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标题: [求助]我的PCR跑不出带,但点样孔是亮的,这是怎么回事啊? [打印本页]

作者: 66小飞侠 时间: 2011-10-22 16:30 标题: [求助]我的PCR跑不出带,但点样孔是亮的,这是怎么回事啊?

[求助]我的PCR跑不出带,但点样孔是亮的,这是怎么回事啊?

我最近跑PCR一直做得不好,干脆我把所有的试剂都换了新的,DNA也是重新稀释的,可还是P不出来,以前都可以的,现在却不行了,今天又做了一天还是没有带,但点样孔却是亮的,这是怎么回事呢?这个国庆节真是郁闷啊!

作者: #黄药师# 时间: 2011-10-22 16:31

点样孔是亮的是蛋白质

作者: #甜# 时间: 2011-10-22 16:32

点样孔应该是基因组DNA。

作者: 阿拉蕾 时间: 2011-10-22 16:33

首先看loading buffer里的溴酚兰和二甲苯氰跑没跑出点样孔，如果是的话，点样孔里的肯定不是pcr产物。如果以前能跑出来，那只能找试剂和pcr条件的问题了。引物没问题吗？可以把引物用page或wave检测一下。

作者: 笔笔 时间: 2011-10-22 16:33

点样孔亮的是基因组DNA，可能是模板浓度太大，重新测一下DNA浓度和纯度；或者是引物发生了交联，换新引物；最后还不行，换一台PCR仪试试。

作者: 66小飞侠 时间: 2011-10-22 16:34

引物没有问题,试剂也是刚换的新的,都没有问题.也许是DNA浓度高了吧,我再降低一下DNA用量试试.谢谢各位!

作者: 131415 时间: 2011-10-22 16:35

我种情况我遇到过,.99%的可能性是模板浓度太高多导致的

作者: 66小飞侠 时间: 2011-10-22 16:36

我把模板DNA浓度降低了，还是跑不出来。然后我又换以前做得很好的模板再做也没有带，真不知是怎么回事！

作者: PPT 时间: 2011-10-22 16:37

我最近也碰到类似问题，最后发现是因为PCR产量太低所致。你可以更换PCR条件，然后再跑电泳试试。（本人是绝对的新手，以上意见仅供参考！）

作者: 二丫头466 时间: 2011-10-22 16:38

我最近也碰见过类似情况,减少了模板量,多增加几次循环,结果就跑出条带了.应该是模板浓度太高了引起的.你试试
另外,建议你加一个阳性对照,检查一下你的试剂及PCR循环参数有没有问题

作者: JK.jon 时间: 2011-10-22 16:39

我以前也遇到过这种情况，模板多做几个梯度
或者换块新胶在跑以下电泳试一试吧

作者: 阳光树 时间: 2011-10-22 16:40

这一周我也正为此发愁，我用的模板量是200ng（基因组DNA），所有的条件都试过了，就是没有条带连以前跑出的现在也不行了！

作者: 菜鸟丙 时间: 2011-10-22 16:40

我也是这样,粘两张图,一张是我还是个新手是做的,另一张是今天做的,以前好好的,现在就是没条带了,什么都没变,就是模版变了,是浓度太高了么?

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作者: 冰岛老叟 时间: 2011-10-22 16:41

我把浓度降低了但还是没有带出来,只是点样孔不亮了,最后我换了一家公司的Taq酶之后就又有带了,所以我觉得不一定是模板浓度高了引起的,还有可能是Taq酶的问题。

作者: queen 时间: 2011-10-22 16:42

不好意思，我降低PCR模板浓度后就做出来一次条带，之后再重复仍然出现点样孔内高荧光，却跑不出点样孔了。而且经测模板OD值，浓度并不高。所以我目前也不知道该怎么办了。可能是模板的问题吧。因为我换用对照DNA，用同样的酶、反应体系及PCR条件，可以出现特异性条带。不过邪门的是，我酶切之后的双链cDNA却又在点样孔内出现大量滞留。酶切前的却能跑出来。怪事了。

作者: standbyme 时间: 2011-10-22 16:42

有的时候退火温度过高，延伸时间过长，也会产生东西堆在胶孔中的情况

作者: windy+++ 时间: 2011-10-22 16:43

有可能是引物特异性不强，没能与模板结合，稍微降低退火温度试试，比如0.5度

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