标题: [精华]】RealTimePCR问题专贴--请先看P1的问题汇总 [打印本页]

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 12:07     标题: [精华]】RealTimePCR问题专贴--请先看P1的问题汇总

[精华]】RealTimePCR问题专贴--请先看P1的问题汇总


开个帖子,有定量PCR相关的问题可以提问,如果有类似/雷同的问题我会整理在一起统一回答.如果有重复的问题，或者本帖的回帖中能自行找到答案的问题不会作答。

现在将每一页的主要问题整理一下

不建议用普通PCR来验证定量引物以及摸索定量的反应条件。

Page1：
1.做目的基因表达量分析的简易小流程。
2.什么样的实验数据才是可靠的呢？

Page2：
1.多重PCR与单一PCR仅仅是引物探针设计上的差别吗？
2.选择绝对定量还是相对定量？
3.如何判断体系的阴性对照是否有污染？
4.溶解温度曲线是如何制作的？

Page3：
1. 定量引物与普通引物的设计差异。
2.如何稀释标准品。

Page4：
1.相关系数与斜率的意义。
2.- △△CT法与标准曲线法的比较。

Page6：
1.反转录前应将totalRNA调整的统一且适当的浓度。
2.模板、preMix均不建议用振荡器混匀。

Page7：
1.total RNA无法电泳以及测OD
2.溶解温度曲线有两个峰怎么办？

Page8：
1.一步法试剂盒与两步法选择上有什么差别？
2.cDNA不能测OD。

Page9：
1.△△CT法要求的扩增效率
2.阈值的民间调整法
3.溶解温度曲线的制作过程

Page10：
PCR反应时模板添加量

Page11：
商品化的premix，只选适合自己的。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 12:09

简单说一下做定量PCR的流程(以RNA起始为例):
1.提取total RNA
针对不同的组织选择不同的试剂盒提取total RNA,尽量严格按照试剂说明书的要求来进行.
提取过后,需要对totalRNA进行质量测定,包括两个部分,一个是1%琼脂糖胶电泳,确定是否降解,一般来说动物组织来源的质量好的total RNA电泳有三条带,28s为最亮,理想情况下接近18s亮度的2倍,5.8s最弱,只是很模糊的一条带;某些植物组织有4条带。并且，如果在电泳前能将total RNA变性一下，跑出来的图片会更漂亮，28S上面是比较干净的。另一方面是测OD

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作者: DDD    时间: 2011-10-13 12:09

你好！我做的是探针法的绝对定量。对于试验后数据分析有一些疑问。看过一些文献，大都要分析ct值变异系数（包括批内和批间的）。变异系数是CT值标准偏差/CT值平均值，但是这样计算只能计算一个点或多个点的变异系数。我见别人文章中有直接评价一个试验或某次试验的变异系数，这是怎么计算的？
另，除此之外绝对定量还有什么一定要分析的方面？
望解答。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 12:10

首先，我不确定您做绝对定量的目的是什么，但凡围绕着实验目的的结论都是有必要分析的。呵呵，看起来是说了一句废话，不好意思啊。

您用的定量仪器是什么呢？现在的软件功能都很强大的，类似于最终定量结果的标准偏差数量都会直接给出，不需要人工来算的。是否有评价整个实验的变异系数这样的说法，我还需要再研究一下，不能给您个确切的答案，抱歉。也希望您找到答案后能跟告诉我，谢谢！

广泛的说一下实验数据可靠性的分析：

1。要看一下有没有偏差特别大的数据，换句话说，本该是阴性的，结果有比较弱的扩增即Ct值较大的扩增，如果有的话，可以手工确定基线、阈值，如果实验的背景太高，还可以消除背景，这样做，会比机器自动给出的扩增曲线和标准偏差等一些图片和数值要好一看些，但如果对于手动调整完全没有概念的的话，还是建议自动生成。对于有些样本忘记加模板或者其他操作失误，请无比忽略该反应孔的数值统计，否则，结果很难看，甚至有可能对趋势产生影响。

2。实验整体控制情况，包括标准曲线线性范围、扩增效率、相关系数、引物特异性、多重探针的的话要看各检出通道之间是否有干扰；如果是SYBR方法的话，还看融解温度曲线的峰是否单一并且且温度是否一致、正确。

3。样品的重复性是否好。

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作者: 魔法师A    时间: 2011-10-13 12:10

你好，我做的是MGB探针的定量RT-PCR，最近一直做不出来，我的引物没有问题，我想问问，做荧光定量PRT-PCR的酶和一般的RT-PCR的酶是不是不一样啊？

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作者: mooon    时间: 2011-10-13 12:11

您好！
我做的是普通Taqman探针的相对定量荧光定量PCR, 目的基因：IL-4,内参：beta-actin；仪器用的是ABI公司的7500 Real Time PCR System，经SDS软件自动分析得到下图：
左边是b-actin，由于IL-4的相对定量按照内参的相对定量进行了标准化，所以b-acting的表达水平是0。
右边是经不同处理后的标本，依次记为C1,C2,C3,C4.我将C1作为对照校正，表达水平设为1，取对数后为0，C2,C3,C4皆与C1进行比较，得到图中数字。
图片不是很清晰：（C1=0,C2=-0.802(绿色）,C3=0.056（蓝色）,C4=-0.486红色)

我要请教的问题是：
1.图中数字的含义是什么？ 是直接说明表达量C3>C1>C4>C2吗？还是表示倍数关 系，负号表示降低？
2. 相对定量采用2-△△Ct法，那么图中数字与2-△△Ct是怎么一种关系？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 12:12

你好，我做的是MGB探针的定量RT-PCR，最近一直做不出来，我的引物没有问题，我想问问，做荧光定量PRT-PCR的酶和一般的RT-PCR的酶是不是不一样啊？

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各个公司的试剂是不一样的,不能简单的说普通的和定量的酶是不是一样,但一般情况下,都是有区别的,同一种酶,来源不同,差异也很大.因此,不建议你为了节约那么一点点成本而混着用.事实上,你在实验的每个小细节都注意到了,保证实验一次成功会节约更大的成本.另外,普通与定量的缓冲体系也是不同的.

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作者: #甜#    时间: 2011-10-13 12:13

能不能帮忙推荐一个公司的荧光定量的试剂盒

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作者: #甜#    时间: 2011-10-13 12:13

我是刚刚接触这方面的东西，我还想问问，你所指的普通与定量的缓冲体系也是不同的. 能说的具体点吗？谢谢！  

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作者: pou    时间: 2011-10-13 12:14

我用荧光定量PCR做snp,用DNA做，结果一直不理想，有一个位点的扩增效率太低，一个溶解曲线为双峰。我怀疑我的引物不是很好，能否给一些建议。十分感谢

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作者: 3N4G    时间: 2011-10-13 12:14

我做的是RNA病毒，可以给我推荐一下，DNA聚合酶，反转录酶用什么样的比较好。  

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 12:15

1.相对定量的柱形图,在取对数之前,是倍数关系,去过对数之后函数关系变成什么样子,是不是还是个倍数关系,请允许我把高中知识都忘光了吧,只记得对数函数是个增函数,其他实在不能回答了.

在0线以下的表示表达量比对照组低,因此那个"-"就表示这个意思.图上确是反应的是C3>C1>C4>C2.

2.相对表达量的分析方法有两种,一种是标准曲线法,另一种就是-△△Ct法.一般来说,后者比较简便,免去很多标准品筛选的麻烦,但是这种方法是有局限性的,把扩增效率默认为1,这样才有底数为2的-△△Ct次幂这么一说.原本的底数应该是(1+E扩增效率)

您图中纵坐标的数据没有什么意义,只是一个倍比的关系,举个例子,(以未取对数前的比值为例)如果C2比C1低100倍,C3比C1高100倍,那么取过对数后,你的纵坐标就变成了正负2.

因此,这个-△△Ct与纵坐标没什么直接的关系.

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 12:18

关于试剂,我只能说,买现成的酶/buffer/dNTP混合液肯定比自己配要方便很多,至少不必摸索实验条件和离子浓度/缓冲液/PH等,如果你不是十分缺经费的话,还是省点心,省点时间吧.(我的输入法没有顿号,以/代替)

缓冲体系不同,主要指的是buffer中各个离子的浓度和PH略有不同.因为普通PCR仪的升降温速度比定量的慢.因此缓冲体系/酶/引物都为适应不同的升降温速度而不同.

定量产物一般都比较端,因此如果把定量的引物放在普通pcr的体系和仪器上做,很可能有许多非特异性的条带产生.同时,我还遇过一次,定量的引物放在普通pcr上做,跑胶看没有任何条带,当换用定量试剂做,结果特别好.

因此,建议大家,在拿到引物和试剂的时候,挑一个样品直接用定量实验来验证引物和反应体系,摸索反应条件.这样做远比先用普通pcr验证引物要有效得多.(这是有时间和金钱的教训在里面的)并且用普通pcr摸索的实验条件放到定量上还是需要重新再摸索.得不偿失,事倍功半.

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 12:19

你是用MGB的探针做的SNP检测吗?能否把你的实验详细的说说?当然,保密的东西除外哈~

我最近正在遭遇taqman探针检SNP,呵呵~一起讨论下.

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作者: 969    时间: 2011-10-13 12:20

我用的是SYBER Green 染料做的，能否教我一下怎样设计SNP的引物，谢谢，非常感谢！  

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作者: 韩梅梅    时间: 2011-10-13 12:20

缓冲体系不同,主要指的是buffer中各个离子的浓度和PH略有不同.因为普通PCR仪的升降温速度比定量的慢.因此缓冲体系/酶/引物都为适应不同的升降温速度而不同.
reply：本人不同意升降温速率会影响缓冲体系/酶/引物等配比，都是一样的热动力学过程罢了，只不过前者慢，后者快。

定量产物一般都比较端,因此如果把定量的引物放在普通pcr的体系和仪器上做,很可能有许多非特异性的条带产生.同时,我还遇过一次,定量的引物放在普通pcr上做,跑胶看没有任何条带,当换用定量试剂做,结果特别好.
reply：定量的引物放在普通pcr机器上还会出现非特异带？OMG，定量的引物相对普通PCR引物而言，就是强调一个特异性，怎么可能在普通PCR上还会出现杂带呢？事实上，如果是设计很好的定量引物，在跑一般PCR时，那结果是相当的好，呵呵。定量的引物如果扩一般PCR没有而用定量试剂做结果很好，只有2个可能：1、你的PCR体系太烂了。2、定量的试剂由于是通过商业化的优化的，譬如加入甜菜碱、DTT等等东东，特异性和效率都是很不错滴，当然和你的普通PCR没得比。另外，不要忘记了大多数qPCR试剂里面用的都是高效率的热启动酶，这个和普通酶相比还是有很大区别的，我猜你说的这个特例只是酶的差异罢了。

因此,建议大家,在拿到引物和试剂的时候,挑一个样品直接用定量实验来验证引物和反应体系,摸索反应条件.这样做远比先用普通pcr验证引物要有效得多.(这是有时间和金钱的教训在里面的)并且用普通pcr摸索的实验条件放到定量上还是需要重新再摸索.得不偿失,事倍功半.
reply：我的观点和你的相反，刚来的引物，最好上普通PCR或是梯度PCR仪上面摸索最佳的温度和条件，看看跑胶有没有非特异性扩增，然后再做标准曲线来验证。  

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作者: she    时间: 2011-10-13 12:21

1.相对定量的柱形图,在取对数之前,是倍数关系,去过对数之后函数关系变成什么样子,是不是还是个倍数关系,请允许我把高中知识都忘光了吧,只记得对数函数是个增函数,其他实在不能回答了.

在0线以下的表示表达量比对照组低,因此那个"-"就表示这个意思.图上确是反应的是C3>C1>C4>C2.

2.相对表达量的分析方法有两种,一种是标准曲线法,另一种就是-△△Ct法.一般来说,后者比较简便,免去很多标准品筛选的麻烦,但是这种方法是有局限性的,把扩增效率默认为1,这样才有底数为2的-△△Ct次幂这么一说.原本的底数应该是(1+E扩增效率)

您图中纵坐标的数据没有什么意义,只是一个倍比的关系,举个例子,(以未取对数前的比值为例)如果C2比C1低100倍,C3比C1高100倍,那么取过对数后,你的纵坐标就变成了正负2.

因此,这个-△△Ct与纵坐标没什么直接的关系.

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有一个问题请教：
您说图中纵坐标的数据没有意义？ 我想问下：在进行统计分析时是否可以在2-△△Ct值或者取对数后的结果（即上图）中任选一个？两者都可以说明实验结果，只是表达方法不同？

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作者: she    时间: 2011-10-13 12:21

1.相对定量的柱形图,在取对数之前,是倍数关系,去过对数之后函数关系变成什么样子,是不是还是个倍数关系,请允许我把高中知识都忘光了吧,只记得对数函数是个增函数,其他实在不能回答了.

在0线以下的表示表达量比对照组低,因此那个"-"就表示这个意思.图上确是反应的是C3>C1>C4>C2.

2.相对表达量的分析方法有两种,一种是标准曲线法,另一种就是-△△Ct法.一般来说,后者比较简便,免去很多标准品筛选的麻烦,但是这种方法是有局限性的,把扩增效率默认为1,这样才有底数为2的-△△Ct次幂这么一说.原本的底数应该是(1+E扩增效率)

您图中纵坐标的数据没有什么意义,只是一个倍比的关系,举个例子,(以未取对数前的比值为例)如果C2比C1低100倍,C3比C1高100倍,那么取过对数后,你的纵坐标就变成了正负2.

因此,这个-△△Ct与纵坐标没什么直接的关系.

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有一个问题请教：
您说图中纵坐标的数据没有意义？ 我想问下：在进行统计分析时是否可以在2-△△Ct值或者取对数后的结果（即上图）中任选一个？两者都可以说明实验结果，只是表达方法不同？

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作者: 蛐蛐儿    时间: 2011-10-13 12:24

你好！我做的是探针法的绝对定量。对于试验后数据分析有一些疑问。看过一些文献，大都要分析ct值变异系数（包括批内和批间的）。变异系数是CT值标准偏差/CT值平均值，但是这样计算只能计算一个点或多个点的变异系数。我见别人文章中有直接评价一个试验或某次试验的变异系数，这是怎么计算的？
另，除此之外绝对定量还有什么一定要分析的方面？
望解答。

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先说一下，我用的仪器是ABI7000，做定量的时候最后会出来每个样本（包括标准品）的标准偏差，应该是stdDev吧，但是我在文献中经常看到mean intra- and inter-assay coefficients of variation (批内或批间的变异系数)用来验证一个实验的重复性。我不明白的是怎么得出整个实验变异系数的。希望楼主或是其它路过的高手能够指导一下。

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作者: @花开花落@    时间: 2011-10-13 12:25

我用的是SYBER Green 染料做的，仪器用的是ABI公司的7500 Real Time PCR System。请教一个简单的问题：7500 Real Time PCR System怎样操作？

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作者: queen    时间: 2011-10-13 12:25

关于是不是需要普通PCR来先摸定量PCR的条件
可能还和定量PCR的方法有关

如果是探针法，探针是最主要因素，摸条件时不加探针没有意义，加探针那就不必要上普通PCR仪了，如果做的话的确也会出现yaoshan战友说的情况；

如果是染料法，因为PCR引物二聚体、非特异扩增对结果影响较大，而且染料往往比其他试剂贵，个人觉得摸一下也无妨
个人意见，大家继续讨论～  

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作者: flower@@    时间: 2011-10-13 12:27

我想请问一下，做目的基因的标准曲线，也是用和做持家基因扩增曲线同种浓度的cDNA么？ 我用做持家基因的CDNA 分别是1倍 0.2倍 0.04倍 0.008倍 0.00016 倍，做目的基因的标准曲线，扩增效率为什么会很大呢 400%多

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8691

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 12:28

我用的是SYBER Green 染料做的，能否教我一下怎样设计SNP的引物，谢谢，非常感谢！

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SYBR的方法是不可能检出SNP的,目前SNP的检测大多用Taqman-MGB探针,或者Cycling探针来检测.

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 12:29

我想请问一下，做目的基因的标准曲线，也是用和做持家基因扩增曲线同种浓度的cDNA么？ 我用做持家基因的CDNA 分别是1倍 0.2倍 0.04倍 0.008倍 0.00016 倍，做目的基因的标准曲线，扩增效率为什么会很大呢 400%多

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不考虑引物扩增表现好坏和你的模板中是否有阻害物,单纯看模板稀释,梯度就特别不好,相信你把模板稀释好,扩增效率不会这么差.
现在你可以先在仪器上把第一个点和最后一个点去掉,看看扩增效率怎样.

还有一点补充一下,5倍的梯度不是太好稀释,如果你基因表达量比较高的话,选10倍梯度吧.

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作者: 猫屎一号    时间: 2011-10-13 12:29

我做过10倍10倍的稀释，可是到达10000倍就没有CT值了，所以才改用的5倍5倍的稀释，我把做定量的PCR拿去跑了个琼脂糖电泳，发现条带都弥散了，现在正在提高退火温度试试效果如何。不知道你们有什么好的建议，分享一下，洗耳恭听。  

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 12:31

不知道你标准品total RNA的起始浓度是多大,可以调整到试剂要求的最大量.如果还不行的,只能8倍或者5倍稀释.找个实验手法好的人给你稀释标准品吧.我们实验室有个高手专门稀释标准品,呵呵~而且标准品要现用现稀释.

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 12:31

不知道你标准品total RNA的起始浓度是多大,可以调整到试剂要求的最大量.如果还不行的,只能8倍或者5倍稀释.找个实验手法好的人给你稀释标准品吧.我们实验室有个高手专门稀释标准品,呵呵~而且标准品要现用现稀释.

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 12:31

你的问题确实太高深了,我不懂.我今天用7000的软件研究研究,我没有7500.然后我们再讨论一下.

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 12:31

仪器的使用请您参看说明书吧.ABI的资料我们论坛上都有下载的,呵呵~

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作者: 爬呀爬    时间: 2011-10-13 12:32

有没有人做过多重real-time？做多重需要注意那些问题呢？
模板间的浓度如果不一致，是否会造成竞争？
请各位高手提点~~~~~~~~~~~

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作者: SOS    时间: 2011-10-13 12:32

我做的不是绝对定量，是做的定量PCR里的相对定量，我是想得到目的基因和持家基因 共同的扩增效率，然后再分别扩增不同时期的样本，看差异，最后分析的结果是这样子的：2的-ΔΔCt次方
ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照

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作者: loli    时间: 2011-10-13 12:33

最近碰到特奇怪的问题

将目的样本跑普通PCR的时候有条带，上real-time倒是什么都不出来。怀疑探针（新的）不行了，但是标准品倒是出来了，百思不得其解。。。

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作者: 韩梅梅    时间: 2011-10-13 12:33

同楼上的，最近刚刚遇到一件很奇怪的事情，引物用来跑常规PCR，跑胶检测带型和预期相符，无杂带，可是一旦上qPCR，同样的模板和反应条件，出来的结果很乱，34个循环以后起峰，跑胶一看，带型和预期的大小不符，而且呈现拖尾的情况，目前百思不得其解？要命的是每种我都重复了2次，结果还都惊人的相似。难道是染液的问题？可是为什么对别的引物没这种情况发生呢？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 12:34

最近碰到特奇怪的问题

将目的样本跑普通PCR的时候有条带，上real-time倒是什么都不出来。怀疑探针（新的）不行了，但是标准品倒是出来了，百思不得其解。。。


一下内容仅限于你的普通PCR产物是目的产物:
1.请将定量结果(加入探针的反应)跑电泳,看是否有目的带.
(1)如果有目的产物说明探针有问题;
(2)如果没有,请首先怀疑引物和试剂,毕竟做探针比较贵,用来反复实验不划算.

2.不清楚你做的是绝对定量还是相对定量.标准品是构建的还是直接在样品中选择了一个做为标准品.
(1)如果是构建的,则该怀疑你的样品模板问题;请将提取的RNA/DNA电泳看是否降解,若是RNA还得怀疑反转录试剂问题.尤其你引物设计的位置跟你选择的反转录引物是否配套.
(2)如果是在样品中选了一个作为标准品,那只能说你中邪了.呵呵~这是玩笑.这个时候只能怀疑你样品模板浓度太低,没达到检出限度.但说实话,此种情况比较少,一般不至于.

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 12:35

同楼上的，最近刚刚遇到一件很奇怪的事情，引物用来跑常规PCR，跑胶检测带型和预期相符，无杂带，可是一旦上qPCR，同样的模板和反应条件，出来的结果很乱，34个循环以后起峰，跑胶一看，带型和预期的大小不符，而且呈现拖尾的情况，目前百思不得其解？要命的是每种我都重复了2次，结果还都惊人的相似。难道是染液的问题？可是为什么对别的引物没这种情况发生呢？

================================================================================================================

看过你之前对我的一些观点的反驳，但我仍然坚持，仪器的升降温速度对反应缓冲体系的要求是不同的，升降温过程中，反应still working，因此其中是不是有非特异性的退火这些都很难讲。另外，定量和普通PCR的反应条件确实不同，建议你在定量上摸一下条件。还有，一般来说，荧光染料对反应是有阻害的，要不你试试降低一下染料添加量。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 12:35

同楼上的，最近刚刚遇到一件很奇怪的事情，引物用来跑常规PCR，跑胶检测带型和预期相符，无杂带，可是一旦上qPCR，同样的模板和反应条件，出来的结果很乱，34个循环以后起峰，跑胶一看，带型和预期的大小不符，而且呈现拖尾的情况，目前百思不得其解？要命的是每种我都重复了2次，结果还都惊人的相似。难道是染液的问题？可是为什么对别的引物没这种情况发生呢？

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看过你之前对我的一些观点的反驳，但我仍然坚持，仪器的升降温速度对反应缓冲体系的要求是不同的，升降温过程中，反应still working，因此其中是不是有非特异性的退火这些都很难讲。另外，定量和普通PCR的反应条件确实不同，建议你在定量上摸一下条件。还有，一般来说，荧光染料对反应是有阻害的，要不你试试降低一下染料添加量。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 15:08

有没有人做过多重real-time？做多重需要注意那些问题呢？
模板间的浓度如果不一致，是否会造成竞争？
请各位高手提点~~~~~~~~~~~

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抱歉，刚刚才看到这个问题。
1。设计：多重PCR的关键就在于引物和探针的设计上。至于设计原则，就不是千八百字能说清楚的了，你可以在网上搜罗一下哈。
2。标记：看你仪器的各个通道之间是否有干扰，这个如果有的话，就属于仪器的硬伤，改变不了，只能避免使用有干扰的通道。

至于您说的模板间的浓度不一致是否会造成竞争，这个问题我没有看懂。一般来说，多重PCR，加的都是同一个样品的total RNA/DNA，只不过同一个管子里检测不同的基因而已。如果您的意思是同一个管子加不同的模板，不同的引物探针，那基本上没必要做多重PCR了。如果指的是，各个样品反应的起始量不同，那就没必要做定量了。定量PCR的第一步，就是尽可能的保证起始量是统一的浓度。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 15:08

有没有人做过多重real-time？做多重需要注意那些问题呢？
模板间的浓度如果不一致，是否会造成竞争？
请各位高手提点~~~~~~~~~~~

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抱歉，刚刚才看到这个问题。
1。设计：多重PCR的关键就在于引物和探针的设计上。至于设计原则，就不是千八百字能说清楚的了，你可以在网上搜罗一下哈。
2。标记：看你仪器的各个通道之间是否有干扰，这个如果有的话，就属于仪器的硬伤，改变不了，只能避免使用有干扰的通道。

至于您说的模板间的浓度不一致是否会造成竞争，这个问题我没有看懂。一般来说，多重PCR，加的都是同一个样品的total RNA/DNA，只不过同一个管子里检测不同的基因而已。如果您的意思是同一个管子加不同的模板，不同的引物探针，那基本上没必要做多重PCR了。如果指的是，各个样品反应的起始量不同，那就没必要做定量了。定量PCR的第一步，就是尽可能的保证起始量是统一的浓度。

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作者: 乌贼老弟    时间: 2011-10-13 15:08

你好，我有个问题：一个炎症发展到肿瘤，经历几个阶段，我要从这几个阶段检测DNA量的变化，可否不用内参，直接把这几个阶段与正常组织所提的DNA进行量的比较呢（定量PCR探针法）？谢谢你！

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作者: 乌贼老弟    时间: 2011-10-13 15:08

你好，我有个问题：一个炎症发展到肿瘤，经历几个阶段，我要从这几个阶段检测DNA量的变化，可否不用内参，直接把这几个阶段与正常组织所提的DNA进行量的比较呢（定量PCR探针法）？谢谢你！

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作者: windy+++    时间: 2011-10-13 15:09

我是用探针作小鼠睾丸组织的 实验已经好长时间了 但总是出现这样一个问题，我在建立标准曲线的时候，我被比稀释质粒后，结果不出现梯度 所以我的标准曲线始终没用建立出来。请帮解释一下！  

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作者: windy+++    时间: 2011-10-13 15:09

我是用探针作小鼠睾丸组织的 实验已经好长时间了 但总是出现这样一个问题，我在建立标准曲线的时候，我被比稀释质粒后，结果不出现梯度 所以我的标准曲线始终没用建立出来。请帮解释一下！  

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 15:11

你好！

我是用探针作小鼠睾丸组织的 实验已经好长时间了 但总是出现这样一个问题，我在建立标准曲线的时候，我被比稀释质粒后，结果不出现梯度 所以我的标准曲线始终没用建立出来。请帮解释一下！

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最高浓度那个点的Ct值是多大啊？copies达到多少了？如果Ct在35以上，再往下稀释基本就不会有梯度了，如果Ct在20左右，那只能从试验的其他方面着手考虑的。您实验是如何操作的，引物探针质量怎样，反应体系、反应条件怎样，模板质量怎样，这些都未知，很难判断。

另外，你样品是RNA还是DNA？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 15:13

好，我有个问题：一个炎症发展到肿瘤，经历几个阶段，我要从这几个阶段检测DNA量的变化，可否不用内参，直接把这几个阶段与正常组织所提的DNA进行量的比较呢（定量PCR探针法）？谢谢你！

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做绝对定量还是相对定量是根据您的实验目的来选择的。二者的区别只举个简单的例子来解释：
相对定量：看药物处理前后，或者不同时间点，目的基因表达量的变化情况，这时，一定要选择管家基因作为校正的。
绝对定量：通过构建好的已知拷贝数的标准品来确定未知样品的量。绝大多数情况做的都是病毒的定量。此时不用管家基因，只要构建好标准品就行。

你看看你的实验是想做什么，就清楚需不需要做管家基因了。另外，相对定量的全称是某个基因的相对表达量分析，既然是表达量分析，那就没有做DNA的必要，做的都是RNA。

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作者: duoduo    时间: 2011-10-13 15:14

请教几个问题：
1，对照是另外一个孔反应还是跟你样品一个孔同时real-time? 对照怎么选？ 常用的对照有b-actin 外还有哪些？ 怎么知道哪一个对照适合自己？
2，质量好点的Realtimepcr KIT哪些公司卖？ 一般里面都有些什么东西？
3，探针的标记5', 3'一般是标什么？ 有没有其他选择？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 15:15

请教几个问题：
1，对照是另外一个孔反应还是跟你样品一个孔同时real-time? 对照怎么选？ 常用的对照有b-actin 外还有哪些？ 怎么知道哪一个对照适合自己？
2，质量好点的Realtimepcr KIT哪些公司卖？ 一般里面都有些什么东西？
3，探针的标记5', 3'一般是标什么？ 有没有其他选择？

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首先建议你看些realtimePCR的科普文章。
1。所谓的对照，大部分指的是内参，即管家基因。目前来看，管家基因的选择还是主要依赖文献。并不是所有的管家基因经过药物处理等一系列实验折腾后表达量仍然恒定，因此目前的管家基因选择一般都选国际上比较认可的。
另外，相对定量还有一个对照组的选择，即未经处理的样本。我更习惯管这种情况叫对照。

2。探针标记的选择，还是根据你的仪器，一般来说，5‘FAM都是比较通用的，淬灭集团可以选择有荧光的，更好的是选择没有荧光的。只要有良好的淬灭效果就行。

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作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-10-13 15:16

你好，我有个问题：一个炎症发展到肿瘤，经历几个阶段，我要从这几个阶段检测DNA量的变化，可否不用内参，直接把这几个阶段与正常组织所提的DNA进行量的比较呢（定量PCR探针法）？谢谢你！

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必须要用内参，而且要用文献报道过的
单拷贝基因作内参，然后再比较正常组织和炎症组织
不加内参对后期分析有很大难度

过来看看，希望楼主指点

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作者: tears    时间: 2011-10-13 15:17

你好，我有个问题：一个炎症发展到肿瘤，经历几个阶段，我要从这几个阶段检测DNA量的变化，可否不用内参，直接把这几个阶段与正常组织所提的DNA进行量的比较呢（定量PCR探针法）？谢谢你！

那有没有必要用目的基因与内参一起做双重PCR呢，还是分开成单管，再进行组与组之间的比较？谢谢！

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作者: tears    时间: 2011-10-13 15:17

你好，我有个问题：一个炎症发展到肿瘤，经历几个阶段，我要从这几个阶段检测DNA量的变化，可否不用内参，直接把这几个阶段与正常组织所提的DNA进行量的比较呢（定量PCR探针法）？谢谢你！

那有没有必要用目的基因与内参一起做双重PCR呢，还是分开成单管，再进行组与组之间的比较？谢谢！

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作者: 微笑的海豚    时间: 2011-10-13 15:18

你好，我有个问题：一个炎症发展到肿瘤，经历几个阶段，我要从这几个阶段检测DNA量的变化，可否不用内参，直接把这几个阶段与正常组织所提的DNA进行量的比较呢（定量PCR探针法）？谢谢你！

那有没有必要用目的基因与内参一起做双重PCR呢，还是分开成单管，再进行组与组之间的比较？谢谢！

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dna的拷贝数变化的研究源于07年又一篇很经典的发在ng上作
艾滋病向关基因ccl3l1的就是用taqman探针，是用单拷贝基因作
内参，所有的拷贝变化都是相对于内参的结果，内参是和目的基因
分开实验，但最好重复三次

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作者: #甜#    时间: 2011-10-13 15:19

为什么不能把两者放在同一管中呢？谢谢

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-13 15:21

dna的拷贝数变化的研究源于07年又一篇很经典的发在ng上作
艾滋病向关基因ccl3l1的就是用taqman探针，是用单拷贝基因作
内参，所有的拷贝变化都是相对于内参的结果，内参是和目的基因
分开实验，但最好重复三次


这篇文章麻烦贴一下地址吧？

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作者: 森林木    时间: 2011-10-13 15:22

我是用试剂做绝对定量的，我的标准品是质粒DNA,现在做标准曲线出现问题
1）我的曲线直线性不是很好，五个点总是不能很好的分布到一条线上
2）扩增效率很大
3）我不明白根据溶解曲线如何来判断样品的阴阳性结果
4）我的阴性对照的Tm的温度居然跟我的标准品一样，但又没有拷贝数，是不是污染了？  

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作者: DONT    时间: 2011-10-13 15:23

我要用的是SYBER Green 染料做，但现在从DNA 做 引物特异性不太好,改变哪些条件会出理想效果?用TAKARA普通的试剂, 谢谢，非常感谢！

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作者: DONT    时间: 2011-10-13 15:23

我要用的是SYBER Green 染料做，但现在从DNA 做 引物特异性不太好,改变哪些条件会出理想效果?用TAKARA普通的试剂, 谢谢，非常感谢！

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 15:24

你好，我有个问题：一个炎症发展到肿瘤，经历几个阶段，我要从这几个阶段检测DNA量的变化，可否不用内参，直接把这几个阶段与正常组织所提的DNA进行量的比较呢（定量PCR探针法）？谢谢你！

那有没有必要用目的基因与内参一起做双重PCR呢，还是分开成单管，再进行组与组之间的比较？谢谢！

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希望你能更详细的描述一下实验目的。你是检测引起炎症的病毒从炎症到肿瘤过程中的DNA拷贝数，还是在这个过程中人体组织中某个基因的变化呢？

如果是前者，你应该做绝对定量，基本上不用做内参了，如果是后者，你应该做mRNA起始的相对定量，而不是DNA的变化量。

PS，我确实没弄明白你的实验目的，仅仅靠自己的感觉说了以上的建议。希望对你有帮助。

另外，没必要做双通道的检测，因为双重PCR引物探针的设计很困难。再加上试剂的优化、条件的摸索，花费时间和成本会比单独检测要高出许多。

内参与目的基因是存在竞争关系的，做PCR的时候不仅仅是简单的将两种引物探针混合在一起配成MIX就能出正常的结果的，其中还涉及到引物探针加入量的调整，反应体系的调整，例如模板加入量，等等，等等，这是个特别浩大的工程。如果材料是RNA起始，还要尝试反转录试剂对这种混合的体系的影响，恐怕就不是我们能想像的麻烦了。

如果本着对科学事业的热爱和崇敬，本着对祖国未来医学事业的深谋远虑，而不考虑毕业、经费等等的实际问题，你可以尝试一下。呵呵～

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 15:24

我是用试剂做绝对定量的，我的标准品是质粒DNA,现在做标准曲线出现问题
1）我的曲线直线性不是很好，五个点总是不能很好的分布到一条线上
2）扩增效率很大
3）我不明白根据溶解曲线如何来判断样品的阴阳性结果
4）我的阴性对照的Tm的温度居然跟我的标准品一样，但又没有拷贝数，是不是污染了？

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1. 线性关系不好主要原因就是模板稀释的问题，只能你自己解决了。
2.理论上来讲，扩增效率大于1是表示反应体系有阻害物，需要从提取那步开始改进，但说句实话，这方面的影响绝对没有模板稀释问题的影响大，解决办法参考上述1。
3.溶解温度曲线没有峰，是平滑的，并且也没有扩增曲线和Ct值，就表示没有扩增，更严谨或者说更可靠的办法是把定量的产物跑电泳，没有条带的才视为阴性。因为当有引物二聚体的时候，仪器也会有扩增曲线和溶解温度曲线，此时，不能仅仅靠这两种曲线来判断是不是阴性。
4.如果不是产物和引物二聚体的Tm值恰巧设计成了一样（当然，这种情况又说明引物设计的不合理），那你的实验就是污染了，还是电泳看一下阴性对照有没有目的带吧。

PS 电泳是个很伟大的发明，太万能了。

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作者: @STAR@    时间: 2011-10-13 15:25

请教个问题：我知道扩增曲线是跟做正常PCR一样，每个循环检测得到的。
可是溶解曲线怎么得到的？
我看了些资料不知道是不是这样理解的，用SYPR GREEN染料时由于PCR得到了产物，由于SYPR GREEN的非特异性，是要做个溶解曲线的。 该曲线就直接在扩增程序完成后，来个95C, 10min，然后从低温如50C左右，逐渐升温，全程扫描。  

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 15:26

请教个问题：我知道扩增曲线是跟做正常PCR一样，每个循环检测得到的。
可是溶解曲线怎么得到的？
我看了些资料不知道是不是这样理解的，用SYPR GREEN染料时由于PCR得到了产物，由于SYPR GREEN的非特异性，是要做个溶解曲线的。 该曲线就直接在扩增程序完成后，来个95C, 10min，然后从低温如50C左右，逐渐升温，全程扫描。

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Tm值的定义是DNA的双链解开一半时的温度.SYBR是嵌合在双链里的荧光,制作溶解温度曲线正是利用了这二点.

第一步: 95度高温迅速降到60度或者更低,是为了能让PCR产物双链比较稳定的存在,相当于一个溶解温度曲线制作的准备过程.
第二步:60度缓慢升温到95度,是为了让仪器每个几秒钟就进行一次荧光信号值的检出,双链持续的打开,当解开到一半的时候,荧光信号值达到最大,然后,继续解链,开始降低,直至最后.

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 15:27

请教个问题：我知道扩增曲线是跟做正常PCR一样，每个循环检测得到的。
可是溶解曲线怎么得到的？
我看了些资料不知道是不是这样理解的，用SYPR GREEN染料时由于PCR得到了产物，由于SYPR GREEN的非特异性，是要做个溶解曲线的。 该曲线就直接在扩增程序完成后，来个95C, 10min，然后从低温如50C左右，逐渐升温，全程扫描。

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Tm值的定义是DNA的双链解开一半时的温度.SYBR是嵌合在双链里的荧光,制作溶解温度曲线正是利用了这二点.

第一步: 95度高温迅速降到60度或者更低,是为了能让PCR产物双链比较稳定的存在,相当于一个溶解温度曲线制作的准备过程.
第二步:60度缓慢升温到95度,是为了让仪器每个几秒钟就进行一次荧光信号值的检出,双链持续的打开,当解开到一半的时候,荧光信号值达到最大,然后,继续解链,开始降低,直至最后.

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作者: @木木@    时间: 2011-10-13 15:28

我的实验目的：一个疾病从炎症发展到肿瘤，要经历几个阶段， 我是要检测在这几个阶段中某个基因DNA的拷贝数。谢谢你！

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作者: 幽兰君    时间: 2011-10-13 15:29

希望你能更详细的描述一下实验目的。你是检测引起炎症的病毒从炎症到肿瘤过程中的DNA拷贝数，还是在这个过程中人体组织中某个基因的变化呢？

如果是前者，你应该做绝对定量，基本上不用做内参了，如果是后者，你应该做mRNA起始的相对定量，而不是DNA的变化量。

PS，我确实没弄明白你的实验目的，仅仅靠自己的感觉说了以上的建议。希望对你有帮助。

另外，没必要做双通道的检测，因为双重PCR引物探针的设计很困难。再加上试剂的优化、条件的摸索，花费时间和成本会比单独检测要高出许多。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 15:30

他做的是遗传的cnv

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谢谢你，看来我确实是青蛙了，还是趴在井底下的，这就去学习学习，还请幽兰君多指教。  

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作者: douding66    时间: 2011-10-13 15:31

我想做药物对TMV(烟草花叶病毒)-RNA的抑制作用，然后需要对TMV-RNA进行定量。我用的是SYBR GreenII，我不想用绝对定量法，相对定量法需要内参，请问TMV有什么内参基因吗？或者是否可以不用内参，直接用用药物处理过的TMV-RNA的Ct值和未处理过的Ct值直接算抑制率呢？

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作者: mod=8048    时间: 2011-10-13 15:32

用Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒在ABI7000上做实时PCR时，无扩增曲线，奇怪的是用实时PCR的产物跑电泳有特异性的条带。望楼主帮分析一下原因，万分感谢！

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 15:32

用Power SYBR Green PCR Master Mix试剂盒在ABI7000上做实时PCR时，无扩增曲线，奇怪的是用实时PCR的产物跑电泳有特异性的条带。望楼主帮分析一下原因，万分感谢！

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两种可能：
1。检查仪器的通道有没有选错，SYBR用的是FAM通道。
2。每个循环荧光信号值检出的步骤是在延伸那一步，如果你设置在了变性95度，那肯定不会有什么信号了。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 15:33

我想做药物对TMV(烟草花叶病毒)-RNA的抑制作用，然后需要对TMV-RNA进行定量。我用的是SYBR GreenII，我不想用绝对定量法，相对定量法需要内参，请问TMV有什么内参基因吗？或者是否可以不用内参，直接用用药物处理过的TMV-RNA的Ct值和未处理过的Ct值直接算抑制率呢？

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我做过烟草叶片的相对定量，用的管家基因是EF1。至于你说的烟草花叶病毒，我没有做过。很遗憾没有帮到你。关于你不使用管家基因，直接对样品定量的方法，其实就是绝对定量。我个人感觉不太适合你目前的实验。一家之言，仅供参考。

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作者: douding66    时间: 2011-10-13 15:35

两种可能：
1。检查仪器的通道有没有选错，SYBR用的是FAM通道。
2。每个循环荧光信号值检出的步骤是在延伸那一步，如果你设置在了变性95度，那肯定不会有什么信号了。

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FAM 是探针用的通道吧，SYBR只选择SYBR dector 就行了吧 ？

我用的是ABI7000，仪器默认在延伸的一步采集信号，好像不能改 。还有我的熔解曲线是倒立的（峰是往下凸出的），也不知道怎么改过来  

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作者: douding66    时间: 2011-10-13 15:35

两种可能：
1。检查仪器的通道有没有选错，SYBR用的是FAM通道。
2。每个循环荧光信号值检出的步骤是在延伸那一步，如果你设置在了变性95度，那肯定不会有什么信号了。

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FAM 是探针用的通道吧，SYBR只选择SYBR dector 就行了吧 ？

我用的是ABI7000，仪器默认在延伸的一步采集信号，好像不能改 。还有我的熔解曲线是倒立的（峰是往下凸出的），也不知道怎么改过来  

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作者: 麻瓜    时间: 2011-10-13 15:35

我做过烟草叶片的相对定量，用的管家基因是EF1。至于你说的烟草花叶病毒，我没有做过。很遗憾没有帮到你。关于你不使用管家基因，直接对样品定量的方法，其实就是绝对定量。我个人感觉不太适合你目前的实验。一家之言，仅供参考。

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同意老大说的，这个课题我建议用绝对定量
建立病毒rna的标准曲线，在衡量用药的情况更容易些

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作者: 胖小妮子    时间: 2011-10-13 15:36

我想做两个基因在疾病分期中的表达情况并比较。想用探针法做，理由是我 就做两个基因，买探针不会太贵，且特异性好些。目前我的引物已经定了，因为我初次接触实验，很多细节不懂，不 知道应该如何做设计的自己实验，目前我 还没有定RT试剂及PCRMIX等，看 了文献，问了别人，他们说先定RT试剂及定RT试剂及PCRMIXPCRMIX，然后不 加探针，就按普通的PCR做做，看看有无表达，摸摸实验条件，待自己熟悉操作后再定探针，你认为呢？
我明年就要毕业了，好着急，希望得到您的帮助。我的困惑就是：1 针对我的 实验目的，我应该选择什么实验方法（相对定量PCR 探针法？还是.....)能让结果更好更简单更快速呢？谢谢!

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 15:36

我想做两个基因在疾病分期中的表达情况并比较。想用探针法做，理由是我 就做两个基因，买探针不会太贵，且特异性好些。目前我的引物已经定了，因为我初次接触实验，很多细节不懂，不 知道应该如何做设计的自己实验，目前我 还没有定RT试剂及PCRMIX等，看 了文献，问了别人，他们说先定RT试剂及定RT试剂及PCRMIXPCRMIX，然后不 加探针，就按普通的PCR做做，看看有无表达，摸摸实验条件，待自己熟悉操作后再定探针，你认为呢？
我明年就要毕业了，好着急，希望得到您的帮助。我的困惑就是：1 针对我的 实验目的，我应该选择什么实验方法（相对定量PCR 探针法？还是.....)能让结果更好更简单更快速呢？谢谢!

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就实验目的来看，想要比较不同时间基因表达变化的情况，你选择相对定量是没有错的，不知道你做的是什么物种，如果不是微生物定量的话，大鼠、猪、人这样的物种，选择SYBR方法不用探针也一样能达到目的。因为现在SYBR方法设计的引物特异性已经很好了，不比探针的方法特异性差。如果你的引物序列已经定了，可以先做定量看看好不好。一般买公司的MIX形式的试剂都有一个推荐的反应条件，基本可以避免大量的摸索条件的时间。

如果你要用探针法的话，就完全没必要先尝试引物好用不好用了，因为探针的设计才是难点，很可能在引物之间根本就找不到探针。请先设计出理论上分析起来很合适的引物和探针再开始买试剂做实验。

还是前几篇帖子说过的问题，探针法，就请用探针法来摸索条件、检测引物探针好用不好用，SYBR法就用SYBR法摸索。用普通PCR检测引物摸条件基本属于浪费时间。当然，这是我个人的经验，也是走了一些弯路后得到的心得。仅供参考。

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作者: qqq111    时间: 2011-10-13 15:37

两种可能：
1。检查仪器的通道有没有选错，SYBR用的是FAM通道。
2。每个循环荧光信号值检出的步骤是在延伸那一步，如果你设置在了变性95度，那肯定不会有什么信号了。

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不知道为什么SYBR要选择FAM通道？FAM不是做探针时用的通道吗 ？

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作者: qqq111    时间: 2011-10-13 15:37

这是我用SYBR 做 realtime 的扩增曲线，请各位帮看一下 为什么会是这样啊 ？正常的扩增曲线应该是是S型往上的。（用此次实时PCR的产物跑电泳，证实有特异性的扩增产物）

图片附件: 55813776_snap.jpg (2011-10-13 15:37, 69.84 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8692

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作者: 胖小妮子    时间: 2011-10-13 15:38

就实验目的来看，想要比较不同时间基因表达变化的情况，你选择相对定量是没有错的，不知道你做的是什么物种，如果不是微生物定量的话，大鼠、猪、人这样的物种，选择SYBR方法不用探针也一样能达到目的。因为现在SYBR方法设计的引物特异性已经很好了，不比探针的方法特异性差。如果你的引物序列已经定了，可以先做定量看看好不好。一般买公司的MIX形式的试剂都有一个推荐的反应条件，基本可以避免大量的摸索条件的时间。

如果你要用探针法的话，就完全没必要先尝试引物好用不好用了，因为探针的设计才是难点，很可能在引物之间根本就找不到探针。请先设计出理论上分析起来很合适的引物和探针再开始买试剂做实验。

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还是前几篇帖子说过的问题，探针法，就请用探针法来摸索条件、检测引物探针好用不好用，SYBR法就用SYBR法摸索。用普通PCR检测引物摸条件基本属于浪费时间。当然，这是我个人的经验，也是走了一些弯路后得到的心得。仅供参考。
yaoshan：你好，我也最近正在准备做real time 呢，看了你帖子的意思是不是说做real time（用syber green）的引物与普通pcr有区别，是否有专门的设计方法，弱弱的问题！

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 15:39

不知道为什么SYBR要选择FAM通道？FAM不是做探针时用的通道吗 ？
望yaoshan兄解释一下，谢谢.....


SYBR与FAM的发射光、激发光波长基本一致，因此，做染料法的时候都选择仪器的FAM通道。

从定量扩增曲线看，是没有任何扩增的，全部都是背景的荧光信号。你的实验电泳有目的带，但却收集不到荧光信号值。此时，又不是我以前描述的两种可能，那只能说明，你忘加荧光染料了。确实没有别的可能鸟～
请你自己看一下仪器的设置吧。

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你好，我也最近正在准备做real time 呢，看了你帖子的意思是不是说做real time（用syber green）的引物与普通pcr有区别，是否有专门的设计方法，弱弱的问题！

定量引物与普通PCR引物设计原则合成级别都是不一样的，定量引物的设计充分考虑了快速升降温的反应条件，因此在某些非特异性反应的控制上，没有普通PCR那么严格，引物的序列也没有普通PCR那么长，这也是为什么不建议大家用普通体系验证定量引物和摸索实验条件的原因。但是定量引物的合成级别高。

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作者: 胖小妮子    时间: 2011-10-13 15:39

SYBR与FAM的发射光、激发光波长基本一致，因此，做染料法的时候都选择仪器的FAM通道。

从定量扩增曲线看，是没有任何扩增的，全部都是背景的荧光信号。你的实验电泳有目的带，但却收集不到荧光信号值。此时，又不是我以前描述的两种可能，那只能说明，你忘加荧光染料了。确实没有别的可能鸟～
请你自己看一下仪器的设置吧。

yaoshan：你好，我也最近正在准备做real time 呢，看了你帖子的意思是不是说做real time（用syber green）的引物与普通pcr有区别，是否有专门的设计方法，弱弱的问题！

定量引物与普通PCR引物设计原则合成级别都是不一样的，定量引物的设计充分考虑了快速升降温的反应条件，因此在某些非特异性反应的控制上，没有普通PCR那么严格，引物的序列也没有普通PCR那么长，这也是为什么不建议大家用普通体系验证定量引物和摸索实验条件的原因。但是定量引物的合成级别高。

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以下的图片是我设置的参数。通道（detector）我只选择了SYBR，你说的FAM没有选，请问这个有问题吗 ？
我是用power SYBR master mix试剂盒做的 SYBR染料等成分都在mix里了，所以不会是没加染料的原因。会不会是染料失效，导致荧光信号减弱呢 ？

注：虽然没有扩增曲线 ，但是熔解曲线是能做出来的

图片附件: 52530402_snap.jpg (2011-10-13 15:40, 56.56 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8693

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作者: BOSS2011    时间: 2011-10-13 16:10

您好！我有 个问题想请教您：
在做定量PCR检测时，尤其是在检测细菌时，都是对基因或基因的一个片段进行扩增与定量，但是对基因的定量并不能说明所要检测的细菌的个数。由于细菌的基因组DNA都是单拷贝的，只要能够设法测定出某个保守基因在细菌基因组DNA中的拷贝数，就可以最后对细菌的数量进行准确的定量。我想问的是目前有哪些方法可以用来测定基因在基因组DNA中的拷贝数？  

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作者: 911    时间: 2011-10-13 16:11

请教: PCR上游引物结尾为A可以否？

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作者: 春雨    时间: 2011-10-13 16:15

我做的是癌和癌前病变和正常组织的基因表达变化，用相对定量2－△△Ct法，该基因在正常组织表达很低，我采用正常组织中该基因表达作为calibrator ＝1，不知是否正确？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 16:15

可以是A，引物的设计原则并不是绝对的，把每条原则整体平衡着看，觉得可以用就行。条条都遵守，是设计不出来的。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 16:16

对照样品的选择主要就是看你想以什么为参照，没有一个绝对的规定。但一般来说都是将未处理的样品作为对照。

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作者: 爆炸头    时间: 2011-10-13 16:18

但我还不是很明白，我的样品作取自癌、癌前病变和正常组织都是没有经过处理的，文献报道该基因在癌组织上是高表达、在正常组织是低表达，那我该取什么作为参照呢？还是说得找一个什么癌细胞株什么的来做对照呢？恳请赐教

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-13 16:21

由于本实验室没有real-time仪器，因此将提供好的CDNA交给公司做后面的qPCR，但是公司用染料法做了一次内参之后，说只有两个标本能够跑出来，其他的均不行，我又拿回来做了一下普通的PCR，结果都有很亮的内参条带，公司说是我的标本有问题，但是我不明白，如果真的有问题，为什么我的普通PCR还是能够跑出来的，我前面的提取RNA和逆转录试剂盒都是天根的，而公司用得好像是TAKARA的。
现在公司又重新用染料法（用我的内参）和探针法（他们的内参）重新对我的标本进行检验，发现阴性对照也有表达，认为是污染，但是此次做得染料法的结果和上次的明显不同，而且相对阴性对照都有污染的话，那么从标本的曲线上看表达还是较低的。
因为我对这方面了解不多，所以想请问一下各位高手，有没有碰到过类似的问题，到底是哪里出了问题，我觉得我的标本没有问题啊，而且阴性对照有表达的话，应该是染料等有污染才对啊，也不能说是标本有问题。
而且公司居然把做完qPCR的产物给扔掉了，并没有跑胶，这点我开始也不知道的，他们之说看机器上的条带就可以了。
请各位高手多给些宝贵建议，谢谢

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-13 16:22

另外一个问题是如果探针和染料两种方法同时做，那么会不会影响结果哪，因为做完之后，发现染料的根本没有溶解曲线。
看看产物怎么样，是不是只看溶解曲线哪，如果证明CDNA有没有降解，还有没有别的办法  

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-13 16:22

cDNA是没有办法验证的，不能电泳，不能OD，只能通过PCR看有没有产物才能确定反转录过程是否成功。跟据你的描述，并不能判断出来到底什么地方出了问题。
你的普通PCR产物测序了吗？如果条带大小和序列都跟内参扩增的序列相同，那么可以肯定是定量没做出来。如果没有这两点支持，恐怕还是很难说明问题。
另外，你有没有totalRNA了？建议你跑电泳，测OD先确定你的RNA是绝对好的。

定量的时候可以SYBR和探针一起做，估计实验条件是相同的，放在不同的反应孔，不会互相干扰的，最后一步再做个溶解温度曲线就可以了。我们实验室为了节省仪器都是这么做的。如果忘了做，只要把定量PCR产物重新放到仪器里单独做一次溶解温度曲线即可。

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-13 16:23

关于对照样品，看你的实验目的。如果想关注癌组织对于正常组织，你可以选择正常做对照；反之亦可。都是根据自己的实验目的来确定的，我不能给你什么意见。做实验前，请先明确目的。

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-13 16:27

在做定量PCR检测时，尤其是在检测细菌时，都是对基因或基因的一个片段进行扩增与定量，但是对基因的定量并不能说明所要检测的细菌的个数。
目前绝对定量定的都是基因的拷贝数，不是细菌个数。
由于细菌的基因组DNA都是单拷贝的，只要能够设法测定出某个保守基因在细菌基因组DNA中的拷贝数，就可以最后对细菌的数量进行准确的定量。
个人觉得理论上这么说是没有错的。如此看来即便是不同的目的基因定出来的拷贝数也都是相同的。但有一点，细菌是分很多种属的，某种基因并不是所有的细菌都有。举个例子，大肠杆菌中可能只有O-157的某几个基因才具有致病性，此时定量，就不能简单的以管家基因代替致病基因。以上都是推测，不代表绝对正确。
我想问的是目前有哪些方法可以用来测定基因在基因组DNA中的拷贝数？
这点参考以上吧。

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作者: HOT兔    时间: 2011-10-13 16:28

http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=13153809&sty=1

麻烦楼主看一下我的胶图? 谢谢!

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作者: fangxiang    时间: 2011-10-13 16:28

但是我的totalRNA都放在-20度好几个月了，降解的也差不多了，而且现在觉得很郁闷的是，我做阴性对照，就是不加CDNA的，周末做了一次，没有条带，今天做了一次，又有结果，同时另外有两个管是分别不加酶和引物的，两个孔都没有条带出来，现在也觉得很郁闷哪，为什么有时候能跑出来有时侯就跑不出来。
我做PCR只是验证一下有没有表达，并没有测序。
另外一个问题是公司用探针法做得，阴性对照都是加的他们的东西，引物也是，也能跑出条带来，这能说明什么问题？

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作者: jude    时间: 2011-10-13 16:29

但是看了您的回复后我还是有几点不明确：

“如此看来即便是不同的目的基因定出来的拷贝数也都是相同的。”
不知这句话如何理解？在一个特定的细菌的基因组中，不同的目的基因定出来的拷贝数为什么是一样的呢？

“但有一点，细菌是分很多种属的，某种基因并不是所有的细菌都有。”
是这样的。但是我需要做的绝对定量只是对某一种特定的细菌的定量，对于特定的细菌来说，总是有特定的保守基因的，这些保守基因在这种细菌的基因组中的拷贝数应该是不会变的。

“大肠杆菌中可能只有O-157的某几个基因才具有致病性，此时定量，就不能简单的以管家基因代替致病基因。”
绝对定量是否需要管家基因我一直没有想清楚，因为只要确定了目的基因(比如您说的致病基因)就可以对细菌定量了。此时又回到了我最初的那个问题：如何通过对基因的定量达到最后对细菌定量的目的？

“这点参考以上吧。”
不好意思，您能否大致说说思路？

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作者: cute    时间: 2011-10-13 16:29

谢谢楼主，但是我的totalRNA都放在-20度好几个月了，降解的也差不多了，而且现在觉得很郁闷的是，我做阴性对照，就是不加CDNA的，周末做了一次，没有条带，今天做了一次，又有结果，同时另外有两个管是分别不加酶和引物的，两个孔都没有条带出来，现在也觉得很郁闷哪，为什么有时候能跑出来有时侯就跑不出来。
我做PCR只是验证一下有没有表达，并没有测序。
另外一个问题是公司用探针法做得，阴性对照都是加的他们的东西，引物也是，也能跑出条带来，这能说明什么问题？

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不建议您继续做下去了，降解光了的RNA即便出了实验结果也没什么说服力了。现在再讨论实验到底怎么回事，也没什么意义了。

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作者: panda王    时间: 2011-10-13 16:30

探针与上游引物重合一部分可以么？  

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作者: qiangren789    时间: 2011-10-13 16:30

我现在用SYBR Green做RT-PCR试验，前两天做了一次，结果阴性批出来了，我当时怀疑是水、引物、MIX(天根的SYBR Green和real mastermix混合而成)被污染了，我今天就把上面的东西全换新的，但是还是批出阴性对照了，做RT-PCR时还应该注意哪些问题？

我还有一个问题就是我在这两次试验的时候，同时都做了标准品的标准曲线，但是一点规律也没有，我重新稀释了两遍还是不行，标准品稀释后的样品得到的Ct值均和阴性Ct值差不多，数值都在17附近，请帮忙分析一下？

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作者: qiangren789    时间: 2011-10-13 16:30

我现在用SYBR Green做RT-PCR试验，前两天做了一次，结果阴性批出来了，我当时怀疑是水、引物、MIX(天根的SYBR Green和real mastermix混合而成)被污染了，我今天就把上面的东西全换新的，但是还是批出阴性对照了，做RT-PCR时还应该注意哪些问题？

我还有一个问题就是我在这两次试验的时候，同时都做了标准品的标准曲线，但是一点规律也没有，我重新稀释了两遍还是不行，标准品稀释后的样品得到的Ct值均和阴性Ct值差不多，数值都在17附近，请帮忙分析一下？

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作者: 阿福    时间: 2011-10-13 16:31

请教：标准曲线法进行多个基因表达的相对定量时是否每做一个基因的同时都要同时做内参

针对同样的标本我有5个目的基因要做相对定量，由于五个基因的扩增条件不同，所以不能同时上机，每次做一个基因。这种情况下，是不是每做一个基因就得同时做内参。

今天某公司的技术支持说每次都得同时带着内参做，如果真是这样的话，那么当内参的扩增条件和目的基因的条件不同而不能同时上机的话该怎么办？

请指教！！

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作者: =菓子=    时间: 2011-10-13 16:32

谢谢你上次给我解答的问题，一直还没感谢您呢!呵呵 ，不过又有新的问题要请教您了！具体如下：
1）麻烦您帮我具体说一下稀释质粒模板时的注意事项和一些细节问题，我现在就是无法避免高拷贝对低拷贝的污染问题；加样顺序如何；稀释模板的时候用不用反复吹打，混匀，瞬离；我的标准曲线就是直线性不好，而且现在还是斜率太大了，扩增效率很高，不知道什么原因。
2）我把定量PCR产物拉PCR,发现标准品居然都没有条带，反而样品有隐约的条带。我用普通PCR拉标准品条带很亮，说明引物没有问题呀，唉 ，奇怪了3）我把我的体系给您说一下啊，您看看是不是体系也有问题，我是用试剂法做绝对定量的：20ul体系---SW 8.2ul ; SYBR 10 ul ; ROX 0.4 ul ; P1 (5umol/l) 0.2 ul; p2(5umol/l) 0.2 ul ; 质粒模板 1 ul
一下写这么多，麻烦您了！

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 16:33

重合2－3个碱基的话，问题不太大。前提是其他各方面的分析都很好。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 16:33

防污染，主要是将新购买的试剂分成小包装；反应混合液配制的地方和加模板的地方严格的区分；枪、枪头什么的也要严格区分。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 16:34

关于标准品的稀释（以10倍稀释举例）
首先注意不要污染试剂和环境。稀释时，先把各个梯度都加上稀释液，一般都是（3ul原液＋27稀释液）用手轻轻弹几下离心管，再离心，此过程反复三次。注意稀释模板时每次原液取出量最少3ul，即每个梯度都是（3＋27）并且每次都要更换枪头，千万不能为了节省枪头而试验失败，浪费更多试剂和时间，得不偿失。

一般来说，标准品应该现用现稀释。

做PCR时，在混合液配制区直接把阴性的管子盖给盖上，然后将分装好的各个管子拿到模板添加区，按照低浓度到高浓度的顺序添加。加模板时，每次都要换枪头。

我现在做定量都是买的mix预混液，其中各组分的量是多少我不清楚，但这个应该是对每个反应都有影响的，您标准品不出梯度，应该不是反应体系的影响。

扩增效率高，主要原因：模板稀释不好；模板中有阻害物。这个问题前面的帖子说过，你实验中注意一下。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 16:34

反应条件不同，引物的扩增效率不同。相对定量为追求准确，反应条件应该是一致，并且管家基因和目的基因应该同时反应，这样才能通过各种数学运算把由于扩增效率不同、模板稀释好坏等一系列问题给校正掉。
我觉得你应该尽量把内参和目的基因的条件给摸索到一致。

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-13 16:35

1、taqman探针如果与上游引物有重合，那就意味着在复性时候，引物和探针是不能同时结合到同一个模板上，那如何利用到taq酶的5’-3’外切酶活性切除荧光基团，从而检测到荧光信号呢？我觉得从原理上分析，最好不要有重合的吧。
2、排除引物和稀释的问题，如果倍比稀释的标准品PE过高，只有一个可能：原液浓度过高，导致抑制效应严重。多稀释几个浓度梯度，在得到的结果里面拟剔除前面1-2个高浓度梯度的点，你会发现扩增效率恢复到1附近。
3、qPCR里面用到的SYBR染液对PCR有抑制作用，所以你会发现得到的条带比普通PCR里面要淡的多，建议你加大Mg离子浓度，会部分缓解这种情况，顺便告诉你qPCR里面最优化的几个参数，都是终浓度，照做就行：Mg离子3mM（最好不要低于2mM），引物200nM，dNTP0.2mM。
3、反应条件不同，引物的扩增效率确实会略有变化，只要带入计算时候用实际的扩增效率取代2就行了，不必苛求每个引物的反应条件都一样，要知道很多时候是无法以一个标准来衡量所有的引物的，有时候过犹不及。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 16:36

请大家思考一个问题，为什么我们想在权重比较高的杂志上发表文章很难。除了进行的研究不够深入前沿外，还有什么原因？是不是在做实验的时候，总是相当然的觉得“这样应该没问题”、“那样模糊的计算一下影响不大”。科学实验应该在我们力所能及的范围内达到“最”严谨。顶尖杂志的编辑每天收到无数投稿，我们的文章凭什么能过关？首先就是要让人家挑不出实验过程中的硬伤。这种硬伤除了反应在实验设计流程上，还体现在是否严谨上。

举个简单的例子：相对定量管家基因的选择，有几个人真正的验证过，你实验组的动物模型所经受的各种药物或其他处理是不会影响管家基因的表达？多数只是查查资料文献，就随意选择一个。当然，并不是说，我们不能应用众所周知的实验结论，可是，对于这个结论的获得又有几个人真正的找到过根源？

除了毕业证，实验究竟能带给我们多少收获？
我们这么多年的学习到底为科学研究贡献了多少有价值的成绩？除了拉动内需。

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-13 16:36

验证看家基因是否属于最优化的内参基因，最好的方法就是在你研究的所有样品里面做绝对定量，看看P值是否小于0.05，否则别无它法。但是绝对定量只能验证该基因是否合适，一旦不行，还要另外寻找别的来做绝对定量。到目前为止，已经找到几百条看家基因，可惜遗憾的是，还没有哪一条看家基因，属于我刚才说的绝对意义上的内参基因——表达无论任何时候、任何处理下永远不变。就这个层面上而言，说得绝对点，使用单个看家基因得到的结果其实完全都是***，可惜目前大家公认就是这样罢了，谈到看家基因一窝蜂的用actin、gapdh等等，得到的结果就那样罢了，很多审稿人也不懂这个，一窝蜂就一窝蜂呗，反正大家默认这个成立了，可惜的是，默认的这个前提就错了。至于你认为我说的看家基因和研究基因可以不同批跑这个观点不对，进而认为我是想了当然，过于严重了点吧，呵呵！我说的那个是事实，如果非要同批跑，只能是过犹不及，和是不是很严谨，完全是两码事。

顺便提下，我做qPCR现在都不玩单看家基因，真正严谨的应该是从多个看家基因里面选择最稳定的3-5个看家基因的组合，然后以此为基础计算出一个标准化系数，在这个基础上再进行相对定量的计算，这个老外已经玩的很娴熟了——GeNorm算法+qbase软件，这个算法应该是目前做相对定量最权威的算法，可以参考今年plant cell8月份的一篇letter。如果等你回头做完了多参照基因得到的表达结果，再回过头来看单参照基因，你就会明白什么叫垃圾结果？你也就会明白为什么我说同不同批跑其实影响不大？  

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作者: @木木@    时间: 2011-10-13 16:37

用SYBR Green做RT-PCR时，其他条件一样的情况下，体系从15ul降到10ul，对实验结果影响很大吗？  

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-13 16:38

没影响，相应调整加入量就行了，我一直都是做10ul体系，节约材料么。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 16:39

用SYBR Green做RT-PCR时，其他条件一样的情况下，体系从15ul降到10ul，对实验结果影响很大吗？

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不同的仪器对反应体系的要求是不同的，不能简单的将体系等比例缩小或放大。即便是在同一台仪器上也是需要经过实验才知道有没有影响的。

如果你实验样本量不太大，不太建议你降低反应总体积。如果样本量很大，降低体积能节省大量成本的话，你可以先选择某几个比较有代表性的样品做一下15ul和10ul的对比，看Ct值是否有滞后。以防万一最后答辩时被问到这样的简单问题，撒谎心虚，不撒谎又对不起这么久的努力。

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作者: loli    时间: 2011-10-13 16:39

我准备采用SYBR Green做REAL TIME PCR.ACHN人源细胞裸鼠造模，肿瘤组织用invitrogen trizol提组织RNA，OD值1.9左右。逆转录用的MBI的盒子。
拿到引物，做普通的RT-PCR摸条件，有两个目的基因一直P不出来，退火温度从55-60都试过，cDNA的浓度2300ng/ul。1ul的模板，25ul体系做的。后来用ACHN细胞提RNA，OD值1.9左右。cDNA的浓度也在2000以上。逆转录后在60度退火温度下两个目的基因P出来了，条带很清晰，目的基因低表达。
用组织的cDNA原液3ul，25ul体系，60度退火温度下两个目的基因还是P不出来。
现在没办法，请大家指教！

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作者: dmg    时间: 2011-10-13 16:40

你好!
我刚开始做实验,合成引物的时候不知道应该怎么设计就在文献中找了一个realtime的引物序列,现在做的时候才发现文献中的引物是大鼠的,而我的标本是小鼠的! 我用所合的引物做了一次普通PCR,结果还行,只有一条带,只是有一些拖尾.但我做realtime的时候,融解曲线不是很理想.
我比对了大鼠和小鼠的基因序列,每对引物里面只有1-2个碱基的差别,我还需要另外合成引物吗?用大鼠的引物会不会对我的realtime的结果产生影响?
谢谢!

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作者: free    时间: 2011-10-13 16:40

如果大鼠和小鼠的引物序列差别的这一两个碱基只是在引物的5‘端，个人认为问题不是很大，但是如果是在3’端，那就会严重影响PCR的效果了。但是你提到做溶解曲线的效果不是很好，试着提高下退火温度，如果还是用双峰，建议还是更换更加合适的引物吧，个人一点拙见！

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作者: TAT    时间: 2011-10-13 16:41

本人第一次做有关逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的实验，所以对很多东西都不懂。现在想向各位请教荧光定量RT-PCR的步骤，是用SYBR GREENⅠ染料，待测物质为IL-6和IL-10。谢谢各位！

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 16:41

准备采用SYBR Green做REAL TIME PCR.ACHN人源细胞裸鼠造模，肿瘤组织用invitrogen trizol提组织RNA，OD值1.9左右。逆转录用的MBI的盒子。
拿到引物，做普通的RT-PCR摸条件，有两个目的基因一直P不出来，退火温度从55-60都试过，cDNA的浓度2300ng/ul。1ul的模板，25ul体系做的。后来用ACHN细胞提RNA，OD值1.9左右。cDNA的浓度也在2000以上。逆转录后在60度退火温度下两个目的基因P出来了，条带很清晰，目的基因低表达。
用组织的cDNA原液3ul，25ul体系，60度退火温度下两个目的基因还是P不出来。
现在没办法，请大家指教！

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如果能够明确不是定量引物和试剂和反应条件的问题，请将定量PCR产物作为模板扩一下二次PCR，二次可以是普通，也可以是定量，最后电泳看有没有产物。有的话说明表达量太低，没有意味着实验别的方面出现问题。

定量请摸条件，个人认为，普通PCR摸条件对定量没什么特别的指导意义。另外，你的模板浓度是不是太高了一些啊？我一般才用到你的1/20。模板浓度太高对PCR是有阻害的，当然你的模板浓度应该不会有那么大的影响，致使没有产物。请问引物是以什么物种设计的？你的RNA最终提取的是人还是鼠？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 16:42

你好!
我刚开始做实验,合成引物的时候不知道应该怎么设计就在文献中找了一个realtime的引物序列,现在做的时候才发现文献中的引物是大鼠的,而我的标本是小鼠的! 我用所合的引物做了一次普通PCR,结果还行,只有一条带,只是有一些拖尾.但我做realtime的时候,融解曲线不是很理想.
我比对了大鼠和小鼠的基因序列,每对引物里面只有1-2个碱基的差别,我还需要另外合成引物吗?用大鼠的引物会不会对我的realtime的结果产生影响?
谢谢!

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内含子情况明确嘛？你可以在NCBI上将RAT的引物做BLAST分析，看能否blast出小鼠的序列。引物上1、2个碱基错配在什么位置啊？另外，你的定量条件优化了嘛？

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作者: PCR    时间: 2011-10-13 16:43

如果能够明确不是定量引物和试剂和反应条件的问题，请将定量PCR产物作为模板扩一下二次PCR，二次可以是普通，也可以是定量，最后电泳看有没有产物。有的话说明表达量太低，没有意味着实验别的方面出现问题。

定量请摸条件，个人认为，普通PCR摸条件对定量没什么特别的指导意义。另外，你的模板浓度是不是太高了一些啊？我一般才用到你的1/20。模板浓度太高对PCR是有阻害的，当然你的模板浓度应该不会有那么大的影响，致使没有产物。请问引物是以什么物种设计的？你的RNA最终提取的是人还是鼠？

准备用东洋纺的实时定量试剂盒，他们给的有退火温度，（60度）引物是实验室推荐的一个代理设计合成的(北京三博），模板浓度确实高了，后来稀释了10倍，还是没出来。引物是按人的物种设计的，毕竟是人源细胞ACHN，裸鼠造模获取的瘤组织。当时为了保证所取的瘤组织是人源的，裸鼠的瘤组织取的时候把周围瘤组织都放弃了，只取中间的瘤组织。不知道说清楚了没。 我在人源ACHN细胞株可以把目的基因P出来，（目的基因低表达）瘤组织的话 在退火温度和模板浓度都试了很久，还是没P出来。
分析原因如下：
1：组织低表达，没P出来
2：基因变异，引物设计没问题，在基因变异的那段序列没P出来
3：RNA降解
准备换对引物试一下。
请问大家还有什么高见？
谢谢  

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作者: @花开花落@    时间: 2011-10-13 16:45

老师好，我不是分子生物学专业的，但是现在需要用RealtimePCR的方法做实验，看书又不懂，请教您个关于实验思路的问题.首先，我在前期给猪攻毒，然后在不同时期采集猪的外周血，后得到CDNA，我的试验 目的是检测不同时期三种不同的细胞因子的转录动态。目前，我已经构建了参照基因既猪的管家基因的质粒，以及目的基因的质粒，并摸索到最合适退火温度，但是下面不知道怎么做了，怎么上荧光定量PCR，我的想法是首先做管家基因的标准曲线，然后再做细胞因子1的标准曲线及不同时期的转录水平，然后做其它的两个基因的转录水平。但是，就是不知道这样做是否可行，数据又是怎么处理的！请赐教！谢谢！

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 16:45

大体的过程你可以参照本帖第一页2楼的流程来做。至于是绝对定量还是相对定量，前面也已经贴过，你自己参考一下。

需要说明的是，如果你是从RNA起始，尽量构建RNA标准品，因为质粒标准品与你的样品（RNA）之间差了反转录，中间有一个反转录效率差异的问题，其影响到底有多大是每个实验都是不同的，并且是无法不能确定的。目前你已经构建了质粒的标准品如果不想弃用的话，只能忽略此步骤。

关于数据处理，还是看你自己选择的实验方法，如果相对定量，可以先用管家基因的定量值校正目的基因，然后在进行样品间的校正，即用对照样品校正检测样品。

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作者: 冰儿0109    时间: 2011-10-13 16:46

实时PCR遇到了这样的问题：
用Power SYBR Green PCR Master Mix(2X)试剂盒，仪器为ABI7000，一直得不到S形的扩增曲线（扩增曲线弯弯曲曲往下，Ct值也检测不到），熔解曲线的峰是有的。问题是我用实时PCR的产物跑电泳，结果显示有特异性的扩增产物被扩增（条带很清晰，无拖尾、无杂带 ，也无引物二聚体），每次做都是这种情况。
现在可以排除试剂盒的原因（用过3个试剂盒，结果都一样），也能排除仪器及仪器设置的原因（在MJ实时PCR仪上做的结果跟在ABI7000上做的结果类似）。至于反应体系，反应条件我试过n个了 ，按照试剂盒说明书提供的参考体系和反应条件，还是做不出来 。
图片中是我的扩增曲线。
等待各位高手救援！ 非常感谢！

图片附件: 90261275_snap.jpg (2011-10-13 16:46, 69.94 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8697

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作者: tieshazhang    时间: 2011-10-13 16:47

你好！~
我的实验要做实时荧光定量PCR，但是我对此存在很多疑问，想向你请教几个问题。
我的实验大概是这样的：测定药物对某个基因mRNA表达的影响。实验分了阴性对照组、阳性对照组和不同剂量的给药组。此前已经提取了组织RNA，并用逆转录试剂盒转录成cDNA，没有及时做荧光定量，所以-80度保存近50天了。现在荧光定量PCR试剂盒（TIANGEN的RealMasterMix (SYBR Green)）和引物(目的基因的和内参基因的)都回来了，我还是不知道要怎么做。

问题1：我想把阳性对照组、不同剂量的给药组都和阴性对照组去比，你说我是不是应该做相对定量呢？

我看见有的文献是这样的：配好反应体系，反应条件：94℃2min; 94℃25s,58℃30s,68℃30s,40cycles(每个循环后自动读板1次),68℃延伸5min, 做55℃-95℃的融解曲线分析, 12℃终止反应。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析特异性。根据绘制的标准曲线得到目的基因及内参基因表达的相对浓度, 以目的基因及内参基因相对浓度的比值来反映表达量。每个样品做3个平行管。

问题2：这个文献上的方法做的就是相对定量吗？
问题3：反应条件中的“每个循环后自动读板1次”是什么意思？
问题4：55℃-95℃的融解曲线分析怎么做呢？
问题5：终止反应的温度如何确定？
问题6：“根据绘制的标准曲线得到目的基因及内参基因表达的相对浓度, 以目的基因及内参基因相对浓度的比值来反映表达量。”这句话具体怎么操作呢？
问题7：我看见有的文献上提到“2- △△CT法”，这和问题6中那句话所表达的是一个意思吗？或者说两者之间有什么区别呢？

我看了本贴所有内容，但是还是不明白，还有很多问题，所以要麻烦你了。希望能够得到你的帮助，浪费你宝贵的时间了。

先谢谢你！~

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 16:50

如果定量产物电泳有目的带的话，说明你的定量实验是完全没有问题的，没有扩增曲线说明你荧光信号收集这一步有问题，请参考仪器的说明书进行设置吧。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 16:50

1 如果是想看处理前后基因表达量的变化的确是选择相对定量。
2 您描述的方法是相对定量的方法，因为绝对定量可以不做管家基因的。但有一点强调一下，不能一味使用文献的反应条件。你已经购买了成品的试剂盒，那先按照试剂盒推荐的反应条件进行预实验（引物验证、条件摸索等）
3 自动读板指的是在退火或者延伸的时候进行一次荧光信号值的检出，定量PCR所谓的实时监控就是指每个循环过后都收集一次荧光信号值。
4 溶解温度曲线是反应仪器自动做的，只要你将步骤设置好即可。
5 所谓的终止反应是很早之前没有成品试剂的时候需要加入一些能使酶失活的试剂，或者将温度调整到酶失活的温度，进而阻止PCR反应继续进行。
6&7 所指的是相对定量获得定量结果的两种计算方法，6是标准曲线法，即通过制作一条标准曲线，将所有样品都在这条标准曲线上定量；7是△△CT法，该方法也能获得定量结果，与6的差别可以参考以往的帖子，或者google一下△△CT法，里面有讲述具体是怎么回事。我所了解的全部信息也都是google的，呵呵，这里就不浪费论坛资源了。我们实验室比较少用这种方法。主要原因是使用△△CT法之前还是需要做标准曲线来确定扩增效率。

本帖子不是定量的科普贴，其中很多问题都没有涉及到，并且前文说的都是很简略的定量步骤，目前只是就大家的问题讨论一下，因此，你光看本贴是远远不够的，论坛上很多战友共享了定量的诸多文献和资源，你可以下载来看一下，大部分都是很好的教材。

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作者: dreaming    时间: 2011-10-13 16:50

我刚才看到一句话：“荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。”
这句话具体怎么理解？你能解释给我听吗？谢谢~

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作者: 猫屎一号    时间: 2011-10-13 16:51

我刚才看到一句话：“荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。”
这句话具体怎么理解？你能解释给我听吗？谢谢~

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以上是网上能查到的官方的对于阈值的设定方法，一般还有一个摸索出来的经验，对于ABI的仪器，想要人为的调整阈值，可以设定在最大荧光信号值的1/5处。有一点请注意，除非你的数据有偏差特别大但又不想舍弃的孔，可以人为调整阈值，否则，还是尽量用仪器生成，毕竟仪器的计算比人眼睛估算要准很多。

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作者: duoduo    时间: 2011-10-13 16:58

你好！
你的意思是说荧光阈值是仪器自动生成的，一般不需要人为设定，是吗？

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作者: dotaaa    时间: 2011-10-13 16:59

你好!我是初次接触PCR。问一个最基础的问题，设计合成引物前，如何查找目的基因序列呢？是在PubMed网站中选择Search “Nucleotide”，然后键入基因名称吗？
以此为例，如果搜寻结果为：
Items 1 - 20 of 104
This search in Gene shows 32 results, including:
Aqp4 (Rattus norvegicus): aquaporin 4
Aqp4 (Mus musculus): aquaporin 4
AQP4 (Homo sapiens): aquaporin 4

1: NM_009700
Mus musculus aquaporin 4 (Aqp4), mRNA
gi|160415210|ref|NM_009700.2|[160415210]


2: NM_207650
Mus musculus dystrobrevin alpha (Dtna), transcript variant 1, mRNA
gi|95113657|ref|NM_207650.3|[95113657]
......
我的问题是:
Q1.哪个是基因bank号呢？以第二个搜索结果为例，是“NM_207650 ”？还是“NM_207650.3"？还是"[95113657]" ？
Q2.根据最先显示的结果：
“Aqp4 (Rattus norvegicus): aquaporin 4
Aqp4 (Mus musculus): aquaporin 4
AQP4 (Homo sapiens): aquaporin 4 ”是意味着只有“Rattus norvegicus”、“Mus musculus”、“Homo sapiens”三个种属来源吗？
Q3.是大鼠属于“Rattus norvegicus”，小鼠属于“Mus musculus”吗？我要找的大鼠类型又如何寻找呢？
Q4.如果此基因只有三个种属来源，其搜索结果右边的
“Top Organisms [Tree]
Homo sapiens (40)
Mus musculus (15)
Rattus norvegicus
Macaca mulatta (7)
Macaca fascicularis (5)
All other taxa (29)”又是什么意思呢？
问题问的太浅显了，真不好意思。耽误大家时间了！但我真的弄不明白又十分渴望弄明白！谢谢！

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作者: one    时间: 2011-10-13 17:00

你好：
本人通过荧光定量PCR来分析基因在组织中的表达，现在所P条带，除目的带外，还具有比较明显的二聚体，导致Real-Time时出现2个峰，请教各位大侠，如何在现有引物条件下，减少甚至去除二聚体？（已试过退火55到57，模板量1/2，1/10，但都没有多大效果）

谢谢指教！

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作者: applebook=213    时间: 2011-10-13 17:00

大家好！
本人最近在做特定基因在组织中的表达分析，一般PCR检测只有目的带和很明显的二聚体，但Real-Time溶解曲线却显示跑出2-3个峰（图添加至附件），应当是引物出现很大的问题，特请教各位高手，能否帮忙设计对引物，我的内参基因的退火温度为55度。谢谢！
序列如下:
ACCATCCAGTGGACCATCATCATTAACATTTTGGTGTGGTTGGGCAGCTTCCTTCTGAGCATCCCGGTCATGATATATGCTAAAGTCATCTCCAAAAAGAACATGAACATATGTATGATTAACCTGGATGGGCCTCAGGATATGTACTGGTACACACTCTACCAGTCCATGCTGGGTTTCATCGTCCCCCTCATTATAATAAGCACATTTTACACTCTCACTCTGTACCACGTGTTCCGCTCCATCCGGCGGGTCAAACGCAAGCAGTCAGTGTGGGCCAAGCGGGCCACTAAGACAGTTGTGATGGTGATCGCCCTGTTCTTGGTCTGCTGGTCTCCCTATCATGTCATCCAGGTGATCAACCTC

谢谢大家啦！

图片附件: 55292155.jpg (2011-10-13 17:00, 52.27 KB) / 该附件被下载次数 18
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8698

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-13 17:13

AATAAGCACATTTTACACTCTCAC
AGACCAGCAGACCAAGAAC
退火温度56°，扩增长度139bp.

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-13 17:19

顺便问下，这是什么物种的内参？长度这么小，前不见ATG，后不见TCC，亦不见Poly A，你找的是其中的一个片段吗？设计引物只是拿其中的一个片段，这个是最忌讳的吧，失败的可能性很高，最好拿NCBI里面确定功能的cDNA或是mRNA序列来设计引物。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 17:25

序列的查找完全看你的实验目的，这方面的问题，你问任何人都不如依靠自己来得可靠，因为没有人会比你更了解自己的实验目的和实验背景。并且目的基因序列的确定是实验成功的大前提。

Q1 ：NM_207650 与NM_207650.3表示的是不同的转录体，一般来说，不同转录体之间都会有比较微小的差异，此时你需要确定，你的实验目的是准备区分不同的转录体而分别设计特异性的引物，还是准备设计一对引物能同时扩增各种不同的转录体的引物。

Q2：因为不知道你NCBI前几个步骤的参数设定，因此我无法确定aquaporin 4基因是不是只有这三个物种有该基因，但据常理判断，其他物种也应该有。

Q3：“Rattus norvegicus”表示大鼠 ， “Mus musculus”表示小鼠，“Homo sapiens”表示人。NCBI物种的表示方法多数是有拉丁来历的英文单词，或者说是学名，而非我们日常生活的常用单词，因此，可能辨别起来比较困难，但google是个很好用的搜索引擎，只要在首页将你不认识的单词输入，点击搜索中文网页就可以了。

Q4：表示不仅仅只大鼠、小鼠、人有该基因，还有其他的物种有。

PS：NCBI的搜索是会搜到很多写法相似的基因的，因此，你要看仔细，别马虎选错了。

关于NCBI的使用方法，论坛上有人发布过，很全，你可以找来看一下，呵呵，只是版本有点老，但无论如何看了都会有很大收获的。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 17:25

先确定两个问题：1 定量产物电泳过么？看看到底几条带，大约是多大；2 如果是RNA起始的模板，引物设计有没有跨内含子？或者模板有没有做DAN分解酶的处理？这两点是基于距离最高的89°峰旁边的84°小峰问的。但你的引物二聚体确实很严重，会影响扩增效率。二聚体跟上述两个问题没有关系。

并且貌似89°主峰还有不同的情况产生，比较尖锐的那个峰没有二聚体也没有非特异性反应，另外一堆反应杂峰比较多，主峰也不明显，都不太好判断啊。这是同种基因的两种不同的模板 还是两个不同的基因，恰巧产物TM值完美的重合了？呵呵，能详细说说么？

这段序列是你自己测序得来的么？我在NCBI上没有查到相似的序列。以下是我设计的引物，只能保证理论上的充分合理性，不能保证实际使用也完美，呵呵，仅供参考。
F：5‘－GGTCAAACGCAAGCAGTCAG－3’ 位置252
R：5‘－ATAGGGAGACCAGCAGACCAAG－3’ 位置342
产物大小91 bp
退火温度的参数设定是55°－60°，具体你自己摸索一下，因为我个人感觉不同的设计软件Tm的算法都不太一样，有时候差异很大，但一般，55退火 72延伸问题不会太大。

另外，你的这段序列很短，不知道是不是在一段序列中截取了一部分。如果是这种情况，建议你先不要使用我提供的这对引物，因为我只将引物在你提供的366bp上分析了一下，没有在全序列上分析，很难保证在全序列其他位置没有错配。或者你自己用oligo分析一下。

我能帮的就这么多了，祝你实验顺利。

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作者: 椰子叶子    时间: 2011-10-13 17:27

谢谢你帮忙设计引物。希望效果可以

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作者: 椰子叶子    时间: 2011-10-13 17:27

.由于是在别人机子上跑的，没有拿到定量产物，所以没有电泳过；是以RNA为起始的模板，引物设计应当没有跨内含子。

2.昨天忘记讲啦，由于数据也是别人处理后发给我的（自己没有软件），所以上图应当是我的内参基因和目的基因的叠加图谱，高峰的应为内参基因的，而目的基因的跑的很差，出现多个峰（而我用一般PCR跑胶时，只显示很亮的目的带和明显的二聚体）。

3.这段序列是我通过设计兼并引物P出来的，而5‘和3’RACE半年都没有成功（几近崩溃），不得已取其中间片段进行组织表达分析。

4.最近上下游引物各设计了5条，组合后，也没有P出满意的条带，单一目的带到是有几对，但二聚体还是很明显，

希望多多指教！

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作者: 大桃子同学    时间: 2011-10-13 17:28

Rattus norvegicus 是褐家鼠，它能代表所有大鼠吗？我找到三个Rattus norvegicus 来源的基因序列，我该如何判断哪个是我所要的呢？

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作者: 天蓝蓝    时间: 2011-10-13 17:29

我最近才开始做荧光定量PCR。结果遇见问题。在这里想请教园子里的高手帮忙一下。我最近在做标准曲线，用的是b-actin，但是我的阴性对照出结果。（未加模板组）。大概是在21个循环处。实验组在19个循环处。我最初认为是污染。将引物重溶，换新水，加样枪与模板枪分开，包括实验区均换。仍有扩增。考虑是mastermix污染。做了以下两个验证：1）又重新做RT，换新的cDNA。结果是，实验组在30个循环处，阴性对照在32个循环。故考虑是新合成的cdna效率不好，拷贝数太低的原因。2）拿别实验室的mastermix做，模板用的是以前的cDNA，结果是实验组ct为19，阴性对照ct为35。本来做到这里，我可以肯定的认为是mastermix污染了。但是仔细一想觉得还是不对。因为如果mastermix污染，那么在验证1）时，ct值不应该那么低，因为不该受新合成cDNA的影响。以前的阴性对照ct值也很高，至少是23呀。所以很糊涂，能否给点提示？究竟是为什么？

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作者: DDD    时间: 2011-10-13 17:29

请教诸位大侠,我最近看了一篇SCI文献,是关于REAL-TIME RT-PCR 的,表中两个地方不知道什么意思,请教诸位啊,非常感谢,我的邮箱:legandsky@163.com,万分感谢!!!

表如下:请问表中Control means,Sample means指什么?
Randomizations 1,000 of 1,000 done.怎么解释?是什么意思?谢谢,原文请见链接!

图片附件: 92322790.png (2011-10-13 17:29, 38.95 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8699

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作者: DDD    时间: 2011-10-13 17:30

我的一篇文章退修(BMC cancer),是在乳腺癌检测某指标,采用real time rt-pcr方法 ,内参选择GADPH,退修意见说,仅选择一个内参不够,应该选择多个,我看很多国外文章都是选择一个啊,退修意见原文如下:
The PCR analyses have been nicely performed. However, since GAPDH has
been shown to be influenced by different stimuli, several housekeeping genes
should have been used.

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 17:30

辑说的是，你实验中不同的处理对GAPDH是有影响的。修订方法估计有两个：一，通过文献找论据证明GAPDH是不受影响的，或者如果你样本量够大，有统计学意义的话，可以将GAPDH的定量结果计算一个P值（如果你实验没有用标准曲线法定量的话，只能再做一次实验了）；二，按照编辑要求补做其他的管家基因。

mean 是平均值.文章我只是大概看了一下，control值的是normal tissue,sample指rectal cancer。不过，就定量PCR描述的那一部分还是比较严谨的。大家做的时候可以参考一下，涉及到了DNase处理的问题。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 17:31

想知道是不是试剂污染，只有更换所有的试剂（primix、 primer、 水 ）包括枪头，做一次阴性对照的反应，与此同时，再将原来的试剂做一次，如果新试剂没有扩增，旧试剂有，就说明是污染。

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作者: +田田+    时间: 2011-10-13 17:31

我想可能是污染了.我现在决定更换mastermix.但是我很纳闷的是如果有污染,为什么只是换了cDNA模板,ct值就明显上升了.理论上说,如果有污染,ct值从理论上不应该有太大的变化.能否帮我解释一下.谢谢!

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作者: 3N4G    时间: 2011-10-13 17:32

非常感谢您的宝贵意见,我想问Control means,Sample means指什么的平均值?
CT值的平均值吗?
Randomizations 1,000 of 1,000 done.怎么解释?是什么意思?谢谢,原文请见链接!

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作者: @STAR@    时间: 2011-10-13 17:33

我最近做PCR，用的是ABI7000，请问slope值和R2值和什么因素有关？谢谢

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作者: 3N4G    时间: 2011-10-13 17:33

接楼上,图片如下,万分急切啊!!
Randomizations 1,000 of 1,000 done.怎么解释啊?

图片附件: 62311191.png (2011-10-13 17:34, 38.95 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8700

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作者: 泉水叮咚    时间: 2011-10-13 17:35

各位高手
好
我最近做定量PCR ，是用的染料法
但是在做不加模板的阴性对照时，老出现起跳，ct值大概在36-39之间，看溶解曲线好像是和产物差不多位置。但是中间有几次又没有出现起跳，而且看溶解曲线也是没有出现扩增。
为了解决这个问题，我换引物，水，试剂盒，实验地点。在这期间，一直是偶尔没有，大部分时间有扩增，我之前看到说仪器的样本孔污染也会造成这样的情况，想问问各位是有这种可能吗？

而且每次都是之前单做标准曲线的时候有可能是阴性，但是紧接着做样本的时候就会出现阳性？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 17:36

首先，你要电泳确定阴性对照产生的到底是引物二聚体还是污染了模板的特异性扩增。因为阴性对照没有加入模板跟引物竞争，因此很容易出现二聚体。而单独看扩增曲线和溶解温度是无法确定是否为二聚体的。

仪器孔污染确实有这种可能性，但个人觉得还是先确定一下可控的因素比较稳妥。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 17:37

首先，你要电泳确定阴性对照产生的到底是引物二聚体还是污染了模板的特异性扩增。因为阴性对照没有加入模板跟引物竞争，因此很容易出现二聚体。而单独看扩增曲线和溶解温度是无法确定是否为二聚体的。

仪器孔污染确实有这种可能性，但个人觉得还是先确定一下可控的因素比较稳妥。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 17:37

这两个参数跟实验中任何一个因素都有关系，包括你的体系配比、引物扩增性能、模板稀释等等。

最直观的，R2(相关系数)，表示标准曲线的线性关系，越接近1越好。斜率反应的是PCR的的扩增效率，官方的解释是，扩增效率比较低，是引物设计的不好，需要更换引物，如果扩增效率太高，说明体系中有反应阻害物，需要改进提取的方法。但更多见的，是因为标准品稀释的不准确造成。

唉，我怎么觉得以上的话，我已经在这个论坛上写过好几遍了。

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作者: 04906    时间: 2011-10-13 17:38

今天一天都再想该如何继续进行我的realtime试验。
希望潇湘子能尽快看到。谢谢啊
我再做细菌基因表达的相对定量试验。设计了三对探针和引物，其中一对是细菌的16s内参基因的。找的是国内的闪晶合成的。完全的自学到现在，磕磕碰碰的，到现在才大概明白要把这三个基因的扩增效率调整到一致。或者是用双标曲来校准我的扩增差异。
试验结果是这样的：分别用这三个基因构建了质粒的标准品，进行梯度标准曲线的绘制。结果还是可以的，单扩增效率一个是91%，一个是97%，一个是101%（16s）。这下可郁闷了，探针不能重新合成的，也不知道该怎么优化。
但又感觉用质粒做标准品对实际样本中的cDNA的扩增是有差异的，拿cDNA做标曲问题却更大了，内参基因的拷贝数非常高，稀释个5次方没有问题，但我要检测的基因原液的ct值也只有25左右，稀释5倍也只能勉强3个梯度，而且扩增效率更加不理想了！
现在想直接进行内参的相对定量是否可行？但内参基因的ct值直接做基本上不到8，而目的基因基本上都在27左右，再加上用质粒做出来的三个探针的扩增效率并不一致。这样下去，我还应该如何设计我的试验呢？
每一次都带上cDNA进行标准曲线的相对定量么？还是采用2倍稀释呢？内参和目的基因差异这么大，是否可以做内参基因扩增的时候把模板多稀释10或100倍呢？
苦恼中。。。等待高手的解救。。。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 17:39

相对定量有两种计算方法，对于实验者来说各有优劣，下面简单说明一下：
1。标准曲线法。相对来说，这种方法比较准确，是传统的定量方法，用已知量的标准品来确定未知样品量。发明定量方法的诸位科学家经过一系列的数学计算发现，Ct与模板起始量的对数成反比的线性关系。于是，我们就大方地拿这现成的理论来应用。这种方法不必考虑扩增效率是否一致的问题，只要大致相同、偏差不太大就可以。但是，对于我们实验者来说，制作标准曲线本身就是件相当麻烦的事情。如果能从样品中选择一个基因表达量比较高的样品作为标准品还算幸运，如果不能的话，就只好构建一个标准品。这是异常麻烦的事情。

2。- △△CT法。这是目前很受欢迎的一种方法，省去了制作标准曲线的麻烦，节省了试剂和时间。但该方法有种硬伤，那就是各种基因的扩增效率必须一致，并且是1。如何能看到扩增效率是多少？是否一致呢？还是需要制作标准曲线。

肯定有人要问，既然使用该方法需要提前制作标准曲线来考察扩增效率，那又何必使用- △△CT法呢？其实，如果样本量很大的话，还是建议使用△△CT法。例如，仪器96孔一下子放不下那么多样品，为了严谨，必然每次反应都同时制作一轮标准曲线，这样确实麻烦。此时，如果能保证稳定成1的扩增效率，- △△CT法是最佳的选择。

当然，目前实验室用的- △△CT法有很多都不做标曲，不看看扩增效率，基本上是直接忽略掉了。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-13 17:40

扩增效率没有什么特别好的优化方法，就我做实验的水平来看，扩增效率每次都不一致，偶尔模板稀释的不好，还会有很大差距，因此，估计idealhy1多做几次标曲，会有比较接近的数值，呵呵。方法比较笨，希望还有达人能指教。

如果你选择使用标准曲线法的话，内参表达量高，就直接选择一个样品梯度稀释下来作标准品，目的基因表达量普遍都低，就只有单独构建标准品了。

标准品只有一个原则，能让未知样品在其上定量即可。呵呵～看起来又说了一句废话，但是请仔细琢磨一下。另外，样品的稀释，不能2倍，一般都是8倍或者10倍。因为定量反应本身就很灵敏，而实验操作中不可控的因素人为的误差总是难以避免的，对模板进行2倍梯度稀释得到的结果，其中人为操作误差的影响是很大的。太难以把握了。

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作者: 8黑眼圈8    时间: 2011-10-13 17:41

小弟急需测miRNA的表达，real-time PCR，可是鄙人新手至今不会设计引物，chen的文章也看了，只是没搞懂。拜请版主和其它高手赐教。不胜感激

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作者: 百分比    时间: 2011-10-13 17:41

非常感谢你的回答
你的意思是我标准曲线分开来做么？
因为我特意为我的内参基因也做了标准的质粒作为标准品。
是不是还是用cdna稀释更好些呢？
如果我做很多次标准曲线，扩增效率基本稳定的话。以后我做样品是否就不再需要标准曲线了呀？
探针如果放久了降解严重会影响扩增效率么？或者我的阴性样品出来了扩增，但水里面却么有扩增。会是什么原因呢？

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作者: @STAR@    时间: 2011-10-14 13:08

我想运用Real Time PCR检测一个指标的mRNA,但是对于引物不知道怎么设计，对于一个刚开始做实验的初学者来说，引物的设计运用软件设计好点，还是查文献根据文献上现有的引物直接送到试剂公司合成好点呢？但是目前我找到的外文文献当中已经注明了引物序列的数目比较少，不知道有没有可信性。

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作者: @STAR@    时间: 2011-10-14 13:08

我想运用Real Time PCR检测一个指标的mRNA,但是对于引物不知道怎么设计，对于一个刚开始做实验的初学者来说，引物的设计运用软件设计好点，还是查文献根据文献上现有的引物直接送到试剂公司合成好点呢？但是目前我找到的外文文献当中已经注明了引物序列的数目比较少，不知道有没有可信性。

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作者: @花开花落@    时间: 2011-10-14 13:10

我用的是SYBER Green 染料做的，能否教我一下怎样查找puma的碱基序列，谢谢，非常感谢！

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作者: 蓝蜗牛    时间: 2011-10-14 13:12

请问大侠，REAL TIME PCR 对细胞三个基因进行分析
结果采用2-DDCT Method统计分析可是结果是，
未处理组 处理1 组 处理2组 重复数 基因
1 5.24+-0.33 0.35+-0.43 3 1
1 6.45+-0.23 0.42+-0.32 3 2
1 5.58+-0.53 0.39+-0.31 3 3

请问大侠，上面的数据可以用STUDENT T TEST进行统计分析吗，谢谢

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作者: douding66    时间: 2011-10-14 13:13

我采用的是相对定量，实验组和对照组各3个样本，用△△CT法处理后可以得到差异倍数，可是P值从何得到呢。
我看过经典的Analysis of Relatie Gene Expression Data Using Real-Time Quantitatie PCR and the 22DDCT Method，可是也没讲这个问题啊。查了好久文献，还是找不到答案，只好上这边来了。请各位不吝赐教，万分感谢，有实例的话最好了。再次感谢！  

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 13:14

不知道你是想设计定量引物还是RNA干扰的引物，我个人只会定量的引物设计，一般都是用定量的方法检测干扰前后表达量的变化。至于定量引物设计的原则，园子里有很多，你可以自己下载来看一下，Oligo6挺好用的，可以设计引物，也可以分析，只要修改一下适合于自己使用的参数就行。另外，强调一点，理论分析与实际检测在个别时候是有差异的。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 13:15

国外的高标准文献，引物还是可以试试的，国内的文献就不建议参考了，还不如你自己设计。设计方法参考以上。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 13:15

如果你是RNA起始的样品，请构建RNA标准品，这样准确一些，如果样品中能筛选出标准品，何必构建呢？不同的基因标准曲线必然不同，考虑到扩增效率的问题必须分开。具体的情况您还是仔细读一下我上次给您回的帖子吧。
另外，探针降解，仪器就收集不到正常反应的荧光信号值，反应本底会很高。那即便你的引物表现良好，有很好的扩增效率，可是仪器检测不到，一切都白搭。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 13:16

关于数据的处理，我十分不在行，统计学已经忘得差不多了，我下午上网查查再答复你啊，不好意思。同时希望高手能赐教。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 13:16

你看试剂的使用说明书上面写没写适用于哪些仪器啊？一般的试剂都会写的。不过universal的试剂应该问题不大。

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作者: ##蒙奇奇    时间: 2011-10-14 13:29

请问你的 Lightcycler Quantification Kit 能在ABI 7900 上使用吗？
有什么特殊要求？
谢谢！

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作者: wawa    时间: 2011-10-14 13:30

您好！很感谢有高手在这里指点，我是菜鸟，我刚做real-time PCR,遇到奇怪的问题，实验室的前辈们都不知道什么原因。

我的标本是外周血提取的白细胞，加入trizol后在-80度冷冻时间1年半至半年不等，后提取RNA,反转录成cDNA,cDNA保存时间为半年，现在设计好两种引物上机。上机前用RT-PCR试过引物还可以。我的标本的cDNA 的浓度在400-1000以上，也就是说上机的标本中肯定是有不少cDNA的，但是加上两种基因的引物包括内参 beta-actin扩增的结果，都在35个循环后才刚起来，曲线比较低平，前辈们说这样的结果不能要。

为什么连beta-actin都扩不好呢？我首先考虑是样本时间太久的问题，有降解。可是测的cDNA浓度也不少呀，为什么呢？

急等求救！！谢谢谢谢！！

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作者: 菠萝菠萝蜜    时间: 2011-10-14 13:31

您好
今天看文献的时候看到一个问题，没有想明白，想要请你帮忙

文献中是用染料法做的绝对定量。制作了标准品，梯度稀释，然后他有讲到标准品浓度下限的确定是找到那个与不加模板阴性对照的ct值差异有统计学意义的那个最低浓度。

对于他的这个描述，我有点糊涂，阴性对照一般不是没有ct值吗？ 那不是只要能检测出来的浓度和阴性对照就会有差异吗？不知道是不是我的理解有问题，希望帮忙解答


还有要是真要这样做的话 那实验应该怎样进行？

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作者: 锤子    时间: 2011-10-14 13:34

我有个问题想请教下，我用的是SYBR GREEN Realtime ,做相对定量，目的是看一个特异片段在不同个体的差异。
模板用的是 基因组DNA，熔解曲线峰很特异，扩增曲线也比较合理，CT值20几，但是我每次做重复的时候都得不到相同RQ值（每次都用同一管的内参，分析时也是用同一个样设定RQ为1.000），有的差几倍，有的差几十倍。我怀疑是不是因为DNA的质量不够高，杂质干扰比较严重呢？因为我的基因组DNA提取后没有经过提纯，就直接用了。还是因为别的原因呢？
希望指教啊~~~··

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作者: 锤子    时间: 2011-10-14 13:34

我有个问题想请教下，我用的是SYBR GREEN Realtime ,做相对定量，目的是看一个特异片段在不同个体的差异。
模板用的是 基因组DNA，熔解曲线峰很特异，扩增曲线也比较合理，CT值20几，但是我每次做重复的时候都得不到相同RQ值（每次都用同一管的内参，分析时也是用同一个样设定RQ为1.000），有的差几倍，有的差几十倍。我怀疑是不是因为DNA的质量不够高，杂质干扰比较严重呢？因为我的基因组DNA提取后没有经过提纯，就直接用了。还是因为别的原因呢？
希望指教啊~~~··

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 13:36

首先，我不能确定样品以及cDNA保存这么长时间还能不能用，这方面没有做过实验。但有一点可以肯定，cDNA是不能测OD的，因为经过反转录，里面有了各种反应组分，对OD是有很大影响的。因此，样品保存1年能不能用，只有提取了RNA后直接电泳、OD才清楚。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 13:37

trizol的说明书，似乎没有写明他们的试剂是否可以作为保护剂一样的功效保存若干时间。只有一句话，意思是，均浆后加入氯仿前，如果不想立即提取，可以在－80°保存至少1周，－5°～－20°保存至少1年。

另外，定量实验的同时，你有做阳性对照吗？能保证试剂和引物绝对没有问题吗？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 15:30

文章中的说法还是比较准确的，他说的是“差异有统计学意义”强调有统计学意义是严谨的。简单的说，我们都希望能通过用有限的样品做出来的结论来说明一个普遍的规律，这其实是一种“以偏概全”的说法，如何才能让这种“以偏概全”更科学可信呢？就引入了P值，即由样本差异推断总体差异的把握性有多大。如P＜0.01，可以理解为由样本差异推断总体差异的把握性达99%以上，两组数据差异有显著意义。

以上是基于对您提到的文献中说法的字面意义上的解释，还有一种实际情况下的可能性是，他检测的样本是自然界“异常”广泛存在的一种物质，例如，做大肠杆菌的管家基因，无论你怎样避免污染，都不可能在阴性对照的时候完全没有扩增，包括你购买的试剂中都无法避免这种污染，这时，只能人为的规定一种具有统计学意义的数值作为阴性的标准，例如Ct在40个循环以后的全部算阴性结果。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 15:32

相对定量没有做DNA的吧？除非是DNA病毒。另外我不知道你说的RQ指的是什么

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作者: pou    时间: 2011-10-14 15:33

楼主好
又有一个问题想要问你
我做的是绝对定量，最近的标准曲线出来，扩增效率总是不好，在87%左右，但是线性关系很好在0.999.我想问一下这样的标准曲线能用吗？
是什么原因造成的呢？

谢谢  

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 15:34

楼主好
又有一个问题想要问你
我做的是绝对定量，最近的标准曲线出来，扩增效率总是不好，在87%左右，但是线性关系很好在0.999.我想问一下这样的标准曲线能用吗？
是什么原因造成的呢？

谢谢

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能不能用要看您的实验要求。我们在做的时候扩增效率80-120都在可以接受的范围内：）

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作者: 阿凡提    时间: 2011-10-14 15:34

你好

我刚开始要做荧real-time PCR ，现在是想将基因组DNA 10倍系列梯度稀释，然后作为模板制作标准曲线，我想请教一下，real-time PCR 对DNA的质量有没有要求? 另外，一般real-time PCR扩增的片段的范围是多大？

等待解答，非常感谢！

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 15:37

你好

我刚开始要做荧real-time PCR ，现在是想将基因组DNA 10倍系列梯度稀释，然后作为模板制作标准曲线，我想请教一下，real-time PCR 对DNA的质量有没有要求? 另外，一般real-time PCR扩增的片段的范围是多大？

等待解答，非常感谢！

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明确你的实验目的后，基因组DNA当然是越完整越好，电泳看不出什么，OD260/280在1.8左右比较好。扩增的片段的大小跟据你的反应条件是可以调整的，但一般没有超过300的，我们经常在100－200bp，

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作者: 阿凡提    时间: 2011-10-14 15:40

感谢搂主！我还有问题要请教您：
我的普通PCR反应程序是
94℃ 3min
94℃ 1min
58℃ 30s 30cycles
72℃ 1min
72℃延伸 10min
我用SYBR Green 做荧光定量PCR ，您能帮我设计一下荧光定量的反应程序吗? 包括熔解曲线的生成 。我们实验室用的仪器是伯乐的iCycler荧光定量PCR仪
，再次感谢搂主！

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作者: 阿凡提    时间: 2011-10-14 15:40

感谢搂主！我还有问题要请教您：
我的普通PCR反应程序是
94℃ 3min
94℃ 1min
58℃ 30s 30cycles
72℃ 1min
72℃延伸 10min
我用SYBR Green 做荧光定量PCR ，您能帮我设计一下荧光定量的反应程序吗? 包括熔解曲线的生成 。我们实验室用的仪器是伯乐的iCycler荧光定量PCR仪
，再次感谢搂主！

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 15:41

你用什么试剂啊？引物退火温度多少啊？产物多大？
一般定量条件
94℃ 10s

94℃ 5s
55℃ 10s
72℃ 15s
（40－45cycles）

你先这么做一下试试，不行的话再摸索！

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作者: mogu    时间: 2011-10-14 15:46

你好

我做real-time PCR时用到了ROX,投文章时审稿人问ROX是那些单词的缩写

我查阅相关资料也没有很清楚的说明，可能有关的信息是：

FastStart Universal SYBR Green Master(ROX),或者ROX reference dye

请问ROX的英文全称是什么？谢谢

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作者: #甜#    时间: 2011-10-14 15:46

各位前辈，小弟现在也想要做real-time PCR。我已经从NCBI下载了CSFV的几十个序列，另还有与它同属的BVDV一二十个序列。我想把这些序列放到一起进行比对然后找出CSFV尽量同源的那段序列，但是又得避开与BVDV同源部分，从中设计出要扩增CSFV的引物和探针。请问这个好弄吗？
如果自己不会，交给诸如TaKaRa之类的公司，他们能帮忙设计并合成好吗？能保证最佳效果吗？
急盼各位前辈指教！！不胜感激！！

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 15:50

我们现在用的是ROX reference dye

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 15:50

你下载一个sequencher的软件，基本能满足你比对序列的要求。说实话，几十个序列的比对，再加上设计，工作量很大啊，除非你付费设计并验证，否则，轻易不会得到什么特别好的结果的。

这个是我个人的感觉，你可以多方试试。

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作者: #甜#    时间: 2011-10-14 15:50

那我尝试一下自己下载那个软件。顺便问下，那个自学起来难吗？
您说的多方还包括哪些途径呢？
Thanks a lot！！

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作者: =菓子=    时间: 2011-10-14 15:52

请求各位帮忙，这个引物是否存在？或者帮忙指出去哪里寻找？
上游引物：5’-TCATCCAGACGCTGTTTTCC -3’，下游引物：5’-AGGCATTTCCCATACAGGTG-3’
谢谢赐教。  

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作者: XYZQ    时间: 2011-10-14 15:54

请问一下
我最近做实时定量（一个目标基因，多种细胞），结果是这样的：
1.目标基因扩增曲线除唯一一个表达量高的（其余细胞表达量的1000多倍），其余均比较靠后，30循环左右，表达高的那个20循环左右扩增出来；内参基因均正常15个循环左右扩增起来，且一致。
2.同一批所做的目标基因溶解曲线只有表达高的那个是很漂亮的单峰，而其他细胞溶解曲线都有杂峰（有的在主峰前，有的在主峰后）；内参基因溶解曲线均为漂亮的正常单峰。

造成这种结果的原因是什么呢，可以用表达

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作者: XYZQ    时间: 2011-10-14 15:54

请问一下
我最近做实时定量（一个目标基因，多种细胞），结果是这样的：
1.目标基因扩增曲线除唯一一个表达量高的（其余细胞表达量的1000多倍），其余均比较靠后，30循环左右，表达高的那个20循环左右扩增出来；内参基因均正常15个循环左右扩增起来，且一致。
2.同一批所做的目标基因溶解曲线只有表达高的那个是很漂亮的单峰，而其他细胞溶解曲线都有杂峰（有的在主峰前，有的在主峰后）；内参基因溶解曲线均为漂亮的正常单峰。

造成这种结果的原因是什么呢，可以用表达量多少来解释吗，还是存在其他问题。
注：（1）相同引物前人用癌组织和癌旁组织做过此实验，结果很好。（2）实验重复了3次，结果类似，此几种细胞均为同时提取RNA，同时反转成cDNA。（3）用的Takara的SYBR green染料，机型是ABI 7500

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作者: lixi559    时间: 2011-10-14 15:55

老师好，我今天看了一篇文章，有点不是很明白，想请教一下！如图：
他用的是2-dtdtct第一组和第二组数据的标准差我能看明白，但是dtct的标准差是怎么算出来的我不是很明白！即第一组数据平均值是30.49+- 0.15 第二组是23.63+-0.09但是他们的dt值怎么是6.86+-0.17，这个0.17是怎么得到的以及后面的0.9-1.0是怎么算的？请老师赐教！谢谢！

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作者: koook5695    时间: 2011-10-14 15:55

老师好，我今天看了一篇文章，有点不是很明白，想请教一下！如图：
他用的是2-dtdtct第一组和第二组数据的标准差我能看明白，但是dtct的标准差是怎么算出来的我不是很明白！即第一组数据平均值是30.49+- 0.15 第二组是23.63+-0.09但是他们的dt值怎么是6.86+-0.17，这个0.17是怎么得到的以及后面的0.9-1.0是怎么算的？请老师赐教！谢谢！

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作者: koook5695    时间: 2011-10-14 15:57

如图

图片附件: 43299692.jpg (2011-10-14 15:58, 49.66 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8706

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 16:11

“cuturl('http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi')” 你的引物在NCBI的blast分析，100％匹配的序列有多个物种，以上的连接是blast结果，你自己查看一下。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 16:12

请将你的定量产物电泳，看是否为同样的产物。

另外，有如下几点问题：
1.你的引物和试剂是没有问题的（无论管家基因还是目的基因均有能得到较好结果的样品）

2.如果融解温度曲线的峰差距在1度以内，应该算是可以的，仪器的误差我们是无法避免的。如果不放心可以将定量PCR产物电泳，看是否是同一目的带。

3.你各种不同模板的起始量是一致的么？即你提取的TotalRNA是否统一稀释到相同的浓度了呢？

4.有可能你各种不同的处理对该目的基因的表达有很大影响，模板与引物之间是有竞争的，模板量少的自然没有模板量高的有竞争力，在模板量少的反应中，引物可能比较容易形成二聚体以及与模板错配情况，影响扩增效率，但如果引物质量特别高的话，这种情况对实验的影响不至于特别明显。

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作者: koook5695    时间: 2011-10-14 16:13

我从未接触过RT-PCR，目前要进行此类实验。有几个问题请教。
在文献中找到了目的基因的引物，和对照actin的引物。但没有提供PCR的条件，如各循环的温度及时间。
我想在NCBI上找到这两个目的基因的长度，及所提供的引物将扩增片段的长度，但没有找到。是在nucleic 中寻找么。我输入了引物 的序列，没法找到相同的序列。
另外，文献中所给出的actin没有提及是alfa还是beta，我不知道什么条件。
我如果能查到这两个片段的长度，是不是就可以决定是否应该放在一个PCR体系中进行吧？
我是新手，万分感谢！

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 16:13

大家做实验，PCR的条件都是摸索出来的。不知道你是自己配的试剂还是买公司的产品？如果是自己配的，你就用前面我的回帖中提到的条件先做一下，一般退火温度都在55－60之间，你做个梯度就知道了。延伸时间30秒左右就可以，因为再长就容易有非特异性反应了。如果是买公司的产品，你就先用说明书上推荐的反应条件试下先。

注意：管家基因与目的基因一定要用相同的反应条件。

至于管家基因的选择，你一定要确认这个管家基因是被认可的，即它的表达是不受你各种处理方式所影响的。这点很重要。我遇到过一个人选错了管家基因，被退修。她都郁闷死了。目前，homo、rat、mus三个物种GAPDH、Actb使用的多一些。  

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作者: queen    时间: 2011-10-14 16:13

我想你扩增的比较靠后的曲线（CT值在30左右），不是特异性的扩增。当模板浓度过低时，引物二聚体及非特异性的扩增对结果会有很明显的影响。建议您下次做的时候设一个阴性对照，就是不加模板。我估计你用现有的条件阴性对照也会在30个偱环左右出峰。建议你将引物浓度降低，将退火温度提高等高规方法应该可以得以改善。  

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作者: nut6694    时间: 2011-10-14 16:15

我是做real-time PCR的新手，现在一直在用普通PCR测试引物，但是一直都有很亮的引物二聚体，但是使用的内参基因ACTIN3 ,是没有二聚体的；重新合成了引物后，做普通PCR测试时，发现ACTIN3也有了，用的是同样的模板，不知道是什么问题？请指教！在现有的引物条件下，如何消除引物二聚体？

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作者: nut6694    时间: 2011-10-14 16:15

我是做real-time PCR的新手，现在一直在用普通PCR测试引物，但是一直都有很亮的引物二聚体，但是使用的内参基因ACTIN3 ,是没有二聚体的；重新合成了引物后，做普通PCR测试时，发现ACTIN3也有了，用的是同样的模板，不知道是什么问题？请指教！在现有的引物条件下，如何消除引物二聚体？

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作者: 春雨    时间: 2011-10-14 16:15

请问怎样操作可以减少SYBR法中复孔之间的差异啊，请问cDNA能用振荡器混匀吗？我总觉得加样的时候模板没有混匀

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作者: 米米    时间: 2011-10-14 16:16

2-ΔΔCt法的前提是目的基因和看家基因一致或近似的扩增效率，我的实验使用的是罗氏的lightcyler480做real-time rt-pcr，现机器自动测得标准品目的基因的E为2.366，看家基因的E为2.034，我在网上搜扩增效率80～120％是比较好的，请问扩增效率是1还是2是理想状态呢？还有我的目的基因和看家基因的E能用么？  

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作者: she    时间: 2011-10-14 16:16

你好！我想问一下做相对定量如果是比较基因在两种不同处理的表达差异，可不可以就用目的基因和内参的ΔCt，即 2-ΔCt值来比较，而不算出两种处理的比值。有没有相关的文献呢？另外做相对定量要不要做目的基因和内参基因的扩增效率呢，我问了ABI技术支持他们都说现在基本都不做了，而是默认它们的扩增效率是1，大家有什么意见阿？

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作者: PCR    时间: 2011-10-14 16:18

刚刚入门，想请教2个简单的问题：
1.在NCBI上如何查找引物序列呢？试了一下选Probe，出来一大堆，也不知道该如何筛选？
2.查找文献上的引物，为什么找了几篇文献碱基序列都不一样呢？是正常的吗？

谢谢！

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作者: 二丫头466    时间: 2011-10-14 16:20

请问：我做的SYBRGree RealtimePCR Ct值是不是和目的基因成简单的反比关系呢？也就是说，目的基因的起始拷贝数多，Ct值在PCR仪器上读取的数值就低呢？急！！！！！！！！在线等答复了，等着分析数据呢，谢谢了

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作者: yonger    时间: 2011-10-14 16:21

你好 ：
请问有没有那位用rt-realtime pcr 做过mir124的定量检测的？或者那位做过 rt-realtime pcr 检测组织中miRNA的  

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作者: 森林木    时间: 2011-10-14 16:22

2-ΔΔCt法的前提是目的基因和看家基因一致或近似的扩增效率，我的实验使用的是罗氏的lightcyler480做real-time rt-pcr，现机器自动测得标准品目的基因的E为2.366，看家基因的E为2.034，我在网上搜扩增效率80～120％是比较好的，请问扩增效率是1还是2是理想状态呢？还有我的目的基因和看家基因的E能用么？

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扩增效率不同软件有不同定义，假设每个循环增加为上一个循环的2倍，roche的软件就认定扩增效率为2，而有些软件就设定扩增效率（1+e)=2,因此e=1。
个人认为扩增效率1.8~2.05直接都可以的，你的2.366高了点，非特异性扩增或者标准品梯度稀释时有点小问题(比如用枪头反复吸打混匀)或者其它。lyikoo的E还是可以用的，不过建议目的基因的标准曲线可以回头补一个，反正roche的软件可以调用外部标准曲线的不是？

[ 本帖最后由 森林木 于 2011-10-14 16:23 编辑 ]

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作者: 森林木    时间: 2011-10-14 16:24

刚刚入门，想请教2个简单的问题：
1.在NCBI上如何查找引物序列呢？试了一下选Probe，出来一大堆，也不知道该如何筛选？
2.查找文献上的引物，为什么找了几篇文献碱基序列都不一样呢？是正常的吗？

谢谢！

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to 2.正常啊，不同人可以选择不同的序列，比如用不同引物设计软件经常得到不同的首选序列。copy一个你信得过的或者影响因子高的吧。

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作者: 不懂    时间: 2011-10-14 16:24

你好！我想问一下做相对定量如果是比较基因在两种不同处理的表达差异，可不可以就用目的基因和内参的ΔCt，即 2-ΔCt值来比较，而不算出两种处理的比值。有没有相关的文献呢？另外做相对定量要不要做目的基因和内参基因的扩增效率呢，我问了ABI技术支持他们都说现在基本都不做了，而是默认它们的扩增效率是1，大家有什么意见阿？

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可以的，不过你的目的基因表达比较低的话可能会有点点影响，先做吧发现结果与你预期不吻合的话，回过头来补做一下扩增效率，到excel里重新计算一下，把 2-ΔCt里的2换成（1+e）就是了

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作者: 天蓝蓝    时间: 2011-10-14 16:26

我是做real-time PCR的新手，现在一直在用普通PCR测试引物，但是一直都有很亮的引物二聚体，但是使用的内参基因ACTIN3 ,是没有二聚体的；重新合成了引物后，做普通PCR测试时，发现ACTIN3也有了，用的是同样的模板，不知道是什么问题？请指教！在现有的引物条件下，如何消除引物二聚体？

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几个办法：
1，适当降低引物的用量，比如从0.5调到0.4，0.3
2，重新设计，引物二聚体占用资源的，肯定影响PCR的性能，如果你的目的基因表达水平很低但目的基因又有二聚体，那还是重新设计吧
3，适当提高复性温度，有时会有点点效果
4，提高检测荧光的温度。做熔解曲线分析找个温度，引物二聚体已经完全解链但PCR产物还没开始解链（相当于引物二聚体和PCR产物2个峰的谷底），比如是八十度，那三步法变4步（72度延伸后面加一步80度，停一秒检测荧光）

正道是2，偷懒1，2，4

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作者: wiwi    时间: 2011-10-14 16:27

请问怎样操作可以减少SYBR法中复孔之间的差异啊，请问cDNA能用振荡器混匀吗？我总觉得加样的时候模板没有混匀

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配置混合液(含引物，PCRmix，水)，振荡混匀后离心分装到每个管，再加cDNA模板（建议尽量控制在3微升以上），加模板时不要用枪头反复吸打，加好后把盖子盖紧再振荡离心上机检测。
如果是384孔加整板，那建议用排枪

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作者: 丁香@@    时间: 2011-10-14 16:28

请教一下：
相对定量时可否不对RNA模板进行浓度计算，因为如果样品量很大的话，这样会很麻烦，而且很费时间。在提RNA时可根据得到RNA沉淀的大小，适宜地给水稀释（通常10-30UL），10UL反时，加入1-2UL模板即可！－－－－争对熟手而言－－－－因为反正都要用内参规一。
另外，在使用又双标准曲线法时，对目的基因，内参基因及标准曲线的扩增效率有什么要求？因为在实验过程中，很难达到每次每个样品都能满足在需要的扩增效率之内。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 16:28

不一定非要把样品的total RNA调整到一个绝对一致的浓度，最终使用管家基因调整校正是可以的。

一般情况下建议将浓度调成一致，是处于以下目的考虑的：
模板浓度高对PCR反应是有阻害的，影响扩增效率等。如果不统一调整的话，模板浓度高的样品中阻害物多，必然会比浓度低的样品对实验的影响大，如此一来，相当于我们人为的引入了一种误差。因此，一般都用测OD的方法计算total RNA的浓度，然后统一稀释。

做标准曲线的时候，一般只参考标准曲线的扩增效率，不怎么考虑单独每一个样品的扩增效率。普遍认为E在80%-120%之间比较好。

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作者: 圆圆圈圈    时间: 2011-10-14 16:29

正准备筹划做实验……做REAL-TIME PCR完全没概念 探针法好 还是染色法好  

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 16:29

看一下你的阈值设定cycles从几到几，如果你自己不会手动调的话，你手动将阈值设在荧光信号值最大的1/5处，然后再观察你的扩增曲线的线型有没有发生变化。

还有一种情况，就是cDNA模板浓度太大，平台期会向下走，你把cDNA稀释一下就好了，Ct在15以前会有这样的情况。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 16:31

cDNA不建议用振荡器振荡。

Premix因为其中含有酶，振荡器振荡也不太好，用手轻轻弹一弹，或者上下颠倒混匀就可以了，注意混匀后离心转数和时间不要太长，1000转几秒就可以，甚至用手甩一甩也行，因为在Premix中有染料、酶等的添加，离心时间长容易将这些离在试管底部。造成溶液不均匀实验有差异。

你自己配置好的混合液（引物、水、Premix）只需要用枪头吹打3-4次，混匀即可，不用振荡也不用离心。注意吹打的时候要轻一点，尽量不要有气泡产生。

减少孔间差，除了选择一把好的枪加模板外，自己的实验技术过关是最重要的，mediated提到的模板加入量在3 ul以上是很有道理的，经常情况下10ul的枪取3ul才比较准。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 16:32

Ct值与起始模板数的对数成反比关系。模板表达量高，Ct值就小，但二者绝对不是简单的反比关系。

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作者: Darcy    时间: 2011-10-14 16:33

初次做实时荧光pcr，我做的是SYBR染料的，可是看到有些人做了标准样，可以不做吗？

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作者: 饭团团    时间: 2011-10-14 16:33

应用RNAI技术沉默不同的人胃癌细胞的相同基因，RT-PCR的引物需要重新设计吗？ 谢谢  

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作者: #甜#    时间: 2011-10-14 16:35

初次做定量PCR,仪器是ABI7300,SYBR染料法,,,为什么得出的溶解曲线是倒的,该有峰的地方是凹下去的,,前两次做都不会有这种现象出现,很不解,也不知道是哪里出了问题,请大家帮帮忙吧,感激!

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作者: 韩梅梅    时间: 2011-10-14 16:39

初次做实时荧光pcr，我做的是SYBR染料的，可是看到有些人做了标准样，可以不做吗？

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看你用什么分析方法了 可以不做的

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 16:40

这说明仪器在该循环处漏检了。即本应该有荧光信号值检出的地方没有检出。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 16:40

沉默前后使用相同的定量引物。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 16:41

次做定量PCR,仪器是ABI7300,SYBR染料法,,,为什么得出的溶解曲线是倒的,该有峰的地方是凹下去的,,前两次做都不会有这种现象出现,很不解,也不知道是哪里出了问题,请大家帮帮忙吧,感激!

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计算方法没有选正确

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作者: 楚留臭    时间: 2011-10-14 16:44

但是该怎么办呢?计算方法没有选正确的话应该怎么选呢,不好意思,实在不懂,谢谢

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作者: one    时间: 2011-10-14 16:46

各位高手好！我现在很急，等着毕业，请各位帮帮忙！谢谢！
我做的是SYBR 法绝对定量的PCR 我是做DNA 病毒的，我先用定量的引物把目的片段拉出来与T载体克隆，酶切鉴定是正确的片段后，作为标准品。
我现在的问题是每次做定量时，用超纯水做的阴性对照都有Ct值，也有溶解曲线，而且是特异的，但没有拷贝数，如果说是污染了 为什么没有拷贝数，是引物的问题吗？

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作者: one    时间: 2011-10-14 16:46

各位高手好！我现在很急，等着毕业，请各位帮帮忙！谢谢！
我做的是SYBR 法绝对定量的PCR 我是做DNA 病毒的，我先用定量的引物把目的片段拉出来与T载体克隆，酶切鉴定是正确的片段后，作为标准品。
我现在的问题是每次做定量时，用超纯水做的阴性对照都有Ct值，也有溶解曲线，而且是特异的，但没有拷贝数，如果说是污染了 为什么没有拷贝数，是引物的问题吗？

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作者: BOSS2011    时间: 2011-10-14 16:47

仪器型号，扩增曲线和溶解曲线的图

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 16:47

各位高手好！我现在很急，等着毕业，请各位帮帮忙！谢谢！
我做的是SYBR 法绝对定量的PCR 我是做DNA 病毒的，我先用定量的引物把目的片段拉出来与T载体克隆，酶切鉴定是正确的片段后，作为标准品。
我现在的问题是每次做定量时，用超纯水做的阴性对照都有Ct值，也有溶解曲线，而且是特异的，但没有拷贝数，如果说是污染了 为什么没有拷贝数，是引物的问题吗？

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定量产物电泳了么？怎么确定是特意的产物，而不是由于二聚体产生的荧光信号的检出呢？如果电泳确定是特异性产物，说明你的试剂或者引物有污染，又或者你自己操作不小心每次都带进去污染了。如果是污染了，你就把全部试剂都更换了再做吧。

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作者: 小鼹鼠    时间: 2011-10-14 16:48

请教各位高手：
1:总RNA提取后，是不是一定要跑电泳，确定有没有降解？据说跑RNA电泳
时要求很高，要避免它降解？
2：做标准曲线时扩增效率老是高，我们仪器最好是90-105%，但通常会大于150%，如何解决？
3：如果做三个样品，用2的-ΔΔCt次方方法分析，是不是每个样品都要做目的基因和内参基因的标准曲线？因为该分析方法要求目的基因和内参基因的扩增效率基本接近100%，且相差小于5%。
谢谢！

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作者: XYZQ    时间: 2011-10-14 16:49

开个帖子,,共同进步.

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请教一下：RealTimePCR的重现性问题。我做了两次RealTime PCR，结果却完全不同，请教RealTimePCR的重现性到底如何，理论上讲，特异性应该很强，但为何完全不一样？  

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作者: 阳光树    时间: 2011-10-14 16:50

潇湘子,你好，图片已经传上去了 麻烦你帮我看下 分析分析 我自己都不知道从何入手 谢谢

图片附件: 75930535.jpg (2011-10-14 16:50, 69.33 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8707

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作者: 开心蔬菜帮    时间: 2011-10-14 16:50

Protocol
Cycle 1:  ( 1X)  
  Step 1:     95.0oC  for 03:00
Cycle 2:  ( 30X)  
  Step 1:     94.0oC  for 00:30
  Step 2:     60.0oC  for 00:30
  Data collection enabled.
  Step 3:     72.0oC  for 00:30
  Data collection and real-time analysis enabled.

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作者: dreaming    时间: 2011-10-14 16:51

请教各位高手：
分子信标如何设计啊，beacon designer 没有序列号啊，哪位高手能帮帮我呀？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 16:52

1.取1ul RNA原液，直接电泳就可以了。不必要专门的电泳槽和用DEPC配制的电泳液，我目前RNA的电泳跟PCR产物电泳都用的一个槽，电泳液也没换，胶更是普通的胶，几乎没什么影响，不会降解的。

2.扩增效率高说明模板中有PCR阻害物，改进提取方法吧。或者，标准品的扩增效率高很有可能是你模板梯度稀释的不好。仔细稀释模板。

3.原则上ΔCt法分析，目的基因和内参基因都要作标准曲线，并且扩增效率要是100％，但很多实验室都简化了，不做标曲，简单的将扩增效率视为1。建议你明确自己的实验归宿后再做实验。我估计不同档次的文章对实验严谨性的要求是不同的，你可以多方打听，看他们的要求如何。记住，准备工作越充分，文章发的越顺利。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 16:53

我们实验室的高手牛人，使用相同试剂、相同模板，同一次反应，重复性很高，Ct相差最大在0.5，正常情况0.3以内。

如果是更换不同次提取的模板之后重复性不好，我想其中最大的差距应该是提取后total RNA浓度的确定。OD的测定上，很难有好的重复性，这就意味着，可能由于两次OD的差异造成初始模板的加入量就不同。模板加入量不同，比较Ct的重复性就没有任何意义了。此种是最直接反应出来的差异，还有可能引物稀释、试剂批号之间的差异，这些都是造成重复性不好的原因，但影响相对OD的测定就比较小了。

这恰恰从另外一个方面证明了相对定量的准确性，通过做管家基因校正，可以将这方面的差异消除。

相对定量的一系列数据处理得到表达量升高还是降低这样的结论，绝对不是单纯的比较Ct值的大小。

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作者: wu11998866    时间: 2011-10-14 16:54

你的循环圈数太少了吧，40－45差不多，现在的反应连平台期都没有，估计这样的结果用不了。

您这四条线分别代表什么？染料还是探针法？是相对定量还是绝对定量？您要我分析什么？

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作者: qiangren789    时间: 2011-10-14 16:56

请问各位高手，我做的是相对定量，做了两次，内参都出现了两个峰，问题出在哪里啊？内参的引物配好浓度后放-20冰箱挺长一段时间了（半年），会不会影响？图中的扩增曲线如何？（CT约=15处为内参基因，后面CT约=25为阴性样本，CT约=30处为处理组）。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8708

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作者: 绿茶公子    时间: 2011-10-14 16:57

大家好，我是个新手。
准备做mRNA定量检测。标本是组织细胞，想问一下要准备哪些试剂，还要问一下主要的实验方法。因为要定了，怕定少了试剂年后开不了工。请教高手。谢谢出手相助！

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作者: 长发piaopiao    时间: 2011-10-14 17:00

老师好！
我是新手，我的课题是想检测患某种疾病的人群中是否存在某个基因的点突变，我看到的一些文献是用的PCR-RFLP的方法做，但是导师希望我用其它的方法做。请问能用real time PCR 的方法做吗？如果能的话具体方法能说下吗？这些天我也浏览了下丁香园PCR区和real time PCR 区的帖子，发现很多帖子包括一些前辈发给我们分享的科普文章里都说可以用这个方法来检测基因突变，但是，好像没找到详细地说明如何检测基因点突变的原理或过程的文章，（也许是我没有发现）。因为我是完全的新手，很多问题都模模糊糊的不明白，所以请老师指点下。
谢谢了！  

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作者: 微笑的海豚    时间: 2011-10-14 17:01

老师好！
我是新手，我的课题是想检测患某种疾病的人群中是否存在某个基因的点突变，我看到的一些文献是用的PCR-RFLP的方法做，但是导师希望我用其它的方法做。请问能用real time PCR 的方法做吗？如果能的话具体方法能说下吗？这些天我也浏览了下丁香园PCR区和real time PCR 区的帖子，发现很多帖子包括一些前辈发给我们分享的科普文章里都说可以用这个方法来检测基因突变，但是，好像没找到详细地说明如何检测基因点突变的原理或过程的文章，（也许是我没有发现）。因为我是完全的新手，很多问题都模模糊糊的不明白，所以请老师指点下。
谢谢了！

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借用一块地方回答你问题，不当地方还请指教

检测某个基因点的突变，可以用你提到的PCR-RFLP方法做，但是该位点处要有合适的酶切位点才好；
real time PCR也可以做基因突变位点检测，主要有两种方法，一是用高分辨率熔解曲线，一是针对突变位点设计探针，用探针的方法做；
这两种方法是间接的检测位点突变，测序法可以通过测定核酸序列来进行直接检测，结果更直观也更准确，当然现在测序也有很多方法，可以了解一下，根据实验方案确定最合适的

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作者: 微笑的海豚    时间: 2011-10-14 17:02

大家好，我是个新手。
准备做mRNA定量检测。标本是组织细胞，想问一下要准备哪些试剂，还要问一下主要的实验方法。因为要定了，怕定少了试剂年后开不了工。请教高手。谢谢出手相助！

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RNA抽提、反转录试剂盒、定量反应试剂盒等，实验方法要看你的实验目的，一般有两种，相对定量采用染料法，绝对定量采用探针法，当然这两种方法也可以相互交换，如果不怕花钱的话 呵呵
建议先把实验方案弄透彻了再考虑买试剂，不然买的不对就亏大了
这几种还是要话些钱的的

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作者: 微笑的海豚    时间: 2011-10-14 17:02

请问各位高手，我做的是相对定量，做了两次，内参都出现了两个峰，问题出在哪里啊？内参的引物配好浓度后放-20冰箱挺长一段时间了（半年），会不会影响？图中的扩增曲线如何？（CT约=15处为内参基因，后面CT约=25为阴性样本，CT约=30处为处理组）。

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溶解曲线出现两个峰说明有非特异扩增产物出现，可以考虑引物的特异性是否严谨，也可把产物跑个胶看一下；当然引物放了这么长时间也有可能降解，跑个高浓度的胶看看结果，不过一般来说，只要不是反复冻融 应该没问题的。

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作者: 微笑的海豚    时间: 2011-10-14 17:02

请教各位高手：
分子信标如何设计啊，beacon designer 没有序列号啊，哪位高手能帮帮我呀？

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不知实验要达成什么效果，一定要用分子信标吗，这个一般用的比较少的。
如果要用它来进行绝对定量，taqman探针可以的；若是跑溶解曲线（我记得这个可以的，但是不怎么用，记不大清了），染料也可以的啊

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作者: ffaa    时间: 2011-10-14 17:04

请问各位高手
我的试验已经做了一批标本，但是不知道如何分析试验结果。我用的SYBR GREEN 染料做的相对定量。但是不知道结果怎么分析。我每个样本做3个复孔有的做出来CT值之间相差结果比较大。一般结果相差多少要重新再做一次呢。我想做的是FOXP3基因在病人和正常人之间表达多少的比较。该如何进行比较呢。请园子里的高手解答！谢了！  

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 17:05

Ct25的所谓阴性样品是什么意思？如果是没加模板的阴性对照的话，你这个实验已经污染了，没有再做的必要了，先解决污染吧。

融解温度曲线有两个峰，有两种可能：
1 引物跨较小内含子，而你的模板没有做过DNaseI处理，扩增时把基因组DNA污染给扩增了。解决办法：处理模板或者换跨大内含子引物。
2 非特异性反应。解决办法：换引物。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 17:05

说的对，请先确定你的实验方案后再讨论买试剂的问题。

例如，你的样品提取是否比较困难，用普通的TriZol提取就能成功，还是含有多糖多酚等类物质需要有些提取的plus试剂加入；你的引物设计上是否考虑了跨足够大的内含子，这直接关系到是否需要DNaseI酶，以及PCI 、CI等一系列有机试剂的购买和配制问题。再有就是用探针法还是染料法，你有多少个样品，选择多大的包装。

以上是随便一想就能想到的，实验过程中可能还有很多小问题，你是否都做好准备了呢？经费是有限的，准备工作越充分，实验将越顺利，花的钱越少。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 17:06

关于基因多态性的问题，使用PCR-RFLP，相对realtime方法费用要少很多（我个人分析，没有做个这种实验，还需求证），但局限在于是否有合适的酶切位点。但这种方法只能看出有没有突变，至于具体是那个碱基突变，变成了什么最终还需要测序。现在有种巢式PCR-RFLP，好像不怎么受酶切位点的限制了。这个实验我真没做过，懂的不多，都是自己看资料分析的，不敢保证100％准确，盼高手赐教。

realtime检测SNP，应该算是比较潮流的方法，但瓶颈在于能否针对突变位点设计出好用的探针。一个位点要合成两条不同标记的探针来检测，光标记费用估计也2000多，再加上试剂一系列，挺贵。与此同时你实验室还必须有定量的仪器。这种方法适用于已知的突变位点，简单易行，有了引物探针就一劳永逸了。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 17:06

分子信标的设计要求实在太苛刻了，我觉得很难能达到。但网络之大无奇不有，你搜索一下，肯定有这方面软件提供的。

另外，你可以打听一下有合成分子信标专利权的公司，问他们是否提供设计服务，一般来说肯定会有的，不然自己设计不出来，别的公司不让设计，还有谁做这种方法啊？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 17:08

重复样品Ct值尽量不要差到1个循环以外。
至于结果分析，本版有很多科普定量PCR的文章，你自己查吧，我就不再浪费论坛资源了。

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作者: panda王    时间: 2011-10-14 17:14

你好，有realtime PCR SNP分型的问题请教。我做了几次预实验，样本扩增曲线还可以，但荧光检测仍无法检测到。NTC还行，其他几个样本都在对角线附近，无法分型。请问有几方面的原因及解决方法。
谢谢！

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作者: join    时间: 2011-10-14 17:15

请教各位高手，如果起始用提取的DNA来做荧光定量PCR的话，效果是不是没有RNA好啊，谢谢，DNA应该没有RNA的限制条件多吧，如果做定量PCR的话，后续的步骤是否一样哪，谢谢各位高人指教  

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作者: qqq111    时间: 2011-10-14 17:16

你好！我们养细胞做荧光定量PCR，总出现双峰（如图），请帮忙分析下是何原因？原来以为是污染，但是更换高压枪头；重新转录cNA均不能解决。

图片附件: 76955314_snap.jpg (2011-10-14 17:16, 37.15 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8715

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 17:20

关于SNP，本版有个专门的帖子完全可以拿来科普，我昨天被科普的一天。连接如下cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=9312879&sty=2')

这方面我不在行，不能给大家的问题做出准确的回答，抱歉。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-14 17:20

如果你的红、绿、蓝三条线是不同模板相同基因的反应，解决方法两点：
1。换引物。必须要换。你先理论分析一下引物错配的可能性有多大。
2。将所有模板纯化。因为有的模板非特异峰有两个，有的有三个。

以上两点并行。如果懒，可以先做第一个，看实验结果再决定是否纯化模板。

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作者: #黄药师#    时间: 2011-10-15 08:34

请问下楼主 用-△△Ct法定量 具体该怎么做 谢谢

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作者: join    时间: 2011-10-15 08:37

我也遇到这种情况,我做相对定量,采用2-△△Ct法,用real-time定量的酶和体系跑普通PCR的时候有条带,非常好,可是上real-time,目的基因起峰特别晚,电泳检测没有条带,百思不得其解,请高人指点，谢谢。

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作者: join    时间: 2011-10-15 08:37

我也遇到这种情况,我做相对定量,采用2-△△Ct法,用real-time定量的酶和体系跑普通PCR的时候有条带,非常好,可是上real-time,目的基因起峰特别晚,电泳检测没有条带,百思不得其解,请高人指点，谢谢。

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作者: lixi559    时间: 2011-10-15 08:39

我想请教一下 我的实验是用相对定量还是绝对定量合适呢？

我要研究某目的基因mRNA在数十例某种肿瘤患者体内的表达 与起其蛋白表达水平（我用组化）是否具有相关性，并且RNA或者蛋白的表达是否与其预后相关？

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作者: lixi559    时间: 2011-10-15 08:39

我想请教一下 我的实验是用相对定量还是绝对定量合适呢？

我要研究某目的基因mRNA在数十例某种肿瘤患者体内的表达 与起其蛋白表达水平（我用组化）是否具有相关性，并且RNA或者蛋白的表达是否与其预后相关？

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作者: lixi559    时间: 2011-10-15 08:39

我做过几次real time PCR 为什么每次内参基因的无模板对照都会有跟样本一样的特异产物呢？而且在20个循环就出现了扩增
而目的基因的无模板对照则基本不出现，出现的时候CT值也是40左右了。
这种污染是怎么造成的 怎么排除呢？我把引物、染料、水都换过了。而且我确定我没有误假模板到里面，因为我对照加水的时候，模板还没从冰箱取出来。

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作者: douding66    时间: 2011-10-15 08:40

我也遇到这种情况,我做相对定量,采用2-△△Ct法,用定量的酶和体系跑普通PCR的时候有条带,非常好,可是上real-time,目的基因起峰特别晚,电泳检测没有条带,百思不得其解,请高人指点，谢谢。

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你的片段多大！如果相对较大的话，可以在real-time pcr时，加上延伸那一步，可能会好一点。

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作者: TAT    时间: 2011-10-15 08:41

我也遇到这种情况,我做相对定量,采用2-△△Ct法,用定量的酶和体系跑普通PCR的时候有条带,非常好,可是上real-time,目的基因起峰特别晚,电泳检测没有条带,百思不得其解,请高人指点，谢谢。

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你的片段多大！如果相对较大的话，可以在real-time pcr时，加上延伸那一步，可能会好一点。

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作者: 椰子叶子    时间: 2011-10-15 08:42

用于qPCR扩增的片段，延伸时间10s足矣。遇到普通PCR很好但是上定量就没结果或是起峰很晚的情况，试试将退火温度降个3-5度再做一次，也许会有意想不到的结果发生，呵呵。

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作者: 功夫张CJ    时间: 2011-10-15 08:42

我的文章是研究某基因在乳腺发育不同时期表达情况，采用 real-time RT-PCR的方法。其中一个reviewer的一条意见是:Regarding realtime qPCR, were negative control reactions performed (without reverse transcriptase) to ensure no genomic DNA contamination of your RNA? were RNA samples evaluated in duplicate? If so, was the agreement between technical replicates reasonable
前半句是怎样证明RNA没有基因组DNA污染，后半句是什么意思？怎样回答？

请教高手，万分感谢  

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作者: @花开花落@    时间: 2011-10-15 08:43

我做过几次real time PCR 为什么每次内参基因的无模板对照都会有跟样本一样的特异产物呢？而且在20个循环就出现了扩增
而目的基因的无模板对照则基本不出现，出现的时候CT值也是40左右了。
这种污染是怎么造成的 怎么排除呢？我把引物、染料、水都换过了。而且我确定我没有误假模板到里面，因为我对照加水的时候，模板还没从冰箱取出来。

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我和你出现的问题一样，只不过我的是目的基因的阴控总出现和目的基因一样的特异性峰值，大家看了都说污染，我现在就在找办法解决，已经把所有的东西都换了一遍还是有，而用同样的东西扩别的基因阴控就很干净。真不知道什么原因，也在郁闷中！若有什么好办法解决，也可以说说。谢谢

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作者: seven7    时间: 2011-10-15 08:43

请教老师：我是做小鼠病毒感染后，测小鼠病毒DNA的表达。做SYBR realtime PCR,碰到问题：
1.首先我合成一对引物，但结果熔解曲线：标准品在82°和74°各有一峰，共有2个峰。样品有时侯只有82°有一峰，有时候有2个峰，阴性对照（水）在74°有一峰。realtime扩增产物跑电泳只有一条带，且位置也对的。
2.怀疑这对引物特异性不好，所以重新合成1对引物，结果熔解曲线在76°有一个峰，标准品、样品、水都在76°有一峰。这次我抽提的DNA OD260/280=1.82。realtime扩增产物跑电泳也只有一条带，且位置也对的。是否水不应有峰出现？

我是用ABI7500,标准品是胶回收纯化后10倍梯度稀释的。

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作者: 魔法师A    时间: 2011-10-15 08:44

如果没有污染的话，76°出现峰正常吗？好像都说在82°的。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 08:44

-△△Ct法是数据处理上的问题，具体到做实验操作上，与做标准曲线法没有什么差别。至于该方法怎么处理数据，你可以参考本论坛的诸多帖子，或者本帖以前的讨论，我就不赘述了。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 08:44

应该用相对定量的方法。基因的表达与蛋白的检测是两种方法，应该不能建立一种直接的关系，只能分别得到结果后做一下比较，估计这种比较很难获得一个拥有数字公式的关系。

关于污染的问题。首先，你是否经过电泳确认，证明的确是污染。如果是，只能更换试剂、严格实验操作、实验分区 等方面来解决。

另外，不知道你的目的基因表达量的高低。如果比较高，说明是你管家基因的引物污染到模板了，而且很有可能是高浓度贮存液已经污染了，而体系中其他的各项并没有污染。如果目的基因表达量很低，那就无法确定是在哪个环节引入污染了，只能自行排查。

嗯，我猜你的实验材料是动物或者人。但如果是大肠杆菌等空气广泛存在的菌体，请翻翻本帖以前的回复，这类的污染是无法避免的。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 08:45

需要做定量的实验，我很少拿普通体系和普通PCR来验证引物、摸索反应条件等，一般都直接上定量。因此，基本不会知道二者是否有差别。遇到反应不理想的情况，在排除表达量低以及模板质量后，我就直接更换定量引物了。

传说中的政治老师教导我们：任何一种事物都要一分为二的被看待。定量仪器与普通pcr仪器的性能、升降温速度有很大差别，定量的优势不言而喻，大部分时候我们认为：较快的升降温速度有利于抑制非特异性反应，当然这正是定量的一大优势。但偶尔也会有特殊情况存在。例如，但如果你的模板结构比较复杂，此时，较慢的升降温速度反而有利于模板二级结构的打开，从而使反应获得较好的效果。但归根结底，瑕不掩瑜。

以上是基于理论上的一部分解释，但具体到实际中很可能没有什么用处。下面说说解决的办法。

1。如前文水溶沙战友回帖所言，请确定目的片段的大小。一般定量延伸30S，300bp是完全没有问题的。主要我们并不知道你定量的条件和普通的条件是否一致。

2。至于havocking提到的降低退火温度，这点我没有什么发言权，没做过，只能靠你自己实验尝试了。但理论上来讲，肯定是有用的，只不过降低退火温度，除了有利于特异性反应，同时也很可能伴随非特异性反应的增加（但并不绝对），如果这样做效果较好，别忘了再把定量产物电泳一下。

3。前面提到的，换引物，避开以前引物的那段设计区域。但这样做无疑比前两点成本高，建议您1、2无法解决的时候再用这个方法。

希望99shaoshuai战友无论是通过增加延伸时间还是降低退火温度或者更换引物来解决这个问题，都能将结果跟大家分享一下，万分感谢！

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 08:45

他应该就是问你每一个RNA样品是否有做重复实验，这些重复实验的数据是否也显示有一致性。我大胆猜测一下，是在跟你求证实验结果的稳定性和可靠性。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 08:45

只能重新合成有污染的引物了。还有，除了换试剂、换枪外，换人、换实验室。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 08:46

75度左右的峰应该是引物二聚体，而82的才是目的产物，这就是溶解温度曲线有2个峰，而电泳只有一条带的原因。

当有模板存在且浓度不那么低的情况下，与引物形成竞争关系，所以不容易出现引物二聚体，而纯粹加水的阴性对照由于没有任何竞争，很容易产生二聚体。

减少二聚体，最重要的就是引物设计的时候尽量避免。在实验时候，注意缩短操作时间，越熟练越好，并且全过程尽量保证在冰上操作。

另外，一般不用PCR产物切胶回收做标准品，因为PCR产物中会有大量的错配情况，毕竟酶的保真性很难达到极致，错配无可避免。而此时你用PCR产物当标准品必然会影响引物的扩增效率，因为很有可能，在引物结合的地方刚好错配。

希望你多找点定量相关的资料看看，然后再做实验。

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作者: @花开花落@    时间: 2011-10-15 08:46

再请教一下，在做realtime时，slope表示扩增效率。那他多少值时，算低；多少值时，算高？  

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作者: PCR    时间: 2011-10-15 08:50

请教各位老师，相对定量方法，如果检测的基因数较多，而且样品数超过了60个，用2的-ΔΔCt次方方法分析的话，加入每块板每个样品都要做目的基因和内参基因，显然一块板检测一个基因是不够的，如果样品的内参基因跟目的基因不在同一块板的话不知行不行，谢谢！

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作者: 白鸟之翼    时间: 2011-10-15 08:51

各位大侠，有没谁做过miRNA的定量PCR的？CT值一般多大呢？我看文献说正常的CT值一般是18-30，不知道有没有包括miRNA，我的CT值每次都超过30。谢谢

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作者: 百分比    时间: 2011-10-15 08:52

请教各位老师，相对定量方法，如果检测的基因数较多，而且样品数超过了60个，用2的-ΔΔCt次方方法分析的话，加入每块板每个样品都要做目的基因和内参基因，显然一块板检测一个基因是不够的，如果样品的内参基因跟目的基因不在同一块板的话不知行不行，谢谢！

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只要你的各种条件保持一致，可以的

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作者: 桔囿    时间: 2011-10-15 08:53

1.我是用sybr做dna病毒的绝对定量，现在遇到的问题如下：
1）未加模板的阴性对照有ct值，但溶解曲线不是特异峰，Tm为75度，应该是引物二聚体吧？还未跑电泳，标准品的tm温度为84.8 且只有一个峰，如果是二聚体的话，不重新设计引物可以吗？
2）做定量pcr的引物设计方面跟普通pcr有什么区别呢？请您具体讲一下。
谢谢您了！期待您的答复。  

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作者: 云端ing    时间: 2011-10-15 08:54

1.我是用sybr做dna病毒的绝对定量，现在遇到的问题如下：
1）未加模板的阴性对照有ct值，但溶解曲线不是特异峰，Tm为75度，应该是引物二聚体吧？还未跑电泳，标准品的tm温度为84.8 且只有一个峰，如果是二聚体的话，不重新设计引物可以吗？
2）做定量pcr的引物设计方面跟普通pcr有什么区别呢？请您具体讲一下。
谢谢您了！期待您的答复。

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我也遇到类似的问题，无模板对照有扩增曲线，ct值在40左右，tm值71度；阳性对照的ct值21，tm值75度。本来怀疑是引物二聚体引起的，但是电泳结果：无模板对照的产物大小跟阳性对照的产物大小一致！ 搞不懂是什么原因 ，请高手指教！不胜感激！

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作者: 章鱼小丸子    时间: 2011-10-15 08:58

请问潇湘子,我最近在做一个关于癌基因的real-timePCR,但是每次管家基因的CT值都会小于癌基因的,这是正常的吗?我觉得癌基因在癌组织中应该是过度扩增,多拷贝的,而管家基因应该是单拷贝的啊?这么说起来的话,应该是癌基因的CT值小才对吧?
还有,为什么我实验每次荧光扩增量都比较低啊?(我的意思是扩增的S形曲线中间那一段特别短),但是我的CT值又都是在20左右的?
我是菜鸟一个,请多指教哈.谢谢  

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 08:58

阳性对照，产物的Tm在75度实在太低了，如果产物的GC含量不是十分十分低的话，只能说明一点-----你的产物太短，我按照GC范围在40%－60%估计，Tm75，产物大小应该就50bp左右。而你的引物二聚体不过也就是50bp左右，普通琼脂糖凝胶电泳当然看不出来是目的产物还是引物二聚体。一般来说，你的阴性对照Ct在40左右出，且Tm71度，基本可以判断是二聚体，问题出在阳性的产物大小上。只能更换引物。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 08:59

简单的说Ct值与表达量是成负相关的，也就是说Ct越大，表达量越低。目的基因的表达量与管家基因的表达量相比是高还是低，一切还是以实验为准。

至于“S形曲线中间那一段特别短” 我估计是你的意思是S的线形不好看，特别扁。这与Ct没有任何关系，你只要调整一下纵坐标的数值就可以了。纵坐标表示荧光信号值的高低，你将纵坐标的最高值调低一点就可以了，至于怎么调，自己参考仪器的说明书吧。

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作者: 不懂    时间: 2011-10-15 08:59

您好！

我想请教一下，
1.您在设计荧光定量PCR引物时使用什么软件？
2.还有用两步法定量PCR时，是否要把cDNA进行浓度的测定？
3.目前有没有一步法荧光定量的试剂盒？
4.同两步法相比，一步法是不是会更好一点？

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作者: 章鱼小丸子    时间: 2011-10-15 09:00

谢谢潇湘子,我想我的表达有点错误,我的问题应该是:我扩增曲线的荧光值特别低,以前还有2-3左右,现在是越来越低,不到1了.但是S形状的曲线还是有的,这是什么原因啊?我调整了模板和引物的量,但是好象没什么效果哦  

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作者: 韩梅梅    时间: 2011-10-15 09:00

to 潇湘子 :
产物的Tm值跟产物的片段大小和GC含量有关系，但是如何从由片段大小、GC含量来推算Tm值呢 ？
我实验的结果是 ：阳性对照的产物片段大小是207bp，Tm值75度

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作者: coolcool    时间: 2011-10-15 09:01

两种可能：
1。检查仪器的通道有没有选错，SYBR用的是FAM通道。
2。每个循环荧光信号值检出的步骤是在延伸那一步，如果你设置在了变性95度，那肯定不会有什么信号了。

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我也遇到类似的问题了，荧光检测値很低，但是凝胶检测的时候出现了大片段的非特异带。

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作者: XYZQ    时间: 2011-10-15 09:03

刚开始做RT-PCR，不是很懂，问点低级的问题
我是用SYBR Green 做定量的
跑出来的曲线显示，处理组目的基因的Cross Point值为33，对照组〉40，是不是说明对照组基因上调了？
但是有人跟我讲说CP值大于35，就是说几乎没有表达，那是不是说我的对照组几乎没有表达，而处理组也是表达量很低？
比较矛盾，恳请高人指点，另外我的Tm值比Primer 给出的Tm值要高，我的是83，给出的62，又没有什么问题。

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作者: #甜#    时间: 2011-10-15 09:09

Cross Point值为33，对照组〉40，是不是说明对照组基因上调了？
我的Tm值比Primer 给出的Tm值要高，我的是83，给出的62，又没有什么问题。

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Cross Point？allanlu也是用roche的定量吧
如果用sybrgreen那还得先看融解曲线分析结果，在确保特异性扩增无引物二聚体的前提下可以认为相对于对照组而言处理组的基因表达上调了（CP越大表达越低）
感觉roche的定量结果不太受cp大小的限制，但sybrgreen法的Cp超过35我还是得质疑一下的，毕竟单拷贝按理论是33个cycle左右起跳的。
allanlu说的2个tm不是同一个东西，一个是引物的tm'一个是整个PCR扩增产物的TM，自然不同啦 。

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作者: 04906    时间: 2011-10-15 09:10

Cross Point？allanlu也是用roche的定量吧
如果用sybrgreen那还得先看融解曲线分析结果，在确保特异性扩增无引物二聚体的前提下可以认为相对于对照组而言处理组的基因表达上调了（CP越大表达越低）
感觉roche的定量结果不太受cp大小的限制，但sybrgreen法的Cp超过35我还是得质疑一下的，毕竟单拷贝按理论是33个cycle左右起跳的。
allanlu说的2个tm不是同一个东西，一个是引物的tm'一个是整个PCR扩增产物的TM，自然不同啦 。

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非常感谢楼上的战友指导，我是用的Roche的定量，你说先看溶解曲线什么意思？我的溶解曲线自认为没有问题，各条曲线均是逐渐下降，让后陡然下降，同一个基因的三组Tm值很相近（83.9、83、89、83.81），GADPH的三组Tm值为也基本相近，而且Melting Peaks，均为单峰，是不是比较理想？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 09:10

引物设计的软件有很多，可以自行选择，我用oligo比较顺手。另外，网上的关于引物设计的原则，个人感觉是很苛刻的，如果完全按照那些条条框框来很难设计的出来，把握一个总体的原则，减少二聚体的可能，减少错配的可能，上下游引物Tm差距不要太大，控制在2度以内，GC含量适中，一般来说能做到以上，引物质量问题就不太大，至于“3‘端尽量避免A”这一原则，能做到就尽量，做不到影响不会太大。

关于试剂的选择，我比较保守，总感觉RT和PCR分开比较好。

一步法试剂盒的优点和缺点都十分的突出，主要应用在那些及其容易受污染的模板上，毕竟操作一次带入污染的可能性要比两步法要小很多。但是，一步法相当于要同时迁就反转录和PCR两种反应条件和缓冲体系，感觉上两种酶的最佳性能都没有发挥出来，很可能扩增效率不会特别好。如果不是有模板污染这方面特殊考虑的话，建议用两步法试剂盒，

cDNA测OD和跑电泳都是没有任何意义的。

因为在反转录的过程中，你的体系引入了各种离子，还包括过量的引物，蛋白，并且PH也有改变，所有这些的任何一项对OD都有巨大影响。

cDNA电泳的话，由于是被Oligo和Random给反转录成不同大小的片断，是smear模糊的一团。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 09:11

产物207bp，Tm才75度？？？你的产物里GC含量有30％么？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 09:11

不能说大于35就没有表达，主要还是看产物电泳有没有特异性的目的带。但一个约定俗成的解释是Ct在35以后的结果我们要严重怀疑，毕竟定量PCR也是有一个最低检出限度的。

溶解温度曲线主要看产物的Tm跟你的预期是否一致，峰是否单一且峰形好看。你的目的基因表达量很低Ct在33，相对应的管家基因是多少？初始RNA模板添加量是多大？如果初始量比较低的话，你可以尝试增加一下模板浓度，这样Ct会有提高，但注意RNA总量最好不要超过500ng。

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作者: 西子    时间: 2011-10-15 09:12

请问给位大侠：
我的realtime-PCR中水的对照CT值很低在16，17，而没有明显的扩增曲线，应该不是谁的污染，是怎么回事？
请帮忙分析原因，谢谢！

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作者: 春雨    时间: 2011-10-15 09:13

谢谢各位老师经常给我解答疑难问题！在各位的指导下，我的问题基本解决了。不过现在还有个问题就是：
1）我把污染问题解决了以后，现在扩增效率很低，K=-4.3 我是不是可以提高引物浓度和增加模板用量来增加效率呢?现在的引物浓度为5umol/l 0.4 模板为2 ul
2）一检样品时标准曲线就不好了，是怎么回事呢？

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作者: 海鸥crazy    时间: 2011-10-15 09:15

请问：1.做标准曲线的时候能不能只做内参的呀？我同学只做内参的一条标曲，但得到了目的基因和内参基因两组数据，不是CT值。我一直弄不明白，不是要双标准曲线吗？2.如果实验设计是研究一种基因在几种组织中的表达差异，没有处理组和对照组之分，那么如何应用双DETA法呢？还是只能用DETA法呢？

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作者: nut6694    时间: 2011-10-15 09:16

可不可以推荐一家带测syber green Real time PCR公司啊，上海基星怎么样啊？收费保准，RNA抽提 40元/样本，样本逆转录成cDNA 50元/样本,荧光实时定量PCR反应 10×（1＋1）×3个（孔）  35元/反应（孔）,这个价钱合不合理啊？

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作者: fangxiang    时间: 2011-10-15 09:17

请问我做的是SYBR荧光定量法做绝对定量，我引用文献的引物先做了普通PCR，p出了目的片段大约560bp，但是进行定量PCR时，仪器上却显示无CT值，是怎么回事？
是引物设计的问题呢？还是不应该使用试剂盒里的热聚酶呢？谢谢指教

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作者: koook5695    时间: 2011-10-15 09:17

请问各位高手：
我是从临床粪便和阴道标本里提取细菌DNA，然后做SYBR荧光绝对定量，请问做定量对提取得细菌DNA有什么特殊要求吗？我是没用试剂盒手工提的，不知道可不可以，谢谢指教

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作者: 我佛慈悲    时间: 2011-10-15 09:18

请教：我即将做RT-PCR实验，想设计糖原生成素glycogenin(GN-1)的引物，
是SD雄性大鼠骨骼肌的，另外我查相关文献觉得做这方面的非常之少,当然很有可能是我没有查到,还请各位有相关资料的能跟我联系,本人邮箱280122866@qq.com,还请各位大侠帮帮忙，我初做实验有很多不懂的地方，请各位不吝赐教，在下不胜感激,多谢！

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作者: 龟仙人    时间: 2011-10-15 09:19

各位高手，
我是用染料法进行miRNA相对定量的 real time PCR。用miRNA的内参引物和目标基因引物进行P，发现CT值都很大，超过30，而且熔解曲线呈下斜行，产物电泳看到模糊的单条带。但是用同样的cDNA，换B-actin引物进行P，溶解 曲线可以看到很漂亮的单峰，我想请教一下，是不是我的引物有问题，或者是miRNA在提取过程中丢失了，才出现CT值大，熔解曲线不漂亮等情况呢？
谢谢指教！

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 09:19

理想情况下，如果所有基因的扩增效率都一致的话，是可以只用一条标准曲线来定量的，但这点似乎不太容易做到。建议你双标准曲线定量。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 09:20

没在外面做过实验，价格行情不了解，抱歉。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 09:20

560bp对于定量产物来说有点长，是不是你的延伸时间不够啊？

再次重申一下：定量的试剂和引物最好不要跟普通PCR的混用。也没必要用普通PCR来摸索定量的条件。

如果无法保证定量引物的特异性，最好还是保证菌种比较单一。提取DNA后同样电泳、测OD。

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作者: 何去何从    时间: 2011-10-15 09:21

帮忙分析一下熔解曲线，我用了两个公司的定量试剂盒扩增同一目的基因，熔解曲线如图，两个公司的产品出来两条熔解曲线，目的条带大小是一样的，熔解曲线不也应该一样吗？

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作者: queen    时间: 2011-10-15 09:23

刚刚接触实时定量PCR，很多东西不懂，向高手请教几个问题。
1、基线和阈值的设置，假如要手动设置基线和阈值，什么情况下才手动，是不是对于同一基因所有样本都需要同一阈值和基线？
2、溶解曲线在机器上是怎么运行的，假如我的退火温度是55度，是不是设置溶解曲线的温度也是55度（机器默认是60度）
3、进行浓度梯度的检测做标准曲线的时候，模板浓度改变，引物的浓度需不需要改变。
在线等答复，急，谢谢！

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作者: @木木@    时间: 2011-10-15 09:24

你好，我有一个问题想咨询一下：
我用的是半定量的办法，用的是subgreen的染料，不过但我看说明书的时候发现原来半定量的办法需要目的基因的扩增效率和看家基因的扩增效率一致；扩增效率的检测我知道如何操作；
我的问题是如果不一致的话那么该如何调节自己的样本或者Mg浓度来保证扩增效率的一致呢？想让两个值完全一样也是不可能的，需要两个扩增效率在多大的差异范围内才可以认为是相同的呢？

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作者: 浆果儿cc    时间: 2011-10-15 09:24

帮忙分析一下熔解曲线，我用了两个公司的定量试剂盒扩增同一目的基因，熔解曲线如图，两个公司的产品出来两条熔解曲线，目的条带大小是一样的，熔解曲线不也应该一样吗？

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很合理，只要跑胶显示大小一样就可以了。至于为什么溶解曲线出现峰值时对应的温度不一样呢？呵呵，好好想想，问题就在这两个试剂盒里面所含的成分浓度不一导致，比如某个试剂盒为了特别消除qPCR里面可能出现的非特异性扩增，那它有可能将DMSO的浓度加大到3%，这样导致Tm值全部降低，从而在溶解曲线处出现峰值对应不同的解链温度。

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作者: 楚留臭    时间: 2011-10-15 09:25

您好，我想问下您或您实验室RealTime 检测过小鼠PPAR-gamma基因嘛~

近期做定量，对小鼠PPARr的表达进行检测，感觉表达量应该很大的，可换了好多引物都未果，要么2聚体，要么扩增效率极低，引物有罗氏网站找的的、文献报道的。。。都不好，不知LZ有没做过这个基因，或您实验室有没做过的，能否把序列分享给我，非常感谢呀~~~  

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作者: 嘉年华    时间: 2011-10-15 09:26

我目前做的是miRNA的荧光定量，我看大家做这方面的人还是很少啊，小的在这有很多问题请教。
1.做miRNA的定量需要测定总RNA的浓度么？还是测定miRNA的浓度，但是它的量太少了，不知道测量准确不。
2.模板需要调整到统一的起始量，那针对miRNA要怎么调整啊？要是浓度不好测定的话。
3.内参的选择：我选择5.8SrRNA（大小约160bp）,直接从样品中分离纯化的，10%PAGE分离的条带不是很好，这样对于我做荧光定量是不是有问题？
4.样品：如果我的内参和目的基因是混合在一起的，也就是说5.8SrRNA和miRNA一起回收的，这对检测结果有影响吗？
5.制作标准曲线：稀释的倍数是按8倍或者10倍，但是我的稀释液是试剂盒里提供的，总共500ul，量不够。说明书上说要是用水或者TE稀释的话会对结果有很大的影响。
6.制作标准曲线时，2倍稀释的标准品（内参）扩增曲线有交叉，是怎么回事？
希望同行们多多交流，等待你们的回复

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作者: 嘉年华    时间: 2011-10-15 09:26

接上
7.溶解曲线：有两个峰，大家帮忙看看，是不是引物二具体啊？
该图是5.8SrRNA2倍稀释的曲线

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8718

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作者: 嘉年华    时间: 2011-10-15 09:27

内参和两个目的miRNA，分别做2个平行管，
红色和黄色的是内参，紫色和蓝色的是表达量较高的miRNA，粉色和绿色的是表达量较低的miRNA，它们的重复性都不好，有什么改进的方法么？


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作者: windy+++    时间: 2011-10-15 09:28

你好，我想请问下，能用Taqman 相对荧光定量PCR方法比较负链RNA病毒mRNA表达量吗？我抽提RNA的时候是从病毒的细胞培养液中直接抽取的总RNA，经过反转录之后成为CDNA。这种方法可行吗？

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作者: 按秒计算    时间: 2011-10-15 09:29

目前我正在做相对定量的准备工作，我想问下我的设计思路是不是正确？
1.先确定目标序列和内参序列的扩增效率是否一致。两个序列都做系列浓度稀释，五个浓度，按十倍稀释(SYBR green 法），分开两管做
2.如果扩增效率一致，就是不是可以开展后续实验了？
3.测定处理过的标本和参照物，同时在测定内参，前二者经过内参均一化处理后，就可以标本/参照，得出结果了，每孔重复测定3次

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 09:29

关于扩增效率的问题，有两位战友都有疑问，这里大红字先说明一下：

理论上，如果使用-△△Ct法的话，管家基因和目的基因的扩增效率要相同，并且是1，但实际中，几乎做不到这么完美，一般二者差别不太大就行，同时，扩增效率不是1的话，直接将实际的扩增效率带入公式计算一下就行。另外，还有一种办法，就是管家基因和目的基因同时制作标准曲线然后定量，这种方法不要求扩增效率一致.

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 09:30

1、关于基线和阈值，如果经验不是特别丰富的话，尽量不要手动设置，仪器自动给出的算法是很精确的，无论怎样都比手动设置要来的合理。
如果非要手动设置的话，个人建议摸索一下，由于大家用的仪器不同，我在这里不能一概而论的给个确定的调整方法。拿比较常见的ABI 7000系列的机器举个例子，一般改成是8-15个循环。还有一种方法，就是直接给阈值设成最高荧光信号值的1/5左右，不能再高了啊，呵呵。
以上手动设置阈值，纯粹是我继承他人的经验，仅供参考。

2、溶解温度曲线的制作是按照Tm的定义来的，双链DNA解开一半时的温度。也就是从60度逐渐升温到95度过程中随着产物DNA双链逐渐的打开来收集荧光信号值，在迅速下降的那个点做负一次微分就出现了带一个峰的图咯。你说的退火温度指的是引物的退火结合到模板上的温度，而制作溶解温度曲线说的是PCR产物。试着回忆一下，我们的引物二聚体经常出现在75度左右，因此做溶解温度曲线其实可以从55度开始，不过没必要那么低。

3、做标准曲线，除了模板浓度梯度改变，其他条件一律相同。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 09:30

不明白你花这么高的成本来做半定量目的是什么。半定量跑胶就行了，普通PCR啊。又或者我没有理解你的问题。再有，你定量PCR的试剂都是自己配制的？这个我真得认真的佩服你一下了，我这里很懒，都买premix那种，拿来主义直接使用的。因此，无法在优化各种组分上给你建议，实在抱歉。关于扩增效率，请看上面大红字。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 09:35

这个基因没做过。值得研究的基因实在太多了，你这个问题好似大海捞针一样难获得答案。如果你实在设计不了好用的引物，建议你查找一个权重比较高的外文文献，直接引用人家的吧。不是我媚外，客观的讲一句，国内文献的引物尽量不要参考。当然，引物拿来后要先在NCBI上做个同源性分析，以及Oligo分析下错配、二聚体什么的。

另外，你是如何知道扩增效率低一定是引物的原因呢？你的模板浓度多少？体系、反应条件优化了么？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 09:35

实验套路是没什么问题，扩增效率参看大红字，祝你顺利

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作者: #甜#    时间: 2011-10-15 09:36

谢谢你的解答，但是我后续实验有点不明白内参的意义了。
1.ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照；这里的两个管家基因是一样吗？（即使是同一组织，假设目的基因和参照都是拿beta-actin当内参测），它们需要分开测吗？以上都是在内参和目的基因扩增效率一致的前提下
2.扩增效率是如何测得的，我在别人的数据上没看到过扩增效率，是不是后来计算的，能不贴个图给我看看  

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作者: @STAR@    时间: 2011-10-15 09:36

请教大侠，我的实验参数是：50°C for 2 minutes hold (UDG incubation)
95°C for 10 minutes hold (UDG inactivation and DNA polymerase activation)
40 cycles of:
95°C, 15 seconds
60°C，60seconds
引物的Tm是65度左右，有人建议把两步法改为三步法，应该怎么改比较好呢？还有就是谁知道ABI7300的熔解曲线起始温度在哪里改吗？急需。
请不吝赐教，谢谢。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 09:37

1.ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照；这里的两个管家基因是一样。所谓的实验组和对照组你不要有太大的负担，呵呵，举个例子，假设在药物处理前有一个样品（对照组），药物处理后也一个样品（实验组），那么做实验的时候，就是把这两个样品同时做管家基因和目的基因，只不过在最后数据处理的时候区分对照组和实验组。

2.扩增效率是仪器自动生成的，有些仪器需要制作标准曲线后才能计算出来，有的仪器可以把每个孔的扩增效率计算出来（这种仪器我没使用过）。当X轴表示Ct值，Y轴表示模板起始浓度（log10），此时扩增效率＝10（－slope）幂指数－1。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 09:37

三步法可以试一下常规的条件退火55度或57度（10-20s），延伸72度（30-40s）

溶解温度曲线仪器默认的足够从60度开始，如果想更改的化，可以新建一个反应，然后在Instrument里选择Add Dissociation Stage，在各处显示温度的小框框里更改就可以了。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 09:37

miRNA相关的实验完全没有做过，全凭网上的资料了解的，我担心根据自己的理解回答问题可能会误导你。因此很长时间没有回复，抱歉。建议你参考一下ABI相关试剂的产品说明书。

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作者: join    时间: 2011-10-15 10:25

刚开始做real time，用的是25ul体系（TOYOBO SYBR Green Mix 12.5ul ，上下游引物各1ul，样本cDNA 3ul，DEPC水补足），发现内参和目的基因的Ct值都很小，阈值在0.002时，Ct值都大约在10左右，而且目的基因的Ct值还小于内参。
请教大虾，是否应该减少样本cDNA的用量？还是有其他的问题？
多谢：）
PS：RNA反转录成cDNA时用的是3ugRNA 20ul反转录体系，转录完毕后稀释至100ul。  

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作者: 鸽子不哭    时间: 2011-10-15 10:26

各位前辈好！我准备做BRCA基因突变的研究，由于两个基因都很大，外显子有40多个，因此直接测序的成本很高，所以想先进行一下筛选再测序。不知哪种方法比较好？原先考虑DHPLC应当不错，但是好像也要20元/片段，这样也太贵了。请问是不是RT-PCR也可以？价钱也比较便宜么？

小女子实在菜鸟，多谢各位帮忙了！

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作者: 萌芽    时间: 2011-10-15 10:26

请教下一个较为细节的问题：
做ΔΔCt法，目的基因和内参都要做标准稀释曲线，来确定扩增浓度！就是到底做实验组的两条曲线，还是做对照组的，请问二者有区别吗？我个人觉得做实验组的好些，万一药物有对内参的干扰作用，与同组的目的基因的扩增效率就相差较大了。是否是如此解释啊？？？

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作者: 雪花子    时间: 2011-10-15 10:27

各位前辈好！我准备做BRCA基因突变的研究，由于两个基因都很大，外显子有40多个，因此直接测序的成本很高，所以想先进行一下筛选再测序。不知哪种方法比较好？原先考虑DHPLC应当不错，但是好像也要20元/片段，这样也太贵了。请问是不是RT-PCR也可以？价钱也比较便宜么？

小女子实在菜鸟，多谢各位帮忙了！

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作者: mogu    时间: 2011-10-15 10:27

求教遇到一个很奇怪的问题:
SYB做的融解曲线只有一个很好的单峰,但电泳确有两条亮度都很高的条带? 可以确定都不是二聚体.

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 10:29

目的基因不是非要比管家基因表达量低的，二者之间没什么必然的联系。你的Ct在10左右，模板浓度比较高，适当稀释一下cDNA，加入量为原来的1/100应该就差不多了。估计是仪器默认的阈值参数不太符合你的模板实际检测出来的Ct值。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 10:29

如果想用定量的方法检测你的突变，大前提是必须知道确切的突变位点，以及具体的突变情况，否则是无法设计引物探针的，根本没有办法做。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 10:30

关于制作标准曲线的样品的选择，只要找一个目的基因和管家基因表达量都比较高的样品就可以了，无所谓是选对照组还是实验组。标准品只是为了提供一个直观的线形关系，可以让其他样品通过落在标准曲线的横坐标（Ct值）而直接算出对应的纵坐标（模板起始量）。

定量的标准曲线并没有多复杂，就好像我们高中时候做的无机化学实验的标准品一样，只是为实验提供一个量的参考。

其实很多人定量时都购买现成的标准品，这种方法也不是不可行，只不过是忽略的引物扩增效率的差异而已。为了实验更准确一些，才会有做双标准曲线这种说法。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 10:31

看看引物的具体情况吧，不确定是什么原因，如果一条是目的带，另一条是非特异性反应的话，那这两个产物GC含量和Tm配合得也太完美了，惊人的一致？不介意的话把你的目的基因信息和引物序列PM给我，帮你分析一下。

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作者: 04906    时间: 2011-10-15 10:31

我问个很弱的问题吧，
为什么老外的文章里片段大小都是3，4百bp，
（因为要借用其他实验室的仪器）主管老师告诉我，片段要设计到150一下。
为什么呀？
还有，如果我做相对定量，是不是就可以在反转录前不用测RNA浓度了呢？（因为，只要和样品的内参结果比较就行了呀）

谢谢，提前谢谢各位~！  

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作者: 阳光树    时间: 2011-10-15 10:33

LZ 你好，我接触定量PCR有段时间了，可还是很多问题不能自己解决！

1，如何判定自己设计的引物或引物+探针是有效的。
2，阴性模板即（H2O）在35CT后有信号被检测到，是正常还是异常？能否通过一些方法改变此现状。
3， TAQMAN 探针设计的引物一般情况下是不是不能用来做SYBR荧光定量PCR？
4，为什么有时候扩增曲线平台期，扩增曲线不平滑？如图


[ 本帖最后由 阳光树 于 2011-10-15 10:37 编辑 ]

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-15 10:37

我问个很弱的问题吧，
为什么老外的文章里片段大小都是3，4百bp，
（因为要借用其他实验室的仪器）主管老师告诉我，片段要设计到150一下。
为什么呀？
还有，如果我做相对定量，是不是就可以在反转录前不用测RNA浓度了呢？（因为，只要和样品的内参结果比较就行了呀）

谢谢，提前谢谢各位~！

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问题1： 3，4百BP 是一般的普通定性PCR吧？定量PCR一般要求扩增子在80-150BP 左右，但可以适当延长至300BP
问题2： RNA浓度是要检测，RNA 定量虽然不能给你一个绝对准确的浓度，但其浓度对RT和PCR反应体系的加入量是有参考价值的， 模板浓度太高会抑制反应扩增效率！模板浓度太低自然就是检测的CT 靠后了。

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-15 10:38

定量做过接近400bp的产物，引物设计的好，再摸索一下条件基本没有什么问题。但目前公认的说法是在150bp左右。定量PCR最大的特点就是速度快，如果产物过长，延伸时间长，必然会对延长反应时间。而且，定量的引物设计上充分考虑了这种快速的特点，一部分的非特异性反应是靠快速反应来避免的。可想而知产物如果特别长的话会有什么后果。

做相对定量也需要把RNA的量统一调整到一个浓度。

模板浓度太高对PCR反应有阻害，模板浓度太低将会降低与引物的竞争，容易有二聚体。如果不调整RNA浓度的话，从反转录开始到PCR每一步的扩增效率都是不同的，从而达不到一个统一的效率，在一个相同的平台上进行比较。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 10:39

1，如何判定自己设计的引物或引物+探针是有效的。
看有无扩增曲线（Ct 35圈以前）。同时，如果是SYBR方法，可以通过溶解温度曲线和电泳来确认。如果是探针法，只能电泳。

2，阴性模板即（H2O）在35CT后有信号被检测到，是正常还是异常？能否通过一些方法改变此现状。
此时需要电泳确认是否有目的条带。如果没有条带，说明荧光信号是二聚体检出的。如果有目的条带，就是污染。

3， TAQMAN 探针设计的引物一般情况下是不是不能用来做SYBR荧光定量PCR？
不能通用。因为多了一条探针，在设计上对引物的要求自然比SYBR的引物设计要求宽限一些。

个人建议，你可以自己在软件上分析一下，如果理论上看与探针配套的引物没有错配什么的，可以尝试把它作为SYBR的引物。

4，为什么有时候扩增曲线平台期，扩增曲线不平滑？如图
需要校正仪器。

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作者: 过路甲    时间: 2011-10-15 10:39

2，阴性模板即（H2O）在35CT后有信号被检测到，是正常还是异常？能否通过一些方法改变此现状。
此时需要电泳确认是否有目的条带。如果没有条带，说明荧光信号是二聚体检出的。如果有目的条带，就是污染。

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但问题是如果真的35CT 后有扩增，恐怕电泳也是看不到扩增产物条带的吧，是不是可以把产物取2ul再PCR，来跑电泳？？？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 10:40

但问题是如果真的35CT 后有扩增，恐怕电泳也是看不到扩增产物条带的吧，是不是可以把产物取2ul再PCR，来跑电泳？？？

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Ct 38的产物电泳是完全可以看得到的。引物二聚体如果严重的话，也不过是38开始扩增曲线有抬起的迹象，此时电泳完全可以看得见二聚体。

拿定量产物再次PCR来验证是否为污染，恐怕只有异常有钱的实验室才能这么干吧。并且，二次PCR引入污染的可能性是很大很大的。凭什么认为这个结果是定量时候就有的污染呢？

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作者: 中国特色    时间: 2011-10-15 10:40

LZ你好,请教下ABI7500机型,相对定量有两个模型,即relative quantification (ddct) plate和relative quantification (ddct) study ,其二者有区别吗?

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作者: wawa    时间: 2011-10-15 10:41

relative quantification (ddct) plate 这个是你开始做实验的时候用来收集数据的

和relative quantification (ddct) study 这个是你分析数据的时候用的 这个网页有仪器的软件说明 可以下载看看
cuturl('http://www.ibms.sinica.edu.tw/support/core/document/AppliedBiosystems7500RealTimePCRmanual_c.pdf')

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作者: 韩梅梅    时间: 2011-10-15 10:42

各位高手，
我是用染料法进行miRNA相对定量的 real time PCR。用miRNA的内参引物和目标基因引物进行P，发现CT值都很大，超过30，而且熔解曲线呈下斜行，产物电泳看到模糊的单条带。但是用同样的cDNA，换B-actin引物进行P，溶解 曲线可以看到很漂亮的单峰，我想请教一下，是不是我的引物有问题，或者是miRNA在提取过程中丢失了，才出现CT值大，熔解曲线不漂亮等情况呢？
谢谢指教！

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MicroRNA定量还用SYBR？ 你这样的结果出去有谁会相信阿？SYBR本来就不精确，加上MicroRNA前体和成熟体的极度相似性，你得出的Ct值很可能是前提的量而不是成熟MicroRNA的量，而在细胞中真正发挥作用的是成熟的MicroRNA ，你查查文献看看，现在研究MicroRNA都是用探针法了，而且一般都是ABI的MicroRNA 试剂盒，几乎是MicroRNA研究的金标准了。打电话去ABI问问吧 他们有免费电话 具体你自己去查吧

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作者: 快乐的大脚    时间: 2011-10-15 10:42

我最近做了一些定量PCR的结果，想问一下关于相对定量的问题，我选ACTIN为看家基因，，加上我的两个目的基因直接用不同处理，不同取样时间的cDNA作为模板，进行SYBR定量PCR，这样得到的结果可以吗？以下是我的融解曲线图，麻烦yaoshan给分析以下啊？

图片附件: 91450625_snap.jpg (2011-10-15 10:42, 81.49 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8721

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作者: 快乐的大脚    时间: 2011-10-15 10:43

不知道上图的融解曲线是否合格呢？

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作者: mod=8048    时间: 2011-10-15 10:44

1.在takara设计的用于real-time pcr的引物退火温度是否都是六十度？我们实验室好像从来就不问你退火温度，直接就是设定60°上机。
2.用takara设计的引物用SYBER Green 的mastermix做实时定量pcr后将产物跑胶有的看不到条带，有的又产生许多非特异性条带，但之前realtime的溶解曲线却很好，单峰并且峰值都在一个地方。那么这样的realtime结果还可信吗？
3.以上两个引物做普通pcr的，将退火温度设梯度，产物跑胶非特异性条带都很多，请问这样是引物不好，还是RNA质量不好呢？
谢谢答复！  

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 10:46

两个基因的扩增曲线交叉不交叉，没有什么意义。在你的实验中，只不过是荧光信号值高低不同、表达量不同而造成了交叉，不必太介意这一点。

你的扩增曲线不是s型，似乎没有进入平台期（而不是很快到达平台期），试着将反应设置为45个循环。另外，还需要分析一下引物的质量，以及优化一下反应条件。

当基因表达量比较低的时候，就比较容易出现复孔不平行的情况。原因已经说过多次了，呵呵，模板与引物是竞争的关系。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 10:46

只要相同基因溶解曲线峰是一致，且比较尖锐就可以了，你贴的图比较乱，似乎有一些是有不同溶解峰的，其实你自己可以在机器上单独看某个基因某个样品的，完全可以判断出来。

另外，实验结果能不能用，不仅仅是看溶解温度曲线，还有扩增曲线，Ct值，模板完整程度和纯度，很多方面的。最重要的，实验结果与理论是否一致。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 10:46

关于takara引物和试剂的问题，请你跟公司咨询，我并不清楚怎么一回事。

不建议定量引物用于普通PCR。

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作者: 花裙子    时间: 2011-10-15 10:47

Ct 38的产物电泳是完全可以看得到的。引物二聚体如果严重的话，也不过是38开始扩增曲线有抬起的迹象，此时电泳完全可以看得见二聚体。

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能看得见引物二聚体我是理解的，但能看到目的条带我不解
如果设置40个循环，阴性模板（H2O）在35CT左右有信号，电泳能看得见目的条带吗？？这点还请LZ 确认，因为我一直没有做过，或者做过跑出来的电泳只看得见引物二聚体，因此就不知道是判断有轻度污染呢，还是没有污染。

说明白点，我的问题就是，如何判断我的体系有没有污染。尤其是阴性对照在35CT左右出信号时候。因为如果我的目的基因丰度不高时，PCR后会影响到我基线的设置，从而影响到我目的基因的定量！

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作者: @花开花落@    时间: 2011-10-15 10:49

谢谢上次的回复！刚第一次跑RT-PCR，发现SYBRgreen的每组荧光信号在40000值以下，同时Rn在0.93为X线的中心线，整个过程是不是失败了，因为整个扩增线都是没怎么起伏的，我的扩增程序如下：95C 60S 1次 ;95C 15S 60C 15S 72C 45S 40次；信号收集在72C
1.是不是反应条件没优化，导致没扩增？我在普通PCR 上扩增出来了
2.收集信号的位置是不是错了？
3.整个过程SYBRgreen的每组荧光信号竟然比ROX每组都低，是不是根本不是标本的信号，是背景的？

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作者: 岸上的鱼    时间: 2011-10-15 10:51

谢谢上次的回复！刚第一次跑RT-PCR，发现SYBRgreen的每组荧光信号在40000值以下，同时Rn在0.93为X线的中心线，整个过程是不是失败了，因为整个扩增线都是没怎么起伏的，我的扩增程序如下：95C 60S 1次 ;95C 15S 60C 15S 72C 45S 40次；信号收集在72C
1.是不是反应条件没优化，导致没扩增？我在普通PCR 上扩增出来了
2.收集信号的位置是不是错了？
3.整个过程SYBRgreen的每组荧光信号竟然比ROX每组都低，是不是根本不是标本的信号，是背景的？

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作者: 菠萝菠萝蜜    时间: 2011-10-15 10:52

ROX是不是基线啊，Rn＝Rfam/Rrox，这个公式每次都是这样得出的吗？我做SYBR法。ROX提供了什么作用啊，消除移液误差吗，怎么体现？
最麻烦的是：我不知道我做出的预实验标本的荧光线到底怎么样才是合理的，或者是最好的。别人说CT在25-35之间，没有引物二聚体就可以了，是这样判断吗？我的想法是确定合适的PCR反应体系和退火温度后，做稀释标准曲线，但是如何确定我的预实验的标本荧光是我想要的？

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1，ROX 其实是一种染料，用来消除由于加样操作的误差,离心管透光性能的差异,荧光激发效率的差异等偶然因素引起的实验误差的，但并不是所有仪器都需要用ROX染料，如LIGHTCYCLE就不需要，而ABI的仪器大多需要。
2，不知道您第二个问题是什么意思，似乎是说怎么就知道扩增的荧光信号就是你的目的基因的扩增产生的信号？是这个问题吗？
如果是这个问题，
1， 定量你的阳性模板（如质粒测OD），然后做梯度稀释，两个判断标准1）梯度稀释阳性模板扩增曲线平滑且平行，间隔均匀。2）根据ct值推导你的阳性模板的起始浓度，如果结果接近，则说明是你的 目的基因的扩增荧光信号
2，电泳法，电泳跑出条带，跟引物设计大小核对，如果一致则说明对头，再者割胶回收测序。
3，如果是SYBR法也可以根据融解曲线判断。

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作者: 131415    时间: 2011-10-15 10:54

ROX明白了
第二个问题是这样的:我知道先做系列稀释梯度曲线(含目的基因和内参),接着通过扩增效率来判断后续实验!我的意思是做梯度之前:我想明白我跑个样本证明我的反应体系和程序是好的,它反应在图片上那条标本荧光该是如何才是最佳  

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作者: 131415    时间: 2011-10-15 10:54

比如说好的标本荧光该满足20-35ct之间,无二聚体.....这是我想明白的问题!  

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-15 10:55

比如说好的标本荧光该满足20-35ct之间,无二聚体.....这是我想明白的问题!

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正常的CT值范围在18-35之间，我们通常能保证的就是阳性对照或者标准曲线的模板的CT值在这个范围内，过大和过小都将影响实验数据的精度，
但实际操作中未知标本并不如所愿，如果信号过早起跳，则要稀释模板的量，但如果CT在35左右，或35之后的要根据具体情况来判断是否阳性，不是统一划定为>35CT的信号就是假阳性或无效，可以通过增加模板量或重复实验来验证>35CT的值是否可信。

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作者: zzzz    时间: 2011-10-15 10:59

那您的意思是说只要满足了ct18-35之间位置,无二聚体的标本荧光,我就可以用此体系和标本做系列浓度标准曲线?如果做出来的扩增效率不好,再修改反应体系是吧(相对定量)

那退火温度是什么时候进行确定呢,ABI7500好像每次只能确定一个退火温度啊  

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作者: ##蒙奇奇    时间: 2011-10-15 10:59

那您的意思是说只要满足了ct18-35之间位置,无二聚体的标本荧光,我就可以用此体系和标本做系列浓度标准曲线?如果做出来的扩增效率不好,再修改反应体系是吧(相对定量)

那退火温度是什么时候进行确定呢,ABI7500好像每次只能确定一个退火温度啊

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我是这样认为的，不过要确定退火温度，就涉及到体系优化的问题，这没有好的办法，只有在定量仪上一次一次的预实验，再通过融解曲线分析来判断有无引物二聚体，没有引物二聚体，同时扩增效率较高，那就可以了。
有人建议在定性PCR仪器上摸索退火温度，然后再上定量，但我不赞成，之前我也试过，但认为不好（毕竟定性PCR的敏感性与定量是不可比的）。仅一家之言，请多讨论。

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作者: Darcy    时间: 2011-10-15 11:23

理论是明白了，具体细节再讨论下，我的标本ct是33ct，我系列稀释浓度已经好了，但是结果是浓度低的标本它的ct反而靠前，理论上是靠后的，奇怪，讨教下

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作者: mooon    时间: 2011-10-15 11:26

理论是明白了，具体细节再讨论下，我的标本ct是33ct，我系列稀释浓度已经好了，但是结果是浓度低的标本它的ct反而靠前，理论上是靠后的，奇怪，讨教下

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所谓的低浓度标本是怎么确定的？是理论上的（课题设计时理论认为的？）？还是实际测得的？
如果说你把33CT的标本进行稀释后，CT靠前的话，我就无言了！

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作者: #甜#    时间: 2011-10-15 11:26

是这样的，我取同一个标本，10倍稀释做5个梯度，结果发现10-4次比10-3次的ct还靠前些，小点，理论上不是低浓度的标本它的ct要大些，靠后的啊？我在想是不是有反应抑制物，还是其他呢

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作者: 阿敏    时间: 2011-10-15 11:30

是这样的，我取同一个标本，10倍稀释做5个梯度，结果发现10-4次比10-3次的ct还靠前些，小点，理论上不是低浓度的标本它的ct要大些，靠后的啊？我在想是不是有反应抑制物，还是其他呢

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如果是做4个10倍梯度稀释，那最高浓度CT值应该在18-20左右，一个梯度相差3.3ct，那最大ct也就在33.2左右，不能用一个CT值在30以后的浓度来稀释，因为这很可能接近你的检测下限了，这时的检测就不在准确，精确！

如果你要判断模板是否含有抑制物，应该在抽提RNA的时候就检测，可通过仪器测RNA的纯度。RNA 中含有酚时，会抑制反应的扩增效率，荧光定量PCR的检测灵敏度会降低。

同时，如果PCR体系中模板量过大的话也会降低检测的准确和灵敏度，（这时你的稀释，确可以出现你这样的情况，这是我的理论推测，）一般模板量不超过总反应体系的10%。

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作者: yonger    时间: 2011-10-15 11:30

谢谢，写的很仔细，我是用了一个CT在30以后稀释做梯度的，检测确实不准确，受教了

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作者: =菓子=    时间: 2011-10-15 11:31

你好我是用普通PCR和TagMan探针的方法分别检测DNA甲基化，引物和探针都是从文献上找来的，用的是zymo的甲基化试剂盒，普通PCR的阳性产物克隆做成标准曲线，同一份模板，普通PCR有明亮的阳性条带，而荧光定量的信号很低，CT值很高，提高模板量还是不行，不知道有没有高手能给我点建议，做了好几个月了，现在很是郁闷啊  

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-15 11:31

你好我是用普通PCR和TagMan探针的方法分别检测DNA甲基化，引物和探针都是从文献上找来的，用的是zymo的甲基化试剂盒，普通PCR的阳性产物克隆做成标准曲线，同一份模板，普通PCR有明亮的阳性条带，而荧光定量的信号很低，CT值很高，提高模板量还是不行，不知道有没有高手能给我点建议，做了好几个月了，现在很是郁闷啊

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看看探针是否能够很好的和模板退火呢？如果普通PCR扩的好的而荧光值低，很可能是探针不能很好退火。可能是探针本身的问题，也有可能是程序设计不是很合适。

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作者: 长发piaopiao    时间: 2011-10-15 11:32

请教楼主：比较Ct法是不是每一次分析之前都要做标准曲线确保扩增效率接近的情况下才能使用？还是只做一次标曲，确保扩增效率接近了，以后就不用再做标曲比较扩增效率，而是直接比较Ct值了？应该是后者吧，如果是前者的话每次都做标曲比较扩增效率那还不如用标准曲线法呢。还有扩增效率“接近”的容忍度是多大呢？实际操作中大家做标准曲线法多一些还是比较Ct法多一些呢？

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作者: 楚留臭    时间: 2011-10-15 11:32

LZ 你好，我接触定量PCR有段时间了，可还是很多问题不能自己解决！

1，如何判定自己设计的引物或引物+探针是有效的。
2，阴性模板即（H2O）在35CT后有信号被检测到，是正常还是异常？能否通过一些方法改变此现状。
3， TAQMAN 探针设计的引物一般情况下是不是不能用来做SYBR荧光定量PCR？
4，为什么有时候扩增曲线平台期，扩增曲线不平滑？如图

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对啊，我也想知道扩增曲线不平滑是怎么回事，也有这情况

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 11:33

Ct在38 溶解温度曲线和电泳均显示为目的产物，这是我自己做过的。

有没有污染，不能看有没有扩增曲线，主要是溶解温度曲线和电泳。即便有扩增曲线，但没有正确的溶解峰以及电泳显示的正常产物大小，也不能说是污染。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 11:33

关于模板浓度高低的问题。有句老话叫做过犹不及，放在这里恰如其分。一个正常配比的反应体系下，模板浓度通常都有一个上限量，高过这个上线，反而对PCR的过程是有阻害的。因此，首先，你需要将最高浓度下调至体系要求的模板上限量。

但是，当模板浓度过低的时候，梯度稀释一系列的点所获得的Ct值并不会有太大的差异。因为定量PCR的检出也是有一个最低限度的。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 11:34

用了差不多一周的时间观察本贴，发现重复的问题越来越多。可能以后不会每个问题都一一回答，只针对没有问过的问题做回复，请大家见谅！

与此同时，我将尽可能快的整理一下本贴中的问题，总结个简单的目录放在1楼，供大家参考。考虑到个人能力有限，仅涉及本贴中的问题，更全面的资料，还请大家搜索本版精华列表，里面的内容很详尽。由于新手甄别问题解决方案的能力极其有限，建议能够不遗余力的参考精华列表中的帖子，尽管有些帖子年份比较老，但那里正解的命中率还是十分高的。

截止到2009年3月31日为止，我回答问题的基本原则是——亲身实践过。问题回答中，基本不存在猜测成分。

针对最开始关于数据处理，统计学方面的问题，以及bluesky219战友提出的关于miRNA的定量问题均没有做出任何回应。 主要就是担心我一些没有把握的回答和潦草的猜测给大家造成误解，像个庸医似的贻误病情。但是，在目录编辑好之后，我会逐步把一些讨论问题引入进来，也说说我个人的理解，这样既有利于共同进步也不会误导新手，错把讨论当真理。

唉，以上说的好像我自己是个大佬，其实，仍然小弟一枚。仅希望散发点余热，减减肥！

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作者: 33号    时间: 2011-10-15 11:34

呵呵，多谢指点
我在继续我的相对定量，发现了内参出现引物二聚体，峰高为正常的一半，很明显，我朋友建议我直接就更换引物，我在想，能不能通过退火温度去除二聚体呢，有这个希望吗  

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 11:35

你现在的退火温度是多少？用的是60度退火、延伸30s么？你可以尝试一下62度，如果用的是三步法，55度退火的话，也升高2度试下。但如过不行的话，也不太建议在此基础上再升温。（主要不知道你不知道你引物情况如何）

你做什么物种？

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作者: queen    时间: 2011-10-15 11:35

现在用的是二步法，退火延伸都是60度，提高过2度，变成变成了三步法，退火62度，延伸60度，但是依旧十分明显二聚体，做的是人的前列腺，引物你想要我回答什么啊，我不知道怎么描述，需要说些什么，请指教

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作者: 小鱼鱼    时间: 2011-10-15 11:36

Ct 38的产物电泳是完全可以看得到的。引物二聚体如果严重的话，也不过是38开始扩增曲线有抬起的迹象，此时电泳完全可以看得见二聚体。

拿定量产物再次PCR来验证是否为污染，恐怕只有异常有钱的实验室才能这么干吧。并且，二次PCR引入污染的可能性是很大很大的。凭什么认为这个结果是定量时候就有的污染呢？

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楼主你好！按照你的方法我特地去跑了个电泳，可惜我的条带跑不好，我把图贴上来，请帮忙分析分析，并告知你成功电泳的条件或经验
我电泳条带大小130bp，是用 1% 或1.5%的琼脂胶，5v/cm 40min 结果跑成这样，都不好意拿出来了！我做的是taqman 荧光定量PCR

图片附件: 87436868.jpg (2011-10-15 11:36, 13.14 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8722

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 11:36

如果变条件二聚体仍然很严重的话，就没有什么好办法了，换引物吧。我说的引物情况就是上下游之间的匹配，以及Tm值。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 11:37

胶换成3%的就好看了。呵呵。

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作者: 开心蔬菜帮    时间: 2011-10-15 11:38

问一下有点业余的问题:我要做骨髓液的基因rtpcr相对定量,内参选b链或GAPDH,在内参低于多少copy(或浓度)的时候标本不可用?正常情况下骨髓和外周血的上述内参含量是多少?如果以k562细胞作为对照细胞的话,骨髓GAPDH/k562细胞GAPDH大约是多少?__________新手,还停留在试验设计上,见谅

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作者: 3N4G    时间: 2011-10-15 11:40

本人刚接触荧光定量还是个生手，现在不知道自己要做绝对定量还是相对定量？我的课题是测mRNA在小鼠体内，正常情况下，注药诱导情况下，疾病情况下，以及药物诱导疾病情况下某个基因的mRNA表达量，求助！

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作者: 绿茶公子    时间: 2011-10-15 11:44

本人刚接触荧光定量还是个生手，现在不知道自己要做绝对定量还是相对定量？我的课题是测mRNA在小鼠体内，正常情况下，注药诱导情况下，疾病情况下，以及药物诱导疾病情况下某个基因的mRNA表达量，求助！

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如果是比较某个基因在不同的处理情况下的表达情况，相对定量就可以了

如果要该基因在某一处理情况下的确切表达量，绝对定量

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作者: 绿茶公子    时间: 2011-10-15 11:44

据你的描述来讲 一般情况下相对定量就可以了

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作者: 绿茶公子    时间: 2011-10-15 11:46

求助！请教各位大侠，
我现在做SYBR的RT-PCR,现在最大的问题是扩增效率太高，昨天相关系数1.0和0.99的扩增效率都158.1和186.5 我是20ul体系，引物浓度0.1um，cDNA用的是扩增后产物，做了5倍稀释，6个梯度，Ct值在18.42、20.73、21.76、23.71、25.12、26.92.Tm：61.6度。能不吝指出问题出在哪里吗？怎么改进和优化呢？
非常感谢！

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cDNA用的是扩增后产物 能否更明确一些？

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作者: 绿茶公子    时间: 2011-10-15 11:46

问一下有点业余的问题:我要做骨髓液的基因rtpcr相对定量,内参选b链或GAPDH,在内参低于多少copy(或浓度)的时候标本不可用?正常情况下骨髓和外周血的上述内参含量是多少?如果以k562细胞作为对照细胞的话,骨髓GAPDH/k562细胞GAPDH大约是多少?__________新手,还停留在试验设计上,见谅

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一般GAPDH的表达量还是比较高的，如果要给一个确切的浓度，还是有难度的 呵呵

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作者: 何去何从    时间: 2011-10-15 11:47

想问问楼主和各位版友，现在市面上的SYBR产品很多
大家是如何选择的？
哪家的口碑好呢？  

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作者: @花开花落@    时间: 2011-10-15 11:48

这个问题大家问的比较多了

其实要根据不同的情况，课题大小，考虑到经费多少，最后要发的文章质量的高低等因素来选择的， 大致说一下

首先 如果说是第一次做定量，但是样本量及要做的基因都很多，自己又愿意学技术，学知识，可以慢慢摸索，可以只买些染料，然后自己来配反应体系。此方法也适用于一些节约的老鸟 O(∩_∩)O哈哈~
你要是自己没有接触过这类实验而且是做着一次以后可能就不再做了，建议直接预混好的mix，只用加模板和引物就OK，省时省力，但是费钱 呵呵

其次 mix又有很多选择，如果要求价廉物美，或者说定量在整个项目中占的位置不是十分重要，可以选择国产或是 toyobo的产品（有替鬼子做广告的嫌疑，不过他们的性价比确实要高一些，比较适合小一些的实验室）；如果再稍微好点的可选择takara的（同样是小鬼子的 唉……）；如果你要发好的文章，发到国外去，又有钱，直接选择ABI的一套东西，配合他的仪器，效果还真是不错。

当然，也许有其他更好的选择我不知道，还请其他战友提出来。

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作者: 晶晶亮    时间: 2011-10-15 11:48

请问各位师兄师姐
对定量标准品质粒的纯度有什么要求吗
我的A1/A2=2.4可以用吗，多谢回答

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作者: nut6694    时间: 2011-10-15 11:49

您好：
我的realtime是找公司做的，但公司做时发现内参和两样不能同一条件扩增出来，于是单独扩增了内参。这样的结果能用么？能用样品和内参作比较后讨论两样品的意义么？
谢谢，急！！！！

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作者: windy+++    时间: 2011-10-15 11:56

好多新同学都关心老手们用什么premix，这其实是我讳莫如深的问题，因为实在不能笼统的讲甲乙丙丁公司的premix到底孰优孰劣。我们只能在实验的过程中慢慢的摸索，把premix当做朋友一样对待，在实验前期验证引物的时候，也顺带摸索摸索反应条件，摸清了它的脾气才能更好的与之相处来实验。

举个我遇过的例子，同一个目的基因，同时比较了两种premix，扩增曲线和溶解温度曲线，用惯了的那种明显优于新送来的试剂，具体表现在旧的Ct值比新的小了3圈多，并且溶解温度曲线反映新试剂有好几个峰，非常明显的非特异性反应。

到此为止，似乎应该已经有了明显的判断。但，事无绝对，同实验室的人拿新试剂扩增了另外一个基因，获得了特别好的结果。

于是，我仔细看了一下新试剂的说明书，原来，我的模板添加量是上限的5倍。全都因为做实验时间久了，产生了一种想当然的惯性。

再次调整模板量，反映效果明显优于前一次，只不过，个人感情上还觉得原来用惯了的试剂比较好，呵呵。

但是，如果我们从模板添加量上来考虑这个问题的话，显然新试剂的灵敏度要比我原来用的那种好。

另外，还有一个感觉，自己公司的仪器兼容他们自己的试剂是最完美的，别家公司的试剂放在那上面经常有有二聚体或者扩增效率等一些小小的瑕疵。只不过，权衡利（钱）弊（瑕疵），没那么多钱，就一定不会选最贵的，性价比最重要。

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作者: windy+++    时间: 2011-10-15 11:56

好多新同学都关心老手们用什么premix，这其实是我讳莫如深的问题，因为实在不能笼统的讲甲乙丙丁公司的premix到底孰优孰劣。我们只能在实验的过程中慢慢的摸索，把premix当做朋友一样对待，在实验前期验证引物的时候，也顺带摸索摸索反应条件，摸清了它的脾气才能更好的与之相处来实验。

举个我遇过的例子，同一个目的基因，同时比较了两种premix，扩增曲线和溶解温度曲线，用惯了的那种明显优于新送来的试剂，具体表现在旧的Ct值比新的小了3圈多，并且溶解温度曲线反映新试剂有好几个峰，非常明显的非特异性反应。

到此为止，似乎应该已经有了明显的判断。但，事无绝对，同实验室的人拿新试剂扩增了另外一个基因，获得了特别好的结果。

于是，我仔细看了一下新试剂的说明书，原来，我的模板添加量是上限的5倍。全都因为做实验时间久了，产生了一种想当然的惯性。

再次调整模板量，反映效果明显优于前一次，只不过，个人感情上还觉得原来用惯了的试剂比较好，呵呵。

但是，如果我们从模板添加量上来考虑这个问题的话，显然新试剂的灵敏度要比我原来用的那种好。

另外，还有一个感觉，自己公司的仪器兼容他们自己的试剂是最完美的，别家公司的试剂放在那上面经常有有二聚体或者扩增效率等一些小小的瑕疵。只不过，权衡利（钱）弊（瑕疵），没那么多钱，就一定不会选最贵的，性价比最重要。

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作者: smile_smile    时间: 2011-10-15 11:58

您好：
我的realtime是找公司做的，但公司做时发现内参和两样不能同一条件扩增出来，于是单独扩增了内参。这样的结果能用么？能用样品和内参作比较后讨论两样品的意义么？
谢谢，急！！！！

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你的结果拿来想干什么？

如果投稿的话，恐怕会有质疑。你可以把你的问题拿去问问公司，看看他们怎么解释。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 11:59

请问各位师兄师姐
对定量标准品质粒的纯度有什么要求吗
我的A1/A2=2.4可以用吗，多谢回答

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质粒的纯度一般在1.8-2.0 2.4 有点。。。

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作者: flower@@    时间: 2011-10-15 11:59

你好! 我要做绝对定量，但我的探针3,端标记的淬灭基团好像在现用荧光定量PCR仪上没有相应广谱，现用ABI的7500，而我的淬灭基团是非荧光基团eclipse，请问遇到此种情况该如何办？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:00

选none

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作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-10-15 12:01

大家好：
我在做荧光定量上是新手，之前曾找公司代做过，现在自己买了酶想再做一点，反应条件就是按照公司给我的，唯一不同的就是酶，但是我做出来CT值一直都很大，在30以上，我调整了CDNA的浓度，最大5ul（total RNA浓度一般在3-5ng/mol），也对cDNA进行了稀释，但是一直做不好，不知道问题出在哪里，重新摸条件该从何处下手，请各位高手多多指教，谢谢！

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作者: =菓子=    时间: 2011-10-15 12:01

各位高手：请帮我分析一下。

图片附件: 77902851_snap.jpg (2011-10-15 12:01, 25.77 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8723

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作者: =菓子=    时间: 2011-10-15 12:02

各位高手：
同上面一样，是GAPDH 5倍梯度稀释后的扩增曲线。
以上曲线是根据TAKARA 试剂盒（SYBR Green）的实验例子，将内参GAPDH 5倍梯度稀释后的溶解曲线，反应条件是95℃ 30s，95℃ 5s， 64℃ 25s，40个循环。
刚刚接触荧光定量RT-PCR，问几个问题：
1、前面的高手提到 做荧光定量就用荧光试剂盒去验证引物和摸条件 ，请问扩增曲线和溶解曲线什么情况下说明引物合适呢？
2、阈值的设定是在荧光仪上设定吗？Rotor-gene 3000荧光仪 如何设定呢，没有老师请教，特请教高手帮助。
3、溶解曲线主峰前面有几个小峰，是引物二聚体吗？如何解决这个问题？与引物的量有关吗，需要如何调整？
4、用来比较不同用药组间基因的表达，分析时是用哪种方法，只是相对定量是不是不需要制作标准曲线？
5、如果制作标准曲线，除了用标准品外，还有其他办法吗？
6、引物是按做普通PCR设计的，纯化是按荧光PCR要求纯化的，这样的引物可以吗，目的基因的片段长度分别是131bp

图片附件: 35255276.jpg (2011-10-15 12:02, 53.74 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8724

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作者: =菓子=    时间: 2011-10-15 12:02

下图中蓝色--目的基因， 另外2个---均为内参。各位，这样的曲线如何分析呢？

图片附件: 29284517.jpg (2011-10-15 12:02, 25.25 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8725

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作者: =菓子=    时间: 2011-10-15 12:03

扩增曲线，下图

图片附件: 68967377.jpg (2011-10-15 12:03, 21.92 KB) / 该附件被下载次数 15
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8726

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作者: 快乐的大脚    时间: 2011-10-15 12:03

今天提RNA的时候 一不小心脑袋坏掉了 有几管细胞用trizol裂的时候没用灭菌的EP管(注意哦,连菌都没灭..我真是傻掉了TOT)

现在我把它冻到-80度了.. 请问还有救么.TOT

我搜到有这么说的... 在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿

意思是说,其实在trizol裂解之后才要求用rnase free的器皿?  

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:04

定量的酶大多是hotstar的，另外，定量體系是多大的？cDNA模板竟然加了5ul，似乎有點多啊

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:04

takara的盒子，好像退火延伸那一步是60度的，64度有點高，最好別超過62度（個人感覺）。

溶解溫度曲綫，第一張差一點，第二張還可以。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:05

有的EP管是出廠就保證RNase Free的，不知你用的什麽，看造化了。你先提一個樣品試看看，我估計問題不太大，其實只要不遇上RNA分解酶，RNA還是很瓷實的，呵呵。

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作者: 微笑的海豚    时间: 2011-10-15 12:05

你好! 我要做绝对定量，但我的探针3,端标记的淬灭基团好像在现用荧光定量PCR仪上没有相应广谱，现用ABI的7500，而我的淬灭基团是非荧光基团eclipse，请问遇到此种情况该如何办？

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这个可以用的，和fam-bhq一样，如果还是没有，需要重新设定一下，怎么做找abi的技术支持去，俺对abi7500不熟的，abi的其它定量用过，不难的。

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作者: 微笑的海豚    时间: 2011-10-15 12:05

你好我是用普通PCR和TagMan探针的方法分别检测DNA甲基化，引物和探针都是从文献上找来的，用的是zymo的甲基化试剂盒，普通PCR的阳性产物克隆做成标准曲线，同一份模板，普通PCR有明亮的阳性条带，而荧光定量的信号很低，CT值很高，提高模板量还是不行，不知道有没有高手能给我点建议，做了好几个月了，现在很是郁闷啊

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是探针问题，原因很简单，C都变成U了，at含量当然过高啊，探针tm太低，结合不上去自然信号低ct值高啦，提高模板量肯定不管用的。
有钱的话换taqman mgb，它可以提高探针的tm，信号强些，当然价钱也很"强"的。论坛里某些家伙一直推的allego探针ms也可以，可惜相关论文不多啊。

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作者: zhezhe    时间: 2011-10-15 12:06

关于您以下内容有疑问：
“关于数据处理，还是看你自己选择的实验方法，如果相对定量，可以先用管家基因的定量值校正目的基因，然后在进行样品间的校正，即用对照样品校正检测样品”

听起来太拗口、难懂了？能否用以下数据（来源cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/6129096_1.html')，病人(1-9)和正常人(10-27)）再解释一遍呢？

图片附件: 49910196_snap.jpg (2011-10-15 12:06, 74.64 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8727

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作者: zhezhe    时间: 2011-10-15 12:06

实验目的：对比化疗前后患者体内CK19 mRNA表达量的变化

实验方法：化疗前后分别抽取患者静脉血5ml，分离单核细胞层（其内含肿瘤细胞），之后按照RT-PCR方法检测CK19 mRNA

目前正在做相对定量 realtime PCR，
结果：
20个标本中只有2个出现目的基因扩增（Ct值31，34；阳性对照标本Ct值25），而文献报道目的基因阳性率为30-40%；同时内参扩增曲线比较好，Ct值大概在15左右。
问题：
1.询问各方面人士认为标本可能存在问题。客观来讲，标本有可能存在问题，因为我用的是06年的标本，一直冻在液氮里面。但是我想问从实验结果上分析，是不是有可能是因为标本的原因？（RNA 纯度，A260/180 1.7-1.9）因为这个牵扯到是否继续做的问题，谢谢！
2..作为新手，还有一些问题想请教：做定量PCR，怎么判别阳性阴性啊？是不是只要有Ct值就是阳性啊？
附：私下和cntspy 战友交流，了解到双2~△△Ct 法怎么应用到我的实验中，和大家分享，并再次感谢战友帮忙：△Ct=Ct1－Ct2 （Ct1为目的基因CT值，CT2为内参基因CT值，Q=2^(-△Ct) =2^(－(Ct1－Ct2)) ，Q即为目的基因的虚拟的表达量，然后分别算出化疗前和化疗后的目的基因的表达量，就可以比较二者的表达量了

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作者: 庄梦蝶    时间: 2011-10-15 12:07

请教：我想做的是胞膜受体和配体mRNA的时空表达分析，同一组织中某些细胞某个受体和配体的表达情况在出生后30天、50天、80天的变化。
请问 是应该做相对定量还是绝对定量？
怎样设定内参？
需要用SYBR Green 或探针法吗？  

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:07

TO zhezhe:
首先，单核细胞的数量是否够啊？还是你的单核细胞是个笼统的概念，把白细胞什么的都算进去了呢？这点你最好说明一下。加入目的基因只有单核细胞表达，而白细胞不表达，但内参肯定二者都会表达的，这样就直接影响了结果哈。

下面假设你的RNA全部是从单核细胞获得的，来分析一下。

如果内参在15的话，目的基因Ct比较大，可能说明该目的基因的表达量比较低，跟你说个简单的办法，你把那些没有扩增的定量PCR产物或者Ct比较大的PCR产物，当做模板，再做一次PCR，定量PCR还是普通PCR随便，（引物用定量的就可以）然后电泳看看是否有扩增。如果因为表达量低而没有扩增的话，做二次PCR无论怎样都是可以出的。如果二次PCR没出，才说明真的没有表达。

关于RNA纯度的问题，其实我以前并没有注意到，似乎每个公司的提取试剂对纯度的界定范围都是不同的，昨天看帖子，又人说Trizol的范围在1.6-1.8，说实话，我拿Trizol提取，但凡电泳结果很好的RNA都是在2.0-2.1。因此，你还是看下RNA的电泳结果再确定是否接着做下去。另外还有一点，到目前为止，我还没看出来RNA降解与完整 对定量结果有影响，哎，亲自做过2次比较一个管家基因一个目的基因，真的没发现Ct和表达量分析有差异。但这可能跟不同的基因有关，还是不能冒险让你继续做下去哈。

关于阳性判断，前面提过好多次啦，Ct在35以前，溶解峰正确，电泳有唯一目的带就算，但我个人把38的Ct也当做过阳性，主要依靠溶解峰和电泳确定的。注意一定不能光看扩增曲线和Ct值哈。

关于△△Ct ，你在google搜一下，好多文章讲的都特别详细，因为这个数学推导以及原理打字太麻烦，我就不说了哈，给个连接，你看看吧
cuturl('http://www.yhyg.com/articleview/2006-6-25/article_view_2163.htm')

其实，你的内参出到15，已经很好了，应该不是标本保存的问题吧？

另外，关于数据处理，我说的是用标准曲线法，你给的是△△Ct ，用你的图片我来解释一下标准曲线法是怎么分析的，首先用管家基因校正，就是每个样品（包括对照组和处理组）的目的基因Ct/管家基因Ct ，得到数值A。然后，在将处理组的A/对照组的A，这样大概明白了吧？

其实你那个表格已经很好的解释了△△Ct ，完全不必再参考什么别的文章了。

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作者: 箭头儿    时间: 2011-10-15 12:08

问楼主下：我做相对定量，因为内参老是出现二聚体，所以一直在等，终于等到了，发现扩增效率是108％，而俩目的基因分别是98％和138％，请问下判断的依据和解决的办法，稀释浓度曲线数据多次重复检验了，没问题

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作者: zhezhe    时间: 2011-10-15 12:08

首先感谢潇湘子战友的热心帮助！
1.单核细胞层里面会不会有白细胞？我觉得这个理论上是可以避免的，因为加入淋巴细胞分离液并离心后，离心管中自上而下可出现五层：血浆层、环状乳白色单个核细胞层、透明分离液层、粒细胞层、红细胞层。但是您提醒的这一点确实自己没有想到，把这个提出来可以保证实验设计的准确性！

其实单个核细胞层里面有：单核细胞，淋巴细胞和可能的循环肿瘤细胞（我的研究对象），而CK19 仅在循环肿瘤细胞中表达，但是的确单核细胞、淋巴细胞也要表达内参基因，所以这个内参基因不可避免的要受到影响最终结果！可是国外文献中也没有特别提及这个方面。我想是不是保证单核细胞层的体积相同就可以了？？？（我觉得这可能是能做的最大限了吧，战友们觉得呢？）

2.您提供的确定是否有表达的方法很巧妙，谢谢！

3.关于阳性的定义，您提到还要满足电泳有唯一条带？弱弱的问一句：是不是每个标本都要跑电泳啊？为什么我了解的是荧光定量PCR不需要跑电泳？谢谢！

4.关于△△Ct法，Q是代表目的基因mRNA的表达量是其内参表达量的倍数吗？

5.RNA的电泳结果如下，您看怎么样？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:09

RNA提取的很好，如果照片再亮一些就更好了，哈哈。

关于阳性结果的判断，如果溶解峰的差异比较大，请将有问题的挑出来跑电泳来看带的大小。另外，将ct在35以后的样品电泳，不必要每个样品都电泳，这样可是真的失去了荧光的意义了。呵呵。

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作者: zhezhe    时间: 2011-10-15 12:09

再提一问：
相对定量PCR 使用△△Ct法，要求目的基因和内参基因扩增相率接近100%，且相差不超过5%，那么扩增效率怎么计算？
有战友说机器自动生成？是吗？
查阅资料，说可以按以下方法计算，可是自己理解的不是很清楚，请战友详解！


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作者: one    时间: 2011-10-15 12:10

请教各位：本人是试验新手，应用荧光染料做PCR，检测胃癌组织中HPSE的表达，多次行荧光均未出现扩增曲线，荧光产物跑电泳也未见目的条带。请各位高手指点！多谢！  

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作者: 阿福    时间: 2011-10-15 12:11

请教各位：本人是试验新手，应用荧光染料做PCR，检测胃癌组织中HPSE的表达，多次行荧光均未出现扩增曲线，荧光产物跑电泳也未见目的条带。请各位高手指点！多谢！

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这个是明显没有扩增了，
想想 模板 引物，反应体系 ，因素有些多了

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作者: INK    时间: 2011-10-15 12:11

请问各位专家，CT值要怎么处理后才能组间比较

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作者: 金丝猴    时间: 2011-10-15 12:12

请教：
这段时间做了摸索条件。我有一个问题，好像都没有人碰到啊！
我的引物二聚体比较严重，所以提高了退火温度，为62度，发现有些目的基因主峰后面（温度高的地方）还有小峰，这是为什么啊？
难道是yaoshan说的温度太高了的原因？（附图）
还有一个问题是要是溶解曲线没有明显的峰的话是不是说明该目的基因表达量很低？因为有扩增的

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作者: sunshine039    时间: 2011-10-15 12:12

各位大侠，我的内参NTC进行复孔2个，一个是阴性结果，没有扩增，一个有扩增曲线，熔解曲线也看到单峰，究竟是什么原因呢？这两个管是一模一样的东西，而且都是混成一个总管才一分为二的，但结果相差那么远。请各位高手指点迷津。

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作者: yonger    时间: 2011-10-15 12:14

2.将totalRNA的浓度调至统一的起始量。
计算total RNA的浓度:RNA浓度（μg/μL）=（A260-A320）X稀释倍数X 0.04根据您所选择的反转录(RT)试剂,以及定量PCR试剂对模板浓度的要求,用TE把total RNA稀释至统一的浓度.

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潇湘子 战友，您好，关于调整totalRNA的浓度问题，有一些困惑，特向您请教：我通常的做法是提取totalRNA以后，测其浓度（我们所那台仪器可以直接测出浓度），然后根据逆转录酶的要求（totalRNA的量需要2ug）计算所需totalRNA的体积，再加其它成分进行逆转录。个人觉得可以根据所需totalRNA的质量和测出来的浓度计算所需体积即可，比调整浓度要简单一些。

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作者: mamamiya    时间: 2011-10-15 12:14

各位前辈大家好，我最近做了几次 real-time PCR，有些不懂的地方想请教下各位：
我用的是SYBR Green 相对定量，对细胞缺氧模型的指标进行检测，对用于做对照用的4小时时间点平行复制了3-4个模型，指标也在同一板中进行检测，但是基本每次它们的 △CT值都相差比较大，其余组分别与它们相比时，有时候相同的组2-△△CT相差几百倍。这是为什么呢？
在此先谢过了！
我做过复孔，CT相差不超过0.5，加样应该没问题。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:15

潇湘子 战友，您好，关于调整totalRNA的浓度问题，有一些困惑，特向您请教：我通常的做法是提取totalRNA以后，测其浓度（我们所那台仪器可以直接测出浓度），然后根据逆转录酶的要求（totalRNA的量需要2ug）计算所需totalRNA的体积，再加其它成分进行逆转录。个人觉得可以根据所需totalRNA的质量和测出来的浓度计算所需体积即可，比调整浓度要简单一些。

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实验并没有绝对正确的做法，根据个人需要来决定。我个人感觉你这样根据total量来计算加入体积的做法有一个小缺陷。

假如，样品的浓度差别很大的话，会造成有的体系中模板体积过大，有的正常，有的过小。相对于大多数反转录试剂，除了有totalRNA的量外，还有会有一个模板体积的要求，举个夸张的例子，如果计算出模板要加9ul，难道你就把反转录的酶、引物、buffer合起来加1ul？

另外，你根据试剂要求的极量来加模板是不是太浪费了啊？如果碰上珍贵的样品怎么办？

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作者: PINK    时间: 2011-10-15 12:16

实验目的：对比化疗前后患者体内CK19 mRNA表达量的变化
1.询问各方面人士认为标本可能存在问题。客观来讲，标本有可能存在问题，因为我用的是06年的标本，一直冻在液氮里面。但是我想问从实验结果上分析，是不是有可能是因为标本的原因？（RNA 纯度，A260/180 1.7-1.9）因为这个牵扯到是否继续做的问题，谢谢！
2..作为新手，还有一些问题想请教：做定量PCR，怎么判别阳性阴性啊？是不是只要有Ct值就是阳性啊？



问题1：
标本的问题主要是会不会溶血，如果保存的好，不溶血，应该影响不大，如何判断溶血呢？
使用淋巴细胞分离液的分离淋巴细胞，经过第一次离心后，会出现分层，具体见下图，如果在“分液层”这层出现红色浑浊， 则说明标本已溶血。如果很清澈，则说明标本很好。具体实验您可采集两份正常人新鲜血，一个立马分离淋巴细胞，另一个室温放置，次日后分离淋巴细胞进行比较。
问题2：
在本版讨论已经很多，这里带过。跑电泳，电泳是金标准，如果电泳阳性，就说明有表达。
我前段时间特地为这事（楼主认为CT28之后如果有扩增信号，可以跑出阳性电泳）做了类似的实验，结果正确，跑电泳要用2%-3%的胶，顺便反馈下。

补充说明，我不同意楼主的单核细胞量少的分析，因为荧光定量PCR 理论的敏感性是10 7个正常细胞中有一个肿瘤细胞都可以扩增出来，qxw9908 用5ML血，1ml血可分离2*106个淋巴细胞，而5ml即10 7个淋巴细胞，如果说有一个表达CK19 mRNA 的细胞存在，那就应该能被检测到，何况5ml外周血中就真的只有1个吗？当然一个也没有的情况也是存在的，另当别论！

欢迎讨论！

顺便推荐你一篇文章，你看看是否对你有用，我只有摘要，你如果能拿到全文，顺便分享下！
Xenidis N, Ignatiadis M, Apostolaki S, et al
Cytokeratin-19 mRNA-Positive Circulating Tumor Cells After Adjuvant Chemotherapy in Patients With Early Breast Cancer.
J Clin Oncol. 2009 Mar 30. [Epub ahead of print]
刚发出来的！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8731

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作者: dreaming    时间: 2011-10-15 12:17

实验并没有绝对正确的做法，根据个人需要来决定。我个人感觉你这样根据total量来计算加入体积的做法有一个小缺陷。

假如，样品的浓度差别很大的话，会造成有的体系中模板体积过大，有的正常，有的过小。相对于大多数反转录试剂，除了有totalRNA的量外，还有会有一个模板体积的要求，举个夸张的例子，如果计算出模板要加9ul，难道你就把反转录的酶、引物、buffer合起来加1ul？

另外，你根据试剂要求的极量来加模板是不是太浪费了啊？如果碰上珍贵的样品怎么办？

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谢谢您的指点！

我用的是Promega的逆转录酶，其他试剂如dNTP、buffer等都是凑起来的，总的逆转录体积为25ul,有时候测出来的RNA浓度比较低，也就是一二百ug/ml，这时候用的模版体积就会超过10ul，如果测出来浓度低于一百ug/ml，根据反转录酶的要求就有可能反转录失败。

我是根据逆转录酶对模版的要求来做的，您说的极量是什么意思？隔壁试验室对模版的要求是3ug呢。

您是怎么调整起始模版浓度呢？能否介绍一下，个人觉得测出来的浓度参差不齐，不容易调整到同样的浓度啊？

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作者: #甜#    时间: 2011-10-15 12:17

请教各位战友：
近期做荧光定量RT-PCR，内参扩增可以，Ct值在20左右，跑电泳也没问题。但目的基因的扩增曲线没有平台期，Ct值在30以上，跑电泳没有目的条带，溶解曲线有多个小峰，没有主峰。这是什么原因呢？这是不是证明RT这一步没有问题，但PCR的反应体系没有优化好或引物设计有问题？老师建议先做普通RT-PCR，并加大RNA的用量，这样可以解决吗？  

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:18

我们实验室的其它师兄师姐也是用SYBR做QPCR检测基因表达的相对量，他们没有做标准曲线，直接用-△△CT法计算，个人觉得应该先做标准曲线检测内参基因和目标基因的扩增效率，待二者扩增效率一致时才能用-△△CT法计算。您觉得呢？

我前天用Bio-Rad做了一次QPCR，加样量和顺序如下：
SYBR：12.5ul
双蒸水：10.5ul
上游引物：0.5ul
下游引物：0.5ul
cDNA: 1ul
先计算所需SYBR、双蒸水和引物的总量，加在一起混匀后分装，最后加cDNA,每个样品做三个复孔。

九个样品B-actin的CT值如下：
1. 16.82 14.91 14.84
2. 11.92 12.67 11.92
3. 12.52 11.72 11.45
4. 10.94 10.71 10.33
5. 10.51 9.40 9.45
6. 11.90 11.12 11.06
7. 15.09 14.38 14.43
8. 15.97 11.10 11.80
9. 14.87 10.05 14.03
这是第一次做QPCR，很多地方不明白：
（1）这些Ct值是否普遍偏低啊，是不是我的cDNA浓度较高啊？
（2）有些复孔之间的差异非常大，比如第1、8、9个样品，按道理来说同样的模版、引物和SYBR不应该出现那么大的差异啊？是否是我加样不均造成的呢？加样时应该注意哪些问题呢？
（3）再做QPCR之前应该先做标准曲线检测目标基因和内参基因的扩增效率吧？无法测cDNA的浓度，那么怎么来梯度稀释cDNA做标准曲线呢？

PS：您曾经提过“将totalRNA的浓度调至统一的起始量，用TE把total RNA稀释至统一的浓度”，但是我测出来totalRNA浓度后（我们研究所里的仪器可以直接测出来浓度），数值参差不齐，比如有的180ug/ml,有的248ug/ml，有的347ug/ml,在这种情况下，我怎么样调整至统一的浓度呢？

谢谢您的关注，期待您的回复。

为追求严谨性先看扩增效率是对的，但是很多人都不做的，呵呵，也一样毕业了。

你的Ct值偏小，需要稀释一下再检测。稀释100倍。
加样不准，除了实验手法熟练之外，给你们实验室的枪也校正一下吧。

假如所有的样品都调整到100ng/ul，180ug/ml的就1.8稀释，其他，自己算吧。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:19

请教各位战友：
近期做荧光定量RT-PCR，内参扩增可以，Ct值在20左右，跑电泳也没问题。但目的基因的扩增曲线没有平台期，Ct值在30以上，跑电泳没有目的条带，溶解曲线有多个小峰，没有主峰。这是什么原因呢？这是不是证明RT这一步没有问题，但PCR的反应体系没有优化好或引物设计有问题？老师建议先做普通RT-PCR，并加大RNA的用量，这样可以解决吗？

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我觉得没必要普通PCR。

增加RNA用量可以考虑，但从管家基因的Ct来看最多再增加10倍。（注意是反转录时增加RNA浓度，体积尽量不要增）。另外，还有很重要的一点，看看你用的试剂的说明书来确定RNA的最大加入量。过犹不及。

与此同时，请查资料，看看你目的基因的表达量是多少。如果本身表达量就很低的话，估计更换引物，或者加大RNA的量都不会有什么明显改善。

还有一种可能，你的引物设计的不太好。请自己分析一下先。

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作者: 白鸟之翼    时间: 2011-10-15 12:19

请教各位师兄师姐：与前面那位做荧光PCR的战友遇见同样的问题，本人也想查一下目的基因的表达量，但是比较愚钝，不知道该怎么查呀，希望各位给与指点，我尝试查阅大量的中外文文献，但是没见有做荧光PCR，所以比较迷茫。谢谢！不胜感激呀！！

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作者: @STAR@    时间: 2011-10-15 12:20

刚开始做定量，碰到这个问题：
有几个样品是2个多星期前反转录的，经过了几次冻融，做普通PCR完全没问题，但是定量却什么也扩不出来，琼脂糖胶也证实确实没扩出条带：2步法和3步法试过，abi，fermentars的premix都试过，就是扩不出。
随后，重新反转录，这次定量效果很好，虽然实验进行下去了，但是心里还是有个疙瘩解不开，为什么我8分钱一个单位的taq酶能扩出来，但是几十块钱一个反应的premix却什么都得不到？这是为什么啊～? ?

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:20

如果没有定量PCR相关的报道,你可以查一下检测蛋白的方法.殊途同归.

但我遇到过蛋白检测显示表达上调,定量结果显示没有差异的情况,呵呵.  

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作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-10-15 12:20

求助版主：我现在试验目的是想比较一个基因在不同病人体内的肿瘤组织以及对应的正常组织表达量是否有差异，内参是GAPDH，用的是相对定量标准曲线法，但是不知道怎么分析数据。通过标准曲线已经得到每个组织的quantity，然后用目的基因除以内参，得到相对含量。但是我看文献上说，此时还应该再用此数据除以calibrator的相对含量后，才是最终的相对含量结果。我就不知道，如何选择calibrator，不知不同的病人是否也能这样相除，再有就是我的样本数量较多，plates之间怎么比较？非常感谢!

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作者: zhezhe    时间: 2011-10-15 12:21

1：标本的问题主要是会不会溶血，如果保存的好，不溶血，应该影响不大，如何判断溶血呢？
回复：您的这个判别方法提示我试验的严谨性，我们科这些东西是交给技术员做的，有时候可能要耽误分离的时间，所以这个真的是要注意啊！多谢

问题2：
补充说明，我不同意楼主的单核细胞量少的分析，因为荧光定量PCR 理论的敏感性是10 7个正常细胞中有一个肿瘤细胞都可以扩增出来，qxw9908 用5ML血，1ml血可分离2*106个淋巴细胞，而5ml即10 7个淋巴细胞，如果说有一个表达CK19 mRNA 的细胞存在，那就应该能被检测到，何况5ml外周血中就真的只有1个吗？当然一个也没有的情况也是存在的，另当别论！
回复：谢谢您的分析，免疫荧光法比如CellSearch系统检测I-III期乳腺癌时定义阳性的标准基本上采取7.5ml大于等于1个，可见CTC的量还是比较少的。我做下来总的阳性率30%多（仅研究I-III期乳腺癌）

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作者: zhezhe    时间: 2011-10-15 12:21

3顺便推荐你一篇文章，你看看是否对你有用，我只有摘要，你如果能拿到全文，顺便分享下！
Xenidis N, Ignatiadis M, Apostolaki S, et al
Cytokeratin-19 mRNA-Positive Circulating Tumor Cells After Adjuvant Chemotherapy in Patients With Early Breast Cancer.
J Clin Oncol. 2009 Mar 30. [Epub ahead of print]
回复：这篇文章我有，用的是绝对定量，作者对比了化疗前后Ck19量的变化。

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作者: HOT兔    时间: 2011-10-15 12:23

引用“在本版讨论已经很多，这里带过。跑电泳，电泳是金标准，如果电泳阳性，就说明有表达。
我前段时间特地为这事（楼主认为CT28之后如果有扩增信号，可以跑出阳性电泳）做了类似的实验，结果正确，跑电泳要用2%-3%的胶，顺便反馈下。

回复：谢谢您的回答，其余问题都在原帖中回复，文章明日上传。
关于阳性定义问题，战友对不住啊，确实没有找到确切的帖子，您看这样描述准确否：
1.pcr产物（目标产物）电泳有唯一条带2.荧光定量pcr时靶基因扩增曲线呈S形状，Ct值在15-35之间，并且溶解曲线呈特异性单峰3.内参基因的电泳、扩增及溶解曲线同上述2条描述。
同时是否要考虑阳性对照、阴性对照标本靶基因及内参基因的情况？
我现在要答辩了，但是怎么样定义阳性还不知道，请不吝赐教！感激不尽啊！

1、对照的问题，对照是肯定要的。
阳性对照，用能表达你目的基因的阳性标本做对照，你这里可以用目的基因的重组质粒或者PCR纯化产物来做阳性对照，但必须经过测序鉴定正确方可做阳性对照。
严格来说，阳性对照是必须要有的。
阴性对照，不表达目的基因的标本做对照，可用正常人不表达目的基因的血标本阴性对照（临床型试验用），也可用不表达目的基因的细胞做阴性对照标本（实验性研究用）。
空白对照：一般用DDH2O来做空白对照
2、阳性定义
这个真的很难，你说的2条当然要包括，但临床型实验不是说很严格的15-35CT，目的基因丰度高，CT靠前一点也可以，目的基因丰度低，CT略靠后点也可以，但有一点，空白和阴性对照不能有荧光信号产生。
举个例子，如果你空白和阴性对照都无荧光信号扩增，而目的标本扩增信号ct为36，那你说是阳性还是阴性呢， 如果纯粹实验的角度，应该算阳性；但如果阴性和空白都有荧光信号扩增，那就只能说污染了。

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作者: 饭团团    时间: 2011-10-15 12:23

最近看到一篇“Novel Light-Upon-Extension Real-Time PCR Assays for Detection and Quantification of Genogroup I and II Noroviruses in Clinical Specimens”的文章。里面介绍了一种名为LUX RT-PCR的方法，因为刚刚接触RT-PCR这方面，我有点看不懂到底它跟普通的RT-PCR有什么不同，及原理！请高手指点，谢谢！

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:25

通俗一点说，LUX是一种基于分子信标的原理发展而来的技术。是介于染料法与探针法之间的一种技术。可以有效的避免引物二聚体（与SYBR比），但特异性没有Taqman探针的方法好。在成本上也介于二者之间。

它将发光基团标记在任意一条引物3'端，将这条被标记的引物设计成发卡结构，当引物没有与模板结合时是不发光的，结合后，发卡结构打开，3'端荧光也就开始发光了。

由于没有探针，LUX方法还是需要制作融解温度曲线的。

我个人觉得这种方法属于锦上添花的一种技术。号称特异性比SYBR好，但事实上SYBR的引物设计技术已经比较成熟了，完全可以通过设计来避免特异性差的问题。当真的遇到相似度比较高的序列时，恐怕LUX也无能为力，探针法毕竟是多了一条探针，作用很强大的。

与此同时，还有几点怀疑的地方：1，利用发卡结构粹灭发光基团，粹灭的可靠性高么？会不会造成荧光本底很高的问题；2，这种发卡结构的引物设计的门槛会不会太高？会不会比SYBR的引物要困难很多？

LUX这种方法我没有做过，以上完全是纸上谈兵，如有不妥的地方，还请多多指正。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:26

您好，我想问下该怎么选取内参基因，怎么确定该培养条件不会对内参的表达产生影响。
是不是加入的总RNA量一致的情况下，内参基因的Ct也应该是趋于一致的呢？
谢谢，麻烦了啊

是的，加入的总RNA量一致的情况下，内参基因的Ct也应该是趋于一致的。

内参的选择，目前主要依靠外文文献，直接使用普遍被认可的housekeeping gene。

如果你研究的东西没有被报道过，一般会要求多个复合的管家基因结果。

与此同时也有这样的做法：利用绝对定量方法，上大量样本，最后计算P值是否有统计学意义，来说明所选管家基因的可靠性。但仅仅依靠定量结果作为依据，还是有点出力不讨好的意思。必须辅助以生理学上的理论来阐述你的管家基因是可靠的。

考虑到高质量编辑那关有多么难通过，以及时间和钱的问题，个人觉得还不如直接从生理学角度考虑，以及做复合的管家基因。

说实话，目前我还没使用过GAPDH和Actb以外的其他管家基因。

我个人不是生物学专业，理论上的知识还是比较欠缺的。贴出来的内容大多是前辈传授的经验和实际工作中的总结，因此可能有不够严谨的地方。要确切的答案还请大家google搜索。

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作者: 果冻也酸    时间: 2011-10-15 12:26

LZ 有个问题探讨探讨，我一直不是很明白

荧光定量PCR技术探针法里可分 taqman（MGB），分子信标，罗氏的双杂交探针等
对于这几种技术的理解，我有一点疑惑
taqman探针是水解法，就是说TAQ酶的5-3外切酶活性把探针给切割下来，导致了荧光的积累
分子信标
变性前，自身杂交的探针不发出荧光，变性后探针自身解链，并杂交于模板，此时发出荧光。
罗氏的双杂交探针
变性前，探针游离于溶液中，无荧光，退火时，杂交双探针杂交于同一模板，一条探针基团激发另一条探针基团，产生荧光。

我想问的是
taqman探针技术在引物延伸时候，是水解法把探针水解掉，然后引物继续向前延伸，
而其他几种探针呢？在引物延伸的时候，这些探针又该何去何从呢，是也被TAQ水解了呢，还是整条探针解开了模板重新游离于溶液中，这个具体动态时怎么样的，不知和楼主有没深究过，如知详情，还望解惑！

希望知道的兄弟姐妹们补充！

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作者: @STAR@    时间: 2011-10-15 12:27

荧光定量PCR技术探针法里可分 taqman（MGB），分子信标，罗氏的双杂交探针等

我想问的是
taqman探针技术在引物延伸时候，是水解法把探针水解掉，然后引物继续向前延伸，
而其他几种探针呢？在引物延伸的时候，这些探针又该何去何从呢，是也被TAQ水解了呢，还是整条探针解开了模板重新游离于溶液中，这个具体动态时怎么样的，不知和楼主有没深究过，如知详情，还望解惑！

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除了taqman探针（包括MGB，还有最近有人推的allego探针其实也是taqman的一种）是被水解的， 其他探针除了分子信标双杂交还有蝎子的探针都是保持完整的。
动态情况视探针情况而定，但可以肯定是不发被检测的荧光（但可能发其它荧光，如双杂交探针在离开互补ＤＮＡ后开始发绿色荧光）

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作者: #甜#    时间: 2011-10-15 12:28

除了taqman探针（包括MGB，还有最近有人推的allego探针其实也是taqman的一种）是被水解的， 其他探针除了分子信标双杂交还有蝎子的探针都是保持完整的。
动态情况视探针情况而定，但可以肯定是不发被检测的荧光（但可能发其它荧光，如双杂交探针在离开互补ＤＮＡ后开始发绿色荧光）

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其实我似乎应该说的更明白点，除了水解探针外，其他的一些探针法，是通过何种原理解离开模版链的,似乎这才是关键。难道说是引物的延伸会竞争性的把模版挤掉吗？
还请明示!

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作者: 百分比    时间: 2011-10-15 12:29

其实我似乎应该说的更明白点，除了水解探针外，其他的一些探针法，是通过何种原理解离开模版链的,似乎这才是关键。难道说是引物的延伸会竞争性的把模版挤掉吗？

很简单啊，温度搞定:
其他探针法延伸温度在72度，那时探针们基本和模板分开了，而taqman探针的延伸在60度，那时探针还和模板结合着，so只有被水解了，据说其他探针法最好用无外切活性的taq酶，但不是完全必须，可能就是这个原因吧。

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作者: #甜#    时间: 2011-10-15 12:30

很简单啊，温度搞定:
其他探针法延伸温度在72度，那时探针们基本和模板分开了，而taqman探针的延伸在60度，那时探针还和模板结合着，so只有被水解了，据说其他探针法最好用无外切活性的taq酶，但不是完全必须，可能就是这个原因吧。

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似乎很有道理啊，我贴一个我问罗氏吴春旭博士的答案：从他的回答中似乎也说明了是温度起着主导作用。在72度延伸时候，温度使得探针与模板结合很弱，而taq酶又有竞争性，这样把探针挤掉了。

图片附件: 42847421_snap.jpg (2011-10-15 12:30, 41.76 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8732

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作者: =菓子=    时间: 2011-10-15 12:30

请各位高手帮忙分析一下：
PCR条件：95℃ 30s（预变性)---95℃ 5s（变性）----55℃ 20s----72℃ 15s
见下图，有2个问题请教：
1 扩增曲线15个循环之前出现 曲线下降 是什么原因？如何解决？
2 溶解曲线 主峰之前 的dF/dT很大 是什么原因？ 如何解决？

图片附件: 20992553.jpg (2011-10-15 12:31, 53.17 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8733

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作者: =菓子=    时间: 2011-10-15 12:31

接上图

图片附件: 64391536.jpg (2011-10-15 12:31, 50.26 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8734

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作者: mimili_901    时间: 2011-10-15 12:32

请问我们用TAKARA公司的EX HOT START TAQ酶做水解探针法REAL TIME PCR怎么做都没有结果，而用该公司用该酶配制的PREMIX就能做出结果。我们调高了Mg 离子浓度到6mM也做不出来，我们还应怎么做呢？我们酶都买来了，也不能浪费啊！  

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作者: 天蓝蓝    时间: 2011-10-15 12:32

普通pcr能p出来，realtime就p不出，什么原因啊？模板稀释了5倍和100倍做realtime都没有结果，扩增曲线是一些杂峰

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作者: 大猫    时间: 2011-10-15 12:33

real time结果分析中的涉及到的计算公式有哪些?谢谢各位大侠了

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作者: jude    时间: 2011-10-15 12:33

各位前辈：
你们好！
我是位PCR新手，买的是东盛的MIX，生工的引物，梯度pcr仪摸退火温度，但是条带总是不在我的目的条带，我需要的是212，但是老是在250以上，请各位高手指点！谢谢！

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作者: dmg    时间: 2011-10-15 12:35

我做一个DNA的real time PCR ，扩增基因为100多bp，用的是Taqman探针。我用的是ABI的7900HT的仪器。荧光定量的曲线是有 但是是锯齿状的曲线。而我放在罗氏Lightcycler 却是可以的；根据ABI的工程师说去掉软件上ROX的按钮，但是我今天做了结果还是一样， 实验就停在这里了，本人很着急 希望有知道的人可以跟我说下，到底是哪里出了问题

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作者: panda王    时间: 2011-10-15 12:36

关于 real time PCR 的一个基本问题：

1。 如何确定baseline 和threshold，为什么？

2. 我同时分析reference gene 和几个目标基因，baseline和threshold 是分开算还是同时

算，为什么？？

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作者: @木木@    时间: 2011-10-15 12:36

taqman探针的荧光基团和淬灭基团的选择有什么规则吗?
参考别人的探针碱基序列荧光和淬灭基团可以任意选择合成吗？

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作者: pou    时间: 2011-10-15 12:37

taqman探针的荧光基团和淬灭基团的选择有什么规则吗?
参考别人的探针碱基序列荧光和淬灭基团可以任意选择合成吗？
比如说我荧光基团和淬灭基团分别选择的是CY5和BHQ2，可以吗

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作者: 糊涂虫    时间: 2011-10-15 12:38

各位同仁好，有个问题想请教一下，关于荧光定量PCR最终数据分析的问题，本人采用ABI 7500以及ABI的SYBR Green做的相对定量检测几种细胞因子mRNA表达情况，采用2的-双Delta法分析出结果，由于样本量较大，需几块96孔板，采用一个正常组织标本做校对平衡，即calibrator, 最终算出得数据均是calibrator的倍数。calibrator的值为1，本人想做箱式图比较几种不同细胞因子的改变情况，图中只给出细胞因子增加或减少的倍数，不用给出正常组织的倍数，所用需要将正常组织的数据标准化为1，但因为正常组织不只calibrator一个标本，其他数据不为1，请问我该怎么做?
为了更好说明，我将举个例子，我想做下面一个图，见图

文字说明TGF-b1和Foxp3在1水平以下，说明表达下调了，而IL-2在1以上，说明表达上调了
，该文献就将正常组织的数据标准化为1了，箱式图中间的数据为中位数，我可以将正常对照组的值求平均，再将其他数据除以这个平均值吗？还是应该用中位数？或者其他更好的办法？请各位战友帮忙解决。

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作者: 碧空子    时间: 2011-10-15 12:39

求助，为什么我的扩增曲线会是这样，前几次做的挺好，最近两次做出来都是这样，但是和之前的条件也是完全相同的。

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作者: SOS    时间: 2011-10-15 12:40

做了几次real-time PCR，但是结果都不理想，在这里麻烦您在百忙中帮我看看，问题可能出在哪里。
我用的是SYBR Green 相对定量，对细胞模型的指标TNF-ALPHA 进行检测，每个时间点重复了三个标本，但是实验的重复性很差。
融解曲线都为单峰。

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作者: 假小子    时间: 2011-10-15 12:40

我昨天做了第一次荧光定量PCR实验，用了7个稀释度（最后发现只有6个成相关性），由于自己也不会操作，是别的老师帮我分析的结果和留图。有下面这样一张图，相关系数为0.999，公式y=-3.945x+42.964。但是扩增效率E=79.2%，是不是太小了啊。
另就是当时分析数据的时候那个老师在扩增曲线上能自如的调整那个Ct阈值,这个不是提前设定的么，还是处理数据时再设定也没关系。
还有一个小问题，这个问题汇总上第一页有说包含了“什么样的数据才是可靠的”这个问题，但是好像没找见答案啊。还请再回复下好吗。
新手入门，问题太多，还麻烦yaoshan兄和各位前辈帮忙解答下！十分感谢！！

图片附件: 54275053.jpg (2011-10-15 12:41, 45.48 KB) / 该附件被下载次数 0
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8736

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作者: 大桃子同学    时间: 2011-10-15 12:41

“做了几次real-time PCR，但是结果都不理想，在这里麻烦您在百忙中帮我看看，问题可能出在哪里。
我用的是SYBR Green 相对定量，对细胞模型的指标TNF-ALPHA 进行检测，每个时间点重复了三个标本，但是实验的重复性很差。
融解曲线都为单峰。
肯请各位高手看看啦！
我用的是心肌成纤维细胞，第三代。本来是细胞应该达到90%融合就应该用的，但是因为细胞生长不同步，就让它们长到了100%或以上，这对实时荧光定量的结果影响是不是很大啊？

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作者: 不懂    时间: 2011-10-15 12:42

我昨天做了第一次荧光定量PCR实验，用了7个稀释度（最后发现只有6个成相关性），由于自己也不会操作，是别的老师帮我分析的结果和留图。有下面这样一张图，相关系数为0.999，公式y=-3.945x+42.964。但是扩增效率E=79.2%，是不是太小了啊。
另就是当时分析数据的时候那个老师在扩增曲线上能自如的调整那个Ct阈值,这个不是提前设定的么，还是处理数据时再设定也没关系。
还有一个小问题，这个问题汇总上第一页有说包含了“什么样的数据才是可靠的”这个问题，但是好像没找见答案啊。还请再回复下好吗。
新手入门，问题太多，还麻烦yaoshan兄和各位前辈帮忙解答下！十分感谢！！

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你的结果相当好了，不必苛求每次的扩增效率都在1.9-2.05之间，就算是同一对引物，在不同的循环里面出现扩增效率有0.2的波动也是很正常的事情，1.792个人觉得是一个很合理的扩增效率。看标准曲线主要就是看R^2值，你的达到了0.999，很不错的结果哦！一般选择R^2最大的时候Ct阈值作为阈值标准，不过如果R^2都很好，可以人为自己选择一个点来做为阈值。

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作者: 丸子妹    时间: 2011-10-15 12:43

我最近做real time PCR遇到一个问题，请教了挺多人，都不知道答案，请高手解答：）
实验方法大致如下：
ABI7300 人DNA，TAKARA的试剂 探针法
同一份人DNA，加样量大概为15-30ng，其他的基因Ct值在20-30之间，而该基因它的Ct值没有（无扩增）或者是很大，35以上（120份样本里大概有30份样本是这样的）。
基本排除了以下可能：
1.模板的问题，因为测得浓度可以，其他的基因可以做出来，内参也可以做出。
2.引物和探针的问题 做过引物的扩增效率，构建的质粒在10-8Ct值约为34左右，最近因 出现上述问题，又拿质粒重新做了一次，仍可做出。同时除那30外，其他的人DNA仍可以做出，Ct在21-30之间。
3.当时怀疑是不是引物或者探针设计在SNP位点上，确定了下，没有，后来一位老师跟我说即使设计在SNP位点上，也不会测不出来或者Ct这么大。
为了知道为什么做不出来，我又设计了该基因普通的引物跑PCR.
设了阴性对照和阳性对照（是我的real time PCR可以做出该基因的Ct的标本），阳性对照有目的条带，而real time PCR 没有测出来的标本没条带，晕死了，本来想知道是什么东西，有条带的话拿去测序的，现在又泡汤了，请专家们给我点好的建议，实验比较急，现在基本停了：（

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作者: XYZQ    时间: 2011-10-15 12:43

求助：我做PT-PCR有关小鼠大脑中皮层和丘脑的,怎么把丘脑和皮层从小鼠大脑里取出来？希望能的到指点。  

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作者: 丁香@@    时间: 2011-10-15 12:44

请问下楼主：我跑电泳时内参有两条带，觉得是DNA污染，请问这个DNA是怎么扩增出来的，我个人觉得cDNA没有内含子啊，我不跨内含子，应该不会扩增出DNA啊，请问这个到底为什么啊  

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作者: 嗨皮    时间: 2011-10-15 12:45

Tm值的定义是DNA的双链解开一半时的温度.SYBR是嵌合在双链里的荧光,制作溶解温度曲线正是利用了这二点.

第一步: 95度高温迅速降到60度或者更低,是为了能让PCR产物双链比较稳定的存在,相当于一个溶解温度曲线制作的准备过程.
第二步:60度缓慢升温到95度,是为了让仪器每个几秒钟就进行一次荧光信号值的检出,双链持续的打开,当解开到一半的时候,荧光信号值达到最大,然后,继续解链,开始降低,直至最后.

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我有点不明白，为什么双链解开一半的时候荧光信号值达到最大呢？？SYBR GREEN不是和DNA得小沟结合吗，为什么不是未解链的时候荧光最大啊？？我是新手，比较弱。。。

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作者: #甜#    时间: 2011-10-15 12:47

我有点不明白，为什么双链解开一半的时候荧光信号值达到最大呢？？SYBR GREEN不是和DNA得小沟结合吗，为什么不是未解链的时候荧光最大啊？？我是新手，比较弱。。。

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你的理解完全错误的。融解曲线的峰图是一个导数图，dl/dt求导，求导的概念是曲线斜切面的斜率，当温度在Tm时，融解曲线的斜率最大，因此他的导数图就形成一个峰。而单纯的融解曲线图是一个随着温度升高，荧光值一直下降的图，类似反S曲线的那个图。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:49

请问下楼主：我跑电泳时内参有两条带，觉得是DNA污染，请问这个DNA是怎么扩增出来的，我个人觉得cDNA没有内含子啊，我不跨内含子，应该不会扩增出DNA啊，请问这个到底为什么啊

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如果你的RNA中有DNA，反转录后，能够被扩增的模板就有两种：1.cDNA 2.DNA 换句话说，即便你不做RT，直接把RNA当模板来PCR也能有产物（引物设计不跨内含子或者跨小内含子）。

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作者: free    时间: 2011-10-15 12:49

请问内参和目的基因的长度需一致吗？相差多大范围是允许的阿？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:50

请问内参和目的基因的长度需一致吗？相差多大范围是允许的阿？

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一般定量产物都是200bp以内。一般默认程序我扩300bp多一点也没问题。所以，只要控制在300以内都是可以的。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:50

一般定量产物都是200bp以内。一般默认程序我扩300bp多一点也没问题。所以，只要控制在300以内都是可以的。

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比如说内参100，目的基因300，完全可以阿？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:51

可以，两步法，退火延伸30S完全能扩出来。

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作者: wu11998866    时间: 2011-10-15 12:52

请问我做梯度稀释的时候按照10倍逐步稀释的，为什么最后五个梯度的扩增Ct值都差不多呢，都在二十左右？而且阴性对照里也有扩增，也是在20左右？

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作者: ffaa    时间: 2011-10-15 12:52

最近在做real time,SYBR Green 相对定量法，比较细胞处理前后，感觉重复性和稳定性都不好，有时候结果很乱，根本没有想要的趋势~
1，通常选用什么公司的荧光染料？
实验室曾经用过ABI的，估计是觉得太贵，现在改用天根的了，可是做出来的溶解曲线都是双峰（包括其他做组织的同学也是，看原来用进口试剂的师兄师姐的都是单峰，所以才开始怀疑试剂）
扩增曲线30个循环之后总会呈波浪状，是因为试剂不稳定么？
2，如果重复三次实验（三次细胞处理前后比较），最后的结果统计是直接用每次的RQ(2-△△CT)值做统计吗？还是前面的CT值，△CT 之类的？

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作者: ffaa    时间: 2011-10-15 12:54

这个算好一点的，今天做的一个更典型。忘了拷回来。明天拷了再上传。

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作者: 喵咪    时间: 2011-10-15 12:55

请问我做梯度稀释的时候按照10倍逐步稀释的，为什么最后五个梯度的扩增Ct值都差不多呢，都在二十左右？而且阴性对照里也有扩增，也是在20左右？

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阴性对照Ct在20左右,那是不得了了，污染吗？这么严重的污染！

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作者: she    时间: 2011-10-15 12:56

请问我做梯度稀释的时候按照10倍逐步稀释的，为什么最后五个梯度的扩增Ct值都差不多呢，都在二十左右？而且阴性对照里也有扩增，也是在20左右？

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我在做定量的时候也出现同样的问题，而且是每一次都是同样的问题，怎么也解决不了，还请各位高手赐教啊！！

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 12:57

阴性对照在20圈出Ct，基本就是污染。请先解决污染问题再做实验。
正常来说，低浓度的模板有可能区分不开，但这样的样品一般Ct都在35以后了。请确保每次加模板都更换枪头。

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作者: BUK    时间: 2011-10-15 12:58

我最近上了几次定量，做的标准曲线，发现扩增效率一直上不去，总在百分之80

几，R的平方可达到99.9%。

但是第一次是别人帮***作的，扩增效率都是百分之九十几，我又连做了2次，很认

真，很仔细，操作上也没太大问题，并且样品用的和以前一样，只是样品都又稀释了10

倍，但扩增效率就是上不去。

这是怎么回事呀，希望您能帮忙分析下可能造成这个结果的原因，好进一步纠正~~~~谢谢

~~~~我做相对定量表达。

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作者: KGZ564    时间: 2011-10-15 12:59

我最近上了几次定量，做的标准曲线，发现扩增效率一直上不去，总在百分之80

几，R的平方可达到99.9%。

但是第一次是别人帮***作的，扩增效率都是百分之九十几，我又连做了2次，很认

真，很仔细，操作上也没太大问题，并且样品用的和以前一样，只是样品都又稀释了10

倍，但扩增效率就是上不去。

这是怎么回事呀，希望您能帮忙分析下可能造成这个结果的原因，好进一步纠正~~~~谢谢

~~~~我做相对定量表达。

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个人认为
1：标准品的稀释是每次都用新的稀释，即不能用上次稀释的浓度来做标准品，更不能用上次稀释的标准品做稀释后再做标准品，而是每次都是新的稀释。
2：在用高浓度标准品做梯度稀释时，请尽量使浓度最低的标准品在线性范围内，做标准曲线时，可适当考虑去掉最后的低浓度的标准品。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 13:00

除参考大家说的外，有的引物扩增性能确实达不到100％。一般80-120％的扩增效率都可以接受的哇。不必太苛求了。呵呵。

实验的影响因素很多，包括使用的试剂是否与你曾经达到90时是相同厂家的相同批号呢？  

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作者: =菓子=    时间: 2011-10-15 13:00

1.下面是看家基因和目的基因的熔解曲线图，想问下前面的那个小峰有没有影响，结果可用吗？如果想去除小峰可以对条件做什么改变，条件是95度15s,55度20s,72度30s.
2.做出来的图看家基因的CT值在10左右，目的基因的CT值在22左右，结果可采用吗？如果想提高看家基因的CT值有什么办法？是减少加样量吗？

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作者: =菓子=    时间: 2011-10-15 13:00

下面是目的基因的熔解曲线，请指导，谢谢！

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作者: 少林弟子    时间: 2011-10-15 13:02

大家看一下我提的RNA和反转的cDNA怎么样？cDNA最亮的那条带是什么，为什么会出现？看不到5S条带。marker 用的是全式金的100bp ladder（5k,3k,2k,1.5k,1k,0.9k...0.1k）。
我提的RNA的A260在0.5-0.6间，算来RNA的浓度在1000-1500ug/ml。我在做反转和定量的时候分别取多少合适？
最后是一个技术性的问题。就是我近期常用到RNA和cDNA，将它们怎么保存呢？是将它们放在-20，但又担心反复冻融会降解。放在4度时间最长只能一周。该怎么处理呢？？
谢谢各位PCR高手指点交流。本人利用蚯蚓做环境毒理的。

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作者: 森林木    时间: 2011-10-15 13:03

今天提RNA的时候 一不小心脑袋坏掉了 有几管细胞用trizol裂的时候没用灭菌的EP管(注意哦,连菌都没灭..我真是傻掉了TOT)

现在我把它冻到-80度了.. 请问还有救么.TOT

我搜到有这么说的... 在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿

意思是说,其实在trizol裂解之后才要求用rnase free的器皿?

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用普通管子无所谓，再灭也灭不掉细胞里面的RNA酶，主要靠Trizol
冻在-80也许是错误，听人说过冷冻条件下Trizol中的酚不起作用

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作者: 森林木    时间: 2011-10-15 13:03

大家看一下我提的RNA和反转的cDNA怎么样？cDNA最亮的那条带是什么，为什么会出现？看不到5S条带。marker 用的是全式金的100bp ladder（5k,3k,2k,1.5k,1k,0.9k...0.1k）。
我提的RNA的A260在0.5-0.6间，算来RNA的浓度在1000-1500ug/ml。我在做反转和定量的时候分别取多少合适？
最后是一个技术性的问题。就是我近期常用到RNA和cDNA，将它们怎么保存呢？是将它们放在-20，但又担心反复冻融会降解。放在4度时间最长只能一周。该怎么处理呢？？
谢谢各位PCR高手指点交流。本人利用蚯蚓做环境毒理的。

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RNA-80，cDNA -20
不要放在那种有化霜功能的家用冰箱中
实在担心反复冻融，可以分装

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作者: 小困    时间: 2011-10-15 13:04

请问一下大家，4个重复，CT值差不多（0.5之内），效率却差的很大
是不是说明加样出了问题？大家加完样后会离心来spin down吗？如果用的话，一般什么速度，多久？

谢谢  

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作者: HP007    时间: 2011-10-15 13:04

关于TAKARA SYBR? Premix Ex Taq?做定量扩增效率

近日开始做扩增效率验证实验（引物以确定无二聚体），2.5ug RNA RT成 50ul cDNA，然后将模板稀释成10ng，1ng,100pg,10pg。20ul体系（pre-mix 10ul,rox 0.4ul,Rprimer+Fprimer 0.4+0.4,ddh2o 6.8ul,template 2ul(分别是100ng，10ng，1ng,100pg,10pg)），含ACTIN，共4个基因，每个模板浓度3个重复，ABI7300，程序按照TAKARA说明书是95 30s,95 5s,60 31s.以△CT值为Y轴、模板浓度的LOG值为X轴，发现所有斜率都不小于正负0.1，也就是不能用2-△△CT 法进行基因相对表达量的比较，仔细分析发现，如果只取1ng，100pg，10pg的△CT做图，斜率都小于正负0.1.其中一组△CT数据如下：100ng 3.405，10ng 5.398，1ng 6.006,100pg 6.186,10pg 6.178.

问题：出现这种情况的原因是什么？

是不是可以将模板稀释到1ng做后续定量试验？

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作者: 二丫头466    时间: 2011-10-15 13:06

您好，我想问下该怎么选取内参基因，怎么确定该培养条件不会对内参的表达产生影响。
是不是加入的总RNA量一致的情况下，内参基因的Ct也应该是趋于一致的呢？
谢谢，麻烦了啊

是的，加入的总RNA量一致的情况下，内参基因的Ct也应该是趋于一致的。

内参的选择，目前主要依靠外文文献，直接使用普遍被认可的housekeeping gene。

如果你研究的东西没有被报道过，一般会要求多个复合的管家基因结果。

与此同时也有这样的做法：利用绝对定量方法，上大量样本，最后计算P值是否有统计学意义，来说明所选管家基因的可靠性。但仅仅依靠定量结果作为依据，还是有点出力不讨好的意思。必须辅助以生理学上的理论来阐述你的管家基因是可靠的。

考虑到高质量编辑那关有多么难通过，以及时间和钱的问题，个人觉得还不如直接从生理学角度考虑，以及做复合的管家基因。

说实话，目前我还没使用过GAPDH和Actb以外的其他管家基因。

我个人不是生物学专业，理论上的知识还是比较欠缺的。贴出来的内容大多是前辈传授的经验和实际工作中的总结，因此可能有不够严谨的地方。要确切的答案还请大家google搜索。

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我是新手，最近因为要做real-time,所以看了一下书《Real-time PCR》，这上面对内参是这么说的，以前常用的是GADPH,beta-actin,18 S,但后来的研究显示前两个有假基因导致的变化，最后一个浓度太高，都不适合做内参。他说现在比较推荐的是ABL和GUS。
附原文：Whether absolute or relative quantitation is carried out, the choice of
control gene is very important. Older publications refer to sequences such
as β-actin, GAPDH or 18S ribosomal RNA for gene expression assays. The
first two have pseudogenes and inaccuracies may result from DNA contamination,
the latter is expressed at very high levels and is not a suitable
control for single copy genes without limiting primer concentrations. Both
test and control genes must amplify with the same efficiency for the ΔΔCt
method to be valid. Another important consideration is that the expression
of the control gene may be influenced by the treatment the patient is undergoing and should remain stable during the course of treatment. The
Europe Against Cancer (EAC) project addressed the choice of control genes
(Beillard et al., 2003); ABL, GUS, and B2M (β-2- microglobulin) emerged as
the most suitable. For genomic DNA targets recommended control genes
include B2M, ALB (albumin), and HBB (β-globin).

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作者: 二丫头466    时间: 2011-10-15 13:07

另外有个初级的问题请教一下yaoshan战友（哈哈，刚开始研究这个，问得太简单，见笑了）。
我想研究Gli1（一种转录因子）的mRNA的相对定量变化，查了文献有用SYBR的，也有用TaqMan探针的，用前者的声明了所用的引物，用后者的两篇文章都没有声明所用的引物，只是分别说了所用的探针，一个用的是Mm00494645-ml，一个用的是HS00171790-ml，都是applied biosystems的，我到该公司的网站找到了这两个探针，但没有查到整个探针的序列，所以想请教以下问题：
1 前面和后面的缩写Mm和Hs，ml分别代表什么，选择的时候有什么说道吗？
2 某种探针的序列在该公司的网站能查到吗，引物是有对应的还是需要自己选择，不是说探针序列最好和前或者后引物接近吗？
3 我看探针产品没标含量啊，请问这东西怎么稀释，一个探针能用多少次啊？
问题可能比较白痴，还望不鄙赐教，谢谢。

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作者: jude    时间: 2011-10-15 13:07

我想请问高手，我正在做Real-timePCR,用的是TAKARA的试剂盒做的，做了3次每次我的目的基因的溶解曲线都是两个峰，第一个峰在80度左右，而且峰较第二个高很整齐，而第二个峰在85度左右，峰低不齐，但是内参基因很好，我加的都是一样除了引物，而我这个引物是找国外在很高影响因子杂志上发表过的教授要的，不知道是怎么回事？难得我用的引物反复冻融变成这个样子？？不清楚，望能指教，谢谢。。  

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作者: 红豆冰    时间: 2011-10-15 13:08

你好，看了你发的贴子很有收获，谢谢你的辛勤劳动。
我现在有的问题是：1、为什么CT值到了25左右，再往下稀释标准品，就没有梯度了？ACTIN和我的目的片段都是如此。我的实验溶解曲线和扩增曲线都还可以。
做了很长时间了，不得解。请你帮帮我。谢谢。

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作者: WHO?    时间: 2011-10-15 13:12

好像大家问的多是实验过程的问题，其实感觉用qPCR进行试验，结果分析才是问题最多的地方，同一个CT值，用不同分析方法往往可以得出差异很大的结果，而结果分析方法又是决定实验步骤繁简的关键，如上面大家所提及的一样，这里问问结果分析的方法：

以2-△△CT方法进行相对定量分析，取多次CT的平均值进行2-△△CT计算，然后再以多次2-△△CT值进行统计学分析，这样一个样本的一个基因就起码要重复9个孔以上才能有可能进行分析。但是，作为ctrl的样本组没有办法得到2-△△CT值（都是1），这样ctrl组的P值如何计算？

谢谢！

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作者: WHO?    时间: 2011-10-15 13:12

好像大家问的多是实验过程的问题，其实感觉用qPCR进行试验，结果分析才是问题最多的地方，同一个CT值，用不同分析方法往往可以得出差异很大的结果，而结果分析方法又是决定实验步骤繁简的关键，如上面大家所提及的一样，这里问问结果分析的方法：

以2-△△CT方法进行相对定量分析，取多次CT的平均值进行2-△△CT计算，然后再以多次2-△△CT值进行统计学分析，这样一个样本的一个基因就起码要重复9个孔以上才能有可能进行分析。但是，作为ctrl的样本组没有办法得到2-△△CT值（都是1），这样ctrl组的P值如何计算？

谢谢！

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 13:24

看下引物的内含子情况。另外，真的就那么相信国外的文献么？国人当自强啊。=============================================================================================================

我想请问高手，我正在做Real-timePCR,用的是TAKARA的试剂盒做的，做了3次每次我的目的基因的溶解曲线都是两个峰，第一个峰在80度左右，而且峰较第二个高很整齐，而第二个峰在85度左右，峰低不齐，但是内参基因很好，我加的都是一样除了引物，而我这个引物是找国外在很高影响因子杂志上发表过的教授要的，不知道是怎么回事？难得我用的引物反复冻融变成这个样子？？不清楚，望能指教，谢谢。。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 13:24

这个问题我研究研究，稍后再回答。我们这边不怎么喜欢用2-△△CT法。===============================================================================================================

好像大家问的多是实验过程的问题，其实感觉用qPCR进行试验，结果分析才是问题最多的地方，同一个CT值，用不同分析方法往往可以得出差异很大的结果，而结果分析方法又是决定实验步骤繁简的关键，如上面大家所提及的一样，这里问问结果分析的方法：

以2-△△CT方法进行相对定量分析，取多次CT的平均值进行2-△△CT计算，然后再以多次2-△△CT值进行统计学分析，这样一个样本的一个基因就起码要重复9个孔以上才能有可能进行分析。但是，作为ctrl的样本组没有办法得到2-△△CT值（都是1），这样ctrl组的P值如何计算？

谢谢！

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 13:24

你模板浓度太高了，查了一下TAKARA试剂盒推荐的RNA浓度是500ng/ul,RT加入1ul。你模板浓度这么高对PCR反应的阻害物肯定是很多的。===============================================================================================================

关于TAKARA SYBR? Premix Ex Taq?做定量扩增效率

近日开始做扩增效率验证实验（引物以确定无二聚体），2.5ug RNA RT成 50ul cDNA，然后将模板稀释成10ng，1ng,100pg,10pg。20ul体系（pre-mix 10ul,rox 0.4ul,Rprimer+Fprimer 0.4+0.4,ddh2o 6.8ul,template 2ul(分别是100ng，10ng，1ng,100pg,10pg)），含ACTIN，共4个基因，每个模板浓度3个重复，ABI7300，程序按照TAKARA说明书是95 30s,95 5s,60 31s.以△CT值为Y轴、模板浓度的LOG值为X轴，发现所有斜率都不小于正负0.1，也就是不能用2-△△CT 法进行基因相对表达量的比较，仔细分析发现，如果只取1ng，100pg，10pg的△CT做图，斜率都小于正负0.1.其中一组△CT数据如下：100ng 3.405，10ng 5.398，1ng 6.006,100pg 6.186,10pg 6.178.

问题：出现这种情况的原因是什么？

是不是可以将模板稀释到1ng做后续定量试验？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 13:25

融解曲线主峰前面的小峰应该是引物二聚体，如果实验要求不严格的化可以用，不必做调整。若严格，把退火温度提高1度－2度试试。

模板加入量多少啊？管家基因ct10的话有点小，可以把模板浓度降10倍。但目的基因的模板量也要降低10倍。

管家基因和目的基因的Ct差异大完全没必要给调小。这只是说明你的目的基因表达量没有管家基因高而已。===============================================================================================================

您好,
1.下面是看家基因和目的基因的熔解曲线图，想问下前面的那个小峰有没有影响，结果可用吗？如果想去除小峰可以对条件做什么改变，条件是95度15s,55度20s,72度30s.
2.做出来的图看家基因的CT值在10左右，目的基因的CT值在22左右，结果可采用吗？如果想提高看家基因的CT值有什么办法？是减少加样量吗？

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作者: #甜#    时间: 2011-10-15 13:27

我估计那两个探针都是成品化的产品编号，可能没有什么特殊的意义。呵呵，ABI的引物探针没用过，贵。

如果真的是成品拿出来卖的话，肯定不会公布序列的。不然去哪里赚钱啊？

探针一般用TE稀释就可以了。一般合成都有一个OD数和碱基数，照着公式计算TE用量，稀释就可以了。注意下贮存浓度和工作浓度的区别。别一下子全稀释成工作浓度了，不好保存。量大的化分成小包装。

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谢谢 潇湘子，那个探针确实太贵了，现在考虑用SYBR GREEN做相对定量了，看了一些材料有点迷惑，再问个基本的问题。
请问做的时候待测基因和内参基因是在一个管中还说在两各管中，材料中说的似乎两个方法都行，哪个更准，有的说在一个管里更准，有的说两者差不多。
如果是在一个管做的话，单纯用SYBR GREEN能实现吗，是不是需要目的基因和内参基因选择不同的荧光，比如一个SYBR GREEN,一个用taqman，然后用多通道的机器测？
还说说用SYBR GREEN不做标准曲线，用-delta deltaC 法的话，只能将两个基因在不同的管中做？

两种做法在最后计算的时候是不是有什么不同？

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作者: 大虾米    时间: 2011-10-15 13:28

这个问题我研究研究，稍后再回答。我们这边不怎么喜欢用2-△△CT法。

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谢谢，回复这个贴不是一般的坚强了，

因为要做的基因有20多个，就该去做microarray的了，所以如果用标曲法实在耗费多，2-△△CT也有它的好处，realtime pcr的结果重要的是看分析，严谨些就可信些！

等候lz的指点！！！

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作者: #甜#    时间: 2011-10-15 13:29

验证看家基因是否属于最优化的内参基因，最好的方法就是在你研究的所有样品里面做绝对定量，看看P值是否小于0.05，否则别无它法。但是绝对定量只能验证该基因是否合适，一旦不行，还要另外寻找别的来做绝对定量。到目前为止，已经找到几百条看家基因，可惜遗憾的是，还没有哪一条看家基因，属于我刚才说的绝对意义上的内参基因——表达无论任何时候、任何处理下永远不变。就这个层面上而言，说得绝对点，使用单个看家基因得到的结果其实完全都是***，可惜目前大家公认就是这样罢了，谈到看家基因一窝蜂的用actin、gapdh等等，得到的结果就那样罢了，很多审稿人也不懂这个，一窝蜂就一窝蜂呗，反正大家默认这个成立了，可惜的是，默认的这个前提就错了。至于你认为我说的看家基因和研究基因可以不同批跑这个观点不对，进而认为我是想了当然，过于严重了点吧，呵呵！我说的那个是事实，如果非要同批跑，只能是过犹不及，和是不是很严谨，完全是两码事。

顺便提下，我做qPCR现在都不玩单看家基因，真正严谨的应该是从多个看家基因里面选择最稳定的3-5个看家基因的组合，然后以此为基础计算出一个标准化系数，在这个基础上再进行相对定量的计算，这个老外已经玩的很娴熟了——GeNorm算法+qbase软件，这个算法应该是目前做相对定量最权威的算法，可以参考今年plant cell8月份的一篇letter。如果等你回头做完了多参照基因得到的表达结果，再回过头来看单参照基因，你就会明白什么叫垃圾结果？你也就会明白为什么我说同不同批跑其实影响不大？

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我觉得一个看家也不一定不行，前提是这个基因是应该经过对比验证的，不过选择这个基因的时候还说建议多看点文献，有些人可能看的是胰腺癌的研究文献，现在要研究肺癌，随便就用了胰腺癌选的看家基因，千万别做的最后才发现选错了。

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作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-10-15 13:29

您好！
我第一次做定量PCR，周围没人做过。遇到一些问题特来请教：
基本情况：我用的机器是罗氏1.5的，SYBR GREEN I 用的是宝生物的，做鸭乙型肝炎病毒。目的片段155BP。
遇到问题：1、扩增曲线没有梯度，（我从10的8次方到4次方，OD值测过） 基本和阴性一 样起跳？？？
2、阴性对照和阳性一样高，扩增曲线基本相同，我怀疑是污染，采取了以下措施：（用ddH2o在生物安全柜中重新配置引物，在生物安全柜中配置体系和阴性对照，在另外一间屋加模板）连续做了好几次，每次阴性基本都和阳性一样，没有区别，是什么原因呢？？？中间换了个公司的SYBR还是一样。
3、我做的溶解曲线只有一个峰，电泳片段不明显。
请求支招，谢谢！
还有，你帖子上的page1到page10是怎么看的呢？我怎么看不到？？


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作者: #甜#    时间: 2011-10-15 13:30

楼上的，怀疑是污染把无模板组的PCR产物跑一下不就知道了吗？

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作者: 荷塘青蛙！    时间: 2011-10-15 13:32

谢谢楼上的， 无模板跑过电泳，应该没有条带。就算是污染的话也不会污染浓度这么大，和阳性的一样大了？？？？？

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作者: 爬呀爬    时间: 2011-10-15 13:36

请教各位定量达人：
问题一：请教real-time PCR时阴性在23个循环时开始起跳，不知行不？一般在多少起跳比较好？
问题二：我的扩增效率出现200%多，是标准品稀释的问题还是体系里有阻碍反应的物资，应该怎么验证？？？请教各位大虾！！！谢谢！！！
问题三：有时我做标准品的几个梯度出现扩增曲线时基本在一块，分不开，没有梯度可言，是怎么回事？？？
问题四：阴性对照出的和阳性的一样高，阳性10的7次方拷贝数，要是污染的话会有这么高吗？还是其他的一些原因？？？

万分感谢，不胜感激！！！

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作者: fangxiang    时间: 2011-10-15 13:36

qPCR一般跑多少个循环比较合适啊？我的有时候跑到35个循环时水里面都能跑出来，为什么啊？

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作者: #甜#    时间: 2011-10-15 13:37

在问个比较弱的问题，怎么确定内参基因在处理前和处理后量没有变化啊？

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 13:38

那个探针确实太贵了，现在考虑用SYBR GREEN做相对定量了，看了一些材料有点迷惑，再问个基本的问题。
请问做的时候待测基因和内参基因是在一个管中还说在两各管中，材料中说的似乎两个方法都行，哪个更准，有的说在一个管里更准，有的说两者差不多。
如果是在一个管做的话，单纯用SYBR GREEN能实现吗，是不是需要目的基因和内参基因选择不同的荧光，比如一个SYBR GREEN,一个用taqman，然后用多通道的机器测？
还说说用SYBR GREEN不做标准曲线，用-delta deltaC 法的话，只能将两个基因在不同的管中做？

两种做法在最后计算的时候是不是有什么不同？

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如果用SYBR的话，不能同管检出两个基因，呵呵，都是在FAM通道收集荧光信号值，到时候怎么区分产物呢？

探针法可以做双重，只要引物探针设计上下功夫没什么问题。标记不同的发光集团。

染料法和探针法不能放在一个管子里做哈。

目前管家基因的确定主要依赖文献，依照国外高质量文章选择的管家基因来确定。

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作者: #甜#    时间: 2011-10-15 13:38

如果用SYBR的话，不能同管检出两个基因，呵呵，都是在FAM通道收集荧光信号值，到时候怎么区分产物呢？

探针法可以做双重，只要引物探针设计上下功夫没什么问题。标记不同的发光集团。

染料法和探针法不能放在一个管子里做哈。

目前管家基因的确定主要依赖文献，依照国外高质量文章选择的管家基因来确定。

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谢谢 潇湘子，总算基本把这个东东弄明白了，过一周开做了，到时有结果了再请教。

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作者: qiangren789    时间: 2011-10-15 13:39

实时定量PCR时用超纯水作NTC，对结果影响大吗？请各位大侠解答，谢了。  

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作者: 金手指    时间: 2011-10-15 13:40

我现在做的是双标准曲线法相对定量比较一种基因的MRNA在两种昆虫中的表达差异，但是遇到了特别奇怪的问题，目的基因的标准品的峰起不来，log曲线也还可以,其它也都很正常，开始以为是无荧光信号，没有扩增.但是荧光pcr后跑电泳有带，并且很亮。测序为目的条带。请各位指教！

图片附件: 71215233.jpg (2011-10-15 13:40, 38.11 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8742

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作者: 金手指    时间: 2011-10-15 13:41

这是一个孔的log曲线,ct值对应18.64989,对应上面那附图

图片附件: 30204149.jpg (2011-10-15 13:41, 34.19 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8743

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作者: 金手指    时间: 2011-10-15 13:41

1:5梯度六个孔的图

图片附件: 62814644.jpg (2011-10-15 13:42, 39.72 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8744

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作者: 金手指    时间: 2011-10-15 13:43

仪器是abi7500fast


图片附件: 62814644.jpg (2011-10-15 13:44, 39.72 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8745

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作者: 金手指    时间: 2011-10-15 13:45

sample的正常图


图片附件: 49715126.jpg (2011-10-15 13:45, 34.16 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8746

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作者: 金手指    时间: 2011-10-15 13:46

这张跟上一张对应.条件除了模板不一样外都是一致的,但是曲线的差别很大.到底是什么地方出问题了?
做了多次重复,但结果都是这样,标准品为质粒,质粒我也处理多次.谢谢版主

图片附件: 95440055.jpg (2011-10-15 13:46, 38.67 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8747

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作者: 蛐蛐儿    时间: 2011-10-15 13:47

你好，最近需要做荧光定量PCR，测定mRNA，但是设备是国产达安公司的DA7600，不知道投国外SCI杂志，行不行？请赐教！

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作者: TAT    时间: 2011-10-15 13:57

我想请问一下，我做的是绝对定量，用的是Taqman探针来建立标准曲线，但是结果很不理想。用的是质粒标准品，按10倍倍比稀释。

（1）荧光量很小，都是在200一下
（2）做出来的Ct值一团糟，阴性对照也有Ct值，Ct=32.54
（3）把PCR产物电泳，条带亮度却是按照一个稀释的浓度逐渐递减，并且阴性对照没有出现条带，所扩出来的条带是目的条带，没有污染
（4）溶解曲线为什么又是直线？

太矛盾了，百思不得其解。
注：仪器已经有将近10年了。不知道是否是它的原因，只是别的同学也做过，并没有出现我的这种现象。

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作者: 莲花白    时间: 2011-10-15 14:01

你好，我现在刚刚开始做RT-PCR，正在准备东西，我想问一下那个内参是怎么选择，是不是内参的引物我也要从新设计啊。

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作者: 胖小妮子    时间: 2011-10-15 14:02

我们最近做的病毒RNA RT－PCR扩增的曲线非常的奇怪，阴性对照都会爬起来，样品的曲线好多好像都是从一个基点开始往上爬，我们怀疑是环境污染，把各个房间都消毒开开通风，但是效果也不明显，我们还换个环境配试剂加样，但结果还是差不多，然后我们更换试剂，刚更换试剂会有点改善，但是没多久又出现原来的情况，不知道什么原因，有哪位高手知道原因的请指教。在此先谢谢了。

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作者: 荒漠孤驴    时间: 2011-10-15 14:02

你好。刚开始做SYBR real time。准备做扩增效率比较。 （逆转录和PCR都是用的TOYOBO的试剂盒）。有几个问题不是很明白，望指教。

1.提取总RNA后测浓度，1ug RNA RT成 20ul cDNA.然后是将cDNA直接倍比稀释后看扩增效率，还是需要把cDNA稀释后（如稀释100倍）再做倍比稀释看扩增效率。
2.20ul体系，cDNA小于反应体系的10%（2ul），我看之前的讨论说要加3ul可使误差小些，那我该怎么处理呢？能直接加1ul或2ul吗？

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作者: tears    时间: 2011-10-15 14:03

要怎么设计所需的引物啊

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作者: zzzz    时间: 2011-10-15 14:04

仪器是abi7500fast

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你可以用鼠标双击横坐标，把那个最大最小值修改一下，最小改为0.01，最大改为1，另外手动设定阈值看你图，设为0.4看看

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作者: 还是孩子    时间: 2011-10-15 14:08

我们最近做的病毒RNA RT－PCR扩增的曲线非常的奇怪，阴性对照都会爬起来，样品的曲线好多好像都是从一个基点开始往上爬，我们怀疑是环境污染，把各个房间都消毒开开通风，但是效果也不明显，我们还换个环境配试剂加样，但结果还是差不多，然后我们更换试剂，刚更换试剂会有点改善，但是没多久又出现原来的情况，不知道什么原因，有哪位高手知道原因的请指教。在此先谢谢了。

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你是不是用的Tiangen 的Master Mix， 如果是的话 ，那就是试剂的问题了， 他们公司的试剂研发部做的图片也是NTC有扩增曲线 ，他们解释说 试剂太敏感， NTC出现这种情况无法避免。哈哈， 你要注意两个问题， 一个是操作手法，养成分装的习惯，每次做实验先配Mix，然后 把你的试剂放回去以后， 再把模板拿出来， 二是不要选择国产Mix， 要么花钱买进口的，要么买酶和SYBR green 染料自己配

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 14:10

我想请问一下，我做的是绝对定量，用的是Taqman探针来建立标准曲线，但是结果很不理想。用的是质粒标准品，按10倍倍比稀释。

（1）荧光量很小，都是在200一下
（2）做出来的Ct值一团糟，阴性对照也有Ct值，Ct=32.54
（3）把PCR产物电泳，条带亮度却是按照一个稀释的浓度逐渐递减，并且阴性对照没有出现条带，所扩出来的条带是目的条带，没有污染
（4）溶解曲线为什么又是直线？

太矛盾了，百思不得其解。
注：仪器已经有将近10年了。不知道是否是它的原因，只是别的同学也做过，并没有出现我的这种现象。

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探针法不用做溶解温度曲线.
10倍稀释,每个梯度Ct相差3.5圈.
目前来看,各个仪器荧光信号值的高低是不同的,有的不到1,有的好几千,我觉得不用太在意.没什么横向比较的价值,只要扩增曲线的信号值正常就可以.
正常来说,Ct32,电泳是能够看见带的.

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-15 14:10

我们最近做的病毒RNA RT－PCR扩增的曲线非常的奇怪，阴性对照都会爬起来，样品的曲线好多好像都是从一个基点开始往上爬，我们怀疑是环境污染，把各个房间都消毒开开通风，但是效果也不明显，我们还换个环境配试剂加样，但结果还是差不多，然后我们更换试剂，刚更换试剂会有点改善，但是没多久又出现原来的情况，不知道什么原因，有哪位高手知道原因的请指教。在此先谢谢了。

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什么病毒?引物特异么?
好像在本帖的前几页说个一个类似的问题.举个例子,环境中有很多菌群,甚至有许多都是试剂本身就带有的,例如大肠杆菌,如果引物不够特异的话...后果就是,根本没有阴性对照可言.
当然,我说的这种情况很特殊,也比较少见.
基础的,还是从外在着手解决一下吧.引物/探针/试剂/水,是否有污染.  

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作者: 蓝蜗牛    时间: 2011-10-15 14:11

thanks!我还想问下咯，为什么我做的标准质粒，其109/uL浓度的Ct值一般是16左右；而看的文献他们的109/mL浓度（相当于我的106/uL了）的Ct值一般是9左右？十分感谢！在质粒的浓度的copy数我是很认真计算过了的，是不是质粒浓度不纯？或者需要用荧光定量试剂盒给质粒定一个量？多谢咯！

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作者: 蓝蜗牛    时间: 2011-10-15 14:11

再次请教下咯，我做的定量PCR，扩增片段是367bp,引物Tm59，设的反应条件是95℃，10min;95℃，30sec, 55℃，30sec,72℃,30sec;45cyclers，
（1）请问我的这个条件怎么样？不知道我所做的Ct值滞后是否与这个有关?
(2) 还是我的荧光探针功能不好？因为我的引物和探针都已经先合成了两个月了。现在才开始 做，不知道是不是这个原因。
(3)并且还想问下，那个荧光探针的功能如何检测？
现在一直没有进展，一筹莫展，很是着急，谢谢了！

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-15 14:12

荧光值的大小，选用的算法不同，在同一台机器上同一个实验结果，会显示1左右或者几千上万，这个没有太大关系的，只要你的扩增曲线图形正常，起点点在正常范围内皆可。

根据你2、3的描述应该是有正常的扩增产物但是机器没有很好的检测到信号，或者是探针有问题。我曾遇到过比较老的机器有的孔极不稳定。

探针中只有分子杂交探针可以做熔解曲线，taqman探针是不可逆的降解，是不能做熔解曲线的，所以是直线，很正常。
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我想请问一下，我做的是绝对定量，用的是Taqman探针来建立标准曲线，但是结果很不理想。用的是质粒标准品，按10倍倍比稀释。

（1）荧光量很小，都是在200一下
（2）做出来的Ct值一团糟，阴性对照也有Ct值，Ct=32.54
（3）把PCR产物电泳，条带亮度却是按照一个稀释的浓度逐渐递减，并且阴性对照没有出现条带，所扩出来的条带是目的条带，没有污染
（4）溶解曲线为什么又是直线？

太矛盾了，百思不得其解。
注：仪器已经有将近10年了。不知道是否是它的原因，只是别的同学也做过，并没有出现我的这种现象。

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-15 14:12

thanks!我还想问下咯，为什么我做的标准质粒，其109/uL浓度的Ct值一般是16左右；而看的文献他们的109/mL浓度（相当于我的106/uL了）的Ct值一般是9左右？十分感谢！在质粒的浓度的copy数我是很认真计算过了的，是不是质粒浓度不纯？或者需要用荧光定量试剂盒给质粒定一个量？多谢咯！

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不知你检测的基因和文献中的基因是否相同 ，如果不同，相同质粒浓度下，Ct值不同也是正常的。而且，定量实验中，一般认为最好的Ct值范围在15-30之间，30<Ct值<15一般认为可信度下降（当然，特殊情况另当别论）

质粒浓度的纯度可以通过电泳、260/280扫描等方法来大致的判断

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-15 14:13

再次请教下咯，我做的定量PCR，扩增片段是367bp,引物Tm59，设的反应条件是95℃，10min;95℃，30sec, 55℃，30sec,72℃,30sec;45cyclers，
（1）请问我的这个条件怎么样？不知道我所做的Ct值滞后是否与这个有关?
(2) 还是我的荧光探针功能不好？因为我的引物和探针都已经先合成了两个月了。现在才开始 做，不知道是不是这个原因。
(3)并且还想问下，那个荧光探针的功能如何检测？
现在一直没有进展，一筹莫展，很是着急，谢谢了！

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如果是用taqman探针做，一般扩增片段长度都在100一下，不知你的为何会设计这么长？
反应条件中，退火和延伸可合为一步，不知你的PCR仪的检测模式是什么

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作者: 神经侠    时间: 2011-10-15 14:13

想请教一下：我用SYBR Green 方法来做Real-timePCR,结果跑出来内参CT值24左右，目的基因的CT值是30以上。引物二聚体太多，不知道怎么解决。用同样的引物跑普通PCR，结果却不见目的条带，是什么原因呢？
Detector  Task  Ct  Ct Std Err
      
Beta-actin_SYBR  ENDO  25.001  0.327
Beta-actin_SYBR  ENDO  24.002  0.327
Beta-actin_SYBR  ENDO  24.807  0.327
Beta-actin_SYBR  ENDO  26.727  0.327
Beta-actin_SYBR  ENDO  22.057  0.327
Beta-actin_SYBR  ENDO  24.511  0.327
Beta-actin_SYBR  ENDO  24.816  0.327
Beta-actin_SYBR  ENDO  22.528  0.327
Beta-actin_SYBR  ENDO  25.332  0.327
Beta-actin_SYBR  ENDO  25.039  0.327
Beta-actin_SYBR  ENDO  24.503  0.327
Beta-actin_SYBR  ENDO  25.048  0.327
目的基因A  Target  35.888  0.378
目的基因A  Target  Undet.  
目的基因A    Target  36.056  0.378
目的基因A    Target  35.261  0.378
目的基因A    Target  37.882  0.378
目的基因A    Target  37.679  0.378
目的基因A    Target  Undet.  
目的基因A    Target  35.286  0.378
目的基因A    Target  Undet.  
目的基因A    Target  39.064  0.378
目的基因A    Target  Undet.  
目的基因A    Target  Undet.

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作者: 神经侠    时间: 2011-10-15 14:14

还有一张图：

图片附件: 84163458_snap.jpg (2011-10-15 14:14, 60.74 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8748

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作者: 回眸    时间: 2011-10-15 14:17

我的那个扩增条带300多的碱基主要是我们的目的DNA的特殊性有关的，一般都是扩这么多个片段。
再请教下咯，不知道为什么我做的实验结果不太稳定？理论上10倍稀释的话，相邻浓度的Ct值应该是只相差3.32，但是我的却不是这样，有些结果还行。然后我想可能是条件或者反应体系还是没有优化好，但是我只要一稍微改一些条件，结果就更是乱七八糟的。真是糟糕，都不知道怎么着手了，急！

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作者: DDD    时间: 2011-10-15 14:17

请问做相对定量的标准曲线，我稀释的是10倍梯度，为什么跑出来后会是10000的梯度啊？

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作者: 韩梅梅    时间: 2011-10-15 14:24

看一下起始RNA量浓度是多大，可以尝试增加一下Total RNA加入量。起始量主要参考使用的反转录试剂的说明书要求做，调整到最大。

另外，你做什么物种的什么管家基因？

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作者: 饭团团    时间: 2011-10-15 14:24

我曾经提取人外周血白细胞的RNA进行荧光定量PCR（SYBR Green法），内参选择的是GAPDH，扩增曲线和融解曲线一直都很好，Ct值一般在十几个循环。后将该内参引物用于另一模板，培养的SHSY5Y细胞（人源)所提的RNA，融解曲线没问题，但Ct值却到了30多个循环，提取RNA、逆转录、以及PCR的步骤和试剂都没有变过。提取的RNA 我也跑过电泳验证其完整性，很清晰地两条带。我换用了另一位同学的内参（actin），Ct值也是30多，而将自己的GAPDH内参用于Hela细胞提取的模板就没问题。这到底是怎么回事呢？百思不得其解，急盼赐教！

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作者: 乌贼老弟    时间: 2011-10-15 14:25

我也是刚开始接触real time ,目的是agrin基因在人的神经肿瘤中的表达高于正常神经组织。
我想问问①标准品和内参是必须同时具备么？是不是这样才能更精确更有说服力呢？我是打算用将肿瘤中的表达量与正常的做对比来验证，这样行么？②我自己设计的引物，电子PCR扩增产物长度为95bp，这个长度可以么？感觉有很多疑问，请问我可以看些什么相关的知识来作为基础的呢？不胜感激

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作者: 雪原    时间: 2011-10-15 14:26

【请教】我想做转基因小鼠的基因纯合和杂合的检测，用realtime pcr测出原始基因拷贝数，比较纯合和杂合的拷贝数，是否就可以了呢？还有taqman探针的设计方法有谁会，可以帮我一下吗？我刚刚确定课题，想请教一下

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作者: 昙花花花    时间: 2011-10-15 14:27

求助 我要用SYBR Green法检测SD大鼠PDGF-D,请问引物要怎么设计比较好？可以提供一下吗？谢谢  

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作者: 橘子水儿    时间: 2011-10-15 14:27

楼主，您好。
我是用SYBR Green定量的试剂摸索条件，操作是在普通PCR仪上，但是P出来后电泳时出现很多非特异条带，而特异性的产物很少。我的引物、条件都是按试剂说明或文献上做的。
我的同学，他和我做的不是同一序列，他提取的RNA几乎看不到条带，但反转录以后P出来的电泳反而非常好。
纠结，望楼主解答，谢谢！
-------编修一下，今天都P出来了，条带很清晰，但是目的基因出来的产物大小与文献报道的不同，内参与文献报道的相同，这是什么原因呢？

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作者: 缘yuan    时间: 2011-10-15 14:29

我做绝对定量RT-PCR，在制作标准曲线的时候遇到了以下的困惑，求助高人。
1.我有一百多个标本，用96孔板每次只能跑87个标本，所以要分2批做完。2批数据在分析的时候发现标准品的扩增效率不完全一样，请问怎么减少两版间的误差？
2.在1e3这个浓度的时候已经出现很高荧光信号的引物二聚体峰，虽然已用4步法去除引物二聚体的荧光信号，但对CT值还是有影响，可见1e4和1e3两个浓度的标准品CT值只差1.5。
如果只用1e6、1e5、1e4三点做标准曲线的线性关系和扩增效率都很令人满意，但我的标本有一部分却不包含在这个浓度范围内，按理论不能推测其模板量。所以要加上1e3这个浓度制作标准曲线，但是线性关系和扩增效率就不那么满意了。
我的疑问是：能不能做两次标准曲线，对于浓度在1e6至1e4范围内的标本用1e6、1e5、1e4三点做标准曲线；对浓度小于1e4的标本用1e6、1e5、1e4、1e3四点做标准曲线？

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作者: 大仙    时间: 2011-10-15 14:51

请教一个问题，我做的是两样品的比较（高表达和低表达），相对定量，SYBR的染料，第一次的结果很好，而之后再做时，低表达样品的目的基因熔解曲线出现了双峰，而内参无任何问题，重做亦然。我开始怀疑是样品问题，但是我再拿第一次real time 样品（未出现问题）重做时，居然也出现了相同的问题，低表达样品熔解曲线出现双峰。跑胶未出现非特异条带，但有引物二聚体。现在与同学讨论后，认为是引物二聚体造成的，决定重新设计引物。
想听一下yaoshan战友的意见。

引物是我们实验室一直使用的，二聚体不是很多，所以直接用了，现在看来太不谨慎了。

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作者: 飞天小鹿    时间: 2011-10-15 14:52

你好，最近想做Realtime-RT-PCR检测一种RNA病毒，初步设想做绝对定量，但是在究竟用一步法还是两步法上左右徘徊，一步法有点自不必说，但是因为是RNA病毒的绝对定量，必然会使用体外转录的方法，也就是用cDNA保存模板，现用现转。于是我想既然这样的话那么两步法是不是更理顺，反正都得费一回事儿，直接反转录在PCR差别是不是就在于一还是二，因为体外转录的话也同样有污染的可能，所以我觉得一步还是两步应该是一样的吧？究竟对文章的质量有多大的影响，另外现有的机器可选的ABI5700和GENE3000，我想做Tagman加内部参照，不是内参，选用TAKARA的盒子可不可以？为什么TAKARA建议我选用两步的盒子呢？
问得很多，真的很急，谢谢！

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作者: 喵咪    时间: 2011-10-15 14:52

请教一个问题，我做的是两样品的比较（高表达和低表达），相对定量，SYBR的染料，第一次的结果很好，而之后再做时，低表达样品的目的基因熔解曲线出现了双峰，而内参无任何问题，重做亦然。我开始怀疑是样品问题，但是我再拿第一次real time 样品（未出现问题）重做时，居然也出现了相同的问题，低表达样品熔解曲线出现双峰。跑胶未出现非特异条带，但有引物二聚体。现在与同学讨论后，认为是引物二聚体造成的，决定重新设计引物。
想听一下yaoshan战友的意见。

引物是我们实验室一直使用的，二聚体不是很多，所以直接用了，现在看来太不谨慎了。

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1，熔解曲线的“双峰”，这个表述本来就不清晰。你是指两个产物峰，还是一个产物峰加一个引物峰？我猜想可能是后者。
2，PCR反应也是一个竞争抑制的过程，样品模板丰度低，引物二聚体就猖狂。
3，重新设计引物是个明智的决定，毕竟又快又便宜。不过，稍微减少一点引物的浓度，提高退火温度，降低一点镁离子浓度，都能一定程度减少dimer的产生，不过有点费事费时。

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作者: 喵咪    时间: 2011-10-15 14:53

你好，最近想做Realtime-RT-PCR检测一种RNA病毒，初步设想做绝对定量，但是在究竟用一步法还是两步法上左右徘徊，一步法有点自不必说，但是因为是RNA病毒的绝对定量，必然会使用体外转录的方法，也就是用cDNA保存模板，现用现转。于是我想既然这样的话那么两步法是不是更理顺，反正都得费一回事儿，直接反转录在PCR差别是不是就在于一还是二，因为体外转录的话也同样有污染的可能，所以我觉得一步还是两步应该是一样的吧？究竟对文章的质量有多大的影响，另外现有的机器可选的ABI5700和GENE3000，我想做Tagman加内部参照，不是内参，选用TAKARA的盒子可不可以？为什么TAKARA建议我选用两步的盒子呢？
问得很多，真的很急，谢谢！
===============================================================================================================1，一步法，不二选择
2，ABI5700？非常非常老的一款机器，你确定没有看错型号？是7500吧？
Gene3000？是Rotor-Gene 3000吧？如果是7500，最好还是用7500吧，ABI在PCR方面的优势还是很大的。
3，内部参照？你说的是ROX？你可以打电话问问takara的技术支持。看看master mix中有没有加ROX。

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作者: 邀月    时间: 2011-10-15 14:55

刚刚接触定量，现在自己用软件设计了一对引物，发夹和自身引物二聚体都没有，引物间存在二聚体。实在是找不到合适的引物了。不知道在做的时候如何尽量降低二聚体的形成？？  

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作者: 不懂    时间: 2011-10-15 14:55

请教什么是In-house PCR? 以及病毒拷贝数如何定量，尤其是没有标准品的时候？

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作者: 胖小妮子    时间: 2011-10-15 14:56

最近在做荧光定量PCR实验，目的基因是从血液中提取出来的，实验结果是目的基因有明显的S型曲线表达，但是内参B－actin是条直线，引物和探针均从公司合成，后来又换了内参GAPDH还是直线，百思不得其解，请高人分析下原因！另做目的基因阴性对照，模板加的是水，居然也有明显的S型曲线，请问是污染么？由于Taqman探针特异性，应该不会是引物2聚体吧？谢谢指教！

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作者: 阿凡提    时间: 2011-10-15 14:57

1，一步法，不二选择
同意moontone的，用2步法等着被argue吧
2，有的机器可选的ABI5700和GENE3000
ABI5700？非常非常老的一款机器，你确定没有看错型号？是7500吧？
5700某些地方还在用的，一般里面很多东东都被换过了。gene3000貌似国产货，所以建议5700，如果有其他新的定量赶紧换
3，内部参照？
内部参照是用于监控PCR反应体系是否work的，必须是探针法，比如fam检测靶基因，joe检测内部参照，内部参照一般在配混合母液时加（引物及对应的joe探针、阳性模板），等于避免出现假阴性。
不建议用内部参照，那是商品化试剂盒做的，科研不必要了，成本贵而且会影响检测性能的
takara不推荐那就不理takara，记得有人给我提过takara的一步法rtpcr不灵的。

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作者: free    时间: 2011-10-15 14:57

最近在做荧光定量PCR实验，目的基因是从血液中提取出来的，实验结果是目的基因有明显的S型曲线表达，但是内参B－actin是条直线，引物和探针均从公司合成，后来又换了内参GAPDH还是直线，百思不得其解，请高人分析下原因！另做目的基因阴性对照，模板加的是水，居然也有明显的S型曲线，请问是污染么？由于Taqman探针特异性，应该不会是引物2聚体吧？谢谢指教！

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信息太少。扩增曲线看看（目的基因和内参都要），探针？做双重荧光么？PCR循环参数？
污染了，通风换试剂吧；用探针那就和二聚体无关。

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作者: 知了知了    时间: 2011-10-15 14:58

我曾经提取人外周血白细胞的RNA进行荧光定量PCR（SYBR Green法），内参选择的是GAPDH，扩增曲线和融解曲线一直都很好，Ct值一般在十几个循环。后将该内参引物用于另一模板，培养的SHSY5Y细胞（人源)所提的RNA，融解曲线没问题，但Ct值却到了30多个循环，提取RNA、逆转录、以及PCR的步骤和试剂都没有变过。提取的RNA 我也跑过电泳验证其完整性，很清晰地两条带。我换用了另一位同学的内参（actin），Ct值也是30多，而将自己的GAPDH内参用于Hela细胞提取的模板就没问题。这到底是怎么回事呢？百思不得其解，急盼赐教！

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SHSY5Y细胞是神经细胞来源的，和外周血白细胞属于不同组织，那么可能是不同组织表达不同
的基因。
这种事actin遇到的可能性比较大，因为actin家族成员很多，gapdh倒是第一次听说。
sybr green法30多可以看作没表达或者表达很弱了。

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作者: 豆荚    时间: 2011-10-15 14:59

最近碰到特奇怪的问题

将目的样本跑普通PCR的时候有条带，上real-time倒是什么都不出来。怀疑探针（新的）不行了，但是标准品倒是出来了，百思不得其解。。。

普通PCR和荧光PCR对Mg离子的要求是不同的，如果你单纯的按照普通PCR的反应液搬到荧光PCR上来做，扩增效率是很低的，甚至扩不出，一般的情况下做荧光PCR要提高Mg离子的浓度3倍才合适。

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作者: duoduo    时间: 2011-10-15 15:01

请问 目的基因和参照基因的退火温度必须一样吗？有的是目的和内参2个温度分别扩增的，请问这样科学吗？谢谢！  

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作者: duoduo    时间: 2011-10-15 15:01

请问 目的基因和参照基因的退火温度必须一样吗？有的是目的和内参2个温度分别扩增的，请问这样科学吗？谢谢！  

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作者: 蝴蝶结子    时间: 2011-10-15 15:01

我遇到一个问题，我做SYBR green的qPCR时候，每个管（相同模版cDNA，不同的引物，浓度一致）的起始荧光强度不一致，大致相差100-200左右。但是每条扩增曲线可以说是平行的。只要消减掉起始值的差异，Ct值就差不多。这可能有集中情况。我用的takara的试剂盒。谢谢

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作者: DONT    时间: 2011-10-15 15:01

我打算做相对定量，做标准曲线时我是直接把rna反转录的CDNA倍比稀释还是要先把CDNA 普通pcr以后把目的片段割胶回收以后再倍比稀释。谢谢  

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作者: 锤子    时间: 2011-10-15 15:02

一般是把PCR后的目的片段构建质粒 再做标准曲线的

不过也可以拿pcr产物来做标准曲线

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作者: wiwi    时间: 2011-10-15 15:02

看了很多，先谢谢大家了
请教：1.我用双标准曲线法，由于我的目的基因丰度很低，我做了克隆，构建了质粒，但是我的内参需要做克隆吗？用cDNA时内参是合适的。就是有没有必要使两者的来源一样，来构建标准品？
2.我的标准曲线是通过构建标准品得来的，而我的待测样是反转录的cDNA，这样两者的来源不一样，会不会给定量带来一定的误差？这样做合适吗？
3.标准曲线制作可以和我的待测样是一起做呢？还是分开做，先做好标准曲线，在测样品？怎样做比较好？
先谢谢了。

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作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-10-15 15:03

看了这么多，学到了不少东西，但还是忍不住想打扰下各位高手。
我现在在做水蚤的毒理学实验。看被暴露在有毒物质里面的水蚤各个基因表达的变化。用Sybrgreen做real time.
最近新设计了几个引物，都是按照网上那些规定找的，没有二聚体结构，两条链温度相差2度之内，特异性也可以。
但我现在开始按5倍稀释做premer test的时候扩增效率一直在70%-80%。可是Ct值是可以的，而且每个样品单独的效率也都是可以的，我实在想不通是为什么。
模板的cDNA是我一直用的，而且之前也出来过不少好的结果，所以我认为模板质量的问题可以排除。两条链的Tm值分别是62.7和63.1度，我的退火温度从62度一直降到55度，结果还是不行。换了模板的浓度，效果也不好。现在因为这个事情我都快吃不下睡不着了。
还想弱弱的问下，看一个引物是不是好，除了看上面我说到的那些指标外还要看什么呀？因为现在除了引物的因素没有排除，其它的都排除了，实在不行可以就得重新设计引物了。
小女子感激不尽~

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作者: dotaaa    时间: 2011-10-15 15:04

请教：1.我用双标准曲线法，由于我的目的基因丰度很低，我做了克隆，构建了质粒，但是我的内参需要做克隆吗？用cDNA时内参是合适的。就是有没有必要使两者的来源一样，来构建标准品？
2.我的标准曲线是通过构建标准品得来的，而我的待测样是反转录的cDNA，这样两者的来源不一样，会不会给定量带来一定的误差？这样做合适吗？
3.标准曲线制作可以和我的待测样是一起做呢？还是分开做，先做好标准曲线，在测样品？怎样做比较好？
先谢谢了。


1/2.标准品来源并不严格要求的，各有优缺点：cDNA的浓度范围往往不足以覆盖所有样品的浓度（一般标准曲线得覆盖所有样品的可能浓度，所以样品的浓度要求在最高和最低浓度标准品之间，cDNA经常无法满足）;质粒或PCR一个容易产生气溶胶污染实验室，另外一个他们和实际cDNA样品扩增效率应该有区别（cDNA中的RT组分对PCR还是有影响的，有次做熔解曲线分析可以看出标准品和cDNA样品的Tm还是有些小差别的），所以没有十全十美的，只要不显著干扰实验结果就可以接受了
3.最好一起做，多数定量pcr仪器的批间差较大，还有2次配置的PCR混合液也是有差别的。但从理论上推导得出，内参基因和目标基因可以分开做，尤其是采用双标准曲线法的时候。
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我现在开始按5倍稀释做premer test的时候扩增效率一直在70%-80%。可是Ct值是可以的，而且每个样品单独的效率也都是可以的，我实在想不通是为什么。
模板的cDNA是我一直用的，而且之前也出来过不少好的结果，所以我认为模板质量的问题可以排除。两条链的Tm值分别是62.7和63.1度，我的退火温度从62度一直降到55度，结果还是不行。换了模板的浓度，效果也不好。现在因为这个事情我都快吃不下睡不着了。
还想弱弱的问下，看一个引物是不是好，除了看上面我说到的那些指标外还要看什么呀？因为现在除了引物的因素没有排除，其它的都排除了，实在不行可以就得重新设计引物了。

没有严格要求扩增效率的啊，其实所有基因的扩增效率都一致的时候也可以用双deltaCt的，算出的结果是有点误差，但绝对不会把基因表达变化的趋势以及相对变化程度改变了的。
标准品配制不准会导致扩增效率的误差。10微升标准品DNA加入35或45微升水稀释比例是多少，楼上的确定你的移液枪准么？推荐40微升标准品加入160微升水（用同一把200ul的枪，一把20一把200配置的话误差是你说不清楚的）
分子生物学，细节决定了很多东东。

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作者: INK    时间: 2011-10-15 15:05

没有严格要求扩增效率的啊，其实所有基因的扩增效率都一致的时候也可以用双deltaCt的，算出的结果是有点误差，但绝对不会把基因表达变化的趋势以及相对变化程度改变了的。
标准品配制不准会导致扩增效率的误差。10微升标准品DNA加入35或45微升水稀释比例是多少，楼上的确定你的移液枪准么？推荐40微升标准品加入160微升水（用同一把200ul的枪，一把20一把200配置的话误差是你说不清楚的）
分子生物学，细节决定了很多东东。

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先谢啦！
不过据说发SCI的时候一定要提供引物的扩增效率的吧。而且我的引物一共有20多个呢，如果不把所有引物规定在同一个扩增效率里面的话也没有可比性啊~
而且最近新买的几个引物的效率都很低，奇怪的很。

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作者: 鲁西西    时间: 2011-10-15 15:05

那倒是引物的问题可能性更大一些了，你的引物太多了，我在roche的定量上经常偷懒调用扩增效率的。其他仪器好像没找到或者说我不会用,比如biorad。
参考一个叫pfaffl的人，他的文章里提到了另外一种相对定量的方法，它允许相对定量中每个基因可以有不同扩增效率，但假设同一个基因每次扩增效率都一致，在此基础上得到一个修正的双delta Ct法（扩增效率不再是2，而是根据不同基因扩增效率来设），这个文章是在biorad提供的资料里看到的，所以biorad定量的软件也许能够实现，roche的所谓Emethod法也是以此为基础的。

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作者: 龟仙人    时间: 2011-10-15 15:06

那倒是引物的问题可能性更大一些了，你的引物太多了，我在roche的定量上经常偷懒调用扩增效率的。其他仪器好像没找到或者说我不会用,比如biorad。
参考一个叫praffl的人，他的文章里提到了另外一种相对定量的方法，它允许相对定量中每个基因可以有不同扩增效率，但假设同一个基因每次扩增效率都一致，在此基础上得到一个修正的双delta Ct法（扩增效率不再是2，而是根据不同基因扩增效率来设），这个文章是在biorad提供的资料里看到的，所以biorad定量的软件也许能够实现，roche的所谓Emethod法也是以此为基础的。

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我的数据还得和我们实验室其他人的数据做比较，换了个计算方法的话他们肯定就疯了，不过真的很感谢，找那个人的方法来研究下！

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作者: 胖小妮子    时间: 2011-10-15 15:06

有2个问题始终不明白：
1.相对定量的双标曲线法，标准品的选择必须是目的基因表达量比较大的吗？如果，我选择检测同一基因的其中一个样本10倍稀释做标准曲线，只要可以做出线性关系的标准曲线，不是一样可以相对定量吗？
2.对于相对定量的-ΔΔCt法，对于目的基因和内参基因的扩增效率是否一致的验证，是否做一次就可以，接下来后续的条件一致的实验就不用再验证。我的理解是，扩增效率与引物、反应条件有关，这些条件不变，那么扩增效率就相对稳定。
麻烦你对我的困惑解答一下，，看了很多帖子和资料，这两个问题始终不能肯定。谢谢。

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作者: fangxiang    时间: 2011-10-15 15:11

有2个问题始终不明白：
1.相对定量的双标曲线法，标准品的选择必须是目的基因表达量比较大的吗？如果，我选择检测同一基因的其中一个样本10倍稀释做标准曲线，只要可以做出线性关系的标准曲线，不是一样可以相对定量吗？
2.对于相对定量的-ΔΔCt法，对于目的基因和内参基因的扩增效率是否一致的验证，是否做一次就可以，接下来后续的条件一致的实验就不用再验证。我的理解是，扩增效率与引物、反应条件有关，这些条件不变，那么扩增效率就相对稳定。

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1.最高浓度标准品和最低浓度标准品的浓度范围要超过所有样品的可能浓度范围，这没得改，不管是哪个物理化学还是生物学，所有实验学科都得遵守这条。否则凭什么认为标准曲线以外的区域也有线性关系呢？注意实验科学哦！所以第一条要严格起来是不行的，建议找目标基因表达尽可能大的cDNA稀释作为标准品
2.可以这么理解，最好扩增效率都等于2，后面的实验就不必验证，当然也有文章认为稳定就行，不必非得等于2。注意，小公司的定量试剂批间差之大有时候足以影响实验结果。

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作者: 胖小妮子    时间: 2011-10-15 15:12

谢谢！讲解的很清楚。
另外，我还有一个问题，两步法PCR,有一个目的基因的熔融曲线,退火/延伸：60℃ 30秒。特异性不太好，如下图1
然后我又升高了退火温度，62℃ 30秒，结果做出的熔融曲线如下图2，还是不好，请问有什么解决办法呢，非常感谢。

[ 本帖最后由 胖小妮子 于 2011-10-15 15:18 编辑 ]

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8749

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作者: 胖小妮子    时间: 2011-10-15 15:18

图片2

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8750

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作者: 胖小妮子    时间: 2011-10-15 15:19

1.最高浓度标准品和最低浓度标准品的浓度范围要超过所有样品的可能浓度范围，这没得改，不管是哪个物理化学还是生物学，所有实验学科都得遵守这条。否则凭什么认为标准曲线以外的区域也有线性关系呢？注意实验科学哦！所以第一条要严格起来是不行的，建议找目标基因表达尽可能大的cDNA稀释作为标准品
2.可以这么理解，最好扩增效率都等于2，后面的实验就不必验证，当然也有文章认为稳定就行，不必非得等于2。注意，小公司的定量试剂批间差之大有时候足以影响实验结果。

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还有一个问题，请问可以用原模板cDNA的PCR产物做标准品吗？

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作者: 我是一片云    时间: 2011-10-15 15:20

各位前辈，小弟是新手，有诸多问题请教，请各位前辈多多帮忙；
1. QPCR扩增效率是怎么计算的？或是在哪可以直接显示？
2. 经常遇见增益值，指的是什么？是baseline或阈值？
3 QPCR时，扩增曲线都有，可溶解曲线有些基因为什么都没有啊？

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作者: 眼药水~    时间: 2011-10-15 15:21

这位版主：您好！
最近一直很纠结，实在想不出是什么原因故来求助于您！首先介绍一下，我们用的机器是eppendorf的，我们这里开始荧光定量pcr已经有十几年的验了，一直都很好，但是最近出现了怪事。我们用的是TOYOBO的subgreen mix跑定量PCR，引物是生工合成的。跑定量是我们都是要先用TAKARA的酶跑普通PCR 摸索退火温度，然后用Qiuagen的胶回收试剂盒回收目的基因后做成7个梯度：10+E9；10+E8；10+E7；10+E6；10+E5；10+E4；10+E3；然后去看看斜率是否R2达到0.95以上才会去上未知样品。但是最近无论做总是第一个梯度在15个循环才起跳（以往都是在10各循环以前起跳的），后面的6个梯度全部在28个循环左右起跳，并且阴性对照也跟着后面的的6个梯度一起起跳，我们拿了定量的结果去跑胶后发现阴性对照跟我们的标准品是在同一个位置。当然我们首先想到的是水污染的问题，可是我们换了多个用来做定量PCR的水后任然得到同样的结果。然后我们分析是否引物污染，结果换了引物后仍然得到同样的结果。我们又分析是否是酶污染了，换了同样的酶后仍然得到同样的结果，我们甚至换用了另外一家公司TAKARA的用来荧光定量的酶，奇怪的是仍旧得到同样的结果。我们只能分析是否空气中有污染，换地方加样后仍然得到同样的结果。没有办法我们拿着我们所有的试剂到别的地方用别人的机器（不是eppendorf的）用同样条件去做，还是得到同样的结果。后来我们委托这个地方的人按照他们的系统（他们的TAKARA酶，水，我们的引物和模板）帮我们做了一次，结果梯度终于拉开了。但是我们按照他们体系和条件，使用他们的酶和水用我们的引物和模板在我们的机器上做仍然得到以往一样的不好的结果。后来我使用了大概一个月前做的非常好的标准品重新稀释，尝试了他们的系统和我们的系统，结果仍然是跟前面不好的结果一样。我实在是无处求助了，没有任何办法和头绪。麻烦您帮忙我们分析分析，万分感谢！

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作者: join    时间: 2011-10-15 15:22

枪，man_xiong一直没提到移液枪。灭菌其实不能去除DNA对枪的污染，可以借用别人的枪试试看，枪的去除DNA污染建议甘露酸加盐酸煮沸半小时（酸煮沸水解DNA，适用于eppendorf的，其他牌子的不确定）

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作者: 缘yuan    时间: 2011-10-15 15:23

我从今年初开始做Realtime PCR，一直纠结于扩增效率的问题（2-△△CT法）。用的是天根公司的SYBR Green Mix，含有ROX。刚开始用ABI的7000仪器，后来由于仪器维修改用别实验室的伯乐仪器。本来早就该做完了，但扩增效率出了问题。因为我之前用5倍稀释，到最后一个点就会有非特异性扩增竞争过产物（之前4个稀释度都还可以）。这还算是不错的情况，现在的问题更严重了，我改成3倍和4倍稀释，反而Ct值更分不开，完全没法做扩增效率比较。而我的原浓度都还不弱（植物的cDNA),基本在16左右起跳。我现在是不明白我哪里出了问题，怎么就是分不开梯度。急死人了。

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作者: 箭头儿    时间: 2011-10-15 15:23

请问探针法做的qPCR多少个CT值算是可信的呢，我的好多都是36、37个Ct值跑出来的，算不算呢？

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作者: ##蒙奇奇    时间: 2011-10-15 15:24

枪，man_xiong一直没提到移液枪。灭菌其实不能去除DNA对枪的污染，可以借用别人的枪试试看，枪的去除DNA污染建议甘露酸加盐酸煮沸半小时（酸煮沸水解DNA，适用于eppendorf的，其他牌子的不确定）

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多谢提醒，我忘记提到这一点了。我们换了枪的，在别人那里做的时候全部使用我们的试剂没做出来的那次和使用他们的试剂做出来了的那次用的都是他们的枪。并且在我们这边每次都没做出来但也有换过别的枪，尤其是我帮他们查找问题的时候使用的是我自己的枪，因为我的枪一直是自己用的，自从上个月做完一批实验（大概P了9个基因的定量，结果都非常好）后基本没有用过自己的这套枪来做实验了，也没有给别人用过，虽然其他人的枪我不敢保证。。。但我的枪应该不大可能被污染吧？

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作者: #黄药师#    时间: 2011-10-15 15:25

我想用实时荧光定量RT-PCR来做基因的表达分析，具体是这样的：有多种等位基因编码一种酶，我想通过在同源区设计得到通用引物，来扩增能编码这种酶的这类基因，通过Q-RT-PCR得到不同时间段（如0d,5d,10d,15d,20d) 这类基因相对于管家基因的相对表达量，来反映不同时间段产这种酶的微生物的动态变化。不知道我的这种想法可行否？或者说这种定量方法能达到我的目的吗？谢谢

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作者: 969    时间: 2011-10-15 15:28

请问我用宝生物SYBR GREEN一步法RT-PCR定量试剂盒实验，循环结束后做熔解曲线分析，有时候也会再跑电泳看一下。可是发现有时候熔解曲线没有杂峰的电泳有明显杂带，而电泳有杂带的熔解曲线确有杂峰，请教大家这是什么原因呢？哪个结果更可靠呢？谢谢！  

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作者: 中国特色    时间: 2011-10-15 15:29

此法由于没有标准品，所以要手动设置阈值。本人共做了14次试验，其中在不同的试验中测定了部分相同的待测样品。由于每次手动设定阈值的原因，在统计结果的时候，相同的待测样品给出了不同的相对量值。原因在哪里？是阈值不同造成的吗？

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作者: Darcy    时间: 2011-10-15 15:29

各位老师好，我最近在用SYBR I 做绝对定量PCR ，我的问题是标准品的5个点的CT值刚好介于15—30之间，我的检测范围为10-3—10-9，拷贝数最低可达240拷贝，现在的问题是当检测样本时，有些样本的CT值可达到36-38左右，此时拷贝数为0.5-1，但也有特异峰，像这种弱阳性该怎么判断结果呢？它已经不再我的检测范围内，该怎么解释呢？我把我的图片传上来了，请各位老师帮我解答一下吧

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作者: SOS    时间: 2011-10-15 15:31

各位老师好，我最近在用SYBR I 做绝对定量PCR ，我的问题是标准品的5个点的CT值刚好介于15—30之间，我的检测范围为10-3—10-9，拷贝数最低可达240拷贝，现在的问题是当检测样本时，有些样本的CT值可达到36-38左右，此时拷贝数为0.5-1，但也有特异峰，像这种弱阳性该怎么判断结果呢？它已经不再我的检测范围内，该怎么解释呢？我把我的图片传上来了，请各位老师帮我解答一下吧

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我看了一些检测病毒的是这样界定的，弱阳性一般是要重新检测，如果重新检测后结果仍然是这样的话，就判定为阳性。但是ct值已经超出你标准曲线的检出限，我觉得这样的数据也是不可靠的。你也要看一下你阴性对照的ct值，如果你样本的ct值大于阴性对照的，那应该也应该判为阴性吧。

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作者: 大桃子同学    时间: 2011-10-15 15:32

请教各位，采用Real-Time PCR,实时荧光定量方法来检测两种物质在人PBMC上面的mRNA上的表达，需要EDTA抗凝血多少啊？我们血样来源比较困难，所以想问需要多少血样才够做。一管5ml的EDTA抗凝血够检测这两个基因的吗？做的时候能采用一步法能做这两个基因吗？非常感谢！

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作者: mamamiya    时间: 2011-10-15 15:33

请问：我做的实验是析因设计，基因含量检测我做荧光定量PCR，用的染料法，得出的数据（mRNA相对含量的计算用目的mRNA的Ct值减去内参的Ct值得到△Ct，以最大的△Ct作为基准，用其他△Ct减去最大的△Ct并取结果的负值，得到-△△Ct，求得2的-△△Ct次方的结果作为mRNA的相对表达量），用析因设计怎么分析？

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作者: @STAR@    时间: 2011-10-15 15:33

你可以去遗传板块
有篇关于cnv的讨论里有
2篇ng的文章，里面有实验方法

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有劳大侠能不能把这两篇NG挂上了，给个链接也行。我找了一下没有找到

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作者: 荒漠孤驴    时间: 2011-10-15 15:34

最近做Real time PCR标准曲线总是不理想（R2=0.92左右）。我的模板使用1*TE溶的，开始用TE稀释，后来改用水稀释，似乎用水稀释好些。
想请问下，模板可以是用TE溶的吗，如果可以，稀释的时候是用水还是TE呢？有人试过吗？  

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-16 11:04

最近做Real time PCR标准曲线总是不理想（R2=0.92左右）。我的模板使用1*TE溶的，开始用TE稀释，后来改用水稀释，似乎用水稀释好些。
想请问下，模板可以是用TE溶的吗，如果可以，稀释的时候是用水还是TE呢？有人试过吗？

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你的模板是什么？DNA？RNA？质粒？一般我们质粒模板是用TE稀释，DNA用水，RNA用DEPC处理水。

TE里有盐，一般的DAN和RNA都是要求纯度较高，如果用TE倍比稀释的化，影响恐怕会很大。而且浓度越低，影响越大。（这是我的推测，没有试过用TE稀释的RNA做实验，具体原因还请多方查资料。）

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作者: 荒漠孤驴    时间: 2011-10-16 11:23

你的模板是什么？DNA？RNA？质粒？一般我们质粒模板是用TE稀释，DNA用水，RNA用DEPC处理水。

TE里有盐，一般的DAN和RNA都是要求纯度较高，如果用TE倍比稀释的化，影响恐怕会很大。而且浓度越低，影响越大。（这是我的推测，没有试过用TE稀释的RNA做实验，具体原因还请多方查资料。）

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谢谢！我的模是DNA，用TE溶解的。做标准曲线，倍比稀释用过TE，也用过水，似乎水的效果好些。但总体还是不太好。我就担心是不是原始模板是TE溶解的原因。

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作者: 冷太阳    时间: 2011-10-16 11:24

我实验设计了几个目标基因，以荧光半定量PCR预测是否确实存在表达下调或上调，以明确该基因受药物诱导后是否会出现变化。例如其中一个是P53，结果公司给的查的mRNA有7个transcript variant 。以前不是干基础的，都忘得差不多了。请问，我应该如何知道哪个transcript variant 是我要的，在我所看到文献中都没有提这个问题。请指点，谢谢

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作者: 眼药水~    时间: 2011-10-16 11:25

我的实验需要做15个细胞系的基因组DNA,我有2个内参基因和1个目的基因，三个基因都做了标准曲线，扩增效率都很好，在0.99左右，我用标准曲线法来做，是不是我做的时候一次实验都要将这3个基因的标准曲线和我要做的标本放在一块板子上同时跑？还是说可以将这三个基因分开来跑3次realtime？  

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作者: tears    时间: 2011-10-16 11:26

请教一个比较弱的问题，real-time产物跑电泳是不做溶解曲线直接跑，还是做完溶解曲线跑？如果是做完溶解曲线，DNA不是都解开了吗？是放到4度中让dna在结合之后跑吗？
因为要区别是污染还是二聚体，所以要跑这个。
再请教一下，所谓的污染是不是环境中的DNA，如果有污染，是不是几个目标产物和内参都会同时污染，如果有相同条件，有不污染的是不是反过来证明其他的也没污染，而是二聚体。
如果定量PCR的产物在机器上曲线明显，跑电泳却出不来，有什么可能？
谢谢，基础比较差，弄不明白。

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作者: ##蒙奇奇    时间: 2011-10-16 11:27

我只知道做完溶解曲线后可以直接跑电泳

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作者: 爬呀爬    时间: 2011-10-16 11:28

各位老师好，有问题想请教一下，期待尽快回复！
在相对定量PCR中，如何通过TM值来判断被检测样本的特异性呢？如果它与标准品的相差值在10以上，可以判断为阴性吗？是不是不同物种的TM值不同呢？

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作者: #甜#    时间: 2011-10-16 11:28

最近想用实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因的拷贝数，但不知道具体步骤怎么做，内参基因选择什么，买什么试剂盒，望做过的高手指点一下，谢谢

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作者: SOS    时间: 2011-10-16 11:29

请教各位老师一个问题，我做的是Taqman荧光定量PCR，为什么老是检测不到荧光信号，没有扩增曲线，几乎是一条直线，但是电泳可见清晰明亮的条带。以为是探针的原因，就让再合成了一批Taqman探针，但是结果还是一样。可能是温度高，探针结合不到模板上，所以就把三步法变成两步法，60度或者58度退火延伸，但是还是一样的结果。同样的标准质粒，扩增不同的区域（不同的引物和探针），却可以得到很好的标准曲线，这种探针和这种可以有扩增曲线的探针Tm值差不多，为什么确实这样的结果？所用的探针和引物是引用参考文献的，并且这种引物与探针被很多人引用的。一筹莫展了!谢谢各位老师了，本人现在急死了。老师又急需要数据。

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作者: queen    时间: 2011-10-16 11:30

我现在也在做real time PCR
由于第一次做，实战经验很不足啊。试验中遇到了些问题，欢迎各位高手指点。以下是我今天做的溶解曲线的图：请大家帮我分析下我的条件该怎么优化下。先谢谢了！
我做的8个孔：一个空白，一个内参，另外六个分别是两个模板的3个基因（有点迷糊哈）不过相信大家的智慧还是能明白我说的

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作者: 椰子叶子    时间: 2011-10-16 11:30

小弟急需测miRNA的表达，real-time PCR，可是鄙人新手至今不会设计引物，chen的文章也看了，只是没搞懂。拜请版主和其它高手赐教。不胜感激！QQ275807524,邮箱shanbo_21c@163.com,感谢大家了

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takara的引物可以由公司合成，本人现在就是他们给合成的引物，还可以吧。你可以试试看。

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作者: zzzz    时间: 2011-10-16 11:31

请教各位高手 ，我real time pcr目的基因的ct值一直在30-31之间，这个值可以吗 有没有参考价值？

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作者: 大仙    时间: 2011-10-16 13:15

最近刚做荧光定量，有些问题不明白，请各位高手帮忙一下，谢谢！
1、下边图一的溶解曲线中浓度最低的时候在主峰后边出现了一个小峰，这是怎么回事啊？这样的话引物能用吗？

图片附件: 72171515.jpg (2011-10-16 13:15, 28.28 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8754

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作者: 大仙    时间: 2011-10-16 13:17

最近刚做荧光定量，有些问题不明白，请各位高手帮忙一下，谢谢！
溶解曲线怎么在右边下降到一半的时候就没有了呢？什么原因？

图片附件: 13811947.jpg (2011-10-16 13:17, 22.6 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8755

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作者: @花开花落@    时间: 2011-10-16 13:17

我将绿色荧光蛋白小鼠的各组织提取RNA,再反转录为cDNA，设计了绿色荧光蛋白的RT-PCR引物，然后跑real time PCR，融解曲线没有峰，跑不出来，跑电泳也没条带，但同样的模板内参却跑得很好。试了两次普通PCR，也是没跑出来，引物二聚体都没有。
我想问一下是绿色荧光蛋白小鼠本来就没有绿色荧光蛋白基因，还是我的PCR体系有问题啊？但是我做western blot有GFP蛋白表达.

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作者: 莓菓333    时间: 2011-10-16 13:18

我的引物是S1 5′GCTATCGCTGG ATGTGTCTG3′ (nt366-385)
S2 5′GTACAATATGTTCCTGCGGTA 3 (nt 928～908)
但是我做了16个病人血清里提出来的HBV-DNA的PCR，琼脂糖电泳后只有三个标本在大约500多bp的位置跑出了条带，其余都没在500多bp位置跑出条带。但是在100bp位置16个标本都跑出来了条带，怀疑是二聚体。
我的模板是HBV-DNA,目的条段是572bp.
请各位大侠帮忙检测下我的引物是不是存在问题？感谢！
我做的是普通PCR  

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作者: #甜#    时间: 2011-10-16 13:18

TaKaRa的还不错！

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作者: 桔囿    时间: 2011-10-16 13:19

我刚做定量PCR 很多问题不是很懂 想请教一下 扩增曲线没有平台期怎么回事 是不是反应 的引物和模板量的问题 怎样确定最合适体系呢 我用的是ABI的试剂盒 25ul体系 谢谢了！

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作者: jude    时间: 2011-10-16 13:19

我用荧光定量PCR做snp,用DNA做，结果一直不理想，有一个位点的扩增效率太低，一个溶解曲线为双峰。我怀疑我的引物不是很好，能否给一些建议。十分感谢

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是引物没有设计好，建议换引物！有什么问题可以联系我！

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作者: 锤子    时间: 2011-10-16 13:20

我在做提取粪便细菌基因组DNA，然后用染料法荧光定量PCR绝对定量3中种目的基因拷贝数，一共250份样品，检测计算提取的每管DNA浓度都不一致。我看到论坛里有说“反转录前应将totalRNA调整的统一且适当的浓度。”我定的荧光定量PCR试剂盒说明书里写的是“DNA模板添加量在100ng以下”，请教一下对于基因组DNA为模板也需要将全部模板样品调到一致浓度？（如果必须调也太麻烦了吧，如何调啊）

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作者: KGZ564    时间: 2011-10-16 14:17

请问：我用Roche3.5荧光定量仪，taqman试剂盒做qRT-PCR，试剂盒给出温度和时间了,为什么跑的扩增曲线是锯齿型上升状？

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作者: 微笑的海豚    时间: 2011-10-16 14:18

缓冲体系不同,主要指的是buffer中各个离子的浓度和PH略有不同.因为普通PCR仪的升降温速度比定量的慢.因此缓冲体系/酶/引物都为适应不同的升降温速度而不同.
reply：本人不同意升降温速率会影响缓冲体系/酶/引物等配比，都是一样的热动力学过程罢了，只不过前者慢，后者快。

定量产物一般都比较端,因此如果把定量的引物放在普通pcr的体系和仪器上做,很可能有许多非特异性的条带产生.同时,我还遇过一次,定量的引物放在普通pcr上做,跑胶看没有任何条带,当换用定量试剂做,结果特别好.
reply：定量的引物放在普通pcr机器上还会出现非特异带？OMG，定量的引物相对普通PCR引物而言，就是强调一个特异性，怎么可能在普通PCR上还会出现杂带呢？事实上，如果是设计很好的定量引物，在跑一般PCR时，那结果是相当的好，呵呵。定量的引物如果扩一般PCR没有而用定量试剂做结果很好，只有2个可能：1、你的PCR体系太烂了。2、定量的试剂由于是通过商业化的优化的，譬如加入甜菜碱、DTT等等东东，特异性和效率都是很不错滴，当然和你的普通PCR没得比。另外，不要忘记了大多数qPCR试剂里面用的都是高效率的热启动酶，这个和普通酶相比还是有很大区别的，我猜你说的这个特例只是酶的差异罢了。

因此,建议大家,在拿到引物和试剂的时候,挑一个样品直接用定量实验来验证引物和反应体系,摸索反应条件.这样做远比先用普通pcr验证引物要有效得多.(这是有时间和金钱的教训在里面的)并且用普通pcr摸索的实验条件放到定量上还是需要重新再摸索.得不偿失,事倍功半.
reply：我的观点和你的相反，刚来的引物，最好上普通PCR或是梯度PCR仪上面摸索最佳的温度和条件，看看跑胶有没有非特异性扩增，然后再做标准曲线来验证。

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我也有相同的看法.另外,我们也是筛SNP,一份样本正常和突变引物同时做,为什么普通PCR阴阳性分明的结果,在定量PCR上却都是阳性呢(溶解曲线显示Tm值还是有差异的)?(普通和定量都是用的同一套体系,只是后者添加了Mg2+和SG染料)我们怀疑是不是模板的量需要事先优化或者酶的活性太强了

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作者: 微笑的海豚    时间: 2011-10-16 14:18

最近刚做荧光定量，有些问题不明白，请各位高手帮忙一下，谢谢！
溶解曲线怎么在右边下降到一半的时候就没有了呢？什么原因？

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我想是跟你的程序设计有关吧,溶解曲线分析那段升温到95,0s后降温,荧光信号有个突变,形成尖峰,你的这张图上显示温度接近升温极限(比如,95),DNA链都解开了,没法结合染料,当然这一段就没有荧光信号了.

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作者: 微笑的海豚    时间: 2011-10-16 14:18

请问：我用Roche3.5荧光定量仪，taqman试剂盒做qRT-PCR，试剂盒给出温度和时间了,为什么跑的扩增曲线是锯齿型上升状？

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会不会是仪器的波动不稳造成的.

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作者: 微笑的海豚    时间: 2011-10-16 14:19

各位老师好，有问题想请教一下，期待尽快回复！
在相对定量PCR中，如何通过TM值来判断被检测样本的特异性呢？如果它与标准品的相差值在10以上，可以判断为阴性吗？是不是不同物种的TM值不同呢？

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你是不是把Tm和Ct的概念弄混了,Tm是产物特异性的标志,如果你只是定性,阴性标本的溶解曲线在阳性产物TM处不出峰;当判断阴性是以量值作为标准时才看CT差异大小.
不知道我理解的对不对.

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作者: 微笑的海豚    时间: 2011-10-16 14:20

SYBR的方法是不可能检出SNP的,目前SNP的检测大多用Taqman-MGB探针,或者Cycling探针来检测.

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受此启发,潇湘子的意思是不是说,引物3端的一个SNP差异不会阻碍扩增的进行,也就是说,无论是阴性还是阳性标本都可以扩出东西,与程序中循环数\温度等无关.
还想请教一下,如果我们在突变引物3端除末端外增加不匹配位点,可以提高特异性吗?

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作者: 微笑的海豚    时间: 2011-10-16 14:21

不考虑引物扩增表现好坏和你的模板中是否有阻害物,单纯看模板稀释,梯度就特别不好,相信你把模板稀释好,扩增效率不会这么差.
现在你可以先在仪器上把第一个点和最后一个点去掉,看看扩增效率怎样.

还有一点补充一下,5倍的梯度不是太好稀释,如果你基因表达量比较高的话,选10倍梯度吧.

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如果阴性标本CT值和阳性标本CT值差别不大,如果排除污染的可能,是否是模板量的问题?如果阴性CT=17,阳性CT=14,我应该把模板以多大比例稀释才好呢?还是说先把模板用OD260初步定量后在做稀释?

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作者: 岸上的鱼    时间: 2011-10-16 14:22

我现在刚刚接触Real-time PCR,想请教各位高手一个小问题，我的细胞因实验需要接种到玻片上，在RNA抽提时，我准备先消化下来，离心后，用冷PBS冲洗后，再加入TRIZOL可以吗？
是否还有其他更好的操作步骤，旺告知。
本人刚刚起步做实验，望各位不吝赐教！
谢谢

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作者: +田田+    时间: 2011-10-16 14:22

各位大侠，我刚开始做real-time pcr ，用AllGlo探针测SNP分型，通过提取血液中的DNA来做的。现在有几个问题请各位大侠指教：
1.荧光检测的温度是机器默认的，60°，不知道这个是不是最佳荧光检测温度
2.我的扩增曲线出现较晚，一般在25个循环才起飞，有什么好的办法能提前5个循环左右？
3.各个样本的曲线间距离过大，请各位大侠指教！！！！！谢谢  

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作者: 麻瓜    时间: 2011-10-16 14:23

刚开始接触定量PCR，用的是BIO-RAD CFX96，试验问题一个接一个，赐教。
1.绝对定量时，标准曲线总是做不好，10倍稀释（取10ul，加90ul水）时，斜率应为-3.3，我做出来总是一点几，二点几，这样扩增效率就肯定不在95%-105%了。
2.做猪的目的基因时，溶解曲线为单峰，阴性对照的溶解曲线却在同样位置出现一个峰，熔点均在80度。
3.做牛的目的基因时，溶解曲线出现两个峰，一个峰熔点在73度，一个峰熔点在78度。做牛的阴性对照（NTC）时，溶解曲线也出现了一个峰，熔点在73度。
这两个目的基因的扩增条件相同：95度30秒，95度5秒，56度30秒（退火温度根据猪的基因在定量PCR仪上温度梯度优化出来的最佳温度）

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-16 14:26

样品处理：SYBR Green mix 10ul
正引物 0.5ul
反引物 0.5ul
水 5ul
混合后，取16ul，样品取4ul

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作者: 大桃子同学    时间: 2011-10-16 14:27

你的模板是什么？DNA？RNA？质粒？一般我们质粒模板是用TE稀释，DNA用水，RNA用DEPC处理水。

TE里有盐，一般的DAN和RNA都是要求纯度较高，如果用TE倍比稀释的化，影响恐怕会很大。而且浓度越低，影响越大。（这是我的推测，没有试过用TE稀释的RNA做实验，具体原因还请多方查资料。）

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请教过一个老师，他说如果标准曲线做的不好，模板是片段的话，用TE稀释稳定些。我换了TE稀释，标曲还是不理想，R没问题，扩增效率120%

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作者: 丸子妹    时间: 2011-10-16 14:27

请教一个问题，我们实验室做realtime很长时间了，用的是ABI7300，SYBGREEN，最近发现用来做内参的18s出现问题，有些样品完成正常Ct值约8，三复孔重复性很好；但有些样品Ct值要39，有些是有的孔8，有的孔39。这些出问题的样品扩其他引物扩增Ct值完全正常，重复性很好；机器使用正常，同样的孔扩其他引物和样品没有问题。操作人员很熟练，发生在多个操作人员身上。
排除机器、引物、样品、人员的问题，还有什么因素？
谢谢！

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-16 14:28

简单说一下做定量PCR的流程(以RNA起始为例):
1.提取totalRNA
针对不同的组织选择不同的试剂盒提取totalRNA,尽量严格按照试剂说明书的要求来进行.
提取过后,需要对totalRNA进行质量测定,包括两个部分,一个是1%胶电泳,确定是否降解,一般来说质量好的total RNA电泳有三条带,28s为最亮,理想情况下接近18s亮度的2倍,5.8s最弱,只是很模糊的一条带;另一方面是测OD,通过OD计算出totalRNA的浓度.一般来说total RNA OD260/280的范围在1.8-2.2之间,都是比较好的.230代表盐离子浓度,260核酸,280蛋白,320背景浑浊度.

2.将totalRNA的浓度调至统一的起始量.
计算total RNA的浓度:RNA浓度（μg/μL）=（A260-A320）X稀释倍数X 0.04根据您所选择的反转录(RT)试剂,以及定量PCR试剂对模板浓度的要求,用TE把total RNA稀释至统一的浓度.

3.RT&PCR
这两个步骤没什么可说的,按照说明书来做就行.值得注意的是,要尽量避免污染,有条件的话,模板添加区和混合液配置区分开,枪,枪头,tube,什么的全部都分开.实在不行,也要用70%酒精把枪都擦一遍再用.

以上仅仅是个protocol,还有很多细节,待遇到了再详细说.

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溶解RNA建议用试剂盒里面的超纯水，不建议用TE

有的反映体系会被TE里面的EDTA影响。

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作者: 泉水叮咚    时间: 2011-10-16 14:29

请教各位老师：
我的实验需要要做实时PCR,该怎么设计引物呢，以前曾做过RT-PCR，这两种PCR有何不同呢？引物设计上需要注意什么呢？求老师帮助。不胜感激。我要做的是转基因鼠的肾小管上皮细胞TKC2转分化，不知道转基因鼠和普通鼠的引物是一样的吗？
还是介绍一下我的实验吧：我要做体外培养的“转基因鼠的肾小管上皮细胞（TKC2）”转分化实验，要测转分化前后目的基因的变化，需要测定的基因很多有补体、肾素（renin）、E-cadherin、Smad等等。现在还在准备阶段，但我没做过RealTimePCR，不知道该做什么准备

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作者: @木木@    时间: 2011-10-16 14:45

受此启发,yaoshan的意思是不是说,引物3端的一个SNP差异不会阻碍扩增的进行,也就是说,无论是阴性还是阳性标本都可以扩出东西,与程序中循环数\温度等无关.
还想请教一下,如果我们在突变引物3端除末端外增加不匹配位点,可以提高特异性吗?

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将突变位点设计在引物的3'端，然后采用保真性能不是很好的酶来PCR，是有可能区分出两种不同的类型的。两种类型都肯定能扩出来，但Ct大小不同。但这种方法最明显的一个缺点是，Ct差多少算是一个界限呢？  

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作者: 知了知了    时间: 2011-10-16 14:45

您好！
我用建立稳转细胞系的RNA逆转后进行Realtime，检测某些因子的表达，但是每次重复性很差，甚至趋势不一样。
每次三复孔重复性倒是很好。
做Realtime很久了，不能单纯说是加样误差啊。
RNA质量也有保证。

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作者: 知了知了    时间: 2011-10-16 14:45

您好！
我用建立稳转细胞系的RNA逆转后进行Realtime，检测某些因子的表达，但是每次重复性很差，甚至趋势不一样。
每次三复孔重复性倒是很好。
做Realtime很久了，不能单纯说是加样误差啊。
RNA质量也有保证。

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作者: 韩梅梅    时间: 2011-10-16 14:46

您好！
我用建立稳转细胞系的RNA逆转后进行Realtime，检测某些因子的表达，但是每次重复性很差，甚至趋势不一样。
每次三复孔重复性倒是很好。
做Realtime很久了，不能单纯说是加样误差啊。
RNA质量也有保证。

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细胞学本身的误差考虑过么？精确的细胞量与处理剂量的关系(10cell:1mg,细胞计数不准的话很可能成为70cells：1mg或130cells：1mg) ，细胞本身状态是否稳定？另外处理时间呢（在对数增长期和在平台期加药细胞的反应很可能完全不同的）？应该还有很多生物学因素可以影响到最终结果的，从三重复好可以判断你的加样和PCR环节基本没有问题的。

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作者: 丁香@@    时间: 2011-10-16 14:46

如果在一次反应一个温度下同时做了两种目的基因和一个内参，是否可以比较这两种目的基因的表达差异呢？
因为涉及到实时引物设计时两种目的基因的产物片段长度不同，是否有公式可以矫正呢？我用的是SYBR染料，多谢了。
还是说必须在引物设计时将Tm值、产物片段设计一样才能比较两种不同基因的表达量呢？

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作者: 小葵    时间: 2011-10-16 14:46

求助：
我做绝对定量qPCR,标准曲线R方0.95会不会影响文章发表呀？
据说要做三个复孔，我只做了两个复孔会不会影响文章发表呀？
还有溶解曲线基本呈单峰，但有的样品前方或后方有小的波浪怕不怕呀？
我用的软件是7500，可以引用外来的标准品曲线吗？

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作者: 按秒计算    时间: 2011-10-16 14:49

我们这几次做RealTimePCR时，溶解曲线总是有两个峰，其中第一个峰和空白对照产生的峰在一个位置上，请问这是不是引物设计的不行，连对照都有峰，是引物二聚体产生的吗？

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作者: 章鱼小丸子    时间: 2011-10-16 14:49

我只要用探针法来验证有没有我需要的产物，因为产物量很少，只能在定量PCR上验证，那我还需要标准曲线之类的玩意吗？谢谢高手回答

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作者: 大虾米    时间: 2011-10-16 14:59

我用SYRB green 实时荧光定量pcr检测40个肺癌组织和40个癌旁组织中某个基因的的表达水平，一共有80个标本。只要的实验目的是：1.检测肝癌组织和癌旁组织中某基因的表达差异。2.肝癌组织某基因的表达水平与临床病理特征的关系。但是出现一个问题：有人说每个标本要测3个复孔，取平均值。如果这样的话要测240次。是否不设复孔，只测一次呢？望高手回复，小弟感激不尽啊！

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作者: dmg    时间: 2011-10-16 14:59

我是做正常人和抑郁患者某个基因表达水平的实验。
1.内参选择，查了相关的文献，真的还没有找到。（自己太笨了）
2.实验室有该基因标准品质粒，是做绝对定量还是相对定量呢？
3.标本来源是全血，病人的很少，只有400UL左右，很发愁用什么试剂盒提RNA效果较好。
4.该基因大概全长1200BP，我想用探针。但是这个只适用于500BP以下的片段。可以选取200BP保守片段来做吗？
非常感谢老师，期盼得到你的回复。谢谢。

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作者: 131415    时间: 2011-10-16 15:00

强烈请求如何解决Real Time PCR污染问题 ？？？

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作者: 大猫    时间: 2011-10-16 15:00

绝对定量，质粒为标准品，10倍稀释。曲线总是不能重合的很好弯弯曲曲（如图）是怎么回事？
另外这个图是不是基线设置有问题？这是自动分析的结果，怎样改啊？

图片附件: 26247841_snap.jpg (2011-10-16 15:00, 36.54 KB) / 该附件被下载次数 7
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作者: queen    时间: 2011-10-16 15:01

开个帖子,有定量PCR相关的问题可以提问,如果有类似/雷同的问题我会整理在一起统一回答.如果有重复的问题，或者本帖的回帖中能自行找到答案的问题不会作答。

现在将每一页的主要问题整理一下

不建议用普通PCR来验证定量引物以及摸索定量的反应条件。

Page1：
1.做目的基因表达量分析的简易小流程。
2.什么样的实验数据才是可靠的呢？

Page2：
1.多重PCR与单一PCR仅仅是引物探针设计上的差别吗？
2.选择绝对定量还是相对定量？
3.如何判断体系的阴性对照是否有污染？
4.溶解温度曲线是如何制作的？

Page3：
1. 定量引物与普通引物的设计差异。
2.如何稀释标准品。

Page4：
1.相关系数与斜率的意义。
2.- △△CT法与标准曲线法的比较。

Page6：
1.反转录前应将totalRNA调整的统一且适当的浓度。
2.模板、preMix均不建议用振荡器混匀。

Page7：
1.total RNA无法电泳以及测OD
2.溶解温度曲线有两个峰怎么办？

Page8：
1.一步法试剂盒与两步法选择上有什么差别？
2.cDNA不能测OD。

Page9：
1.△△CT法要求的扩增效率
2.阈值的民间调整法
3.溶解温度曲线的制作过程

Page10：
PCR反应时模板添加量

Page11：
商品化的premix，只选适合自己的。

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为什么不建议用普通PCR来验证定量引物以及摸索定量的反应条件啊 据我所知很多人都是如此做的啊

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作者: 去看海    时间: 2011-10-16 15:01

你好，我想请教一下关于ROX校正的问题：首先我用的是含ROX的master，由于引物Tm较低，所以设定的退火温度为51度。溶解曲线为一致的高尖的单峰，但是在72度左右，电泳结果显示是目的基因（172bp）。所以考虑ROX可能影响溶解曲线的峰值，故改用不含有rox的master，溶解曲线的峰值依然为单峰高尖，但是相同产物出现峰值的温度不一致，且温度没有明显提前，电泳检测结果也为特异性产物。重复一次，结果一致。我的问题：出现这样的结果是不是可以认为ROX对溶解曲线的峰值会有影响，或者有其他原因，如果是ROX的原因，为什么会出现？
（用的两种master为：faststart sybr green master和faststart sybr green master（ROX），定量PCR仪为Rotor Gene 6000，这个仪器是可以不用ROX校正的，重复实验中将两种master在同一次PCR中反应，同时加的样）

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作者: 橘子水儿    时间: 2011-10-16 15:03

请问一个问题，我做标准曲线发现，9次方的标准品起跳大概在28CT左右，我电泳看了产物，感觉产物量也不算低，为什么会起跳这么晚，另外就是标准品老是稀释不开，不知道有什么好办法没有，谢谢  

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作者: ffaa    时间: 2011-10-16 15:03

请问，血（血清or血浆）提取的RNA逆转录后的cDNA做模板，realtime的内参用什么基因？

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作者: 白鸟之翼    时间: 2011-10-16 15:05

缓冲体系不同,主要指的是buffer中各个离子的浓度和PH略有不同.因为普通PCR仪的升降温速度比定量的慢.因此缓冲体系/酶/引物都为适应不同的升降温速度而不同.

定量产物一般都比较端,因此如果把定量的引物放在普通pcr的体系和仪器上做,很可能有许多非特异性的条带产生.同时,我还遇过一次,定量的引物放在普通pcr上做,跑胶看没有任何条带,当换用定量试剂做,结果特别好.

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版主好！我现在做的定量PCR，就是跑胶怎么都跑不出来，但是溶解曲线看，挺好的。现在不知怎么办！
跑胶的目的是回收PCR产物做标准曲线！另外，现在跑胶跑不出来也没有信心用△△CT法做！

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作者: #黄药师#    时间: 2011-10-16 15:06

我用SYRB green 实时荧光定量pcr检测40个肺癌组织和40个癌旁组织中某个基因的的表达水平，一共有80个标本。只要的实验目的是：1.检测肝癌组织和癌旁组织中某基因的表达差异。2.肝癌组织某基因的表达水平与临床病理特征的关系。但是出现一个问题：有人说每个标本要测3个复孔，取平均值。如果这样的话要测240次。是否不设复孔，只测一次呢？望高手回复，小弟感激不尽啊！

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为数据的准确性和可靠性，要做复孔，因荧光定量PCR灵敏度较高！单孔CT值出现差异不知是否是因为试验中手法加样造成所致。

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作者: 冰激凌小姐    时间: 2011-10-16 15:07

大侠们，想请教一些问题。我我用SYRB green 实时荧光定量pcr做房颤病人与非房颤病人一个基因的表达差异，应用2-ΔΔCt做相对定量分析，内参是GAPDH，共有16个样本，每组各8个。遇到以下一些问题：
1.各样本内参CT值相差较大，大概3-5个CT值，有些样本测得CT值大于目的基因CT值，不知道为什么。
2.我这是两个组，每组有八个样本，根据2-ΔΔCt，我应该设个对照组的，怎么设这个对照呢？
3.目的基因溶解曲线有些样本出现双峰，考虑为二聚体存在，但是3个复孔，只有一个出现双峰，是加样问题？内参溶解曲线很好，没有双峰出现。每个样本，内参和目的加的是同样的模板，为什么双峰只出现在目的，和引物有关？但是所有目的加的同样引物，为什么只有一些样本出现双峰呢？

望高手回复，小妹感激不尽啊

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作者: 阿福    时间: 2011-10-16 15:08

大侠们，想请教一些问题。我我用SYRB green 实时荧光定量pcr做房颤病人与非房颤病人一个基因的表达差异，应用2-ΔΔCt做相对定量分析，内参是GAPDH，共有16个样本，每组各8个。遇到以下一些问题：
1.各样本内参CT值相差较大，大概3-5个CT值，有些样本测得CT值大于目的基因CT值，不知道为什么。
2.我这是两个组，每组有八个样本，根据2-ΔΔCt，我应该设个对照组的，怎么设这个对照呢？
3.目的基因溶解曲线有些样本出现双峰，考虑为二聚体存在，但是3个复孔，只有一个出现双峰，是加样问题？内参溶解曲线很好，没有双峰出现。每个样本，内参和目的加的是同样的模板，为什么双峰只出现在目的，和引物有关？但是所有目的加的同样引物，为什么只有一些样本出现双峰呢？

望高手回复，小妹感激不尽啊

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首先说明我不是高手啊，呵呵，只是你提出的问题1和3，我也遇到过，对此我是这样考虑的：
每个样本内参基因的表达有多有少，其与目的基因之差有正有负是很正常的，因为内参只是“肯定会表达”，并不是一定表达“最多”。
三个复孔有单峰有双峰，我觉得加样是最主要原因吧，至于内参只有单峰，很可能你程序设置的退火温度对于内参更有特异性。
由于各模板不是来自同一个样本，所以含有的杂质量和种类也不同，在扩增体系的作用下有些杂质可能影响了反应，溶解曲线出现双峰很可能是其导致的后果之一吧，而有些对反应影响不大或未对溶解曲线造成明显影响，所以溶解曲线是单峰。也许稀释模板可以解决这个问题？
一点拙见，不知是否合理，还请大虾指正啊！

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作者: @STAR@    时间: 2011-10-16 15:08

你好，我用的是SYBER Green 染料做，刚开始做对一些问题不是太了解。刚刚做了一次,内参的扩增曲线挺好的，可目的基因的扩增曲线却不是平滑的，呈锯齿状，这是什么原因造成的？和延伸温度有没有关系？

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作者: @STAR@    时间: 2011-10-16 15:11

“另外，一般不用PCR产物切胶回收做标准品，因为PCR产物中会有大量的错配情况，毕竟酶的保真性很难达到极致，错配无可避免。而此时你用PCR产物当标准品必然会影响引物的扩增效率，因为很有可能，在引物结合的地方刚好错配。”我想如果PCR产物都是<300bp这样的小片段错配的发生几率要小得多吧。不知道我想的对不对？

另外，对标准品用RNA还是DNA，一直没搞清。看了前面的帖子好似如果你从RNA开始，通过反转录成cDNA再做Q-PCR对某个基因表达相对定量的话就最好用RNA的标准品。Qiangen的教程上说RNA标准品来源可以是体外转录的RNA、或是目的基因浓度已知的RNA样品。这些都是怎么得到的，百思不解？我的实验是看处理因素X对靶基因Y表达情况的影响（对照组A、处理组B、内参C）。做相对定量，肯定也是从提RNA—cDNA-QPCR 如果做标准曲线我能用质粒做标准品吗？质粒标准品必须需要线性化处理吗？

另外如果靶基因Y和内参C的PCR效率不同，我用pfaffi方法做结果分析的话，因为要比较Y和C的扩增效率需要用样品进行倍比稀释，利用稀释倍数的对数值和二者的△Ct值做图，进行倍比稀释的样品用A还是B，还是用标准品呢？

看内参C是否受X的影响，只要拿A和B的模板（已经把A和B的total RNA浓度调整一致）做QPCR看二者的Ct值是否相同就行了吗？

问题多了点，谢谢大家多帮忙。

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作者: 飞天小鹿    时间: 2011-10-16 15:11

请楼主帮忙看看我做的扩增曲线为什么是这个样子的？我刚开始做荧光定量PCR，请问这是什么原因造成的？

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作者: 飞天小鹿    时间: 2011-10-16 15:12

如图：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8757

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作者: 小螺号    时间: 2011-10-16 15:13

老师，我要收集外周血的肿瘤细胞做realtime-pcr（相对定量），比较基因的表达差异，但流式分选的外周血中的肿瘤细胞太少，只有几百个，我打算比较3个样本9个基因的表达差异。打算用微量rna提取试剂盒去提取它，不知道rna的量够不够用，还需要去测od值吗？（9个基因+1个内参）x 3个样本 x 做3个副孔=90个孔，像这种情况是用一步法还是两步法的qrt-pcr去做啊？一步法的引物就是和两步法的引物是一样的吗？如何摸实时定量的条件啊？我用sybr-green的染料。

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作者: PCR    时间: 2011-10-16 15:14

大家做实验，PCR的条件都是摸索出来的。不知道你是自己配的试剂还是买公司的产品？如果是自己配的，你就用前面我的回帖中提到的条件先做一下，一般退火温度都在55－60之间，你做个梯度就知道了。延伸时间30秒左右就可以，因为再长就容易有非特异性反应了。如果是买公司的产品，你就先用说明书上推荐的反应条件试下先。

注意：管家基因与目的基因一定要用相同的反应条件。

至于管家基因的选择，你一定要确认这个管家基因是被认可的，即它的表达是不受你各种处理方式所影响的。这点很重要。我遇到过一个人选错了管家基因，被退修。她都郁闷死了。目前，homo、rat、mus三个物种GAPDH、Actb使用的多一些。

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为什么管家基因要和目的基因的反应相同呢？我看到文献上说的是：用62度扩增看家基因，而后用65度扩增目的基因，这又怎么解释呢？
还有个问题：用SYbr时，是看家和目的各一个管，然后放进机器里反应；如果用两种不同的探针反应，看家和目的依旧是各一个管，还是放在同一个管中？

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作者: mogu    时间: 2011-10-16 15:15

Tm值的定义是DNA的双链解开一半时的温度.SYBR是嵌合在双链里的荧光,制作溶解温度曲线正是利用了这二点.

第一步: 95度高温迅速降到60度或者更低,是为了能让PCR产物双链比较稳定的存在,相当于一个溶解温度曲线制作的准备过程.
第二步:60度缓慢升温到95度,是为了让仪器每个几秒钟就进行一次荧光信号值的检出,双链持续的打开,当解开到一半的时候,荧光信号值达到最大,然后,继续解链,开始降低,直至最后.



您好！首先感谢您默默的 回答这么多问题，受益匪浅！

我没明白为什么溶解曲线制作过程中当解开到一半的时候,荧光信号值达到最大，为什么呢？

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利用下午和晚上的时间把这个精华帖从头到尾看了一遍，真的收获不少！非常感谢楼主以及其余几位无私奉献的同志！谨在此向你们致敬！看完以后明白了为什么当解开到一半的时候溶解曲线出现峰值了。非常感谢，但是还是没明白为什么抑制物的存在会导致效率大于100%，还请楼主及各位高人指点小弟！

对于我的求助帖cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/topic/19549944?tpg=1&age=0')中提到的问题，我读完本帖之后感觉1、重复稀释梯度标准品；2、规范加样操作。希望我能做出来更好一些的！如果各位有什么建议或是发现什么问题，敬请明示，不胜感激！

谢谢！

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作者: she    时间: 2011-10-16 15:16

SYBR与FAM的发射光、激发光波长基本一致，因此，做染料法的时候都选择仪器的FAM通道。

从定量扩增曲线看，是没有任何扩增的，全部都是背景的荧光信号。你的实验电泳有目的带，但却收集不到荧光信号值。此时，又不是我以前描述的两种可能，那只能说明，你忘加荧光染料了。确实没有别的可能鸟～
请你自己看一下仪器的设置吧。

yaoshan：你好，我也最近正在准备做real time 呢，看了你帖子的意思是不是说做real time（用syber green）的引物与普通pcr有区别，是否有专门的设计方法，弱弱的问题！

定量引物与普通PCR引物设计原则合成级别都是不一样的，定量引物的设计充分考虑了快速升降温的反应条件，因此在某些非特异性反应的控制上，没有普通PCR那么严格，引物的序列也没有普通PCR那么长，这也是为什么不建议大家用普通体系验证定量引物和摸索实验条件的原因。但是定量引物的合成级别高。

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您好，这么说是不是如果定量PCR的引物采用和普通PCR的引物相同的话，也必须是得重新合成一批级别高的？我之前都是拿完全一样的做的，~~~~(>_<)~~~~

还有，多次看您提到扩增效率大于1是说明体系内有抑制物存在，不太明白，抑制物存在不实应该降低扩增效率么？为什么反而大于1呢？

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作者: she    时间: 2011-10-16 15:16

谢谢，回复这个贴不是一般的坚强了，

因为要做的基因有20多个，就该去做microarray的了，所以如果用标曲法实在耗费多，2-△△CT也有它的好处，realtime pcr的结果重要的是看分析，严谨些就可信些！

等候lz的指点！！！

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您好！可否分享一下数据分析处理方面的资料以及经验？非常感谢！

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作者: 森林木    时间: 2011-10-16 15:16

本人做在样品模板中挑了一个来做标准曲线，内参和目的基因各稀释5个梯度，3个复孔，做标准曲线时为了让两个基因的扩增效率基本相等（因100个样品比较多，想用2-DELTDELT法处理数据），各去除了一个梯度，剩4个梯度，并有些复孔去除了。请问发表文章时附4个梯度的图可行吗？上图：请问这两个能不能用这个方法处理数据呢？请指点！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=8758

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作者: 小米虫子    时间: 2011-10-16 15:17

我做qRT-PCR，2个对照的目的基因，在PCR这一步时，我将目的1加的2ul。目的2加的0.5ul。我每管反应体系是20ul。 上下游 引物均是10um 0.8ul，我跑出的溶解曲线 有的峰很粗大 ， 还有的有许多小峰 ，并且峰还比较高 ， 也有内参 的溶解曲线的峰很好的 ， 在一个孔板中 ， 是什么原因 导致呢 ？

1. 是我cDNA加的 不均匀吗？

2. 我的引物 浓度高咯？ 或者没混匀？

3.我之前的引物 在内参 和样本中 都跑出来过 ， 而且峰还不错。

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作者: bring    时间: 2011-10-16 15:18

我是新人 想请教各位前辈 Tapman探针 与 SYBR染料 做的时候有哪些区别？

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作者: bring    时间: 2011-10-16 15:18

我是新人 想请教各位前辈 Tapman探针 与 SYBR染料 做的时候有哪些区别？

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作者: 紫烟    时间: 2011-10-16 15:19

麻烦请教一下，我做相对定量，目的基因的扩增曲线上升缓慢，是怎么回事，CT值28左右 要到70几个循环才能达到荧光平台期，还有 我有些基因的引物，开始做没有二聚体，做了一段时间后就有二聚体了 是怎么回事，麻烦大家帮忙分析下，谢谢！！

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作者: 二丫头466    时间: 2011-10-16 15:24

1.由于可能我所研究的目的基因在样本的表达量低的原因，我按试剂盒上的反应体系40个循环反应后，部分样本无扩增，想改成45个循环试试看，这样是否可行？如果可以，那所加的荧光燃料和引物是否需要加量?

2.如果我的CT值为35~45之间，结合溶解曲线及定量PCR产物电泳，分析得到产物是目的片段，无非特异性或引物二聚体，那这么大的CT值是否能用，因为听别人说的都是小于35的才能用。

谢谢解答！  

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作者: 金丝猴    时间: 2011-10-16 15:25

.将total RNA的浓度调至统一的起始量.怎么调啊。。不好调啊。。  

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作者: 韩梅梅    时间: 2011-10-16 15:26

将total RNA的浓度调至统一的起始量.怎么调啊。。不好调啊。。

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可以用紫外分光光度计测A260然后计算RNA浓度，再调整，公式能搜到的

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作者: 131415    时间: 2011-10-16 15:26

可以用紫外分光光度计测A260然后计算RNA浓度，再调整，公式能搜到的

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我们这边有台机器可以直接测出来浓度。。我的意思就是那些浓度都不是整数不好调啊。。。只围观师兄做过一次。。不知道他怎么算的。。

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作者: wu11998866    时间: 2011-10-16 15:30

大侠你好，我想用RT-PCR来测定转基因老鼠的转基因拷贝数，首先需要把带有转基因的质粒稀释到老鼠DNA中作标准曲线， 想问大家的是，如果只有1个COPY的话，RT-PCR能测出来么，因为只有1个COPY的话，要很晚才会出扩增出来的吧？难道要增加“循环数”？ 我做了1COPY的试验，根本就没有扩增出来啊，请问应该怎么做阿？有什么意见么？叩谢了：）

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作者: tieshazhang    时间: 2011-10-16 15:30

我做的是相对定量，提出总RNA后，就测OD值及浓度，然后反转录加RNA的量为2ug，可是等上机器做RT-PCR的说话出现了CT值相差很大的的结果，这是什么原因造成的啊，管家基因的Ct值和目的基因的Ct值在哪个范围好啊？

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-16 15:31

我想用RT-PCR来测定转基因老鼠的转基因拷贝数，首先需要把带有转基因的质粒稀释到老鼠DNA中作标准曲线， 想问大家的是，如果只有1个COPY的话，RT-PCR能测出来么，因为只有1个COPY的话，要很晚才会出扩增出来的吧？难道要增加“循环数”？ 我做了1COPY的试验，根本就没有扩增出来啊，请问应该怎么做阿？有什么意见么？叩谢了：）

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这位童鞋，一个拷贝的时候有取样误差和反应体系性能2方面的影响。
假设你取5ul样品有单拷贝的话，那只是理论值，实际上有泊松分布的问题：实际每次取5ul时，既有可能一个拷贝都没有，也可能一次2个或更多拷贝，只不过每次单拷贝的可能性是最大而已。
反应体系要自己优化了。

还有，用qPCR吧，RT-PCR会误会的，看起来不舒服

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作者: nut6694    时间: 2011-10-16 15:31

1.由于可能我所研究的目的基因在样本的表达量低的原因，我按试剂盒上的反应体系40个循环反应后，部分样本无扩增，想改成45个循环试试看，这样是否可行？如果可以，那所加的荧光燃料和引物是否需要加量?

2.如果我的CT值为35~45之间，结合溶解曲线及定量PCR产物电泳，分析得到产物是目的片段，无非特异性或引物二聚体，那这么大的CT值是否能用，因为听别人说的都是小于35的才能用。

谢谢解答！
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你扩增的是目的片段而不是非特异性扩增，那么这个数据时可用的，如果想让CT值变的好看点，可以先不采集荧光跑上10个循环，再采集荧光跑上40个循环，这样CT值会在35个循环之前出现。
还有个建议，其实不需要完全按照试剂盒说明书做的，稍微可以有变通的，可以通过增加模板量或调整实验温度等达到目的。

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作者: @STAR@    时间: 2011-10-16 15:32

用2-ΔΔCT的方法做出来图表了，然后怎么在组与组之间进行对比？用什么统计学方法？是统计2-ΔΔCT之后的数据还是原始数据？

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作者: flower@@    时间: 2011-10-16 15:33

求助：

我做RNAi，未处理、单药组、siRNA组、siRNA+药组目的基因的表达是依次下降（经过内参校正），扩增曲线良好，但融解曲线有一个很高主峰+一个小双峰。产物跑胶时发现目标基因条带位置正确且很光亮，但其上方有一条很淡的非特异性条带，内参融解曲线和跑胶条带都很好。重复三次，结果一样。后让公司重新设计引物，再进行实验。可是，用了新的引物，得到的结果却与之前大相径庭，处理组比对照组基因表达不但不降反而还上升了！。。。请教高手，我该怎么办？是引物的问题还是要重新设计siRNA?  

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作者: fangxiang    时间: 2011-10-16 15:34

我目前还是菜鸟 请高手帮忙看图分析下哈 分别是扩增曲线 溶解曲线 目的片段是内参基因 GAPDH 500bp左右（我老板设计的 我也纳闷为什么这么大）做了五个温度梯度 每个梯度做了两管平行 下面的图只是其中一组平行管 两管条件完全相同 为什么扩增曲线和溶解曲线不同呢？另外的四组平行管也是同样情况 另外 更重要的是 溶解曲线峰出现之前 应该是比较平坦的线吧 为什么我的有渐渐升高的趋势呢？ 怎样调整才能把溶解曲线做的更标准呢？



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作者: 3N4G    时间: 2011-10-16 15:37

Tm值的定义是DNA的双链解开一半时的温度.SYBR是嵌合在双链里的荧光,制作溶解温度曲线正是利用了这二点.

第一步: 95度高温迅速降到60度或者更低,是为了能让PCR产物双链比较稳定的存在,相当于一个溶解温度曲线制作的准备过程.
第二步:60度缓慢升温到95度,是为了让仪器每个几秒钟就进行一次荧光信号值的检出,双链持续的打开,当解开到一半的时候,荧光信号值达到最大,然后,继续解链,开始降低,直至最后.

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那请问为什么是双链解到一半的时候，荧光信号最大啊？不应该是SYBR GREEN与双链DNA结合，双链未解时荧光信号最大？随着解链，荧光信号强度越来越小吧?我理解的不对吗？？？

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作者: INK    时间: 2011-10-16 15:37

在做到标准曲线的时候，发现稀释了100倍和稀释了10000的模板所扩增的CT值差不多，体系用的SYBGREEN，以为是某个试剂被污染的问题。后来用水做模板，希望能够扩增出阴性，但是也有扩增曲线，CT值在5-30不定，primer和mix都换用新的，操作很小心，只是没有在超净工作台做了，同样的都是阳性，并且有个孔只加水和MIX，也有斜行抬高的斜线，简直不知道是什么原因，不知道怎么解决！在此请教！

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作者: dreaming    时间: 2011-10-16 15:39

请教诸位大虾：

1、qPCR为何实验重复性那么差，尽管操作步骤及程序均一样，但每次结果大不相同，怎样才能得到好的稳定结果？

2、与内参比较SQmean值是正确的吗？得出的是绝对数值还是相对数值？

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作者: 小蜜蜂    时间: 2011-10-16 15:40

老师您好，我现在正在做qRT-PCR，提了几次RNA效果都不理想，OD260/OD280比值总在1.5到1.7之间。请问这个问题有哪些地方要注意呢？谢谢！  

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作者: loli    时间: 2011-10-16 15:40

请问，ABI 7500 荧光定量PCR仪 可以做 高分辨率溶解曲线 吗？

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作者: 微笑的海豚    时间: 2011-10-16 15:41

那请问为什么是双链解到一半的时候，荧光信号最大啊？不应该是SYBR GREEN与双链DNA结合，双链未解时荧光信号最大？随着解链，荧光信号强度越来越小吧?我理解的不对吗？？？请教yaoshan

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个人理解，溶解曲线的纵坐标应该是荧光的变化率，所以应该是一开始全部为双链时荧光信号最强，而当温度到达Tm值时，PCR产物开始明显的变性致使荧光信号快速降低，荧光变化率最大，所以在溶解曲线的纵坐标上会出现最大值（峰值）。  

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-16 15:41

RNA的 OD值还受其他因素影响，比如提取试剂，样品类型。能用的RNA就是好的RNA，OD值参考指标。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-16 15:44

熔解曲线的纵坐标一般是-dF/dT,即熔解曲线斜率取负数后作为纵坐标，软件里一般都有注明的，自己再看看去。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-16 15:44

7500 fast（不是7500）号称可以，实际上很怀疑。

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作者: 潇湘子    时间: 2011-10-16 15:45

1、qPCR为何实验重复性那么差，尽管操作步骤及程序均一样，但每次结果大不相同，怎样才能得到好的稳定结果？
这个影响因素太多了，仪器、样品中待测基因浓度、试剂、操作、程序设置都有可能，建议是和师兄师姐或者隔壁实验室的兄弟们讨论一下。
2、与内参比较SQmean值是正确的吗？得出的是绝对数值还是相对数值？
没有绝对正确的数值，只有可以接受的数值。不过你的SQ不清楚是什么东西，貌似软件给出的Ct值？

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作者: 阳光树    时间: 2011-10-16 15:45

尊敬的各位战友、潇湘子 老师您好！

我们实验室现在用的是外标法定量，就是外部标准曲线法，既五个已知浓度的含有目标序列的质粒做标准线，单色检测。 我初次接触荧光定量PCR（RT-QPCR），有几个关于绝对定量的问题想请教下大家：

1. 绝对定量有几种方法？

2. 什么是探针法定量（本帖第三楼说的方法）？

3. 什么是内标定量？使用标准品和内对照进行绝对定量（双色检测）。

老师要我查找内标定量的文献，优点什么的，我还搞不懂什么是内标定量，望各位不啬赐教。

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-16 15:46

在做到标准曲线的时候，发现稀释了100倍和稀释了10000的模板所扩增的CT值差不多，体系用的SYBGREEN，以为是某个试剂被污染的问题。后来用水做模板，希望能够扩增出阴性，但是也有扩增曲线，CT值在5-30不定，primer和mix都换用新的，操作很小心，只是没有在超净工作台做了，同样的都是阳性，并且有个孔只加水和MIX，也有斜行抬高的斜线，简直不知道是什么原因，不知道怎么解决！在此请教！

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首先想确认下：100倍稀释和10000倍稀释后获得的Ct值是多少？如果在30cycle以上，那么可能因为基因丰度低而不适合做10倍的倍比稀释，可以试试5倍稀释。另外，稀释的准确性也很重要，而且要选择连续的梯度稀释。

其次，如果用水作为模板即NTC的阴性对照实验，出现扩增曲线的话，是否出现了融解曲线？如果有融解曲线，看下对应的温度，如果是在70-78℃范围内，那么基本上是引物二聚体；如果在78℃以上，那么基本可以判断是模板污染造成的。

再次，要根据仪器看结果，因为仪器设置基线和阈值的不同，所获得的Ct值就是不同的。

最后，建议电泳检测下PCR扩增产物，确认下是否有条带。

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作者: 阿拉蕾    时间: 2011-10-16 15:46

从当前的结果来看，似乎没有扩增。

定量实验是染料法的吗？如果是染料法的，那么对应看一下融解曲线，如果有起峰，对应Tm值在78℃以上，那么是有产物的，只是基因丰度偏低，建议增加模板加量；如果没有起峰，那么可以确认是没有扩增产物的。

如果是探针法，首先电泳确认是否有产物，如果有产物，那么引物正常，确认探针是否降解或者结合的特异性不够好。

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作者: 韩梅梅    时间: 2011-10-16 15:48

为什么管家基因要和目的基因的反应相同呢？我看到文献上说的是：用62度扩增看家基因，而后用65度扩增目的基因，这又怎么解释呢？
还有个问题：用SYbr时，是看家和目的各一个管，然后放进机器里反应；如果用两种不同的探针反应，看家和目的依旧是各一个管，还是放在同一个管中？

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1、因为管家基因是用来校正目的基因的，这样不同样本间的目的基因间才有数据上的可比性。所以，管家基因和目的基因必须用同样的条件和同样的体系及同样的模板来源来扩增。

而你所说的文献，不知可否写出文章名称和出处？

2、如果采用两种标记的探针分别扩增目的基因和内参基因，一般也会选择分别各一管进行反应，因为如果两个基因的引物和探针放在同一管中进行反应时，两个基因间针对同一模板会有竞争抑制，那么内参的校正意义就不强了。所以，如果只是做相对定量，那么当前会首选染料法，如果目的基因引物特异性确实不好，就选择探针法。选择探针法时，也不必标记不同的荧光标记。

通常做多重PCR时，才会选择在同一管中标记不同荧光染料进行扩增。

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作者: 韩梅梅    时间: 2011-10-16 15:48

老师，我要收集外周血的肿瘤细胞做realtime-pcr（相对定量），比较基因的表达差异，但流式分选的外周血中的肿瘤细胞太少，只有几百个，我打算比较3个样本9个基因的表达差异。打算用微量rna提取试剂盒去提取它，不知道rna的量够不够用，还需要去测od值吗？（9个基因+1个内参）x 3个样本 x 做3个副孔=90个孔，像这种情况是用一步法还是两步法的qrt-pcr去做啊？一步法的引物就是和两步法的引物是一样的吗？如何摸实时定量的条件啊？我用sybr-green的染料。谢谢。新年快乐！

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外周血的肿瘤细胞我没有提取过RNA，不知道具体情况如何。如果你已经作成功了，贴些经验出来吧。

如果做相对定量，还是选择两步法比较好。至少可以避免反转录效率不同，PCR扩增时选择同样的模板。

一步法时，会选择下游特异性引物做RT反应，即一步法的RT-PCR时，反应体系中只添加上下游特异性引物；

两步法时，可以选择通用的Oligo dT或random Primer进行反转录所有的基因，然后在PCR反应时分别添加各自的上下游特异性引物进行扩增。

实时定量的条件一般可以先按照所选择试剂推荐的条件来做，通常效果还好；如果有异常，也可以根据试剂的说明书进行调整。

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作者: 韩梅梅    时间: 2011-10-16 15:48

我们这边有台机器可以直接测出来浓度。。我的意思就是那些浓度都不是整数不好调啊。。。只围观师兄做过一次。。不知道他怎么算的。。

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一般情况下，测定获得的浓度都不是整数。我们通常会计算好浓度之后，将其稀释到200ng/ul。

所以你也可以这样来操作。然后保证RT时RNA的加量是相同的。

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作者: 韩梅梅    时间: 2011-10-16 15:49

您好！首先感谢您默默的 回答这么多问题，受益匪浅！

我没明白为什么溶解曲线制作过程中当解开到一半的时候,荧光信号值达到最大，为什么呢？

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利用下午和晚上的时间把这个精华帖从头到尾看了一遍，真的收获不少！非常感谢楼主以及其余几位无私奉献的同志！谨在此向你们致敬！看完以后明白了为什么当解开到一半的时候溶解曲线出现峰值了。非常感谢，但是还是没明白为什么抑制物的存在会导致效率大于100%，还请楼主及各位高人指点小弟！

对于我的求助帖cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/topic/19549944?tpg=1&age=0')中提到的问题，我读完本帖之后感觉1、重复稀释梯度标准品；2、规范加样操作。希望我能做出来更好一些的！如果各位有什么建议或是发现什么问题，敬请明示，不胜感激！

谢谢！

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1、溶解曲线制作过程中当解开到一半的时候，并不是荧光信号值达到最大，而是荧光信号的变化率。你所看到的是一次微分后的融解曲线结果。而原始的融解曲线是随着60℃起始升高温度的过程，双链缓慢解链，嵌入在DNA双链中的SYBR Green I数量减少，荧光信号强度逐渐降低，当温度达到Tm值时，荧光信号值骤然降低，而此时的荧光信号的变化率是最大的，即对应一次微分结果的峰值。

2、当模板中有抑制物存在时，浓度高的模板抑制物浓度也高，会抑制PCR扩增，这样获得的Ct值就会比理论上偏大，而随着稀释梯度增大，后几个梯度的PCR扩增结果会趋于正常，这样获得的标准曲线的斜率的绝对值就会偏小（横坐标是Ct时），这样计算出来的扩增效率（E）就会大于100％。

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作者: 长发piaopiao    时间: 2011-10-16 15:49

实时定量做了溶解曲线，产物用来跑琼脂糖凝胶，是否还会出现目的条带？目的条带是否已在实时定量做溶解曲线时已经完全打开溶解了？

我要扩增3个基因ABC，每个基因的目的条带均是200bp，今天做了实时定量，还做了溶解曲线，我把产物用来跑琼脂糖凝胶，结果是：内参A的4个样品均存在200bp大小的片段，同时存在拖尾，另外两个基因没有200bp大小条带，只存在拖尾。请问这可能是什么原因。

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作者: 少林弟子    时间: 2011-10-16 15:49

请教大家：
我刚开始做荧光定量，染料用的SYBR green1，溶解曲线actin的很好，但是目的基因峰很小或没有，引物原来在别的组织上也跑过，峰值也很好，这次只是换了另外的组织，这是怎么回事。

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作者: duoduo    时间: 2011-10-16 15:50

大家好
刚开始做real-time pcr什么都不懂 一头雾水

想请教几个问题 非常感谢

1 我想用taqman探针 real-time pcr 做绝对定量 ，我看好多地方都说产物要在50-150bp, 我的一个产物是273bp，我想问这个能行吗，对定量影响大吗？

2 我用的仪器是ABI step one plus，设计的两个探针是HEX-BHQ ，和FAM-BHQ, 但仪器通道里没有相应的，所以我该选VIC-NONE和 FAM-NONE ,还是VIC-TAMRA，FAM-TAMRA呢？

为什么ABI的仪器猝灭就只有TAMRA、NONE、MGB三种呢？难道设计到专利问题吗？

3 我的扩增曲线
是两个体系分别扩增的，但最终是想把两个放在同一管中做一个双重实时定量PCR的

4 rox内参的问题
我用的ABI step one 的仪器 ，但我给工程师打电话他说用rox的话曲线会很差，不推荐用。
那这个要用吗？

体系1

[ 本帖最后由 duoduo 于 2011-10-16 15:51 编辑 ]

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作者: duoduo    时间: 2011-10-16 15:51

我想问下扩增曲线到底是看Rn 还是德尔塔Rn的；
我这个是不是荧光信号太低，还是扩增效率太低？ （随后跑胶条带很弱）
我这个VIC的信号都是在ROX的下面

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作者: duoduo    时间: 2011-10-16 15:52

接着上面的 这是体系2的

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