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标题: [求助]脂肪组织提RNA [打印本页]

作者: lgm 时间: 2011-10-22 17:28 标题: [求助]脂肪组织提RNA

[求助]脂肪组织提RNA

各位高手:
你们好!我无法从脂肪组织中提取总RNA(用Trizol法),不知能否介绍些宝贵经验,在下万分感激!

作者: 蝴蝶结子 时间: 2011-10-22 17:28

分子克隆第三版上讲，提取含甘油三脂较丰富的脂肪组织中的总RNA不能用一步法。可以用Chirgwin等（1979）发展，由Tavangar(1990)改进的方法。你可以查一下全文。

A micromethod for the isolation of total RNA from adipose tissue.
Anal Biochem.
作者：Tavangar K, Hoffman AR, Kraemer FB。

作者: 过路甲 时间: 2011-10-22 17:29

我在从脂肪组织中抽提RNA前也查了一些文献，看到zhongzidegushi说的那条信息，咨询Trizol产品公司，建议用柱式RNA进行抽提，但考虑到麻烦，于是进行了一下尝试，用普通的Trizol进行抽提，并进行RT-PCR，最后电泳，结果很好，条带清晰而且没有杂带，所以普通的Trizol用于脂肪组织的抽提也是可行的

作者: qiangren789 时间: 2011-10-22 17:29

我提了好多次脂肪组织的RNA，其实也并不是很难！总结一下需注意的问题如下：
1 脂肪组织由于含有很高的甘油三脂和其他脂类，所以在提取的时候，所取组织的量要增加，
2 加入TRIZOL后，充分匀浆，静止，然后4度12000转离心10分钟！
3 弃取上层的油，将下层，红色的液体吸出，再加氯仿！
4 脂肪组织更易降解，除了研磨时要注意，取样时也要注意，最好是新鲜的样！
你试试吧！祝好运！

作者: 研究僧112 时间: 2011-10-22 17:30

终于找到同志了,我好高兴,不过我也没提出来.我用的是Qiagen 的RNeasy mini kit试剂盒,都说这个试剂盒挺好的,但我提了10次了.还是没提出来,而且我不知道该怎样去除上层的油,是直接倒掉,还是用吸头吸,我试了吸头吸,但效果不好,请高手指导一下,感激不尽.

作者: lgm 时间: 2011-10-22 17:30

你好！首先得感谢你的热心帮助。昨日我用你介绍的方法提脂肪组织（前日杀RAT所取脂肪）的RNA（先加入TRIZOL后，充分匀浆，静止，然后4度12000转离心10分钟！后弃取上层的油，将下层，红色的液体吸出，再加氯仿！）最终在加异丙醇后离心，EP管底可见明显沉淀，好高兴！同时提心肌RNA也见明显沉淀，但跑胶后两者均未见三条带，心肌提取物跑胶后为一条亮带，不知为何？所提物是RNA吗？沉淀用无酶水可完全溶解，如沉淀为DNA 或蛋白质，无酶水可完全溶解吗？今日用上法提-70度保存近2月的脂肪组织提RNA，但未见沉淀 ...？？？组织取材后未放液氮仅用-70度保存，可明显影响以后RNA提取吗？请指教。非常感谢！
祝万事如意！

作者: 笨鸟321 时间: 2011-10-22 17:31

各位高手、大侠
你们好!我无法从脂肪组织中提取总RNA(用Trizol法),不知能否介绍如何从脂肪组织提RNA做RT-PCR的详细步骤及注意事项，在下万分感激!

作者: +田田+ 时间: 2011-10-22 17:31

若我的建议能对你有一点的帮助，我也是非常高兴的！
不过，你的实验好像还是有问题的，正常的总rna是要跑出三条带的，5s最弱，28s的亮度大约是18s的两倍，不过由于胶的问题，常常不会那么明显，在跑1％的TBE琼脂糖凝胶时，1：1就不错了，为防止跑胶时降解，可以配置MOPs胶，你可以查一下，它跑出的效果要好的多！
对了，怎么没见你提到RNA的OD值呀？正常提完都要测得，看一下比值，你的RNA是降解了，是蛋白多了就大致有数了！
我提过保存一年的脂肪组织，确实降解得很厉害，所以建议你最好用新的组织，还有我觉得脂肪组织中，脂肪滴占有很大的比例，而细胞数要比其他组织少的多，越是成熟的脂肪细胞越严重，所以，组织量要控制好！
好像也没说什么有用的，希望你能尽快得出结果！

作者: +田田+ 时间: 2011-10-22 17:31

加异丙醇后不会立即可见白絮状漂浮物及较多细丝线团状物形成，但是会有很多气泡！离心后才可见沉淀！我提时就是按照Trizol说明书上的步骤，没有什么特别的改动，要注意的几点我也说过了，其他象什么防止RNA酶污染等我想也不用交代的，我觉得你还是应该测一下OD值，你提的很可能是DNA，因为提DNA时会出现这样的现象！

作者: #黄药师# 时间: 2011-10-22 17:32

如何防止用Trozol 提的是RNA而非DNA？谢谢！

作者: vivian4123 时间: 2011-10-22 17:32

在加氯仿之前离心12K，5分钟，因该有一个上层覆盖物弃出，再吸取上清，再加氯仿，然后按说明书来就可以的！祝你实验成功！

作者: #甜# 时间: 2011-10-22 17:33

你提不出来是你脂肪的用量可能太少了，多加一些组织在试试看吧。

作者: 冰儿0109 时间: 2011-10-22 17:33

先回答你的问题:
1.加异丙醇后离心前需静置2小时或过夜吗？
不需要!加完后轻轻晃动,混匀,然后静止5分钟即可.
2.用70%酒精还是75%的洗涤RNA？
其实我是用的75%的乙醇洗的,但我觉的70%和75%不会对实验结果产生很大的影响,它的作用应该就是洗去残留的异丙醇,
3.提出总RNA后用无酶水还是用酒精保存？
那要分组织,脂肪的保存在无酶水中即可,我没有用酒精保存过,也没听说过!不过可以保存在甲酰氨中
4.可用普通TBE缓冲液及琼酯糖跑电泳吗？TBE缓冲液用1X,琼酯糖用1%浓度，100V跑小胶的2/3,即可,你可以查一下,用甲醛变性胶,结果更好!

作者: （cat） 时间: 2011-10-22 17:34

我用最普通的方法提，没看到沉淀，但也跑出三条带了，我用的组织放在--70C冰箱里，拿出来后马上在冰上匀浆。

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