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标题: 【求助】A260/A280的Ratio低与DEPC水有关么？ [打印本页]

作者: 小螺号 时间: 2016-4-9 10:30 标题: 【求助】A260/A280的Ratio低与DEPC水有关么？

我在做RNA提取时A260/A280的Ratio总是徘徊在1.4左右，反复找原因后发现在其他操作及条件均相同的情况下，DEPC水不同得出的Ratio也不同。
问题是：用买的两家公司的DEPC水和自己配制的DEPC水都得不到理想结果，只有用以前一位前辈用过的分装后未注明来源且所剩无几的DEPC水可以得到理想结果！！！
郁闷死我了！哪位前辈可以给我指点迷津呀？请帮帮我！！

作者: 8princess8 时间: 2016-4-9 10:30

消毒不严格吧？

作者: 33号 时间: 2016-4-9 10:32

A260/A280的Ratio低说明提取的RNA纯度低
加氯仿后离心的转数跟时间够不够？
还有很重要的一点就是：离心之后吸上清，中间有一层白白的东西，那一层一点点都不能吸，宁愿上清少吸一点也不能把那层吸进去了，一吸，纯度就降了。
我以前也是把上清吸得很干净，把中间那一层都吸了。纯度一直都上不去，后来同学跟我说过不能吸中间那一层之后，纯度就都很高了～

作者: 8princess8 时间: 2016-4-9 10:32

我的一个老师说RNA使用TE Buffer稀释后再进行吸光度值的测定会比较高，（我没试过，都是用DEPC水溶解和测量的）如果用DEPC水来溶解测量，相对稍低一些，但也不至于象楼主那样1.4左右，楼主是使用得试剂盒吗？我用试剂盒提取的一般在1.7～1.9，常在1.8多，有时候还会高于2.0，但是对实验结果影响不大，如果不用试剂盒，1.3多也是有可能的，我也曾经作出过结果。一般来说，低离子强度或低pH值会使OD280值升高，估计是楼主的DEPC水出了问题吧。
另外一个原因就是样品裂解时加入的试剂量偏少，或者组织块偏大，造成蛋白变性不充分，可以再次对RNA溶液进行苯酚/氯仿抽提，以除去蛋白。

作者: 9900 时间: 2016-4-9 10:33

谢谢大家的宝贵意见！太感谢了！
我用的不是试剂盒提取，样品裂解时50mg左右的组织加入1mlISOGEN，不知道这个量是不是可以？
homogenize后加0.2mlchloroform，12000rpm,15min,4℃，不知道这样的设置转速和时间是不是够？
吸取上清时为避免吸取中间层我用166ulpipette吸取三次，第三次时只是看上清残余情况取适量，这样应该可以排除中间层影响的可能性了吧？
如果真的是EDPC水出了问题的话我该采取什么措施呢？
请高手指教！

作者: 831226 时间: 2016-4-9 10:33

50～100mg左右的组织加入1mlISOGEN都没有大问题。
homogenize后加0.2mlchloroform，12000rpm,15min,4℃还可以，只是楼主加入chloroform有没有剧烈震荡啊？这一步的剧烈振荡十分关键的，不然就可能有蛋白。
吸取上清注意了应该问题不大。
DEPC水换一个公司的试试。测OD值用的时候换新配制的试试。

作者: 101010 时间: 2016-4-9 10:33

我在做RNA提取时A260/A280的Ratio总是徘徊在1.4左右，反复找原因后发现在其他操作及条件均相同的情况下，DEPC水不同得出的Ratio也不同。
问题是：用买的两家公司的DEPC水和自己配制的DEPC水都得不到理想结果，只有用以前一位前辈用过的分装后未注明来源且所剩无几的DEPC水可以得到理想结果！！！
郁闷死我了！哪位前辈可以给我指点迷津呀？请帮帮我！！！
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这个应该不是拫重要,比值只是一个参考,我们实验室(科技部的一个重点实验室)在做反转的时候,一般不怎么考虑A260/A280的比值.若果,你后面的实验要求很高,如建文库什么之类的话,那就要考虑这个值了!希望能对你有用.

作者: 101010 时间: 2016-4-9 10:34

260/280值低说明蛋白含量高，有可能是离心后取上清的时候不小心吸到的中间的蛋白层.可以在提取后做PCI抽提,乙醇精制来除去蛋白.

作者: 101010 时间: 2016-4-9 10:35

我在补充一下,还有一种可能的原因是,在测量OD的时候，调零和稀释RNA的溶液应该用TE,用DEPC确实是会使260/280高,你以前用的剩一点的DEPC可能是偏碱性,这样所受的影响比较小,但是绝对没有用TE的好.

作者: 小螺号 时间: 2016-4-9 10:36

QUOTE:

原帖由 101010 于 2016-4-9 10:35 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我在补充一下,还有一种可能的原因是,在测量OD的时候，调零和稀释RNA的溶液应该用TE,用DEPC确实是会使260/280高,你以前用的剩一点的DEPC可能是偏碱性,这样所受的影响比较小,但是绝对没有用TE的好. ...

谢谢您的意见！
不好意思，我是新手，对相关的词汇都还没弄很明白，请问一下：TE是指？

作者: 小螺号 时间: 2016-4-9 10:36

QUOTE:

原帖由 831226 于 2016-4-9 10:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
50～100mg左右的组织加入1mlISOGEN都没有大问题。
homogenize后加0.2mlchloroform，12000rpm,15min,4℃还可以，只是楼主加入chloroform有没有剧烈震荡啊？这一步的剧烈振荡十分关键的，不然就可能有蛋白。
吸取上清注意了应该 ...

谢谢您的意见！
第一次做实验时，加入chloroform后确实没有震荡，结果chloroform都很安静地躺在下层，一点儿作用都没起，没办法又重新震荡离心了一遍，幸亏用的是练习用的sample。呵呵，现在回想起来还觉得挺好笑的。也感觉做实验确实能体会到失败是成功之母这样的道理。只是希望借助大家的帮助我能够顺利从这一步的失败中走出来。

作者: 65urh 时间: 2016-4-9 10:37

不好意思，我是新手，对相关的词汇都还没弄很明白，请问一下：TE是指？

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TE就是TE buffer，TE缓冲液。祝实验成功！

作者: 45778 时间: 2016-4-9 10:37

OD260/280 在提取组织RNA，进行RT-PCR等类似实验操作中，仅仅是个参考，只要确认自己的实验操作无误，比值1.3多也能RT成功，PCR做出很漂亮的条带来
OD值受很多因素影响，它的比值不如参考书上的那么标准，并不能完全代表你的实验结果不好

作者: 8princess8 时间: 2016-4-9 10:38

OD260/280 在提取组织RNA，进行RT-PCR等类似实验操作中，仅仅是个参考，只要确认自己的实验操作无误，比值1.3多也能RT成功，PCR做出很漂亮的条带来
OD值受很多因素影响，它的比值不如参考书上的那么标准，并不能完全代表你的实验结果不好
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谢谢您的意见！
我在看到OD260/280比值不理想后就停在这里了，一直反复找原因，重复试验，确实没再往下进行过。或许我该先做到最后试试看。呵呵，谢谢了！

作者: 33号 时间: 2016-4-9 10:38

我提的PNAOD 值一直都比较高 ,多数在2.0-2.1之间, 太高了也不好吧?我是拿DEPC水融RNA的, 也用来调零

作者: kulee 时间: 2016-4-9 10:39

我用比值为1.2的来做RT 也能做出来所以我认为比值关系应该不大不用太在意做出来就可以了

作者: zzzz 时间: 2016-4-9 10:39

今天也做了第一次
浪费了好多试剂和时间，幸好最后还是有点结果：反转录的cDNA可以扩出阳性片段，目的片段却没出来

作者: 911 时间: 2016-4-9 10:39

可能跟DEPC水的灭菌有关吧

作者: u234 时间: 2016-4-9 10:40

核酸样品的A260/A280值一般在1.7~1.9是比较合适，偏离这个值可能是由于蛋白含量偏高(A260/A280值大于2.0)、DNA样品中有RNA污染（比值小于1.7）、RNA中有机物如氯仿等污染（比值小于1.7）造成。值得注意的是：当样品中的脂肪含量较高，而使用的抽提方法又没有特别注意这一点时，比值也会偏低。DEPC水有影响，但不是根本性的问题。RNA的质量及浓度以在胶上鉴定为使用前的最终标准，以rRNA条带尖锐（sharp）且28S的亮度是18S的亮度的2倍以上为好。另外，不同组织、不同的RNA提取方法所得RNA跑胶时rRNA的条带数可能并不仅仅是28S和18S这2条，可能还有较大的条带，但与DNA的污染又明显不同，它们与点样孔的距离较远。一般来说，这样的RNA样品可能质量更好。

作者: 8princess8 时间: 2016-4-9 10:41

QUOTE:

原帖由 u234 于 2016-4-9 10:40 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
核酸样品的A260/A280值一般在1.7~1.9是比较合适，偏离这个值可能是由于蛋白含量偏高(A260/A280值大于2.0)、DNA样品中有RNA污染（比值小于1.7）、RNA中有机物如氯仿等污染（比值小于1.7）造成。值得注意的是：当样品中的脂肪含量 ...

到底是A260/A280值大于2.0有蛋白质污染还是有核算污染

作者: 黄花菜 时间: 2016-4-9 10:41

感觉关系不太大，关键是蛋白浓度比较高，应该是氯仿抽提的不好

作者: 9900 时间: 2016-4-9 10:41

你到底是要干什么？是要做克隆测序？还是要做表达分析？
要是做克隆测序，比值的大小无所谓了，跑个胶看一下，如果降解不是很严重，就可以继续进行反转录和后续的PCR，没问题的；但如果你要进行表达分析的话，小心了，最好两方面都做，而且我觉得跑胶的结果更能说明问题，就如大家所说，影响OD值的因素很多，但是电泳结果是最直观、最准确的，所以建议你把提取的RNA电泳一下，根据它的结果进行判断！
祝实验顺利！

作者: idea2011 时间: 2016-4-9 10:41

有关系
用PE或双蒸水测会高0.1左右

作者: 小螺号 时间: 2016-4-9 10:42

你到底是要干什么？是要做克隆测序？还是要做表达分析？
要是做克隆测序，比值的大小无所谓了，跑个胶看一下，如果降解不是很严重，就可以继续进行反转录和后续的PCR，没问题的；但如果你要进行表达分析的话，小心了，最好两方面都做，而且我觉得跑胶的结果更能说明问题，就如大家所说，影响OD值的因素很多，但是电泳结果是最直观、最准确的，所以建议你把提取的RNA电泳一下，根据它的结果进行判断！
祝实验顺利！
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谢谢您的意见！
我要做的是表达分析，跑过胶了，出来的条带倒是很漂亮，这样的话是不是就可以不去管OD值了？

作者: 小螺号 时间: 2016-4-9 10:42

核酸样品的A260/A280值一般在1.7~1.9是比较合适，偏离这个值可能是由于蛋白含量偏高(A260/A280值大于2.0)、DNA样品中有RNA污染（比值小于1.7）、RNA中有机物如氯仿等污染（比值小于1.7）造成。值得注意的是：当样品中的脂肪含量较高，而使用的抽提方法又没有特别注意这一点时，比值也会偏低。DEPC水有影响，但不是根本性的问题。RNA的质量及浓度以在胶上鉴定为使用前的最终标准，以rRNA条带尖锐（sharp）且28S的亮度是18S的亮度的2倍以上为好。另外，不同组织、不同的RNA提取方法所得RNA跑胶时rRNA的条带数可能并不仅仅是28S和18S这2条，可能还有较大的条带，但与DNA的污染又明显不同，它们与点样孔的距离较远。一般来说，这样的RNA样品可能质量更好。
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谢谢！
我做了跑胶，出来了三条带，28S条带的亮度大约是18S条带的两倍，tRNA条带也出来了。各条带也都比较sharp的感觉。这样是不是就可以说明我提取的RNA没有大问题？

作者: xueyouzhang 时间: 2016-4-9 10:42

个人觉得应该没有什么问题了，但是请你还要注意，跑胶时，只有核酸能被EB结合，紫外下发出荧光，也就是说，你的胶面很干净，一是说明RNA没有降解，而是说明没有DNA污染，不过至于其他杂质，比如：蛋白、多糖等是看不出来的。但是只要你按说明小心操作污染蛋白的可能性不大，如果你提RNA的组织多糖含量不高，也不用去管了，继续做吧！
还有，这个比值还与你溶解RNA的水的PH值有关，正常我们说得1.8～2.0，是溶于偏碱性（ph7.5）的溶液中的比值，不知道你用的水的ph值是不是偏低！
祝实验顺利啊！

作者: 3648755 时间: 2016-4-9 10:43

可以负责任的告诉你，和DEPC水有关。
把你的DEPC水换成MILLI Q再测，OD值就会上去了，当然也不排除有一些污染。
如果你只是做RT，接着做PCR，那么你不用考虑260/280，除非里面的成分影响到逆转录的效率了。OD值只能反应纯度，并不能反映你的RNA的质量，也就是常说的RNA是否有降解，RNA的质量需要通过RNA电泳来确定，只要RNA没有降解就可以继续往下做RT了，不会影响实验结果。

作者: ilovegaga 时间: 2016-4-9 10:44

同意楼上的说法，我也层碰到过类似的问题，用DEPC水来测定OD值时比用TE测的值要0.3左右。如果只是进行rt-pcr，只要不影响翻转录，可以不用考虑这个值。一点个人看法

作者: yhtfyl 时间: 2023-2-24 07:33

感谢楼主分享，受教了

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