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标题: 【求助】关于荧光定量PCR的假阳性问题（探针法） [打印本页]

作者: any333 时间: 2016-4-8 15:25 标题: 【求助】关于荧光定量PCR的假阳性问题（探针法）

用荧光定量PCR检测一个基因，用的探针法。现在有两个问题：
1. 我的无模板对照总是出现曲线，在10-30循环，没有固定的位置。起初以为是污染，可更换了新的水、dNTP、探针等，基本都换了新的，还换了加样的地点，换了加样的枪，仍然出现，没有什么区别。不知道为什么？
2. 用或不用模板，总有些曲线是斜行抬高的，就是从一开始就斜着上去的。以为是探针降解，可探针也是刚买的，用TE缓冲液溶解后还是比较注意操作的。
求助各位，谢谢

作者: any333 时间: 2016-4-8 15:26

我也是刚买的探针，买回来之后单独对探针跑线，都能跑出线，但不是S型的。。。是不是机器坏了？

作者: bluelake 时间: 2016-4-8 15:26

把所有的试剂混匀后再试一试，另，探针稀释一步要严格，稀释后分装，超低温保存，一定要避光

作者: yjf1026 时间: 2016-4-8 15:28

是气溶胶污染吧，同一个基因做多了可能会出现。有的说是盖子没盖严，阴性曲线会很奇怪。
多通风，或者用UNG酶吧

作者: 3.14 时间: 2016-4-8 15:28

对第二个问题，可能是液体蒸发造成的，我们遇到过。

作者: wiwi 时间: 2016-4-8 15:28

估计是气溶胶引起的可能性比较大，之前我也遇到相同的情况，然后挪到超净台去做就好多了。

作者: yhn 时间: 2016-4-8 15:29

恩我们实验室也遇到过类似问题，即使没有模板也会出现扩增曲线；老师解释说是行实时定量的实验室充满了大量DNA

作者: ero11 时间: 2016-4-8 15:30

关于气溶胶我已经很无奈了我每次用台前都要用酒精在台内彻底烧一遍- -

作者: bluelake 时间: 2016-4-8 15:30

遇到同样的问题，不过我是用的SYBGREEN，用水做模板都有扩增曲线，CT值在5-30不等，所有东西都换完了，操作很小心，同样的有情况，并且有个孔只加引物和MIX，也有斜行抬高的斜线，简直不知道是什么原因，不知道怎么解决！

作者: milkdog 时间: 2016-4-8 15:30

如果是斜行抬高的话，但不是S型的话，可能是由于蒸发的原因，可以考虑以石蜡油封盖试试

作者: 8princess8 时间: 2016-4-8 15:30

楼主的问题我也遇到了，出现假阳性，而且还有一开始就有曲线上扬的，请各位高手帮忙

作者: 8princess8 时间: 2016-4-8 15:36

我第一次引物循环在20-22，与文献中的不一致，所以后来也是相同的标本，浓度基本也一致的，重复一次在11-12左右，与文献中的一致了，所有的操作条件也一样的。可是发现对同一引物，同一疾病的不同标本的变化趋势却不一样，求解原因。

作者: 831226 时间: 2016-4-8 15:37

是斜行抬高的曲线，还是S型拐头向上的曲线？我们都用探针法做基因检测很多年了，好像不大容易出现假阳性结果。不过仪器要经常清洗，调整背景。

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