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标题: 【求助】因为想做LncRNA，所以需要克隆cDNA全长，... [打印本页]

作者: ending 时间: 2016-2-9 21:35 标题: 【求助】因为想做LncRNA，所以需要克隆cDNA全长，...

我的做法就是提取细胞株的RNA，用takara一步逆转录试剂盒逆转录。然后用自己设计的引物PCR，PCR产物条带杂带很多，原因可能是因为LNCRNA存在polyA尾，有连续5个A，而我又需要克隆全长，引物基本没有什么选择的余地，导致引物比较差。但是最亮的条带大小是对的。然后接下来的步骤就是常规的割胶，酶切，连接。转化。。。可是测序结果送回来之后blast一下完全不对。
原因目前我分析可能是由于takara这种普通的一步逆转录试剂盒很难逆转录cDNA全长。特别是容易在5’段或者3‘段出现丢失或者错误。所以我克隆编码蛋白的基因的CDS基本不会失败，但是要克隆这种cDNA全长可能就存在难度。
解决办法目前我准备采用takara的3’RACE试剂盒进行尝试。据说可以逆转录出cDNA全长。
请问各位高手有没有什么经验或者意见？或者用过3‘RACE，效果如何？

作者: jiushikeshui371 时间: 2016-2-9 21:35

你进展咋样了？我是lncRNA新手，碰到和你一样的问题了

作者: milkdog 时间: 2016-2-9 21:35

那你可以选择不要polyA尾巴啊你是做表达载体不要尾巴也行的（个人意见）

作者: seagate 时间: 2016-2-9 21:36

我也是，做了梯度都没有扩增出来。郁闷。看文献说是用RACE5或3能够得到全长。

作者: seagate 时间: 2016-2-9 21:36

有没有找lncRNA全长的方法呀！我只知道lncRNA中的一个转录本，全长怎么搜？并且转录本还没有NCBI中的accession。怎么办？难呀！

作者: 月牙牙 时间: 2016-2-9 21:38

我的做法就是提取细胞株的RNA，用takara一步逆转录试剂盒逆转录。然后用自己设计的引物PCR，PCR产物条带杂带很多，原因可能是因为LNCRNA存在polyA尾，有连续5个A，而我又需要克隆全长，引物基本没有什么选择的余地，导致引物比较差。但是最亮的条带大小是对的。然后接下来的步骤就是常规的割胶，酶切，连接。转化。。。可是测序结果送回来之后blast一下完全不对。
原因目前我分析可能是由于takara这种普通的一步逆转录试剂盒很难逆转录cDNA全长。特别是容易在5’段或者3‘段出现丢失或者错误。所以我克隆编码蛋白的基因的CDS基本不会失败，但是要克隆这种cDNA全长可能就存在难度。
解决办法目前我准备采用takara的3’RACE试剂盒进行尝试。据说可以逆转录出cDNA全长。
请问各位高手有没有什么经验或者意见？或者用过3‘RACE，效果如何？
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好像clontech的race试剂盒比较厉害~
目前也在做LncRNA 的研究，看来你显然比我厉害多了已经做到RACE了，真是羡慕哇~
不过我也有点不明白的地方，做了RACE之后得到了cDNA的全长，你接下去计划怎么研究呢？如何得到DNA全长呢？或者做RACE的最终目的是什么？

作者: 西子 时间: 2016-2-9 21:38

我的做法就是提取细胞株的RNA，用takara一步逆转录试剂盒逆转录。然后用自己设计的引物PCR，PCR产物条带杂带很多，原因可能是因为LNCRNA存在polyA尾，有连续5个A，而我又需要克隆全长，引物基本没有什么选择的余地，导致引物比较差。但是最亮的条带大小是对的。然后接下来的步骤就是常规的割胶，酶切，连接。转化。。。可是测序结果送回来之后blast一下完全不对。
原因目前我分析可能是由于takara这种普通的一步逆转录试剂盒很难逆转录cDNA全长。特别是容易在5’段或者3‘段出现丢失或者错误。所以我克隆编码蛋白的基因的CDS基本不会失败，但是要克隆这种cDNA全长可能就存在难度。
解决办法目前我准备采用takara的3’RACE试剂盒进行尝试。据说可以逆转录出cDNA全长。
请问各位高手有没有什么经验或者意见？或者用过3‘RACE，效果如何？
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不知道您的问题解决了么？能分享一下做qPCR的流程和注意事项么？我让takara给设计引物，他们说之前没有人做过！谢谢！

作者: ending 时间: 2016-2-9 21:39

QUOTE:

原帖由西子于 2016-2-9 21:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我的做法就是提取细胞株的RNA，用takara一步逆转录试剂盒逆转录。然后用自己设计的引物PCR，PCR产物条带杂带很多，原因可能是因为LNCRNA存在polyA尾，有连续5个A，而我又需要克隆全长，引物基本没有什么选择的余地，导致引物比较差 ...

qPCR引物自己设计就好，最好跨外显子，TM60左右，一般都问题不大

作者: standbyme 时间: 2016-2-9 21:40

定量的引物设计应该是要跨内含子，除非没有内含子。我的问题是克隆lncRNA时，引物只能从两端设计，选择余地没有，所以引物比较难设计。有没有哪位大师有合适的方法？

作者: zhenxin 时间: 2016-2-9 21:40

你好，想问一下我想通过realtimePCR验证lncRNA的差异，应该怎样做

作者: viviwang1987 时间: 2016-2-9 21:41

需要人全长lncRNA克隆可以找上海龙钱生物

作者: fox_79 时间: 2016-2-9 21:41

qPCR引物自己设计就好，最好跨外显子，TM60左右，一般都问题不大

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请问，我现在要设计的lncRNA跨了一个外显子，大小是1986bp，这么长的片段要怎么设计qPCR引物呢？有没有设计qPCR好的软件或建议呢？还有lncRNA的q引物需要特别注意那些因素呢？本人刚刚接触，望大神指点啊

作者: bring 时间: 2016-2-9 21:41

我现在也开始克隆植物lncRNA全长，用的clontech试剂盒，可是更换了引物，体系条件，一直扩不出任何条带，一度怀疑其不含poly(A)，所以先5‘race，也扩不出任何条带。是从师兄荧光定量pcr扩出短片段处设引物，后来也试过别的位置设引物，但是还是没有效果。前辈有好的建议吗？

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