分析测试百科

标题: 【求助】请问如何消除引物二聚体？测序需要！ [打印本页]

作者: tie8 时间: 2016-4-4 22:06 标题: 【求助】请问如何消除引物二聚体？测序需要！

师兄师姐好，750bp长度的PCR产物，扩增出来目的条带还可以，但是100bp下面有模糊的引物二聚体，有时甚至和目的条带一样清晰，之前不以为然，测序后发现不理想，请问如何消除这些恼人的小玩意？一般的方法我都试过了，好像效果不佳。:(
总之谢谢各位了，还请不吝赐教。小弟在此谢过先

（PS:不太喜欢重新设计引物的方法，因为这对引物已经是所能找到的最合适的了）

作者: 911 时间: 2016-4-4 22:07

我们也有这种情况，我们就在跑琼脂糖电泳的时候多跑一会，让二聚体的条带尽量跑在下面。不知道能不能满足你的要求。

作者: cbou876 时间: 2016-4-4 22:07

尝试减少引物量，做个梯度，选取即能保证回收条带亮度，二聚体又最少。

作者: tie8 时间: 2016-4-4 22:09

恩谢谢各位了，不过问题还是没有解决哦。

作者: one 时间: 2016-4-4 22:09

如果减少引物浓度还不行的话，估计只能重新换引物了吧。

作者: bring 时间: 2016-4-4 22:11

各加２％，４％，６％DMSO试试看，做三个梯度，通过增加特异性减少二聚体。

作者: daod 时间: 2016-4-4 22:11

首先我提个问题，为什么测序需要把引物二聚体去掉？
我讲讲我们这边测序，一般两种情况：1.有非特异性条带，直接切胶回收目的条带，纯化后送去测序就可以了。2.只有单一的特异性条带，用cleanup试剂盒过柱纯化PCR产物就可以了，一般小于75bp的条带都能去掉。Takara的据说可以除去100bp以下的片段。这种情况不需要跑胶的，我觉得应该适合你。

作者: vvmmoy 时间: 2016-4-4 22:12

引物二聚体不影响你的测序，你的测序问题应该是其它的原因导致的，应该在别的地方招招原因。把你的胶回收之前的图看看！回收过程是否有污染，还有就是你的测序结果不理想到底是怎么样的不理想，最好截个图上来看看！
费劲找取出二聚体的方法缘木求鱼，而且二聚体存在一般是不影响实验的！除非产物被引物二聚体所覆盖，其余情况与其无关！

作者: october7 时间: 2016-4-4 22:12

750bp长度的PCR产物，扩增出来目的条带还可以，但是100bp下面有模糊的引物二聚体
1,目的片段750，引物二聚体100，切胶回收对你的测序没有任何影响~~
2.不知道拟所说的测序不理想是什么不理想，建议做个克隆之后再测序~~
3，如果希望引物二聚体少点的话，你可以优化反应条件，引物二聚体过多是因为大量引物没有参与扩展，PCR效率太低的原因。可以考虑从退火温度和引物浓度入手做梯度优化~~~

作者: 101010 时间: 2016-4-4 22:13

做二次ＰＣＲ，对消除引物二聚体效果不错．我试过．

作者: tuuu2 时间: 2016-4-4 22:14

楼主可能是想要漂亮的图哦！
呵呵！
纯化纯化就可以了！

作者: pou 时间: 2016-4-4 22:15

同意楼上的看法。dimer在100bp以下，你的目的条带在750左右，两者距离远者呢。测序要么对，要么在不重要的bp上不符合，这两种结果都是可以接受的。最严重的就是测序错误。建议你搞清楚你所谓的“不理想”的结果是怎么不理想，会不会影响你下一步的实验，比如蛋白表达。如果不影响，就ok啊。如果你实在不待见它，我的想法是减少你的primer的用量。或者参考其他高手的方法吧。

作者: iii_ii 时间: 2016-4-4 22:16

降低引物浓度，如果还不行，那就是引物设计的不好。

作者: zhenxin 时间: 2016-4-4 22:17

一般调整引物和模板的比例，但也可能和引物设计有关。

作者: chengjie79 时间: 2016-4-4 22:42

有就有啊，反正跑胶回收，不影响你实验。测序会有影响吗？应该不会有影响的，不过如果你连接是表达载体，测序的话是有可能有影响，有些公司有些序列他就是测不出。遇到这种情况，先连接t-vector,应该问题可以解决。不过也可能你的序列是复杂的2级结构，确实测不出。那么。。节哀。

作者: bgf5 时间: 2016-4-4 22:42

PCR时热启动试试，消除引物二聚体挺好用的

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)