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标题: 【求助】DNA甲基化(CpGenome™ DNA Modification... [打印本页]
作者: 阿福    时间: 2016-4-8 15:53     标题: 【求助】DNA甲基化(CpGenome™ DNA Modification...

目的：1.DNA甲基化处理，2.甲基化特异PCR
已试方法：
利用chemicon 公司的CpGenome™ DNA Modification Kit 进行甲基化处理（步骤见下）；
参考文章订购了FAM标记引物进行PCR.
结果：DNA甲基化处理后紫外分光光度计测试230nm吸收特高（盐及小分子物质？），260nm约0.14左右，做了好几次，最后有几个浓度月200多ng/ul，但是230nm吸收还是很高，260/280高达7。虽然如此，电泳最终还是有条带了，但是用这个DNA去MSP，总是出现和阴性对照一样的dimer（primer浓度调试过）
排除的情况：原DNA是好的（电泳测试过）；引物设计（引用多篇权威文章的）；PCR仪器没问题；操作没问题。
可能的情况：在甲基化处理时需要用以下自己配的
Reagents
a. NaOH pellets
b. 70%, 90% and 100% EtOH
c. β-mercaptoethanol
d. TE Buffer (10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 7.5)
我用的 NaOH pellets只有96%纯度的，是不是这个罪魁祸首？
提问：在加入DNA时，原则要求1微克，我多加了一些（为了多点产量），行不？
请用过这个kit的朋友多多帮助 ，积分感谢，尤其是做过人雄激素受体的MSP的（HUMARA基因）。非常 急 。xx(xx(:X:X
作者: 阿福    时间: 2016-4-8 15:54

所用protocol：
2.2 DNA修饰
2.2.1 取旋盖1.5ml离心管，加水100µL，再加1.0µg DNA,最后加7µL 3M NaOH，混匀。
如样品中DNA不足1.0µg时，加 DNA 修饰试剂IV，补水使总体积达到100µL，然后加7µL 3M NaOH，混匀。
（98µL水 + 2µL DNA 修饰试剂 IV + DNA样品 + 7µL 3M NaOH）
2.2.2 50℃ 10min
2.2.3 加550µL新鲜配制的DNA 修饰试剂 I，漩涡混匀。
2.2.4 50℃ 16h。
2.3 完成化学修饰，DNA洗涤
2.3.1 重悬试剂Ⅲ，漩涡混匀，确保混匀。
2.3.2 取重悬好的试剂Ⅲ5µL至上述DNA溶液中，再加入750µL试剂Ⅱ，轻轻混匀。
2.3.3 室温孵育5-10min，5000g 离心10sec，弃上清。
2.3.4 加1ml70%乙醇，漩涡混匀，5000g 离心10sec，重复三次。
2.3.5 第三次去除上清后，再高速离心2min，吸去残存的上清。
2.3.6 加50µL 20mM NaOH/90% 依存与上述样品中，漩涡混匀，重悬沉淀物，室温孵育5min。
2.3.7 5000g 离心10sec，直接加1ml90%乙醇，漩涡混匀，洗涤沉淀，离心弃上清，重复两次。
2.3.8 第二次上清去除后，再高速离心3min, 吸去残存的上清,室温干燥10-20min.
2.3.9 加TE Buffer（10mmTris/0.1mmEDTA,pH7.5）漩涡混匀。Buffer的量取决于开始时DNA的量。（一般25-50µL）
2.3.10 50-60℃ 15min。高速离心2-3min，转移上清至另一Ep管中。
2.3.11 进行MSP或sequenceing,或储存-15℃~-25℃，可保存两个月；-80℃六个月。可分装，避免反复冻融。
2.3.12 当保存的样品融化后作MSP时，避免将析出的试剂Ⅲ加入，可先离心去除沉淀。
作者: 131415    时间: 2016-4-8 15:54


2.3.7 5000g 离心10sec，吸取上清至另一Ep管中，加1ml90%乙醇，漩涡混匀，洗涤沉淀，离心弃上清，重复两次。
Onobel ,你好，我也正在做MSP，用的也是这个试剂盒，现在的PCR也还没有做出来。我要告诉你的就是，2.3.7的这一步你是做错了的，你可能是按照DXY中别人的贴子做的，当时我看到这句话翻译的与试剂盒上的操作好象有出入，我特地联系了翻译这个的战友，他现在也在做MSP，他已经有过成功的经验了，他已经明确告诉我，在加90%乙醇前的上清液是不要去掉的，是直接加入90%乙醇。
另外，我在核酸技术版发了个帖子的，有几个做了这方面的高手提出了许多宝贵的建议，你可以去看一下的。
作者: PINK    时间: 2016-4-8 15:54

2.3.6 加50µL 20mM NaOH/90% 依存与上述样品中，漩涡混匀，重悬沉淀物，室温孵育5min。
2.3.7 5000g 离心10sec，吸取上清至另一Ep管中，加1ml90%乙醇，漩涡混匀，洗涤沉淀，离心弃上清，重复两次 。
加50µL 20mM NaOH/90% 乙醇与上述样品中，轻弹混匀，不别离心，直接加入1ml90%乙醇，混匀。
根据本人经验，上述protocol略作一下修改：
1.在试剂1配置中，原说明书中大约用20µL 3M NaOH调pH，应调整为40µL，否则达不到所要求的pH。
2.在用乙醇洗涤离心时， 5000g 离心 1 min，否则吸上清时会带走试剂3，导致DNA丢失。
3.在每一步洗涤后重新加入乙醇洗涤时，用手指将沉淀弹起，不必漩涡混匀，剧烈涡旋会将DNA断裂。
4.在加入DNA时，原则要求1微克，我多加了一些（为了多点产量） ，影响不大，我的可能都大于1微克（5µL）。
作者: www.1    时间: 2016-4-8 15:55


1.在加90%乙醇前的上清液是不要去掉的，是直接加入90%乙醇:是这样的，我在上贴中已修改。
2.是的。每步都一分钟，转速可以提高。
3.混匀时只要弹起就行了，不必彻底混匀。我的离心机不能定10sec，只能点动离心，所以容易弹起，而且也容易吸走，
个人经验，仅供参考。
祝顺利！
作者: 阿福    时间: 2016-4-8 15:56

还是有些小疑问（多次失手后现在很小心）
1.战友提到“在加90%乙醇前的上清液是不要去掉的，是直接加入90%乙醇”，而zrzhong6519 君说“吸取上清至另一Ep管中，加1ml90%乙醇到这个Ep管，漩涡混匀”， 似乎有点出入。
2.战友君说的“乙醇洗涤离心时， 5000g 离心 1 min（原来是10sec）”，是包括70%乙醇和90%乙醇洗涤吗？都是1分钟？
3.说的“在每一步洗涤后重新加入乙醇洗涤时，用手指将沉淀弹起，不必漩涡混匀，剧烈涡旋会将DNA断裂”，感觉10sec的离心后沉淀都比较难弹起啊，呵呵（这是我过分了）
再次谢谢pzhl2004 和zrzhong6519 君，俺马上开始修正，如实验顺利，5分赠送（实在没什么好表示的）
作者: PINK    时间: 2016-4-8 15:56


1.在加90%乙醇前的上清液是不要去掉的，是直接加入90%乙醇:是这样的，我在上贴中已修改。
2.是的。每步都一分钟，转速可以提高。
3.混匀时只要弹起就行了，不必彻底混匀。我的离心机不能定10sec，只能点动离心，所以容易弹起，而且也容易吸走，
个人经验，仅供参考。
祝顺利！
作者: 阿福    时间: 2016-4-8 15:56

甲基化处理后，你有在分光光度计上测浓度吗？
我在修正实验后，甲基化的DNA在230nm处吸收还是过高，电泳无带，晚上测试PCR看看有没有结果。
作者: 阿福    时间: 2016-4-8 15:57


PCR后还是没有条带出现..................555！！
作者: 菜鸟丙    时间: 2016-4-8 15:58

甲基化处理后我没有测，但跑过电泳，看不到条带。
你可以提高模板量试一试，另外再多试几个温度，延长变性、反应及退火时间，我都使用1min，40 cycles。
作者: wanglaoshi    时间: 2016-4-8 15:58



QUOTE:
原帖由 菜鸟丙 于 2016-4-8 15:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
甲基化处理后我没有测，但跑过电泳，看不到条带。
你可以提高模板量试一试，另外再多试几个温度，延长变性、反应及退火时间，我都使用1min，40 cycles。 ...

我的预计产物只有200bp。
看了这里很多的MSP帖子，似乎大家都很困难。
作者: HPLC使者    时间: 2016-4-8 15:58

不知道你修饰后用玻璃奶珠沉淀后是否发现奶珠颜色有变化了呢?我的好象是变黑了的,考虑是提的DNA的纯度不够好,据成功者们的经验,MSP实验中除了引物的因素外就属DNA的纯度最重要了,所以我已经买了提DNA的试剂盒准备重新开始.如果还是不行的话就只好到外面去学习去了,如果大家有好的地方请帮忙推荐或者是联系一下,不胜感激!
作者: 阿福    时间: 2016-4-8 15:59



QUOTE:
原帖由 HPLC使者 于 2016-4-8 15:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
不知道你修饰后用玻璃奶珠沉淀后是否发现奶珠颜色有变化了呢?我的好象是变黑了的,考虑是提的DNA的纯度不够好,据成功者们的经验,MSP实验中除了引物的因素外就属DNA的纯度最重要了,所以我已经买了提DNA的试剂盒准备重 ...

不好意思，我不懂什么是玻璃奶珠？不过修饰过程中始终没有看到黑色的东西。
作者: HPLC使者    时间: 2016-4-8 15:59

就是试剂3。
是的，MSP确实不好做，就是现在也不是每次都能成功。你的产物200bp应该好一点，我的产物只有100bp。
上海肿瘤所作的比较多，而且做得基因也比较多，他们好像都使用手工修饰的。
作者: 阿福    时间: 2016-4-8 15:59

你的primer是标记的吗？我的是，在MSP总是看到dimer，和阴性对照一样的。唉....
作者: HPLC使者    时间: 2016-4-8 16:00

我的没有标记，但我的从来没出现过二聚体。
作者: 阿福    时间: 2016-4-8 16:00


你认为230nm处吸收过高（盐和小分子物质）的可能性出错的地方是...？:I:I:I:I
作者: 阿福    时间: 2016-4-8 16:00

另外，“2.2.1 取旋盖1.5ml离心管，加水100µL，再加1.0µg DNA,最后加7µL 3M NaOH，混匀”
应该是改成：
2.2.1 取旋盖1.5ml离心管，加水90µL，再加1.0µg DNA（100ng/µl）,最后加7µL 3M NaOH，混匀
是吗？
作者: 碎星星    时间: 2016-4-8 16:01


问:2.2.1 取旋盖1.5ml离心管，加水90µL，再加1.0µg DNA（100ng/µl）,最后加7µL 3M NaOH，混匀
是吗？
答:这个是要求加了水后总体积达到100ul的,加多少水就要看你是加多少ul的DNA了.
作者: HPLC使者    时间: 2016-4-8 16:01

说明书上的意思100ul可能不包括7µL 3M NaOH，我没有把它算进去。
作者: toy    时间: 2016-4-8 16:02


我没有做过甲基化方面的东西，但今年暑假时听过这方面的讲座，是我们医院出去的一个牛人，去美国五年了，一直做甲基化方面的东西，做了很多工作，在SCI上发表文章11篇，我把他的E-mail pm给你，跟他讨论应该能解决部分问题。并请为我保密他的邮箱！！！
作者: 阿福    时间: 2016-4-8 16:02


众位认为怎么样才能确认DNA的甲基化处理是成功的？因为MSP扩不出来，首先考虑Template的问题。
作者: yhn    时间: 2016-4-8 16:02


以下是个人的经验，仅供参考：
说明：只列出了和onobel不同的步骤：
2.2.1 取旋盖1.5ml离心管，加水和1.0µg DNA,总体积为100µL。最后加7µL 3M NaOH，混匀。
2.3.3 室温孵育5-10min，8000rpm 离心5分钟，弃上清，共2次。
2.3.4 加1ml70%乙醇，漩涡混匀，8000rpm， 离心1－2min，重复三次。
2.3.7 8000rpm 离心1min，直接加1ml90%乙醇，漩涡混匀，洗涤沉淀，离心弃上清，共两次。
2.3.10 65℃ 15min。高速离心2-3min，转移上清至另一Ep管中。
作者: 阿福    时间: 2016-4-8 16:03

非常感谢yhn的指点。请问你提及的“2.3.3 室温孵育5-10min，8000rmp离心5分钟，弃上清，重复2次。”是指离心后弃上清后重复离心一次，还是指包括前面的步骤重复一次（试剂Ⅲ5µL＋750µL试剂Ⅱ）？
同时我已经在和chemicon公司联系了，如果有回答了再与大家一起探讨。
总之，MSP有一定难度，但是办法总比困难多。
作者: yhn    时间: 2016-4-8 16:03

重复离心一次，除去残余的少量上清。
Good luck!
作者: 131415    时间: 2016-4-8 16:03


请问：chemicon 公司的CpGenome™ DNA Modification Kit 要多少钱的呢？有没有这个公司的电话呢？谢谢告诉！！
作者: tears    时间: 2016-4-8 16:04


答：chemicon 公司的CpGenome™ DNA Modification Kit现在好象吉泰生物是总代理，他们给出的价格也是最低的，可以打8折，折后价是3180元，其他的代理好象都是给8.5折的.不过这个试剂盒好象都没有现货的,要3周才能到货!吉泰上海总部的电话是021-54262677,你自己打电话去问吧!
作者: jujuba    时间: 2016-4-8 16:04


CpGenome的到货时间多久？
作者: DDD    时间: 2016-4-8 16:04

大约一周多就可到货
作者: 小明    时间: 2016-4-8 16:05

chemicon 公司的CpGenome™ DNA Modification Kit S7820说明书上提到要设计三对引物，请问野生型的一定需要吗？如果不要对实验会有什么样的影响？谢谢 ！
作者: 小明    时间: 2016-4-8 16:06


还有一个问题，S7820说明书还提到引物长度为20-21bp,产物大小为100-200bp是the standard rules，那如果引物长度最大29bp，产物大小80-90bp，能用该试剂盒吗？引物是大多数文献都用的。谢谢了！
作者: 00无名指00    时间: 2016-4-8 16:06


1 野生型的不一定要,只是用来检测你抽提的模板是否有问题.因为如果野生型的做不出来，那么MSP肯定也做不出来
2 S7820试剂盒只是用来修饰你的DNA,它和之后的MSP没有必然联系.它说的the standard rules是指一般MSP是这样的。
作者: 911    时间: 2016-4-8 16:07


我用的也是chemicon 公司的CpGenome™ DNA Modification Kit(S7820),在修饰前DNA纯度有1.8,可是修饰完后纯度就只有1.13了,做了好几次了,差不多都是这种结果,后面的PCR也做不出来了.不知用过该试剂盒的朋友修饰完后纯度可达到多少,是不是国产的氢氧化钠纯度不够的原因(不小于96%)???
作者: 831226    时间: 2016-4-8 16:08

MSP比较不容易跑出结果，修饰以后OD值不高是很正常的。试试改变PCR反应条件多跑几个循环也许结果就出来了：）



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