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标题: 【求助】PNPG法测a-葡萄糖苷酶活性实验 [打印本页]

作者: 66+77 时间: 2016-2-10 20:47 标题: 【求助】PNPG法测a-葡萄糖苷酶活性实验

最近在用酶标仪做a-葡萄糖苷酶抑制剂的研究，选用的方法是PNPG法。实验方法和原理本来应该很简单，但是将酶和底物先后加入96孔板反应30min后，最后加入0.2M Na2CO3 ，溶液没有显示明显的黄色，而且酶标仪测的OD值很小（不超过0.2），我用的酶浓度最大的有20U/ml，底物也是20mmol/L。这是为什么呢？另外，还有一个问题想要请教一下。我买的酶标签上写着250IU，2.9mg，111U/mg，含79%蛋白这几个主要参数，是不是有用的信息只有那个250IU呢？也就是说，我要是直接往该瓶冻干粉中加入2ml酶浓度就变成125U/ml了呢？多谢各位啦！！！

作者: seagate 时间: 2016-2-10 20:48

我也做这个酶，是做固定化。我觉得应该是这个酶活性在自然环境中损失很快，直观反映就是需要时间延长。我做固载的时候也是这样，甚至放置3d后才有黄色。对于这种酶活易损失的酶，楼主一开始分装的时候就应该直接往瓶子里加缓冲液，倒至离心管（或其他容器）里，稀释至所需浓度（一般按U表示），-20℃冷冻。要用的时候可以放到烘箱里（50℃左右）冻融，一有全部融化赶紧用，这样才能保证酶活损失最小。其他的酶活损失就不是人为所能及的了。至于瓶子上所标示的我个人觉得也只有250U能用吧~

作者: seagate 时间: 2016-2-10 20:49

还有，底物水解产生的产物NPG只有在碱性条件下才能显色，最后加碳酸钠一是停止反应，二是将体系调为碱性。楼主所加的0.2M貌似不给力啊，试试1M的，我是这么做的。

作者: 66+77 时间: 2016-2-10 20:49

昨晚上放在37度恒温箱放了一夜，结果变成淡黄色的了，OD值也升高了，但是最高的也就0.3左右。这是为什么呢？难道是酶活不行？恳请各位有谁知道这是神马情况啊？快被折磨疯了！金币可以给更多的哈！

作者: 66+77 时间: 2016-2-10 20:50

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我也做这个酶，是做固定化。我觉得应该是这个酶活性在自然环境中损失很快，直观反映就是需要时间延长。我做固载的时候也是这样，甚至放置3d后才有黄色。对于这种酶活易损失的酶，楼主一开始分装的时候就应该直接往瓶子里加缓 ...

太感谢啦！感动啊终于有肯定的答复了。确实是呢，有的要放2-3天才有黄色。看来我还要再买一批酶，然后按照你的方法分装一下。请问除了这种方法外，还有没有别的比较好的可以体外抑制a-葡萄糖苷酶的模型呢？我还要做那个蔗糖和酶反应后，用血糖试剂盒测OD值的方法，但是貌似也得用到这个葡萄糖苷酶，晕啊！

作者: 66+77 时间: 2016-2-10 20:50

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还有，底物水解产生的产物NPG只有在碱性条件下才能显色，最后加碳酸钠一是停止反应，二是将体系调为碱性。楼主所加的0.2M貌似不给力啊，试试1M的，我是这么做的。 ...

嗯哪，多谢啦！最近也在买试剂盒想用葡萄糖氧化酶法测，希望有好的结果。

作者: seagate 时间: 2016-2-10 20:50

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太感谢啦！感动啊终于有肯定的答复了。确实是呢，有的要放2-3天才有黄色。看来我还要再买一批酶，然后按照你的方法分装一下。请问除了这种方法外，还有没有别的比较好的可以体外抑制a-葡萄糖苷酶的模型呢？我还要做那个蔗糖和 ...

还有一种测糖苷酶的方法就是和葡萄糖氧化酶联用，记得Talanta上发了一篇，具体没印象了，肯定是看过，你查查吧。但貌似不如这个方法来的容易，并且两种酶的话引入的影响因素更多，不好控制。现在做α酶的少，β的多就是因为这个原因吧。

作者: 66+77 时间: 2016-2-10 20:51

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还有一种测糖苷酶的方法就是和葡萄糖氧化酶联用，记得Talanta上发了一篇，具体没印象了，肯定是看过，你查查吧。但貌似不如这个方法来的容易，并且两种酶的话引入的影响因素更多，不好控制。现在做α酶的少，β的多就是因为这个原 ...

嗯哪，多谢啦！最近也在买试剂盒想用葡萄糖氧化酶法测，希望有好的结果。

作者: seagate 时间: 2016-2-10 20:51

嗯哪，多谢啦！最近也在买试剂盒想用葡萄糖氧化酶法测，希望有好的结果。...

作者: seagate 时间: 2016-2-10 20:51

后面要做的第一个实验就是动力学参数测定，有次可以得出酶底比，楼主加油吧，这个酶的确不好做。

作者: 2541 时间: 2016-2-10 20:52

我也准备做这个模型，楼主方法能不能给俺分享下啊，不胜感激

作者: seagate 时间: 2016-2-10 20:52

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我也准备做这个模型，楼主方法能不能给俺分享下啊，不胜感激

Food Chem. Investigation of α-glucosidase inhibitory activity of wheat bran and germ 里面有具体的方法，不过是用酶标仪做的，方法都一样，量不同而已，可以参考下。

作者: seagate 时间: 2016-2-10 20:52

嗯哪，多谢啦！最近也在买试剂盒想用葡萄糖氧化酶法测，希望有好的结果。...

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后面要做的第一个实验就是动力学参数测定，有次可以得出酶底比，楼主加油吧，这个酶的确不好做。

作者: 66+77 时间: 2016-2-10 20:53

后面要做的第一个实验就是动力学参数测定，有次可以得出酶底比，楼主加油吧，这个酶的确不好做。...

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多谢指导！哈哈真是太感谢了！看来真得耐下性子好好做啊！

作者: 66+77 时间: 2016-2-10 20:53

Food Chem. Investigation of α-glucosidase inhibitory activity of wheat bran and germ 里面有具体的方法，不过是用酶标仪做的，方法都一样，量不同而已，可以参考下。...

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我们这里只有一台迷你型酶标仪，还有一台紫外分光光度计。要是方便的话可否麻烦传一下这篇文献啊？哎，条件所限，查不到外文的啊中文的好多文献重复不出来......多谢多谢啊！

作者: seagate 时间: 2016-2-10 20:54

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Food Chem. Investigation of α-glucosidase inhibitory activity of wheat bran and germ 里面有具体的方法，不过是用酶标仪做的，方法都一样，量不同而已，可以参考下。...

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迷你型？预订波长是多少？

作者: 66+77 时间: 2016-2-10 20:57

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原帖由 seagate 于 2016-2-10 20:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

迷你型？预订波长是多少？

酶标仪只有405、450、492、550、620nm这几个滤光片，平常都是用405nm测OD值。我也不知道是否可以传文献，要不发我邮箱吧！zhaofen1320@163.com 多谢多谢哈

作者: prettygirl@ 时间: 2016-2-10 20:57

我做的是β-葡萄糖苷酶，貌似我看的所有的文献最后在终反应时加的都是1M的，加完后会变黄，根据活性的高低颜色也有所不同，对照就是显淡黄色的！

作者: 66+77 时间: 2016-2-10 21:04

我做的是β-葡萄糖苷酶，貌似我看的所有的文献最后在终反应时加的都是1M的，加完后会变黄，根据活性的高低颜色也有所不同，对照就是显淡黄色的！...

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但是β-葡萄糖苷酶和a-葡萄糖苷酶方向不一样吧，降糖的话是不是不能用β-葡萄糖苷酶啊？我之后用1M后，得经过好长时间（至少过夜）才能变色呢，不是立马就能看到黄色的。

作者: eric930 时间: 2016-2-10 21:05

Food Chem. Investigation of α-glucosidase inhibitory activity of wheat bran and germ 里面有具体的方法，不过是用酶标仪做的，方法都一样，量不同而已，可以参考下。...

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谢谢，我已经找了方法，正在尝试，不过还是很感谢了。。。

作者: seagate 时间: 2016-2-10 21:05

但是β-葡萄糖苷酶和a-葡萄糖苷酶方向不一样吧，降糖的话是不是不能用β-葡萄糖苷酶啊？我之后用1M后，得经过好长时间（至少过夜）才能变色呢，不是立马就能看到黄色的。...

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降糖？你说的是药物作用？倒是只有α-葡萄糖苷酶抑制剂被研究作为二型糖尿病的治疗药物，β葡萄糖苷酶更多是用来水解纤维二糖或者是人参皂苷

作者: milkdog 时间: 2016-2-10 21:06

你好，我现在也在做这方面的实验，请问你 pnpg的浓度最高用到了多少？可否资源共享一下，先谢谢了！

作者: remonte 时间: 2016-2-10 21:06

楼主你的酶溶解性好吗？我的酶不溶都郁闷了

作者: mybioon 时间: 2016-2-10 21:06

嗯哪，多谢啦！最近也在买试剂盒想用葡萄糖氧化酶法测，希望有好的结果。...

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楼主用试剂盒测的怎么样啊？我试了这两种方法，结果都不是很好~

作者: wzqzy 时间: 2016-2-10 21:07

我在做α糖苷酶活性抑制试验，想请问各位怎么确定所加样品浓度，外文中都是直接说加多少量，没说浓度、、真心求指导。谢谢~

作者: 锤子 时间: 2016-2-10 21:07

你好，我想问一下你的底物PNPG配成溶液是什么颜色的？无色还是有色？

作者: 3N4G 时间: 2016-2-10 21:07

好像配完是无色的，然后生成有色的png，在加了碳酸钠以后显色，那个酶怎么保存不易失活我也不太清楚，多交流下啊～

作者: 少林弟子 时间: 2016-2-10 21:08

楼主，现在准备做这个实验，实验室之前没人做过，各种问题。希望得到楼主的指导

作者: #甜# 时间: 2016-2-10 21:08

嗯哪，多谢啦！最近也在买试剂盒想用葡萄糖氧化酶法测，希望有好的结果。...

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请问你有做抑制淀粉酶的实验么？为什么阿卡波糖对它的抑制率很低呢？？？

作者: linlinstar 时间: 2016-2-10 21:09

请教楼主一个问题，一般样品、底物、酶加的顺序如何？用DMSO溶解的样品，体积比为多少对整个体系没影响？一般粗提物浓度多大才算有活性？反应体系的体积多少才好？有没有做天然产物组份筛选的

作者: dreaming 时间: 2016-2-10 21:10

我在做α糖苷酶活性抑制试验，想请问各位怎么确定所加样品浓度，外文中都是直接说加多少量，没说浓度、、真心求指导。谢谢~

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请问您现在确定了么？是不是用DMSO所能溶解的最大浓度，之后进行梯度稀释。但是最大浓度我也不清楚

作者: cbou876 时间: 2016-2-10 21:10

请问楼主有没有做酶活力测定以及反应体系优化实验？

作者: dreaming 时间: 2016-2-10 21:11

谢谢，我已经找了方法，正在尝试，不过还是很感谢了。。...

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求方法，也在做这个实验，对照组不变色，甚至加药组比背景组OD值还要小。

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