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标题: 【求助】甲基化特异性PCR的修饰问题 [打印本页]

作者: 小荷尖尖 时间: 2016-4-7 10:35 标题: 【求助】甲基化特异性PCR的修饰问题

我做了三周的甲基化特异性PCR了，可用修饰完的DNA做模板，甲基化、非甲基化引物都扩不出来，而野生型引物确能扩出来，引物设计应该没问题，我现在高度怀疑是亚硫酸盐修饰有问题，不知用国产的亚硫酸氢钠和对苯二酚（北京化学试剂公司）可不可以？现在周围没有人能帮我，希望能得到任何做过MSP的人的指点，打电话也可以！急盼赐教！

作者: yes4 时间: 2016-4-7 10:36

我都是用Sigma的sodium bisulfide及hydroquinone 修飾我的DNA建議你用的純度高一點或是覺得MSP不好做也可改用COBRA(Comined Bisulfite Restriction Analysis)以bisulfide修飾後PCR amplify 後再以酵素切能切動即是有甲基化(Nucleic Acids Research, 1997, Vol. 25, No. 12 2532–2534)

作者: u76mp 时间: 2016-4-7 11:21

野生型引物能扩出条带来，是因为甲基化修饰不完全，修饰后的DNA中有野生型的DNA 。在进行MSP时往往要采用热启动PCR,使双链DNA充分解链，仅其中的一条链作为模板进行扩增。

作者: 小荷尖尖 时间: 2016-4-7 11:23

先谢谢你, 我正准备换用Sigma的产品,但又觉得同样是分析纯,国产试剂(新买的)应该可以修饰,即使是修饰的不完全,M或U引物也应有条带,我是完全按照Current Protocols in Human Genetics(1998) Herman 提出的方法做的，有用这个方法的同胞吗？是不是这个方法做msp 很难！马上要交课题总结了，急死我了！

作者: 33号 时间: 2016-4-7 14:16

实在是劝你改用现成的试剂盒，如chemicon公司的，效果很好，价钱也不算贵，3000左右。可以做几十例呢，我们一直在用，到目前为止已经用到第三盒了。

作者: 小荷尖尖 时间: 2016-4-7 14:21

我用手工修饰的纯化试剂也很贵,要是做不出什么就换试剂,我怕过不了老板这一关呀!我相信别人用这种方法能做出来,我的试验不知是哪个环节出了问题!

作者: DDD 时间: 2016-4-7 14:21

我用的是chemicon公司试剂盒，可一直做不出来，请教楼上你的PCR体系是多少？修饰前后DNA量有多少？能否把你的protocol传一份给我，急啊，老板催!

作者: boom 时间: 2016-4-7 14:26

你的问题确实有修饰不完全的因素存在。建议：
1、重新修饰。降低修饰的DNA的量（1-2ug就可以了）；提高修饰的温度，约提高5度左右；也可以增加修饰的时间。当然能用试剂盒就更好了。
2、“如果修饰不完全，至少应该有少量的目的片段被修饰，这样以这些少量的DNA为模板，应该M或U引物也应该有条带呀？” 你所说的这个也很有道理的，所以你可以优化你的PCR，建议提高你的退火温度，延长退火与延伸时间（可以用45s--60s）

作者: 小荷尖尖 时间: 2016-4-7 14:31

有个问题不明白，我看到不同的实验室用的亚硫酸氢钠的浓度不同，我是按HERMAN提出的2.6M的终浓度，有人用3.3M，还有用更高浓度的，我用的是国产的试剂，而HERMAN用的是SIGMA的试剂，想请教你1、亚硫酸氢钠、氢氧化钠和醋酸铵的终浓度用多大量合适？
2、醋酸铵的作用是中和反应体系中的碱，还有作为沉淀反应的盐，那么该如何确定其用量呢？
3、氢氧化钠再修饰的过程中用到两次，第一次起变性作用，机理是什么（怎么变性）？第二次是脱磺基作用，反应式是什么？
我想调整我的试验，但又不明白其中的细节，希望做甲基化的朋友能踊跃参加讨论，不知道在哪能找到这方面的知识？请大家给个提示！

作者: 9900 时间: 2016-4-7 14:32

我用的也是chemicon公司试剂盒，一直做不出来，试剂都快用完了还没有结果．郁闷呀．tjmedwnn，你能传一份你的protocol给我吗．感激不尽！！

作者: 33号 时间: 2016-4-7 14:57

帮小弟一把，我做了很长时间了，可就是不知道哪里出问题了。会不会是chemicon的试剂有问题啊，请教tjmedwnn 你的PCR体系是多少？修饰前后DNA量有多少？能否把你的protocol传一份给我

作者: cj_mondy 时间: 2016-4-7 14:58

我觉得PCR体系倒不是重要的啊，操作就是照试剂盒的说明书一样啊，你先说说你的问题所在吧，是PCR扩后没带还是什么啊，你确定你的标本就一定是甲基化标本吗？

作者: wiwi 时间: 2016-4-7 14:59

我现在用的是细胞系做的Raji,Hela。文献上Raji是甲基化的，我做出来有很多非特异带，没有目的带（应该是100bp左右）。我的引物是文献上的，在做的过程中有什么需要特别注意的

作者: SO2 时间: 2016-4-7 15:02

你可以试一下做一个梯度PCR，从文献的退火温度向上下各5度
还有就是你在加DNA模板的时候千万主意不要加进去沉淀（就是试剂III），另外不知道你在修饰的时候加试剂IV了没有啊，没有就最好加一下。

作者: xueyouzhang 时间: 2016-4-7 15:04

我做过梯度，试剂IV不是要样本量不足时才加吗？我的DNA量够，所以就没有加，
是否应该在用ＴＥ溶解后，再离心使试剂III沉淀后吸取。
我试试，回头告诉你结果

作者: 33号 时间: 2016-4-7 15:04

你的结果怎么样了啊？

作者: chenshuanhe 时间: 2016-4-7 15:05

已经看到有目的条带大小的条带出来了，我想应该是吧，但是非特异的杂带也很多，今天重复设了模板和温度梯度可是目的带没有了，不知是怎么回事

作者: 101010 时间: 2016-4-7 15:06

给上面的朋友推荐一个好的实验方法论坛 protocol online论坛: 是美国华人所办，版主都是美国实验顶尖高手。有许多实验中的疑难问题的解决方法。尤其是甲基化实验。
cuturl('http://www.protocol-online.org/forums/index.php?showforum=6/')

作者: 131415 时间: 2016-4-7 15:07

我也正在准备这个实验，国外师兄推荐的这个MSP的方案值得参考。他是一次就成功的。
cuturl('http://www.mdanderson.org/departments/methylation/dIndex.cfm?pn=A3F15D82-C9B4-41CD-BA4BE767E50A73D2')

作者: SO2 时间: 2016-4-7 15:07

我知道这个网站，上面的protocol是手工修饰，我用的是试剂盒，昨天做出来的结果不错，带清晰背景干净，但是非甲基化也有大小相似的带出来（样本是甲基化的），怎么回事？

作者: 33号 时间: 2016-4-7 15:08

我还没有完全明白，不过这里到是有这样的结果。文章见
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=1623846&sty=3&keywords=%BC%D7%BB%F9%BB%AF')
下面附件中标记处
这里的解释是标本4-6中既含有甲基化的等位基因，也含有未甲基化的等位基因。我的理解是标本的DNA经亚硫酸盐不完全处理，因为对于某一个个体的DNA，他/她的基因是否甲基化和/或甲基化的水平在一定情况下（比如你已经取到的标本中）是一定的。希望战友再给出确定的解释。

作者: 33号 时间: 2016-4-7 15:09

建议看这个帖子，很有启发。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=2704574&sty=1&tpg=1&age=0')

作者: 33号 时间: 2016-4-7 15:09

我知道这个网站，上面的protocol是手工修饰，我用的是试剂盒，昨天做出来的结果不错，带清晰背景干净，但是非甲基化也有大小相似的带出来（样本是甲基化的），怎么回事？

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我个人认为可能是：
首先，你能否保证你的标本就是完全甲基化的呢？如果使用的是非细胞系标本（如手术后组织标本），是无法保证在完全甲基化标本内没有参杂未甲基化DNA的
其次，甲基化可以分为完全甲基化，完全未甲基化，还有半甲基化（即一条完全未甲基化，而另一条则完全甲基化，事实上这就是所谓的基因印迹Gene Imprinting）这在人类都可能是正常的。

作者: ending 时间: 2016-4-7 15:11

修饰PCR和MSP的反应条件一致吗,它们除了引物不一样,其他条件一样吗

作者: 33号 时间: 2016-4-7 15:11

QUOTE:

原帖由 ending 于 2016-4-7 15:11 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
修饰PCR和MSP的反应条件一致吗,它们除了引物不一样,其他条件一样吗

不知道你说的修饰PCR是什么东东啊？？

作者: wu11998866 时间: 2016-4-7 15:12

我现在做Hela细胞系的甲基化，文献报道是完全非甲基化的，可是我用两对引物分别做出来甲基化和非甲基化两种结果（引物都是引用文献里的），而且每批修饰后的MSp，有时是甲基化，有时是非甲基化，那位大侠能帮我分析一下是怎么回事，谢了先

作者: 45778 时间: 2016-4-7 15:15

不好意思,是测序PCR,其引物包括目的基因的上下游片断.不包括CpG位点.

作者: 555444 时间: 2016-4-7 15:18

我考虑是不是细胞存在亚系的问题？

作者: 3.14 时间: 2016-4-7 15:18

我考虑是不是细胞存在亚系的问题？
我用的细胞是同一瓶同一次提的DNA,修饰,MSP,但是不同的引物,就有不同的结果

作者: 小荷尖尖 时间: 2016-4-7 15:20

我现在做Hela细胞系的甲基化，文献报道是完全非甲基化的，可是我用两对引物分别做出来甲基化和非甲基化两种结果（引物都是引用文献里的），而且每批修饰后的MSp，有时是甲基化，有时是非甲基化，那位大侠能帮我分析一下是怎么回事，谢了先

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我认为你应该先分析一下你的引物是否特异，如CG位点的含量是否过少，再设计一对引物试试是否结果一样？

作者: F22 时间: 2016-4-7 15:21

请问：
国产的亚硫酸氢钠和对苯二酚（北京化学试剂公司）和Sigma的sodium bisulfide及hydroquinone 的价格个是多少？谢谢

作者: daod 时间: 2016-4-7 15:25

大家知道北京医科大学肿瘤研究所的邓大君教授么？他可是专家啊！我也想做MSP，可是畏难啊！失败……

作者: kswl870 时间: 2016-4-7 15:25

请问邓教授是在北大医院还是在定慧寺的肿瘤医院?

作者: 二子 时间: 2016-4-7 15:30

邓教授在北大附属一院，北京市肿瘤研究所。

作者: 831226 时间: 2016-4-7 15:43

想请教各位大侠：如何设计MSP的引物？有专门的软件吗？

作者: 65urh 时间: 2016-4-7 15:50

野生型引物能扩出条带来，是因为甲基化修饰不完全，修饰后的DNA中有野生型的DNA 。在进行MSP时往往要采用热启动PCR,使双链DNA充分解链，仅其中的一条链作为模板进行扩增。
我想问一下何谓野生型引物？它和M或U引物有和不同？何谓甲基化修饰不完全，是不是一部分DNA修饰了另一部分完全不修饰，但这样的话M或U引物均扩得出啊；还是所有DNA中仅部分位点进行修饰，所以M或U引物扩不出，但野生型引物扩哪段？

作者: TAT 时间: 2016-4-7 15:52

野生型引物是针对未修饰的DNA设计的，而甲基化特异和非甲基化特异性引物都是针对修饰后的DNA设计的，所以如果修饰完全的话野生型引物是不会扩增出条带来的。

作者: ladyhuahua 时间: 2016-4-7 15:52

我知道这个网站，上面的protocol是手工修饰，我用的是试剂盒，昨天做出来的结果不错，带清晰背景干净，但是非甲基化也有大小相似的带出来（样本是甲基化的），怎么回事？

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请问你在修饰过程中有哪些需要特别注意的吗?或者是你有什么样的心得,能交流一下吗?

作者: 45778 时间: 2016-4-7 15:53

有可能是部分甲基化呀

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