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标题: [求助]请教－PCR基础问题 [打印本页]

作者: 我是新人 时间: 2011-10-20 14:59 标题: [求助]请教－PCR基础问题

[求助]请教－PCR基础问题

在进行PCR时，使用的反应体系使用的是师兄们摸索好的反应体系。但根据分子克隆上面的标准反应条件：如：DNTP 200μmol/L 等，这些成分如何换算成我们实际应用时的体积的？请高手具体解答，谢谢！

作者: panda王 时间: 2011-10-20 15:08

dNTP为200μmol/L是指它的终浓度,例如如果你的工作液被稀释到10mmol/L,在
15μl的PCR体系中加0.3μl就可以了.

作者: 我是新人 时间: 2011-10-20 15:09

还有其他成分呢？如模板镁离子等
谢谢！

作者: 飞天小鹿 时间: 2011-10-20 15:10

模板的浓度一般可以根据你的电泳结果（和Marker比！）或测OD值的结果估计出来质量，再换算成体积。
镁离子的浓度，可以根据试剂的产品介绍中获得相关的浓度，然后，可以小量做个剃度试验，就能找到一个最佳的浓度了！

作者: 我是新人 时间: 2011-10-20 15:10

楼上高手能否给出具体公式（结合举例），谢谢

作者: 101010 时间: 2011-10-20 15:16

1.PCR反应体系中的总体积不变的前提下(例如50ul体系)，体系中加入某一成分的量与你需要的最终浓度和贮存液浓度决定，贮存液浓度*X/50=最终浓度，算出的X就是你要加入某一成分的用量，
2.模板用量与你制备模板中目的DNA的浓度有关，目的DNA浓度高，用的量就少，目的DNA浓度低，用的量就少
3.实验条件一般根据试剂盒中的说明书是可以的，温度要根据引物的Tm值来定，这在第一实验时都是要摸索条件的

作者: 我是新人 时间: 2011-10-20 15:16

最后问各位高手有关引物的体积
在公司合成引物提供的清单上，只有引物的μg/OD，这个如何转换成体积呢？
谢谢！

作者: 我是新人 时间: 2011-10-20 15:18

同时还请教另一个问题：
在PCR参数中变性，退火及延伸时间如何确定？根据目的基因大小？如果时间过长是否会出现大量非特异性产物？
谢谢！

作者: 庄梦蝶 时间: 2011-10-20 15:18

你可以根据引物的OD值算出摩尔数啊。
33×OD/引物的分子量=摩尔数啊，再根据需要加水溶解就得到摩尔浓度啦。水是有体积的呀。我们一般稀释成两个浓度梯度。60μg/L和20μg/L两个浓度。在根据上面的公式算出就对啦。变性温度一般用的94或95，退火温度根据TM值来确定。比TM值低5左右。延伸温度用72度就可以。

作者: 我是新人 时间: 2011-10-20 15:20

谢谢楼上的兄弟：
我还是有点不懂，你说的33×OD，这个OD是否就是公司合成引物提供的清单上的μg/OD对应的那个值？引物的分子量是否安如下公式计算：
C×289+A×313+T×304+G×329
我问的第二个问题是指时间而非温度
谢谢

作者: 飞天小鹿 时间: 2011-10-20 15:22

基因组DNA做模板，每个反应1μg就够了

质粒做模板，1pg

作者: 飞天小鹿 时间: 2011-10-20 15:23

同时还请教另一个问题：
在PCR参数中变性，退火及延伸时间如何确定？根据目的基因大小？如果时间过长是否会出现大量非特异性产物？
谢谢！

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延伸时间根据目的片断大小，时间太长会使酶失活吧，我做实验倒是好像没有出现过延伸时间长产生非特异性产物
退火是根据Tm值调整的

作者: 雪花子 时间: 2011-10-20 15:23

在PCR参数中变性，退火及延伸时间如何确定？根据目的基因大小？如果时间过长是否会出现大量非特异性产物？
谢谢！

PCR参数中变性要看你扩增目的基因中G+C含量，包括你的退火温度也是。延伸时间要看扩增目的基因片段大小，一般Taq酶每分钟大约扩增2000bp，因此延伸短可能会产生非特异性产物，而时间长可能性不大。退火温度可由电脑软件分析后推荐的Tm值上下调整几度。

作者: 我是新人 时间: 2011-10-20 15:24

比如公司提供的上下游引物的Activity(μg/OD) 分别是30和31.9，那么如何配储存液及在反应体系（50μl）选择应加的体积。
谢谢！

作者: 冰岛老叟 时间: 2011-10-20 15:24

OD值和分子量都是引物序列上提供的值.

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