分析测试百科

标题: 【求助】如何在BLAST里寻求引物所能扩增目的片段的长度? [打印本页]

作者: langlang 时间: 2016-4-6 10:51 标题: 【求助】如何在BLAST里寻求引物所能扩增目的片段的长度?

各位高手,向你们请教:
我从文献上查到我想要的引物,但文献上并没写此引物所能扩出的目的片段的大小,如何用某种工具如BLAST去找到该引物所能扩出的目的片段长度呢?万分感谢你们的帮助!

作者: SO2 时间: 2016-4-6 10:52

找到pubmed中Nucleotide界面，点击左侧工具条内的BLAST，进入blast界面，选择Nucleotide板块中的Search for short, nearly exact matches ，在Search 提供的空白区键入上游（5‘-3’）nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn（20个以上的n）下游引物（5‘-3’），在其他选框中进行必要的限定。点击blast按钮。待进入下一界面后点击format, 待出现下一界面后，察看其中上下游引物能100%互补序列，用目的序列的最大碱基位置-最小碱基位置+1即目的片段的长度。需要补充说明的是，统一引物可能会blast到多条pcr产物，但目的片段的大小一致，主要是同一基因，有些提供的序列不完整造成的。

作者: langlang 时间: 2016-4-6 10:54

谢谢楼上的热情帮助,但我还是不太会找,比如我要扩小鼠的IL-4,文献中的引物为上游: 5’-TCGGCATTTTGAACGAGGTC-3’;下游:5’-GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC-3’,从BLAST搜到如下结果,那哪个是呢?"上下游引物能100%互补"是指谁和谁互补,怎么个互补法呢? 这个问题已经困扰我很久,万分感谢你们的再次帮助.

作者: langlang 时间: 2016-4-6 10:55

我搜到的结果在"我的IL-4"里,望不吝赐教.谢谢

作者: any333 时间: 2016-4-6 11:10

5楼
楼主所用的引物在DNA和RNA中均能扩出来，下面这个是以DNA为模板扩出的片段，长度=91574-86987+1(bp)=4588bp
gi|3687208|gb|AC005742.1| Mus musculus chromosome 11, BAC clone CT7-111I18 (LBNL M01),
complete sequence
Length=159500
Score = 44.1 bits (22), Expect = 0.017
Identities = 22/22 (100%), Gaps = 0/22 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 19 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 40
||||||||||||||||||||||
Sbjct 86987 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 87008
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 1 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 20
||||||||||||||||||||
Sbjct 91574 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 91555
下面这个是以RNA为模板扩出的片段，长度=379-162+1(bp)=218bp
>gi|51826|emb|X03532.1|MMIGG1R Mouse mRNA for IgG1 induction factor
Length=580
Score = 44.1 bits (22), Expect = 0.017
Identities = 22/22 (100%), Gaps = 0/22 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 19 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 40
||||||||||||||||||||||
Sbjct 379 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 358
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 20
||||||||||||||||||||
Sbjct 162 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 181

作者: any333 时间: 2016-4-6 11:11

准确地说，楼主的小鼠IL-4引物所扩增片段的大小应该为：
1、以RNA反转录所得的cDNA为模板，扩增产物为216bp（403-188+1）。
>gi|10946583|ref|NM_021283.1| Mus musculus interleukin 4 (Il4), mRNA
Length=605
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.089
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 20
||||||||||||||||||||
Sbjct 188 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 207
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.089
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 26 GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 45
||||||||||||||||||||
Sbjct 403 GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 384
2、以基因组DNA为模板，扩增产物为4586bp（91574-86989+1）
>gi|3687208|gb|AC005742.1| Mus musculus chromosome 11, BAC clone CT7-111I18 (LBNL M01),
complete sequence
Length=159500
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.089
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 26 GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 45
||||||||||||||||||||
Sbjct 86989 GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 87008
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.089
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 1 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 20
||||||||||||||||||||
Sbjct 91574 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 91555
对于所设计的引物，上游引物应该与模板序列某段完全相同、下游引物应该与模板序列的某段完全互补。下面看看用你的引物序列BLAST的结果，Identities后面的是引物序列与基因序列某段的匹配程度（如，100%），Query后面的是用于BLAST的引物序列，Sbjct后面的是与引物序列匹配的基因的某段序列。从BLAST结果可以看出，你的上游引物与小鼠IL-4基因序列的某段完全相同（注意上面的红色部分）；你的下游引物与小鼠IL-4基因序列的某段互补且完全匹配（注意上面的蓝色部分）。

作者: langlang 时间: 2016-4-6 11:11

今天向你学到了很多东西,还想向你问一个比较初级的问题,我是打算做RT-PCR,如果RT后变成以cDNA为模板做PCR所得结果不能把你所提的以DNA也能扩出的目的片段也扩出来吧?也就是说不会出现两条带吧 ,一个是4588bp,一个是218bp?cDNA是去除内含子的,所以与DNA是不一样的,做RT-PCR的化,应该只能出来218bp的目的片段,对吧?

作者: langlang 时间: 2016-4-6 11:11

楼上所选的扩增产物说明的是什么意思呢?与你所选的区别在哪里呢?他是选择了1-20 19-14,你选的是1-20 26-45,为什么会有不同选择呢?谢谢

作者: ero11 时间: 2016-4-6 11:12

楼上所选的扩增产物说明的是什么意思呢?与你所选的区别在哪里呢?
我和zzy1895所选的基因实际上都是同一个基因，即小鼠的IL-4（见下面的Other Aliases）。所不同的是，我选的是经NCBI整理过的、公认的小鼠的IL-4基因序列。
Il4
Official Symbol: Il4 and Name: interleukin 4 [Mus musculus]
Other Aliases: RP23-188H3.4, IgG1, Il-4
Chromosome: 11; Location: 11 29.0 cM
GeneID: 16189
他是选择了1-20 19-40,你选的是1-20 26-45,为什么会有不同选择呢?
这不是有不同的选择的问题，而是我和zzy1895进行BLAST时所用的序列有所不同。我用的序列是“上游引物”+nnnnn+“下游引物”，即TCGGCATTTTGAACGAGGTC nnnnnGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC ；而zzy1895进行BLAST时用的序列应该是“上游引物”+“下游引物”，即TCGGCATTTTGAACGAGGTC GAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 。结果虽然看起来不一样，但实际上是一样的。对于zzy1895的BLAST结果，必须用你的引物序列和BLAST结果进行比较，找出引物在基因序列上的确切位置，这样才能准确算出扩增产物的长度。以zzy1895 BLAST结果中的、以mRNA为模板计算扩增产物长度为例（见下面），你的上游引物在该基因序列上的位置是162-181（见红色部分），下游引物在该基因序列上所对应的位置应该是377-358而不是379-358（见蓝色部分），所以扩增产物长度应该是216bp（377-162+1）而不是218bp（379-162+1）。
>gi|51826|emb|X03532.1|MMIGG1R Mouse mRNA for IgG1 induction factor
Length=580
Score = 44.1 bits (22), Expect = 0.017
Identities = 22/22 (100%), Gaps = 0/22 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 19 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 40
||||||||||||||||||||||
Sbjct 379 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 358
Score = 40.1 bits (20), Expect = 0.27
Identities = 20/20 (100%), Gaps = 0/20 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 20
||||||||||||||||||||
Sbjct 162 TCGGCATTTTGAACGAGGTC 181

作者: ero11 时间: 2016-4-6 11:12

不好意思,还想向楼上请教,很难得遇见象你和zzy1895这么细心,耐心,水平高又热心的老师,为什么在我的下游引物前会多出来TC呢?
Query 19 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 40
||||||||||||||||||||||
Sbjct 379 TCGAAAAGCCCGAAAGAGTCTC 358

作者: wanglaoshi 时间: 2016-4-6 11:12

我实际上没有自己检索，就按楼主提供的blast结果分析了一下pcr产物的长度。
“他是选择了1-20 19-40,你选的是1-20 26-45,为什么会有不同选择呢? " ,实际上，具体选择哪个片断不是看上列，而应看下列，上列是楼主自己输入的，而下列才是特异性序列在核酸中的位置。另外，只要楼主的RNA提得纯度高，没有DNA污染，就不用担心扩出基因组的片断来。

作者: langlang 时间: 2016-4-6 11:13

12楼
不好意思,我的问题比较多,我是初学者,还很少有机会向高手请教,几乎全靠在园子里浏览大家的精彩讨论,学到很多东西,本次发贴也是实在自己冥思苦想也无果的举措.
我在用文献中查到IFN- gamma的引物找其所扩片段大小时,(上游: 5’-GCTCTGAGACAATGAACGCT-3’ 下游:5’-AAAGAGATAATCTGGCTCTGC-3’)发现结果:
>gi|26354598|dbj|AK089574.1| Mus musculus activated spleen cDNA, RIKEN full-length enriched
library, clone:F830002I10 product:interferon gamma, full insert
sequence
Length=1208
Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.019
Identities = 21/21 (100%), Gaps = 0/21 (0%)
Strand=Plus/Plus
Query 1 GCTCTGAGACAATGAACGCTA 21
|||||||||||||||||||||
Sbjct 99 GCTCTGAGACAATGAACGCTA 119
Score = 42.1 bits (21), Expect = 0.019
Identities = 21/21 (100%), Gaps = 0/21 (0%)
Strand=Plus/Minus
Query 21 AAAGAGATAATCTGGCTCTGC 41
|||||||||||||||||||||
Sbjct 327 AAAGAGATAATCTGGCTCTGC 307
即上游引物Query 1 GCTCTGAGACAATGAACGCTA 21
后面比我的引物多出来一个A,我也不知道是原文献中在印刷时少打了一个"A"?还是不要这个"A"也能扩增出想要的目的片段呢?我要想合成引物,要不要把"A"加在后面呢?
不好意思,耽误大家的保贵时间了

作者: wanglaoshi 时间: 2016-4-6 11:13

这位站友太客气了，大家只有在院子里多多讨论，彼此学习，才能不断进步，我这些关于blast方面的知识也全是在园子里学来的，楼主所说这种情况我还真没注意过，不过这个a可有可无，如果按引物设计的原则来说，没有更好，因为3‘端是A容易引起非特异扩增，但在实际操作过程中，好像并不是这样。所以，我认为楼主没必要深究这个问题。只要引物序列能100%互补就行。

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)