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标题: 【求助】求高人指点Bandscan及Qantity one分析结果！ [打印本页]

作者: gmjghh 时间: 2016-4-8 16:09 标题: 【求助】求高人指点Bandscan及Qantity one分析结果！

各位战友：
本人行RT-PCR后琼酯糖电泳跑了下DNA，并要进行半定量分析。初次学习并使用了凝胶图像分析软件。试着用了Bandscan5.0及Quantity one两种软件对我的图片进行分析。意外的是两种软件得出的数据竟然存在出奇的差异。所以还请有使用过此两种软件的高人指点下，指出本人使用软件分析哪个环节存在问题。
首先，先看下面这张图片，此为我要分析的DNA电泳图片。上面的条带为目的条带，下面条带为内参。
Bandscan分析方法：
参照园子里贴子：“两分钟Step by step 学习凝胶分析软件BandScan” 回复：两分钟Step by step 学习凝胶分析软件BandScan - 丁香园论坛
按上述方法，通过软件框好目的条带及内参条带，最后途径是window/band data table/select band data/percent signal，最后得出目的条带及内参条带各自的灰度值占本泳道条带总灰度值的百分比，然后计算出目的DNA与内参的比值为：5.83017956，5.383062453，1.403072495，2.35895817，2.332600915，2.431437525（从左到右）。
Quantity one分析方法：
打开文件后通过volume菜单，下选择volume rect tool，然后通过鼠标手工框好目的条带及内参条带，最后点volume analysis report。最后计算目的条带与内参条带Density的比值。得出的数据为：1.380286471，1.364362557，1.225269624，1.191564837，1.289548934，1.186465237（从左到右）。
实在是不明白为何两种软件处理的数据相差这么远，还请指正。
谢谢了！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43466

作者: 人小鬼大 时间: 2016-4-8 16:09

最后得出目的条带及内参条带各自的灰度值占本泳道条带总灰度值的百分比，然后计算出目的DNA与内参的比值为：5.83017956，5.383062453，1.403072495，2.35895817，2.332600915，2.431437525（从左到右）。

作者: 66+77 时间: 2016-4-8 16:10

QUOTE:

原帖由 人小鬼大 于 2016-4-8 16:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
最后得出目的条带及内参条带各自的灰度值占本泳道条带总灰度值的百分比，然后计算出目的DNA与内参的比值为：5.83017956，5.383062453，1.403072495，2.35895817，2.332600915，2.431437525（从左到右）。 ...

应该是目的条带与内参条带灰度的比值，而不是二者占本泳道总灰度值的百分比。在运行find bands命令后，在随后出现的select more orselect few对话框中通过鼠标拖动滑块，只使目的条带和内参条带被选中，因为如果不拖动滑块的话，一些背景会被选中，而软件会误认为其也是要分析的条带，这样的话肯定有误差，要注意的是最后得出的percent signal中二者之和为100%（因为一个泳道正常时只有目的与内参2个条带）.对Quantity one使用不会:I。前段正学习scion image软件分析电泳条带的积分光密度值仍不得要领-，不知理解的是否正确，请各位指正。

作者: gmjghh 时间: 2016-4-8 16:11

自己来顶一下！用过这两种软件的来帮帮忙指教下吧！

作者: hdmi 时间: 2016-4-9 09:02

我估计你通过鼠标手工框好目的条带及内参条带这一步，选择的目的框的大小在两次不同的软件中有差异，从而导致比值差异。不过既然结果产生这么大的差异，应该还有其它的原因导致。

作者: gmjghh 时间: 2016-4-9 09:03

这两种软件我都是各重复测了6次，然后取其均值，得出以上数据的。我的体会是Quantity one软件手工框条带计算出来的数据每次偏差不是很大，而且通过取其均值也可以减少误差。我倒是觉得Bandscan自动框起条带每次的数据变异反大些，不知是不是方法有问题。

作者: jude 时间: 2016-4-9 09:18

QUOTE:

作者: jude 时间: 2016-4-9 09:18

应该是目的条带与内参条带灰度的比值，而不是二者占本泳道总灰度值的百分比。

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我将楼主的意思理解错了，其实想说的是一个泳道中应只有内参和目的两个条带被框选，而其他的背景等没有被框选，这里的泳道总灰度值应该是指目的基因与内参条带灰度的和，二者的percent signal之和为100%，

作者: gmjghh 时间: 2016-4-9 09:19

QUOTE:

原帖由 jude 于 2016-4-9 09:18 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
应该是目的条带与内参条带灰度的比值，而不是二者占本泳道总灰度值的百分比。

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我将楼主的意思 ...

有您以上这句话，足以解释我使用Bandscan时对同一张图片，每次测得的值偏差比较大的原因了。因为我在框条带时除了目的条带和内参被框选之外，在这一泳道中也框到其他前景了。之前我也不懂，以为没有影响的，原来是要求目的条带和内参percent signal之和为100%。所以假如我之前一个泳道中除了要的两个条带被框之外，再框到一个背景，那等于是目的条带+内参条带+所框背景=100%了。是这样子产生的误差吧！
而我为什么会框到背景呢？因为我想将上面图片的6个泳道中12个条带全部框中，然后一并生成它们的数值。这样我发现我在增减选中框过程中，在减少背景被框到时，有时框到的目的条带也会被去除，所以为保证我要的12个条带均被选中，势必会有多有的背景被选到。
我想我明白了，是我使用Bandscan软件没注意到这个问题，谢谢jude战友。

作者: vcve 时间: 2016-4-9 09:19

谈下我个人的看法，你的这张图上样量可能有的稍微大了一些，因为我记得好像是说Quantity One这些软件所照出来的照片都是有一个最大数值的，达到一定的亮度就饱和了，所以在计算灰度的时候可能就会有错误产生。记得Quantity One里面好像有个东西能分析，如果峰到了最亮的地方平了，就是达到饱和值了。

作者: jude 时间: 2016-4-9 09:20

而我为什么会框到背景呢？因为我想将上面图片的6个泳道中12个条带全部框中，然后一并生成它们的数值。这样我发现我在增减选中框过程中，在减少背景被框到时，有时框到的目的条带也会被去除，所以为保证我要的12个条带均被选中，势必会有多有的背景被选到。

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在保证需要的条带被选中，而背景不被选中的方法：在用软件打开电泳图片时先不要着急用鼠标去选择区域，而是直接点击OK

图片附件: 64962178.snap.jpg (2016-4-9 09:20, 25.45 KB) / 该附件被下载次数 16
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43478

作者: jude 时间: 2016-4-9 09:27

下面对比一下两者的区别，一是在打开图片是先用鼠标选择了要分析的区域，另一种情况是直接点击了OK,先看一下第一种情况的图：

图片附件: 62984331.snap.jpg (2016-4-9 09:27, 25.08 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43479

作者: jude 时间: 2016-4-9 09:28

第二张图：

图片附件: 73595228.snap.jpg (2016-4-9 09:28, 30.68 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43480

作者: jude 时间: 2016-4-9 09:29

第三张图：

图片附件: 82115524.snap.jpg (2016-4-9 09:29, 36.91 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43481

作者: jude 时间: 2016-4-9 09:29

第四张：注意此时往往会出现所要分析的条带未被选中，即使将滑块滑动到最上方。

图片附件: 86780550.snap.jpg (2016-4-9 09:29, 40.72 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43482

作者: jude 时间: 2016-4-9 09:30

下面看一下第二种情况，即打开图片后不用鼠标选择区域，而是直接点击OK：

图片附件: 67295398.snap.jpg (2016-4-9 09:30, 25.45 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43483

作者: jude 时间: 2016-4-9 09:30

第二张

图片附件: 45651601.snap.jpg (2016-4-9 09:30, 27.94 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43484

作者: jude 时间: 2016-4-9 09:32

第三张：

图片附件: 70719798.snap.jpg (2016-4-9 09:32, 34.82 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43485

作者: jude 时间: 2016-4-9 09:39

第四张：此时会出现很多选框（黄色的），将滑块慢慢下拉即可。

图片附件: 25577793.snap.jpg (2016-4-9 09:39, 34.9 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43486

作者: jude 时间: 2016-4-9 09:45

分别比较一下这两种情况下的第二张图和第四张图，会发现有两点不同：1、图片大小 2、被框助的框数不同。如果用第二种方式打开的话在随后的分析中就可以出现很多选框，（要分析的条带一般都被选中了）我们要做的只是滑动鼠标，减少选中框；而用第一种方式打开的话，经常会出现即时将滑块滑到最高仍有目的条带未被选中。

作者: gmjghh 时间: 2016-4-9 09:46

我用的是第一种方法，在一开始黄色的框是框到了包括所有我要的条带了，当然也有很多背景框到了。然后我滑动右边的鼠标减少选中框，但当减少到我要的条带框也即将被去除时仍有少数几个背景框存在，所以我当时就确保我要目的条带框中之外，也留下了少数几条背景框在我所要的泳道内了。

作者: 2541 时间: 2016-4-9 09:46

RT-PCR后琼酯糖电泳后半定量分析,各位觉得可靠吗?
既然RT-RCP了,为什么不引物小点,来个real-time 呢?岂不更可靠?

作者: 1221 时间: 2016-4-9 09:47

定量PCR毕竟不好做，价钱也比较贵，而且不少地方连定量PCR仪器都没有。我们实验室有人做了都半年了也没有好的结果。万事开头难啊。而且我觉得有些做半定量有很大的差异的话也足够说明问题吧。

作者: hdmi 时间: 2016-4-9 09:47

用电泳图像进行半定量分析，我想有几个关键点还是要控制好的：
1.用已经有这定量结果的样品一起PCR后电泳作标准曲线；如果没有，梯度稀释的DNA也可以给出一些相关的提示，从理论上讲，半定量可能只是在一个浓度范围内有效，即标准曲线的有效浓度范围。
2.确保每次照样的参数保持一致。因为半定量就是计算一个灰度值或者积分光密度值，受影响的因素非常多，甚至你连续分析两次都会有差异。
因此，半定量的结果可能只供参考。

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