分析测试百科

标题: 【求助】如何扩增启动子序列 [打印本页]

作者: @STAR@ 时间: 2016-2-10 17:30 标题: 【求助】如何扩增启动子序列

我的实验中需要用PCR法扩增一段启动子序列，该段序列包含很多顺式作用元件，GC含量很高，达75%以上。
努力了一个多月，未得到任何扩增产物（假阳性都没有），唉~~~~~~怎一个郁闷了得。
我已做了以下工作：
1. Taq酶：最初用的是高保真酶，没结果，有位博士指点：高保真酶效率低，且贵，建议用普通Taq酶摸索条件；改用Taq酶仍没结果；现在用的是宝生物的LA Taq(因其含有GC Buffer)仍……
2. 引物：引物是自己根据文献报道的DNA序列用DNAstar设计的（文献中没有现成的引物）。开始用的是上海生工合成的，没结果，后来因对该段序列不满意，重新设计了引物，上海申能博彩合成的，还是……
3. Mg2+浓度：设定了各种梯度，结果同上。
4. 模板：有一位高手（博士）帮我重新抽提的大鼠基因组DNA，并经反复纯化，应该没问题吧。可是PCR有问题。PCR前我还把模板作了变性处理——100℃10min然后冰浴。结果同上。
5. 我还使用矿物油、DMSO、GC Buffer，结果同上。
6. 反应条件：变性温度——94℃、95℃，时间——30sec、45sec、60sec
复性温度——55℃、52℃、50℃、48℃、60℃，时间——30sec、45sec、60sec
延伸温度——72℃，时间——1min、2min

作者: @STAR@ 时间: 2016-2-10 17:31

本人考虑失败原因可能是目的片断GC含量太高所致，想把扩增的片断向下游或两侧延伸，使GC含量降下来，然后把扩增出来的片断（如果能的话）用核酸内切酶酶切，不知是否可行?
另外，我怀疑启动子序列因其结构复杂，如设计引物时不易避开二级机构区等，导致其不可能用PCR法进行扩增。如果真是这样我就不要再做无用功了。如果有哪位战友曾扩增过启动子，请回个帖，给兄弟一点指点和信心。
再没有进展，毕业就成问题了，请各位走过路过的朋友都谈谈，给点建议，帮兄弟一把，谢谢了先。

作者: baidukk 时间: 2016-2-10 17:31

你确定基因组DNA是好的吗？最好用另外无关的引物作一下阳性对照。另外，如果你要做下一步的工作，应该预留酶切位点吧。

作者: @STAR@ 时间: 2016-2-10 17:31

我也考虑过阳性对照的问题，但不知如何设计，能给一点具体的方案吗？
酶切位点在设计引物时已经预留了。
其他还有什么建议，也请谈谈。
非常感谢！

作者: ha111 时间: 2016-2-10 17:32

既然GC含量这么高，为什么不试一下某公司推荐的专门用于扩增高GC含量的TAQ酶和buffer?

作者: zhenxin 时间: 2016-2-10 17:32

完全理解兄弟你的郁闷，我最近刚作了6个基因的2KB的启动子PCR，如你所言，刚开始一个多星期非常之郁闷，可是目前结果已经全P出来了，一点经验，希望对你有用！
1。Taq酶就普通的即可，首先你要做的是跑个温度剃度，范围可以大一些，我们一般是16个的一起跑，8个一排，其中4个不加任何添加剂，另4个间隔加DMSO（8%），第二排4个加甘油，还有4个加甲酰胺（浓度为4%）
2。一般情况下上面是有1个可以做出来的，如果不行，可以用降落PCR，从70度开始，每个cycle降落0.5度，做18个cycles，最后用你的退火温度18个循环，辅助试剂都要加的
good luck
注：我跑的GC达到76%

作者: BUK 时间: 2016-2-10 17:32

不知你的引物设计如何。
我曾p过启动子。
引物比一般引物长，35个bp。
就用普通PCR的方法，不过结果p出的条带较弱。

作者: vcve 时间: 2016-2-10 17:33

这个问题的原因很复杂,我也不是十分清楚,给你个E-mail,你可以依照这个E-mail地址与此人试着联系一下,或许他可以帮你分析分析,但是成功的把握有多大,偶实在不敢说,此人经验比较丰富,博士课题做的也是关于promotor.从我自己的感觉,连假阳性也没有的话,也许其中的问题很大,但是具体的我又说不上来,你咨询咨询他吧~~~~~

作者: wanglaoshi 时间: 2016-2-10 17:33

我也要从人的genomic DNA中扩一段promoter序列，做了两个多月了，变换了各种条件，收获的只有二聚体，痛苦！
不知现在做得怎么样了？谈谈你的体会和经验，多谢先

作者: bring 时间: 2016-2-10 17:33

请问做出来了吗？有什么心得体会？跟大家讲授讲授

作者: bring 时间: 2016-2-10 17:34

我最近用PCR法扩增了一段启动子序列，谈点体会供参考
1）采用多重PCR
2）用了LA酶或KOD-PLUS
3）8%DMSO+5%甘油
4）基因组DNA的加入量：1-10ng

作者: wzqzy 时间: 2016-2-10 17:35

我现在正在做Streptococcus gordonii（戈登链球菌）rgg/IgG启动子的PCR，我设计的引物为：
上游（F）： 5'-CGCGGATCCTTTTATTGACGGAGATTAGC-3'
下游（R）： 5'-CGCCTCGAGATTGGTCACTTGATTAGC-3'
其中能与模板连接的部分是CTTTTATTGACGGAGATTAGC和ATTGGTCACTTGATTAGC，其余的部分是酶切位点和保护碱基。
从NCBI找的这段基因的序列见附件。
请问我的引物对扩增这个启动子是否合适？我的扩增程序应该怎么设计？
因为我用退火温度60℃和58℃一直没有P出来。

作者: @STAR@ 时间: 2016-2-10 17:35

一直忙着做实验，现在很少来园子里了。今天是准备给老板发E-mail,在收件箱里看到回复通知,才知道还有战友在观注这个贴子.那么我就汇报一下我的结果.
我现在已经得到了大小相符的条带,但条带很淡,回收后量太少,没法直接测序鉴定.准备用T-载体连接,大肠杆菌扩增后测序,但是目前实验室T-载体出了问题,大家都连不上去,已经订了新的T-载体,就快到货了.
我用的是LA酶和配套的GC buffer.
反应条件：变性温度——94℃(首次为95℃），时间——1min
退火温度——56℃(比引物的退火温度低10℃)，时间——1min
延伸温度——72℃，时间——2min
上下游引物长度分别为30和29bp
根据上述反应条件进行实验时，结果并不稳定，多数情况下没有条带或条带太淡，没法回收，十次实验能得到较亮的可以回收条带的次数不超过两次。可能反应条件还需要近一步优化。
体会是PCR反应太不确切，付出极大努力，回报却很难令人满意。我已近乎绝望。以后做实验能不做PCR则绝不做PCR。
祝苦海中的兄弟们好运。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)