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标题: 【求助】请问AS-PCR和ARMS-PCR的区别？ [打印本页]

作者: 天蓝蓝 时间: 2016-4-8 15:38 标题: 【求助】请问AS-PCR和ARMS-PCR的区别？

是不是同一回事啊？

作者: PCR 时间: 2016-4-8 15:38

NAR(核酸研究)上关于AS-PCR有篇文章绝对经典，做AS-PCR必须要看。1990年左右，Huang MM写的。讲的是突变检测用引物3'末端不匹配碱基错配延伸问题。错配不可以是t:t，这样即使错配也能很有效地延伸。具体情况，请自己看那篇文章，必看文章。
最好用hot start.
根据我的经验以及文献报道，50以上，升高退火温度对错配区分特异性没有多大贡献。
如果你是要做multiplex PCR，引物浓度需要摸索，先从最低开始--可以考虑0.04uM。然后看哪条带不够亮那么就增加那条带的引物浓度，0.02地望上加。
注意一定要使用Taq而不能用有extaq, pfu, pyrobest这些有3'末端外切活性的。
或者考虑采用一种全新的实验方案。
这种方法有多种称谓，除了ASPCR这个名称之外，还有：等位基因特异扩增(ASA，Allele-specific enzymatic amplification)，等位基因特异酶扩增(ASEA，allele-specific enzymatic amplification)，扩增耐受突变系统(ARMS，amplification refractor mutation system)，错配PCR(mismatched polymerase chain reaction)，聚合酶等位基因特异扩增(PASA，PCR amplifications of specific alleles)以及错配扩增突变分析（MAMA，Mismatch amplification mutation assay）等等(K·B·穆里斯等，1997)。
错配延伸问题
在ASPCR问世时，人们就发现并非所有的错配碱基都可以有效地抑制PCR反应从而达到模板区分的目的(Newton等，1989)。然而，许多就错配延伸这个问题展开的研究结果之间，相互矛盾。
综合若干文献：引物末端与模板之间的a:a, a:g错配，可以放心地应用在ASPCR中。其他错配的情况，依据反应条件、所用试剂以及模板的不同，仍然需要具体实验来进行确定。
ASPCR的发展
ASPCR的发展，主要是围绕提高3’末端碱基错配分辨率来进行的。为了提高ASPCR对末端碱基错配的分辨力，人们尝试了许多方法。比如：改换另一条链进行分析以规避这些错配延伸率高的碱基组合；把控制PCR反应的关键成分稀释到接近极限的浓度；在检测用引物的3'末端附近人为引入新的错配；截短Taq DNA聚合酶；利用正配碱基、错配碱基掺入的动力学性质的差异，用腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)来增强这种差异，从而使信噪比大大提高；以及利用人工修饰的碱基作为3’末端碱基来抑制错配延伸率等等。
早期的改进方法
Bottema 等（1993）提出两个解决方案：一是设计引物时，如果引物3'末端可能与样品模板形成延伸率高的碱基错配，那么可以考虑以其互补链作为模板，从而避开这些高延伸率的错配。二是把控制PCR反应的关键成分稀释到接近极限的浓度。由于错配延伸效率毕竟比正配延伸要差，在扩增资源极低的情况下，错配延伸即使发生，也达不到可被显示出来的水平，因此避免了假阳性结果。但是，这两种方案都需要大量实验来对实验条件进行摸索优化，因此目前已较少被采用。
近期改进方法：
1。在3‘末端附近引入额外错配
2。腺苷三磷酸双磷酸酶介导的等位基因特异PCR法(apyrase-mediated allelespecific extension, AMASE)以及焦磷酸解激活的聚合反应法(Pyrophosphorolysis-activated polymerization, PAP)
3。AMASE
4。改进酶
5。锁定的核酸技术(locked Nucleic Acid, LNA)

作者: 9900 时间: 2016-4-8 15:39

是不是一定要扩增个大片段用来作阳性对照？扩增的几条引物之间（普通引物和等位基因特异性引物）的比例有讲究吗？

作者: u76mp 时间: 2016-4-8 15:39

您好！ARMS-PCR相关的实验我并没作过，体会不深，所以对于您的问题我也不敢信口雌黄，还望谅解！ZLMG肯定是这方面的能手了，您可以与他商量一下，估计能有很多收获。（我已经PM他了，请他来帮忙解决）

作者: xueyouzhang 时间: 2016-4-8 15:39

您好，看见你的pm了，您谬赞了，我也不是高手，只是自己做了一些，看了一些文献而已，crestor战友的阳性对照是什么意思呢？我们一般所说的阳性样本是已知基因型的纯合野生型或突变型的样本，您说的是不是内参考？至于公共引物和allele-specific primers之间的比例，有的文献是不同的，我查一查，或者您留个地址，我找着给您发过去

作者: 天蓝蓝 时间: 2016-4-8 15:40

我说的阳性对照是指的大片段，比如说：引物1和引物2扩增出500bp的片段，在引物1、2之间存在引物3和4，用3和2或者4和2可扩出小片段，比如200bp。我指的大片段就是500bp的这一条。
我想，既然2和3或者2和4的扩增产物的有无就可以确定基因是否发生突变了，那引物1存在是否必要呢？
关于几条引物的比例，我想请教的是长度和用量是否有讲究？我查到的资料，一般来说引物3和4比较短，大约13－17个就可以了；用量来说，一般3或4比1、2用的量稍微大一点。我想知道这样设计的理由是什么？
再次表示感谢。

作者: 3648755 时间: 2016-4-8 15:40

我来说一下我的体会
引物1存在的意义在于：它可以排除假阴性。因为在进行PCR时可能由一些不确定的因素导致扩不出产物，如果不加引物1这可能将这一情况误判为2，3或2，4的阴性结果。而加入引物１后无论2，3和2，4是阴性还是阳性结果都必须有1，2的扩增产物，从而避免了假阴性结果的产生。

作者: 8princess8 时间: 2016-4-8 15:41

我也在做这个，还在摸索条件。今天三个片段都看到了，但有非特异性。2和3或者2和4的扩增产物的有无就可以确定基因是否发生突变的要做两次可以不要1，但加4个引物在反应体系只做一次。其实引物浓度是自己摸索的，不尽相同吧，有的4个引物都相同。但最好退火温度接近。

作者: uaubc 时间: 2016-4-8 15:47

楼上战友说的有道理，加引物1是为了检测你的pcr体系的，这可能是一般所说的内参照吧，防止你所得到的阴性结果是否是假阴性。另外我所看见的文献说Allele-specific primer最好设计在30nt左右，是为了防止非特异性扩增的出现，将退火温度尽可能的提高，关于非特异性，楼上的战友可以试试touchdown的方法

作者: queen 时间: 2016-4-8 15:48

NAR(核酸研究)上关于AS-PCR有篇文章绝对经典，做AS-PCR必须要看。1990年左右，Huang MM写的。讲的是突变检测用引物3'末端不匹配碱基错配延伸问题。错配不可以是t:t，这样即使错配也能很有效地延伸。具体情况，请自己看那篇文章，必看文章。
最好用hot start.
根据我的经验以及文献报道，50以上，升高退火温度对错配区分特异性没有多大贡献。
如果你是要做multiplex PCR，引物浓度需要摸索，先从最低开始--可以考虑0.04uM。然后看哪条带不够亮那么就增加那条带的引物浓度，0.02地望上加。
注意一定要使用Taq而不能用有extaq, pfu, pyrobest这些有3'末端外切活性的。
或者考虑采用一种全新的实验方案。
这种方法有多种称谓，除了ASPCR这个名称之外，还有：等位基因特异扩增(ASA，Allele-specific enzymatic amplification)，等位基因特异酶扩增(ASEA，allele-specific enzymatic amplification)，扩增耐受突变系统(ARMS，amplification refractor mutation system)，错配PCR(mismatched polymerase chain reaction)，聚合酶等位基因特异扩增(PASA，PCR amplifications of specific alleles)以及错配扩增突变分析（MAMA，Mismatch amplification mutation assay）等等(K·B·穆里斯等，1997)。
错配延伸问题
在ASPCR问世时，人们就发现并非所有的错配碱基都可以有效地抑制PCR反应从而达到模板区分的目的(Newton等，1989)。然而，许多就错配延伸这个问题展开的研究结果之间，相互矛盾。
综合若干文献：引物末端与模板之间的a:a, a:g错配，可以放心地应用在ASPCR中。其他错配的情况，依据反应条件、所用试剂以及模板的不同，仍然需要具体实验来进行确定。
ASPCR的发展
ASPCR的发展，主要是围绕提高3’末端碱基错配分辨率来进行的。为了提高ASPCR对末端碱基错配的分辨力，人们尝试了许多方法。比如：改换另一条链进行分析以规避这些错配延伸率高的碱基组合；把控制PCR反应的关键成分稀释到接近极限的浓度；在检测用引物的3'末端附近人为引入新的错配；截短Taq DNA聚合酶；利用正配碱基、错配碱基掺入的动力学性质的差异，用腺苷三磷酸双磷酸酶(apyrase)来增强这种差异，从而使信噪比大大提高；以及利用人工修饰的碱基作为3’末端碱基来抑制错配延伸率等等。
早期的改进方法
Bottema 等（1993）提出两个解决方案：一是设计引物时，如果引物3'末端可能与样品模板形成延伸率高的碱基错配，那么可以考虑以其互补链作为模板，从而避开这些高延伸率的错配。二是把控制PCR反应的关键成分稀释到接近极限的浓度。由于错配延伸效率毕竟比正配延伸要差，在扩增资源极低的情况下，错配延伸即使发生，也达不到可被显示出来的水平，因此避免了假阳性结果。但是，这两种方案都需要大量实验来对实验条件进行摸索优化，因此目前已较少被采用。
近期改进方法：
1。在3‘末端附近引入额外错配
2。腺苷三磷酸双磷酸酶介导的等位基因特异PCR法(apyrase-mediated allelespecific extension, AMASE)以及焦磷酸解激活的聚合反应法(Pyrophosphorolysis-activated polymerization, PAP)
3。AMASE
4。改进酶
5。锁定的核酸技术(locked Nucleic Acid, LNA)

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