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【求助】表达的质粒已经测序确认开放阅读框内序列没问题
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作者:
大大
时间:
2016-4-2 12:52
标题:
【求助】表达的质粒已经测序确认开放阅读框内序列没问题
这次做原核表达一波三折,这块到最后了,又出问题了。本人用的pET-30载体,BL21菌株,IPTG诱导过后能确定诱导成功了,可是目的蛋白要比预测的小4kD左右(目的条带约55kD),用于表达的质粒已经测序确认开放阅读框内序列没问题……求解,不甚感激!
作者:
yayayu
时间:
2016-4-2 12:53
标题:
【回复】
目的蛋白要比预测的小4kD左右(目的条带约55kD)如果SDS-PAGE结果的话也不能说明真的小,SDS-PAGE出来的只是表观分子量,不是真实分子量。如果不符,可以利用质谱、凝胶排阻等确认。
作者:
mimima
时间:
2016-4-2 12:53
标题:
【回复】
这个质谱是不是跟分析化合物质谱差不多啊?凝胶排阻需要哪些东西啊?我们这条件有限,以前师兄师姐都不怎么做分子,所以对这方面了解较少……
作者:
dadaai
时间:
2016-4-2 12:53
标题:
【回复】
有点不一样,是飞行质谱。
质谱和凝胶排阻都要蛋白纯化后做,凝胶排阻就是凝胶过滤,需要一些已知分子量的蛋白做为标准。
作者:
燕子@
时间:
2016-4-2 12:54
标题:
【回复】
楼主的那个预测蛋白分子量是怎么预测啊
作者:
malong
时间:
2016-4-2 12:54
标题:
【回复】
这位仁兄,你看电泳跑出的结果跟网上预测结果相差4kD~5kD,这属于正常范围吗???
作者:
rrra6
时间:
2016-4-2 12:54
标题:
【回复】
正常,但最好别的方法验证下。
作者:
rrra6
时间:
2016-4-2 12:55
标题:
【回复】
我也想验证啊,可是条件有限啊,你有什么简单易行的方法可以推荐一下吗???
作者:
燕子@
时间:
2016-4-2 12:55
标题:
【回复】
诱导表达后马上跑电泳
作者:
jishiben
时间:
2016-4-2 12:55
标题:
【回复】
Are you sure ?诱导表达做完天都黑了,在跑电泳我就要在实验室过夜了,请问诱导表达后马上跑电泳有什么理由吗?谢谢~
作者:
冰激凌
时间:
2016-4-2 12:56
标题:
【回复】
兄台,你看我这个分析的对不对,我的上样缓冲液里没有加β-巯基乙醇,但是目的蛋白氨基酸序列里含有半胱氨酸,是不是会形成二硫键使目的蛋白没有完全打开,最终导致跑出来的条带偏小???
作者:
美人鱼
时间:
2016-4-2 12:56
标题:
【回复】
如果是分子间形成二硫键,形成二聚体或多聚体,分子量会偏大;如果是分子内形成二硫键,分子量不变
作者:
跳跳哈里
时间:
2016-4-2 12:57
标题:
【回复】
学习了,不过分子形状对分子量大小也有影响吧,分子内形成二硫键应该体积变小,是不是分子量要相对小些?
作者:
冰激凌
时间:
2016-4-2 12:57
标题:
【回复】
我最近也出现了这种问题,请问楼主现在找到原因了么
作者:
wwwh
时间:
2016-4-2 12:57
标题:
【回复】
你好,正在做原核表达,想请问一下表达载体应该怎么选择尼?后期是要用纯化目的蛋白做抗体的,pET-22,pET-28,pET-30,我应该怎么选择尼?
作者:
燕子@
时间:
2016-4-2 12:58
标题:
【回复】
最近做表达,也出现了这个问题。蛋白一部分上清表达,一部分包涵体,上清为20KD,包涵体尿素溶解后只有14.用的PET28A载体,测序没有问题,实在不知道什么原因了
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