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标题: 【求助】QPCR扩增效率太低 [打印本页]

作者: ending 时间: 2016-4-6 11:22 标题: 【求助】QPCR扩增效率太低

大家好，我做QPCR基因扩增效率的时候，一个基因由于CT太大，所以只进行4个2倍的稀释度，二步法退火温度是61度扩增效率不高只有78%（图1）溶解曲线（图3），所以我做了三步法退火温度59度扩增效率反而更低了只有57%（图2）溶解曲线（图4），很奇怪，请教下大家看这是什么原因，该怎么改进呢？有看到资料说把引物浓度提高，不知道效果怎样。

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作者: ending 时间: 2016-4-6 11:24

图2

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作者: ending 时间: 2016-4-6 11:25

图3~~~~~~~~~~~~~~~

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作者: ending 时间: 2016-4-6 11:26

图4~~~~~~~~~

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作者: viviwang1987 时间: 2016-4-6 11:30

2倍的稀释度很容易产生误差（枪头微小的残留可能就影响样品之间的稀释比例）。
再加上你本身样品CT值就很大，通常来说CT值大于32可信度就已经降低了（因为样品稀释度很高时就不服从正态分布，而是服从贝努里分布）。
所以你的标准曲线数据重现性会很差，计算出来的效率也会忽高忽低。
建议先用PCR扩增目的基因，然后再用PCR后产物（最好是10倍等比稀释7个梯度，每个梯度做三个重复）来做标准曲线。

作者: viviwang1987 时间: 2016-4-6 11:30

举个简单例子说明这个问题：
1）假设地上有1000个绿豆。现在你闭上眼睛从中间切下去，那么大致能对半分，也就是500：500（1:1）的关系。
2）然后将其中的500再闭上眼睛从中间切下去，那么还是能大致对半分。
3）如此反复进行。。。。
4）当最后剩3个绿豆，现在再闭上眼睛从中间切下去，就有很大概率是一边3个，另一边0个（即全或无的关系）。
因此，如果绿豆数量多的时候，闭上眼睛从中间切下去，大致能对半分，这就是服从线性分布。
如最后绿豆数量减少到一定的时候，闭上眼睛从中间切下去，绝大部分情况是全或无的关系，这时就服从贝努里分布。
回归qPCR:
“绿豆” = “DNA”
“闭上眼睛从中间切下去” = “二倍稀释” （强调“闭上眼睛”是因为我们稀释时也看不见DNA，保证随机性）。
当DNA稀释服从线性分布时，这时的qPCR就是传统意义上的qPCR. 这时候的标准曲线才时一条直线。
当DNA稀释服从贝努里分布时，这时的qPCR叫做"digital PCR(数字PCR)". 为什么起这个名字呢？因为计算机存储是 0与1, 也就是全或无。以前大学生理学上提到过细胞动作电位的“全或无”现像也是这个道理，是数字信号，区号于模拟信号。

作者: 9900 时间: 2016-4-6 11:35

无所谓吧。pcr效率本来就很少95%的。多数都是90%就不错了。只要每次实验都做标准曲线就可以了。

作者: owanaka 时间: 2016-4-6 11:35

楼主是用那个公司的染料？最近我也在做实时荧光PCR，发现扩增效率也降低了，本来90%以上的，现在只有60%左右了，不知是不是染料原因？

作者: wiwi 时间: 2016-4-6 11:38

我的是Thermo下的FINNZYMES

作者: wiwi 时间: 2016-4-6 11:42

楼主是用那个公司的染料？最近我也在做实时荧光PCR，发现扩增效率也降低了，本来90%以上的，现在只有60%左右了，不知是不是染料原因？

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可以说是染料原因，也可以说不是染料原因。
因为SYBR这个染料是靠嵌入DNA发光来检测DNA量的。所以必然会影响DNA复制的效率。另外SYBR是溶解在DMSO中的。如果量太大DMSO也会抑制PCR反应。
因此很多正常的引物用在SYBR里面都会效率下降，有时候需要重新设计引物。
但是只要质量合格，跟哪个公司关系不大。

作者: wiwi 时间: 2016-4-6 14:18

好像理论上95%-105%是算比较有效的扩增。

作者: jude 时间: 2016-4-6 14:24

我用的Evagreen，在ABI7500里扩增，用自带软件分析每次扩增效率都大于100%，一般都超过105%了。

作者: nut6694 时间: 2016-4-6 14:24

2倍的稀释度很容易产生误差（枪头微小的残留可能就影响样品之间的稀释比例）。
再加上你本身样品CT值就很大，通常来说CT值大于32可信度就已经降低了（因为样品稀释度很高时就不服从正态分布，而是服从贝努里分布）。
所以你的标准曲线数据重现性会很差，计算出来的效率也会忽高忽低。
建议先用PCR扩增目的基因，然后再用PCR后产物（最好是10倍等比稀释7个梯度，每个梯度做三个重复）来做标准曲线。

作者: ending 时间: 2016-4-6 14:37

QUOTE:

原帖由 nut6694 于 2016-4-6 14:24 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

2倍的稀释度很容易产生误差（枪头微小的残留可能就影响样品之间的稀释比例）。
再加上你本身样品CT值就很大，通常来说CT值大于32可信度就已经降低了（因为样品稀释度很高时就不服从正态分布，而是服从贝努里分布）。
所以你的标 ...

谢谢，很好的建议！以后尝试下。就是有个问题，以前我相同方法，试剂什么也一样的情况下，这个基因CT值有30的，现在补做扩增效率，怎么也达不到30了，只有33左右。这是什么原因，模板降解了吗？我都是放在-20度的，就这次用的时候解冻了下。

作者: nut6694 时间: 2016-4-6 14:38

QUOTE:

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谢谢，很好的建议！以后尝试下。就是有个问题，以前我相同方法，试剂什么也一样的情况下，这个基因CT值有30的，现在补做扩增效率，怎么也达不到30了，只有33左右。这是什么原因，模板降解了吗？我都是放在-20度的，就这次用的时候解冻了下 ...

有几个潜在原因：
1）首先就是你所说的模板降解。
2）荧光染料随时间增加而敏感性降低。
3）qPCR软件在处理数据过程中设置的baseline和threshold前后有所差别也会导致单一CT value的变化。

作者: ending 时间: 2016-4-6 14:49

QUOTE:

原帖由 nut6694 于 2016-4-6 14:38 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

有几个潜在原因：
1）首先就是你所说的模板降解。
2）荧光染料随时间增加而敏感性降低。
3）qPCR软件在处理数据过程中设置的baseline和threshold前后有所差别也会导致单一CT value的变化。 ...

是啊，我的染料4月份就过期了。可能是这个的原因。
另外我最近一直有个关于兼并引物的困惑，一直没有被解答，很着急，能麻烦您有空的时候帮我解答下吗？不甚感激

作者: xyw5 时间: 2016-4-6 14:50

因为样品稀释度很高时就不服从正态分布，而是服从贝努里分布）。

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能否详细解释下这句话什么意思？本人数学不是很好。。。谢谢

作者: 33号 时间: 2016-4-6 14:57

能否详细解释下这句话什么意思？本人数学不是很好。。。谢谢

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举个简单例子说明这个问题：
1）假设地上有1000个绿豆。现在你闭上眼睛从中间切下去，那么大致能对半分，也就是500：500（1:1）的关系。
2）然后将其中的500再闭上眼睛从中间切下去，那么还是能大致对半分。
3）如此反复进行。。。。
4）当最后剩3个绿豆，现在再闭上眼睛从中间切下去，就有很大概率是一边3个，另一边0个（即全或无的关系）。
因此，如果绿豆数量多的时候，闭上眼睛从中间切下去，大致能对半分，这就是服从线性分布。
如最后绿豆数量减少到一定的时候，闭上眼睛从中间切下去，绝大部分情况是全或无的关系，这时就服从贝努里分布。
回归qPCR:
“绿豆” = “DNA”
“闭上眼睛从中间切下去” = “二倍稀释” （强调“闭上眼睛”是因为我们稀释时也看不见DNA，保证随机性）。
当DNA稀释服从线性分布时，这时的qPCR就是传统意义上的qPCR. 这时候的标准曲线才时一条直线。
当DNA稀释服从贝努里分布时，这时的qPCR叫做"digital PCR(数字PCR)". 为什么起这个名字呢？因为计算机存储是 0与1, 也就是全或无。以前大学生理学上提到过细胞动作电位的“全或无”现像也是这个道理，是数字信号，区号于模拟信号。

作者: vvmmoy 时间: 2016-4-6 14:58

最近在做QPCR之前用罗氏的SYBR做得很好，扩增效率均在95%，引物溶解曲线是单峰，特异性好。但是老板换了TOYOBO的SYBR同样的体系扩增效率下降了60%，扩增效率很低，荧光染料也会影响扩增效率么？

作者: yhtfyl 时间: 2023-2-24 08:42

感谢楼主分享，受教了

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