyouzhang    时间: 2016-2-8 22:00


你是怎么知道自己没提出来的？用rt-pcr来做pcr了吗？
最后离心后能看到试管底部的白色羽状固体吗
作者: baidukk    时间: 2016-2-8 22:01


把标本给我，我帮助你提取，不可能提不出来．
作者: baidukk    时间: 2016-2-8 22:02

注意污染，注意降解，带口罩不说话，仔细操作，一般都没有问题。trozil进口最好，国产也行。稍微差点。
作者: 乌贼老弟    时间: 2016-2-8 22:03

谢谢．就是没提出来！！！
作者: ROSE李    时间: 2016-2-8 22:04


有没有邮箱？我给你一个液氮研磨的好方法。
作者: xevin    时间: 2016-2-8 22:04

先加750ul乙醇，是为了洗你提取的RNA。
我也有个问题请教大家：我用TRIZOL可以提取原代心肌细胞的RNA，但老板非让用qiagen --RNeasy plus mini kit提取RNA，说改试剂盒提取的RNA质量好，无genomic DNA污染，但我试过几次，都不成功，如何办？谢谢！



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