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标题: 【求助】荧光定量 PCR扩增曲线异常，超奇怪 [打印本页]

作者: IAM007 时间: 2016-4-6 11:15 标题: 【求助】荧光定量 PCR扩增曲线异常，超奇怪

扩增漂亮的是标准品（含目的基因的质粒），起始荧光背景高的是样品（从肾脏用TRIZOL提RNA，反转录CDNA），用REAITIME产物跑了电泳，目的带很亮且特异。并且这些模板都用普通PCR检测均有目的带，病毒含量应该很高的，难道是模板不纯抑制了。望各位前辈赐教，谢谢

作者: IAM007 时间: 2016-4-6 11:15

REAITIME产物跑的电泳，最右为阳性对照

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作者: IAM007 时间: 2016-4-6 11:15

融解曲线结果，没有杂峰

作者: IAM007 时间: 2016-4-6 11:16

分析可能模板太浓，稀释10倍100倍1000倍，结果如图，稀释后有所转好，但CT值很大了，这样的结果可信吗？并且三者检测结果不成１０倍梯度关系。待测得病毒含量低的样品稀释后其不测不出了(敏感性标准品为10*1拷贝数）

作者: IAM007 时间: 2016-4-6 11:16

模板释10倍100倍1000倍，REAITIME产物跑电泳结果如图从左到右：1000---100--10---阳性对照，梯度挺明显的呀

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作者: IAM007 时间: 2016-4-6 11:17

怀疑是用TRIZOL从肾脏提RNA右问题，跑电泳如图从左到右：RNA三条带，15000MARKER(没跑开）。RNA完整性很好，用分光光度计测的２６０／２８０为１．８。纯度也没有问题，难道是反转录CDNA过程有问题，可都是按说明书一步一步做的，普通PCR电泳图很好的呀

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作者: IAM007 时间: 2016-4-6 11:18

普通PCR电泳图

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作者: 555444 时间: 2016-4-6 11:19

看起来是样本提纯的问题，之所以浓度高的样本扩增曲线没有分得太开，可能的原因是样本不纯，存在很多其他的双链，导致荧光染料内插进双链发光，所以背景很高，虽然扩增结束后融解曲线有明显的峰，但背景高导致扩增产物经过很多循环其表征的荧光信号才能超越背景。
稀释后杂质也相应减少了，所以背景有降低，曲线背景和平台期区分得更明显些。其实Ct值在13～30之间都可以采用，只是模板浓度越低，样本稀释等问题越容易导致结果不准确。事实上，一般检测1000拷贝一下的样本，使用realtimePCR的染料法要慎用了。
在园子里检索一下，类似的问题有好多。

作者: IAM007 时间: 2016-4-6 11:21

谢谢，已经重新提模板了，希望有所改善

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