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标题: 【求助】聚丙烯酰胺凝胶电泳 [打印本页]

作者: HP007 时间: 2016-4-6 15:31 标题: 【求助】聚丙烯酰胺凝胶电泳

想问一下，相隔十个bp的片断在聚丙烯酰胺凝胶电泳中好不好分离啊？有没有哪位做过这么小片段的分离。谢谢了。

作者: 33号 时间: 2016-4-6 15:32

应该可以分离的，因为聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用来检测点突变和基因微卫星，都是对小片段异常的检测，分离10bp片段应该是可以的，但要注意选择合适的胶浓度和交联度，可以参考分子克隆书

作者: 45778 时间: 2016-4-6 15:32

个人认为，用普通聚丙烯酰胺凝胶电泳是分辨不出的，
1.双链DNA分子存在构象上的差异，其直链，环与超螺旋的迁移率有一定差别，在带型判定上会引起混淆
2.普通聚丙烯酰胺凝胶电泳的有效分辨率只有在凝胶浓度达到20%时，分辨率才能达到10bp，但此时的分辨范围只有10bp-100bp，恐怕不能达到实验要求。
建议使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，即加入8M尿素的聚丙烯酰胺凝胶，尿素可使DNA双链打开全部呈单链状态，消除了构象带来的干扰，分辨率最高可达1bp。

作者: 831226 时间: 2016-4-6 15:33

请问楼上的战友，用同样的样品（标准）做单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳＆双链聚丙烯酰胺凝胶电泳，其结果一样吗？有什么差异吗？急！

作者: HPLC使者 时间: 2016-4-6 16:05

回楼主：
我做过相差这么大的片段，用非变性聚丙烯酰胺凝胶肯定没问题，具体用多大浓度，就看你的片段长度了，DNA片段长度与丙烯酰胺的浓度选择如下:
DNA片段长度(核苷酸数) 丙烯酰胺(%)
1Kbp～700bp 3.5
700bp～500bp 5
500bp～200bp 8
200bp 12

作者: viviwang1987 时间: 2016-4-6 16:11

我做了一个月了可以用非变性聚丙烯酰胺凝胶分开10bp的DNA片断。用的是12%浓度胶。电泳仪和电泳槽是美国amersham公司。marker是大连宝生物公司20bp梯度marker，范围是20-200bp。你的电泳片断在200bp以下应该可以分出。
电压是50v，时间是3h。胶为9cm长，20bp，40bp，60bp间隔约1.5cm。

作者: u76mp 时间: 2016-4-6 16:13

我最近也要做PAGE,我的目的片段在50－150bp，我也觉得选择非变性PAGE，浓度大约在8%－12%比较合适，但是我还有一个疑问：在分子克隆书书上提及的关于染料溴酚蓝的迁移率是什么意思啊，对电泳分析结果有什么影响吗？谢谢指教

作者: 8princess8 时间: 2016-4-6 16:13

6%-12%的非变性聚丙烯酰胺凝胶可分开4bp的片段，若是变性聚丙烯酰胺凝胶甚至可分开2bp的片段。现在很多法医实验室就是用PAGE胶银染方法进行4bp重复的STR等位基因分型。
另外一点就是电泳时间最好久一点，2~3小时，根据玻璃板的长度和电压而定。所以玻璃板最好要长点，30~40cm为佳。但象你只分开10bp片段，无需这么长，20cm左右就可以了。

作者: idea2011 时间: 2016-4-6 16:13

我觉得可以用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，我们法医物证教研室就用的浓度为6%交联度为4%的PAG，电泳槽是自制的，通过银染的方法进行STR基因分型，重复单位是4bp，效果很好啊。
关键是实验室的设备条件的差异，需要选择最合适的电泳条件。我们用的是恒流，当然也可以恒压电泳。

作者: idea2011 时间: 2016-4-6 16:14

求助: 我的两个片段是750BP左右,它们相差十几个BP,我想分开这两个片段,并且想回收.请问我该用多大浓度的胶? 怎么回收?用银染可以回收吗?和用EB回收方法一样吗?

作者: 许愿精灵 时间: 2016-4-6 16:16

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原帖由 idea2011 于 2016-4-6 16:14 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

求助: 我的两个片段是750BP左右,它们相差十几个BP,我想分开这两个片段,并且想回收.请问我该用多大浓度的胶? 怎么回收?用银染可以回收吗?和用EB回收方法一样吗? ...

俺的也是750左右，相差十几个bp。目前也还没分开。

作者: hdmi 时间: 2016-4-6 16:22

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原帖由 许愿精灵 于 2016-4-6 16:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

俺的也是750左右，相差十几个bp。目前也还没分开。

要用梯度胶分离两个相近片段。

作者: 831226 时间: 2016-4-6 16:22

QUOTE:

原帖由 hdmi 于 2016-4-6 16:22 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

要用梯度胶分离两个相近片段。

我最近也要做PAGE,我的目的片段在50－150bp，我也觉得选择非变性PAGE，浓度大约在8%－12%比较合适，但是我还有一个疑问：在分子克隆书书上提及的关于染料溴酚蓝的迁移率是什么意思啊，对电泳分析结果有什么影响吗？谢谢指教
溴酚蓝的迁移率是指溴酚蓝在电泳时相当于多少bp的片段，比如在12%聚丙烯酰胺胶里相当于20bp的片段额。。。。应该是这样的

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