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标题: 【求助】PCR扩出来的条带亮度很弱是什么原因？ [打印本页]

作者: fei1226com 时间: 2016-4-4 21:55 标题: 【求助】PCR扩出来的条带亮度很弱是什么原因？

从高GC%的细菌基因组中PCR扩增一个2500bp左右片段，电泳检测有目的条带、无杂带，但目的条带亮度弱，我增加了模板的用量但没有改善。
反应条件：
95度 5min
（95度 1min
60度 45sec
72度 3min）33个循环
72度 5min
请大家帮我出出主意。

作者: jujuba 时间: 2016-4-4 21:56

加大产量的方法一般有几种
1，加大镁用量
2，加大引物或者摸板用量，非必要不要用这种方法
3，采用降落PCR
对于楼主的问题，建议采用降落PCR，你的后23个循环，可以每循环降低退火温度0.2-0.3度，或者加大Mg的浓度
此外不要为了加大产量，就轻易的增加摸板用量，有的时候加大摸板用量也有可能抑制PCR，反而降低摸板用量或许可以得到更多的产量。

作者: wood533 时间: 2016-4-4 21:56

偶的拙见：
1. 模板的用量在你这种情况下应该和目的条带浓度关系不大——记得realtimePCR的原理图么，循环数够多时，目的片段的终浓度在不同模板量条件下相差不大；
2.首先考虑扩增效率问题，可用touch down PCR，除开头几个循环外，后面的退火温度降低一些，可提高扩增效率；
3.如果无效，建议使用两步法，95度 1min，（60-65）度 3min，可加入touch down 步骤；
4.不知道反应体系如何配置，应该是使用了GCbuffer吧？TaKaRa的GCbuffer（尤其是II）的确会降低一些扩增效率；
5.视你最终需要，如果是诊断目的，可多加一些Taq酶，也能增加扩增效率，但错配率和非特异扩增可能会增加。如果是克隆目的，其实目的条带暗一些很多时候并不影响最终实验结果。
有不当之处，请多批评。

作者: fei1226com 时间: 2016-4-4 21:57

谢谢楼上两位的建议。我做的目的是为了克隆（不是诊断）。我用的是天根公司的PCR Supermix，就是只需加入模板和引物就可以的，那上面说可以有效扩增高GC%模板。我是在50微升体系中加入3微升模板（模板浓度75ng/微升）。因为我还扩增另一个1000bp左右的基因亮度就很大，所以我想是不是2500bp的长片段比较难扩？
另外，请问楼上，什么是两步法？

作者: bring 时间: 2016-4-4 21:57

如果增加Mg离子浓度的话,需要增加多少的量?我用的是Takara RNA pcr kit(AMV)Ver.3.0试剂盒,50ul体系,MgCl2(25mM) 2ul.

作者: youreyes 时间: 2016-4-4 21:58

正常的mg是1.5，可以提升到2.0，2.5，3.0，不过不建议太多，因为太多会发生非特异扩增

作者: 穿越时空 时间: 2016-4-4 21:59

谢谢楼上!
我的RT条件是:
30 度 60min
42度 30min
99 度 5min
5度 5min 一个循环
Total RNA 500ng/ul
PCR条件是:
94 度 2min 一个循环
94 度 30sec
56度 30sec
72 度 1min 30循环
72 度 5min
跑电泳条带不亮,如果用降落PCR的话,可以增加扩增效率吗?怎样使用降落PCR?

作者: XYZQ 时间: 2016-4-4 21:59

72 度 1min ？时间短了点。150sec试一试，你要P的2.5K长。

作者: bring 时间: 2016-4-4 22:00

谢谢！
我要Ｐ的不是2.5k长，而是408bp.我Ｐ的另外一个目的基因是685bp,条件同上，跑出的电泳挺好的．

作者: bgf5 时间: 2016-4-4 22:00

408bp的确不长，如果685bp扩的很好的话，要考虑你的引物是否有问题。
另外，你的RNA质量如何？有没有DNA污染，两对引物都是在外显子区还是跨了内含子，这些都是RTPCR必须考虑的因素。

作者: bring 时间: 2016-4-4 22:01

谢谢!
这两个是同一批RNA,如果是RNA质量问题的话,那么685bp也应该扩的不好.我想现在改变一下RT-PCR的条件,看扩的怎么样.如果改变不行的话,那么就考虑是引物设计的不好.可是我现在不知道怎么改变反应条件,他们有说的要增加Mg离子浓度,或使用降落PCR,不知道有没有用过的,效果怎么样?

作者: yapuyapu 时间: 2016-4-4 22:01

两步法就是退火延伸使用同一温度。
touchdown就是头几个循环退火温度逐步降低，然后在较低退火温度条件下进行剩余循环。
我扩增的GC含量高的样品都用的是TaKaRa 的酶和GC buffer。天根的不大好用。
后来熟了，也为了省钱，就用DMSO代替GC buffer，效果不错，不过浓度要摸索一下，
TaKaRa 和GC buffer联用的就是一种Taq LA酶，记得就是专门扩增长片段用的，可以试一下。

作者: fei1226com 时间: 2016-4-4 22:01

请问可不可以用PCR扩增出来的产物为模板再做PCR来增加产物量？

作者: 社会主义好 时间: 2016-4-4 22:02

可以这样做，但是一般都要做个梯度稀释的，10－1000倍不等，但是这样产生突变的几率就增加了许多！

作者: fei1226com 时间: 2016-4-4 22:03

两步法就是退火延伸使用同一温度。
touchdown就是头几个循环退火温度逐步降低，然后在较低退火温度条件下进行剩余循环。
我扩增的GC含量高的样品都用的是TaKaRa 的酶和GC buffer。天根的不大好用。
后来熟了，也为了省钱，就用DMSO代替GC buffer，效果不错，不过浓度要摸索一下，
TaKaRa 和GC buffer联用的就是一种Taq LA酶，记得就是专门扩增长片段用的，可以试一下。
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LA酶扩增的产量如何？听说还有一种pfx酶，那是什么呢？

作者: yonger 时间: 2016-4-4 22:03

为什么用pcr产物再p，要做梯度稀释，为何产生突变的几率增加许多？

作者: hot_hot_hot 时间: 2016-4-4 22:04

“TaKaRa 和GC buffer联用的就是一种Taq LA酶，记得就是专门扩增长片段用的，可以试一下。“
能否具体解释一下做法。我就在作长片段的扩增。15kb。正为用什么酶发愁那。
我用的是TaKaRa PrimerSTAR HS DNA Polymerase.您说的TaKaRa是什么酶？

作者: 8964357 时间: 2016-4-4 22:04

TaKaRa LA Taq with GC buffer
code No. : DRR02AG
在目录书上有，你打电话给公司，告诉他们编号就可以。

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