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标题: 【求助】RT-PCR一步法好还是两步法好? [打印本页]

作者: 爱老虎游tt 时间: 2016-4-8 09:04 标题: 【求助】RT-PCR一步法好还是两步法好?

请问
1.RT-PCR一步法好还是两步法好?
2.有没有人用过Access RT-PCR系统,请介绍一点经验!
3.我看过DXY的一些帖子,现在头都大了,RT-PCR到底能不能定量?怎样做才可以达到半定量?
4.我不知道该买多大的试剂盒,有哪位高手帮忙预算一下经费,和试剂盒的次数?优化的过程好像要花费很大的精力和试剂.
5.能否帮忙预算一下从RNA提取到RT-PCR全过程的经费预算?
谢谢各位大侠,我的问题很菜吧!!

作者: 王六六 时间: 2016-4-8 09:04

1.个人认为两步法好，因为反转录之后可以放心摸PCR反应的条件，特别是来源珍贵的标本或要做多个基因表达的标本的时候，用两步法更经济合算一些。
3.RT-pcr做半定量不准确，要不断地优化条件。最好实时荧光定量PCR。
4.5. 经费和你的标本量有关。TRIzol 100ml 1500左右，RT-PCR试剂盒100T好的要7000多，稍次一点的4000多，再差的用国产的几百，再加上琼脂糖，marker等，就一万五吧。PCR的优化过程可以买Takara或Promega的酶，比较经济实惠。

作者: ztonyc 时间: 2016-4-8 09:05

哥们，各有各的好处把。愚见如下：
一步法
优点：简单，方便。
缺点：灵敏度要比两步法低。不适合PCR初期条件的摸索，出了问题之后不能够很好的找到原因。
两步法
优点：灵敏度要比一步法高。在初期摸索PCR条件时，可以很容易找到问题所在。还有更为关键的一点是，做两步法可以节约monney,特别是宝贵的反转录酶，把反转录体系分开做，一次的转录产物可以多次用来做PCR，非常适用于摸索PCR条件。
缺点：麻烦。
故，如果你在PCR初期建议用一步法。如果你的条件摸索成熟，建议用两步法。

作者: coolcool 时间: 2016-4-8 09:05

RT-PCR定量比较麻烦，如果你想做的比较准确，最好还是用探针法，如果经费紧张，可以考虑染料法，PCR优化的好的话（非特异性扩增和引物二聚体比较少），加点SYBR Green I染料就可以定量。作为半定量还可以。
另外，如果你打算定量，最好还是用一步法，分为两步操作，就增加了出现误差的机率，另外，每一部的效率不同也能影响结果。最好同时加上一个看家基因作为内参，这样半定量更可靠一些。
Promega的Access RT-PCR System （A1250）我用过，效果不错，3000元左右，50微升的体系可以做一百次，当初为了省钱，每次都是做30微升的体系，可以多做很多次，至于具体的用量就要看你的样本量和实验进展了，如果你的引物设计的比较合理，实验室有些相关经验的话，摸条件应该不是很难。（我当初就是用这个直接加SYBR Green I做的荧光半定量。）
至于RNA的抽提，你可以买试剂盒，也可以用TRIzol 提取，看经费情况吧，前者省事些。

作者: 爱老虎游tt 时间: 2016-4-8 09:05

感谢各位大侠的执教,小弟受益匪浅!
我的经费很有限,我想根据文献的条件进行试验,实在不行再优化,不知大家是否赞同?

作者: eor 时间: 2016-4-8 09:06

Access RT-PCR我用过：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/373634_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/373637_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=373638&sty=3&keywords=Access+RT-PCR')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/275824_0.html')
效果不错，就是比较浪费一点，不过大批量样本做起来很爽呀。

作者: zhy平平 时间: 2016-4-8 09:06

QUOTE:

原帖由 eor 于 2016-4-8 09:06 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
Access RT-PCR我用过：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/373634_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/373637_0.html')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=373638&sty=3&keywords=Ac') ...

笨笨的问问，Access RT-PCR就是一步法RT-pcr吗？

作者: 爱老虎游tt 时间: 2016-4-8 09:06

QUOTE:

感谢！你提供的联接非常有用!!
我想根据文献的条件(别人的优化条件)进行实验,实在不行再优化,不知大家是否赞同,因为我感觉RT-PCR麻烦就麻烦在优化条件这一环节,也很浪费试剂,毕竟我们的经费太有限了,再者我们实验室没有PCR仪,到别人那里去蹭遭白眼的感觉真是很难受!!

作者: uaubc 时间: 2016-4-8 09:07

Access RT-PCR就是一步法RT-pcr。
根据文献的条件(别人的优化条件)进行实验,实在不行再优化，是可以的，就是一定要注意加样的量一定要精确。
祝你们成功！

作者: 3.14 时间: 2016-4-8 09:07

各位同志：
好，我也要做基因的定量，想做competitive RT-PCR, 不知哪位前辈做过给点建议

作者: eor 时间: 2016-4-8 09:08

QUOTE:

原帖由 爱老虎游tt 于 2016-4-8 09:04 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问
1.RT-PCR一步法好还是两步法好?
2.有没有人用过Access RT-PCR系统,请介绍一点经验!
3.我看过DXY的一些帖子,现在头都大了,RT-PCR到底能不能定量?怎样做才可以达到半定量?
4.我不知道该买多大的试剂盒,有哪位高手 ...

一步法和二步法各有优缺点。
　二步法RT-PCR ：
（1）可使用oligo(dT)，随机六聚体引物或基因特异性引物进行第一链合成。
（2) 高灵活性：可选用不同的酶系统。
（3）可优化困难的RT-PCR反应
（4）可实现长模板mRNA的转录扩赠(使用ELONG ASE Enzyme Mix) 。
（5）最适用于克隆产物(使用高确限度酶或混合酶) 。
一步法RT-PCR：
（1）第一链合成时只能使用基因特异性引物。
（2)高灵敏度：使用预混合的SUPETSCRIPT H和Taq聚合酶，可检测到低至0．1pg的mRNA。
（3）高便利性：所使用的酶已经预混合。移液步骤少，减少污染机会。
（4）产物长度，<3KB。
（5）最适于大量样品的分析
您可以根据你实验的要求来定。实验的经费我觉得买RT-PCR试剂盒可以先买一个25次的盒子试试，也就是1700—3000元左右，说不定你做熟了可以将反应体系减少一半，就相当于50次的了。

作者: INK 时间: 2016-4-8 09:08

各位同志大家好！有谁知道DDRT-PCR引物是如何设计的吗？可以给小弟推荐一些随机引物组合吗？谢谢！！！

作者: uaubc 时间: 2016-4-8 09:08

什么叫一步？
什么又叫两步？
谢谢，不吝赐教！

作者: yhn 时间: 2016-4-8 09:08

一步法是提取的RNA，设定特异性引物直接进行特定GENE扩增。两步是将RNA逆转录为cDNA后再进行特定GENE扩增。

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