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标题: 【求助】请教大家反转录后PCR加多少模板cDNA的问题 [打印本页]

作者: @STAR@ 时间: 2016-4-6 15:00 标题: 【求助】请教大家反转录后PCR加多少模板cDNA的问题

各位高手请不吝赐教。。感激不尽。。。
我做的RNA反转，现在提到的RNA浓度有1000ng/μl，然后用的TAKARA的反转试剂盒。
是要做荧光定量的，所以想先做个普通的PCR看看引物的效果。。。
请教大家用一个25μl的体系怎么样，怎么配比较好？。
我是新手。。。完全没有概念。。。
加cDNA模板的浓度要求是多少？
谢谢大家⊙﹏⊙b。

作者: ending 时间: 2016-4-6 15:00

不要超过PCR体系的10%。
逆转录的Buffer体系(主要是缓冲体系和镁离子)会影响后续PCR的Buffer 体系。
另外，配制PCR体系，每种成分的加样量不要低于1ul，不然实验重复性会非常糟糕了；引物和PCR成分可以事先预混，cDNA可以稀释后再加。

作者: @STAR@ 时间: 2016-4-6 15:01

QUOTE:

原帖由 ending 于 2016-4-6 15:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不要超过PCR体系的10%。
逆转录的Buffer体系(主要是缓冲体系和镁离子)会影响后续PCR的Buffer 体系。
另外，配制PCR体系，每种成分的加样量不要低于1ul，不然实验重复性会非常糟糕了；引物和PCR成分可以事先预混，cDNA可以稀释 ...

谢谢您的指点。。我是不是可以把除了模板和taq酶之外的其他组分先配成MIX，然后分到每个管中？。。。我师姐说必须要按顺序一个一个的加。。。但是我觉得先混合成MIX没有区别啊

作者: SO2 时间: 2016-4-6 15:02

如果用相同的引物，可以把模板之外的所有成分预混，最好所有PCR成分都预冷，预混后放冰上。
在冰上操作是为了减少非特异性扩增，因为在低温时Taq酶的聚合活性较低。你师姐说的也有一定的道理：各成分绕PCR管加在壁上或者盖子上，最后离心混合，也是为了减少非特异性扩增。但是那样做的话加样误差太大，实验重复性不高。

作者: @STAR@ 时间: 2016-4-6 15:02

QUOTE:

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如果用相同的引物，可以把模板之外的所有成分预混，最好所有PCR成分都预冷，预混后放冰上。
在冰上操作是为了减少非特异性扩增，因为在低温时Taq酶的聚合活性较低。你师姐说的也有一定的道理：各成分绕PCR管加在壁上或者盖子 ...

谢谢你的指点。那混合后能不能涡旋一下？我听有人说有酶的都不能涡旋。。。但是我们一直都是涡旋一下再离心。。。

作者: F22 时间: 2016-4-6 15:03

Taq 和pfu之类的酶都很强悍的，涡旋一下不会有影响的

作者: shenkunjie 时间: 2016-4-6 15:04

建议不要把引物和buffer还有酶预混，酶在低温也是有活性的，容易形成引物二聚体，而且万一你的引物设计的有问题，那你混好的东西就全浪费了。
1000ng太高了，可以稀释成100ng/ul，然后加1ul就够了，甚至有人告诉我她用30ng也能扩出来，不过我一直用100ng

作者: @STAR@ 时间: 2016-4-6 15:05

QUOTE:

原帖由 shenkunjie 于 2016-4-6 15:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
建议不要把引物和buffer还有酶预混，酶在低温也是有活性的，容易形成引物二聚体，而且万一你的引物设计的有问题，那你混好的东西就全浪费了。
1000ng太高了，可以稀释成100ng/ul，然后加1ul就够了，甚至有人告诉我她用30ng也能扩出 ...

那么除了酶、模板之外其他的成分（buffer,mg,dNTP,水）先混起来做个Mix应该没有问题。对吧？

作者: any333 时间: 2016-4-6 15:08

恩，不过一定要按比例混匀，每次拿出来P的时候也最好涡旋一下

作者: 33号 时间: 2016-4-6 15:09

你好，你一直用的100ng/ul 是在做普通PCR时的cDNA的用量吗？
谢谢

作者: 33号 时间: 2016-4-6 15:10

你好，我现在也正在做普通PCR，想检测在细胞中一种基因是否存在，我提了RNA后逆转录cDNA ,40ul 体系的，RNA我加了4000ng。在做普通PCR时，cDNA加入多少量合适？多了是否会有影响？

作者: yhtfyl 时间: 2023-2-24 08:46

感谢楼主分享，受教了

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