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标题: 【求助】蛋白表达分子量偏大 [打印本页]

作者: huali 时间: 2016-3-21 11:10 标题: 【求助】蛋白表达分子量偏大

最近在做重组蛋白表达，表达之后也有目的条带，但是就是分子量比理论值要偏大。我的质粒是经过测序的，没有碱基的缺失和突变。另外，我做的是SDS-PAGE.偏大5-50都不等，各位大师帮帮忙，解决下... 着急啊！！！

作者: n111 时间: 2016-3-21 11:11 标题: 【回复】

SDS-PAGE确定的分子量不是很准确的，有些蛋白的疏水性强，等电点高，在胶上跑得慢也不足为奇。只要确定表达的蛋白正确就可以了。

作者: wawa11 时间: 2016-3-21 11:11 标题: 【回复】

有些偏大很常见的，可以通过表达测试时设置阴性对照来初步确认。
进一步确认可以通过活性检测。

作者: mimima 时间: 2016-3-21 11:12 标题: 【回复】

对照是有的就是表达的目的蛋白偏大

作者: wwwh 时间: 2016-3-21 11:12 标题: 【回复】

楼主你倒是说说目标蛋白的大小啊。目标蛋白5KD偏大5KD ，跟目标蛋白50KD偏大5KD，那不是一个概念啊。
SDS-PAGE是不太准确，不过50KD的话，就太夸张了吧- -
而且SDS-PAGE根据的就是蛋白分子量大小，蛋白被负电荷包裹主要受电场力作用迁移，跟等电点疏水什么的关系不大啊。

作者: 今生如此 时间: 2016-3-21 11:13 标题: 【回复】

SDS-PAGE虽然把变性变性并且由于蛋白表面结合了SDS而带负电荷，但是实际上疏水性强的蛋白变性不完全，所以不会是标准的球形。等电点高的蛋白即使结合了SDS，所带的电性也比较少，所以它们在胶上移动比较慢。

作者: jishiben 时间: 2016-3-21 11:13 标题: 【回复】

为什么你们表达蛋白都不用MS确认一下精确的分子量呢？

作者: mimima 时间: 2016-3-21 11:13 标题: 【回复】

是这样的，我的理论值是70KD,但是在脚上的为止已经有120KD了，还有一个样品的理论值是37KD，胶上就是四十多了，还有请教一下蛋白序列的亲疏水性怎么判别呢

作者: 灵魂 时间: 2016-3-21 11:14 标题: 【回复】

请问下你这两个蛋白是分别跑的胶么？
如果跑分子量大的蛋白，可以用浓度低点的胶，这样会比较准确。不然来不及扩展开就电泳停了。
蛋白中氨基酸，非极性多的表现为疏水，极性多的表现为亲水。
一般蛋白内部以非极性氨基酸为主，外部会多点极性的。
如果要准确预测，有软件可以算序列的物理特性的。详细你可以上ExPASy 看看

作者: 8899 时间: 2016-3-21 11:14 标题: 【回复】

MS是质谱的简称 mass spectrum

作者: 大嘴猴 时间: 2016-3-21 11:15 标题: 【回复】

Mass, 也就是质谱测分子量。

作者: xiaoxiaojinglin 时间: 2016-3-21 11:15 标题: 【回复】

1.如果你是在动物细胞里表达重组蛋白，因为翻译后修饰的存在（如磷酸化、乙酰化、泛素化等），蛋白比预测大一点比较正常，如果特别纠结，加一个原核表达的蛋白作为对照（去除标签）
2. 也有一些跟预测大小差别比较大的情况，如人的SIRT1，预测82kd左右，western Blot检测癌细胞一般接近120kd
所以建议你参考你研究蛋白的文献、抗体公司提供的datasheet，综合考量分析原因。

作者: 灵魂 时间: 2016-3-21 11:15 标题: 【回复】

你的蛋白是不是糖蛋白？如果是糖蛋白，糖基化修饰会造成蛋白分子量比根据氨基酸预测分子量大

作者: qinqinai 时间: 2016-3-21 11:16 标题: 【回复】

理论值70kD，在胶上120kD肯定不正常的；37kD，在胶上40多kD还是可以接受的。要想确定是不是你的蛋白，最好一下肽谱鉴定。
提醒一下楼主注意克隆时终止密码子问题

作者: 大大 时间: 2016-3-21 11:16 标题: 【回复】

mass spectrum，通过质谱确定精确的分子量，但是对于确认一个蛋白是不是你的目标蛋白，证据并不充分。因为你在表达纯化中可能存在降解、截短等，因此还是建议你通过质谱做一下肽指纹来鉴定

作者: aaby 时间: 2016-3-21 11:17 标题: 【回复】

不是分别跑的，是在同一块胶上的，但是我分开跑的时候也是偏大的

作者: 886爱 时间: 2016-3-21 11:17 标题: 【回复】

我是做过WB 的有条带，所以应该就是我的目的条带，现在只是偏大的问题还有就是我老师说要我做变性电泳，可是我现在做的SDS-PAGE就是啊，还有别热什么方法使蛋白质变性么？

作者: 钻石 时间: 2016-3-21 11:17 标题: 【回复】

不是糖蛋白呀，而且我是在大肠杆菌中表达的，是原核表达系统，一般不会形成糖基化吧

作者: mimima 时间: 2016-3-21 11:18 标题: 【回复】

楼主过表达的质粒上是否带有融合标签？如果有的话试着检测一下标签看看

作者: wawa11 时间: 2016-3-21 11:18 标题: 【回复】

你用质谱测定一下样品蛋白质的分子量，这应该是准确的。SDS-PAGE有时与胶或者蛋白质的形状有关，有时候测定的不太准确。

作者: 小妖精@ 时间: 2016-3-21 11:18 标题: 【回复】

可是SDS过量，不是保证了蛋白质在电泳时泳动速度只和蛋白的大小有关，而和蛋白原本的等电点无关了吗？

作者: 大大 时间: 2016-3-21 11:19 标题: 【回复】

这时候理论上的。实际上经SDS上样buffer处理后，蛋白不完全是球形，带电荷的多少也不完全相同，所以有时候迁移率与分子量的关系与理论计算出来的不完全吻合。

作者: 燕子@ 时间: 2016-3-21 11:19 标题: 【回复】

你好想向您请教一下有关蛋白质分子量的问题。我看到有文献说蛋白质中7S的分子量在180000-210000Da之间，11S分子量在302000-375000Da，从两一篇文献中（蛋白酶水解大豆分离蛋白的分子水平表征）看到凝胶电泳图显示7S的分子量大小大于11S，我有点糊涂了，两者到底哪个分子量大，希望大侠不吝赐教

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