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标题: 【求助】MSP的阳性对照问题 [打印本页]

作者: 铜雀 时间: 2016-2-10 16:44 标题: 【求助】MSP的阳性对照问题

之前都是用细胞的DNA来做BSP的，最近要做MSP，样本是人外周血DNA，阳性对照的问题，有的protocol是要先将人外周血白细胞genomic DNA酶切后用M.SSS1 酶处理得到阳性对照，有的没有酶切直接用M.sss1处理，然后NaHSO3修饰的，我的问题是：
1.到底酶切这步是不是必要的呢？？
2.阳性对照的DNA一定得是白细胞的genomic DNA么？我得理解是只要这段DNA得CpG位点被甲基化后，甲基化得引物能结合扩增就可以了，不知我得理解对不？
之前做BSP，没有酶切，直接用genomic DNA做的，一样是成功的，MSP是不要要求更高，请做过的大侠指点迷津啊，谢谢了^_^

作者: qqshepherd 时间: 2016-2-10 16:44

BSP，MSP是什么啊？

作者: milkdog 时间: 2016-2-10 16:44

酶切应该不是必要的。
脐带血dna好像也可以的。
msp的引物中含有是可能的甲基化的CG岛，如果引物序列对应的dna序列中的CG出现部分甲基化的话，引物是不能结合的，我是这样理解的。
想请问一下，我的msp做完了，正在做bsp，你bsp的上下游引物的TM值相差大吗？

作者: 铜雀 时间: 2016-2-10 16:45

我也考虑到了用血中的DNA会有半甲基化的情况，但是阳性对照用M.sss1处理后，应该是CpG位点都是甲基化了啊，而且我认为阳性对照用来自单克隆的细胞系的genomic DNA比较好吧，单个位点的甲基化情况是确定的，不知这样理解对不对？
BSP的上下游引物的差别用methprimer计算不大，相差大概两度吧，可公司合成的出来的报告的Tm差别很大有5度以上了，最后证明最适退火温度在Methprimer给的Tm值附近。当然你的如果相差太大的话，估计不好括，理论上在最适退火温度时，两个引物应都能和模板结合，差别太大了，可能有影响，不过你可以试试

作者: 101010 时间: 2016-2-10 16:45

细胞系化很麻烦，单克隆的gDNA也不容易获得。
msp的阳性对照好像是有试剂盒出售的。
另外，要谢谢你给我的建议

作者: 铜雀 时间: 2016-2-10 16:45

不客气
细胞株就是来自单克隆得啊，每个细胞得genomic DNA是一样得基因信息

作者: 小游abc 时间: 2016-2-10 16:45

请问哪里有阳性对照试剂盒啊?

作者: quiqui008 时间: 2016-2-10 16:46

我用的是chemicon的阳性对照,货号S7821,2000多块钱,10ug

作者: standbyme 时间: 2016-2-10 16:46

请问基因组的DNA用试剂盒变性会不会不完全，听说用稀有酶切会好一点，稀有酶是指什么酶呢？还有，用SSS1处理时，S－腺苷甲硫氨酸是要单独买吗？在哪个公司买？我刚开始做，请各位多指教！不胜感激

作者: mybioon 时间: 2016-2-10 16:46

酶切不是必要的，用Tip吸吹剪切也可以。
阳性对照的DNA我认为什么都可以，考虑到未甲基化的阳性对照，用健康人白细胞DNA相对最方便。

作者: milkdog 时间: 2016-2-10 16:47

你做的过程顺利吗？亚硫酸氢钠变性是用的哪个公司的什么试剂盒，我买的QIAGEN的，现在还没送过来，不知道效果怎么样？

作者: yes4 时间: 2016-2-10 16:47

也不顺利，刚开始做，现在是第三周，第一次PCR跑电泳阳性对照倒是有目的条带，后来重复了三次都没有。现在正一步步排除问题，感觉DNA纯化过程中DNA丢失很厉害，第一次做时用的是MN的，最近用的是天为时代的，修饰完后不进行PCR，直接跑电泳，看不到条带。我也没有糖原，没办法示踪。我是手工做的，没用试剂盒，据说Chemicon的不错，我也了解过QIAGEN的，有个新产品用来做修饰加纯化的，时间只需6小时，应该不错。你买的是那个吗？开始使用后如果结果不错，请告知我，一起交流。

作者: sunbent 时间: 2016-2-10 16:47

我的试剂盒到了，但是PCR拿出来跑胶，一片空白，不知道哪个地方出了问题，是不是模板太少了，用QIAGEN的试剂盒变性，拿出来测纯度怎么是3.6217阿，我的PCR反应体系：sense primer 1ul
antisense primer 1ul
dna 100ng
buffer 5ul
dNTP 5ul
hotstar(2.5u/ul) 1ul
ddH2O 27ul
请帮忙看一下，有没有问题？谢谢

作者: october7 时间: 2016-2-10 16:48

楼上90%的可能性是模板量过大,减少模板试试,如果还不行就可能是引物的问题了

作者: wzqzy 时间: 2016-2-10 16:48

我用的QIAGEN的变性的试剂盒，效果还可以，跑出了阳性条带，但是正常对照怎么也有条带阿，还有几条非特异性条带，还得摸下条件

作者: xevin 时间: 2016-2-10 16:48

我现在做BSP，我设计的引物都要放2轮才能看到条带，我是用PerlPrimer设计的，我不知道是不是引物设计上有问题还是模板损失太厉害，我的引物TM相差2度（软件给的），我是手工修饰的。

作者: birdfish 时间: 2016-2-10 16:49

我的试剂盒到了，但是PCR拿出来跑胶，一片空白，不知道哪个地方出了问题，是不是模板太少了，用QIAGEN的试剂盒变性，拿出来测纯度怎么是3.6217阿，我的PCR反应体系：sense primer 1ul
antisense primer 1ul
dna 100ng
buffer 5ul
dNTP 5ul
hotstar(2.5u/ul) 1ul
ddH2O 27ul
请帮忙看一下，有没有问题？谢谢
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亲，后来你的体系怎么改啦？我现在做出来和你这个一样，能请教一下么？

作者: yysr238 时间: 2016-2-10 16:49

请教一下，您是怎么做阴性对照的呢？

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