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标题: 【求助】抗体杂质检测项中的HCP残留酶联免疫检测... [打印本页]

作者: 大桃子同学 时间: 2016-4-11 22:27 标题: 【求助】抗体杂质检测项中的HCP残留酶联免疫检测...

我们用的Cygnus F550 CHO HCP ELISA kit，现在在做方法验证，专属性怎么做？希望有单抗药物临床申报经验的同行给点意见。
中检院曾指出过“对于不同的目的蛋白质，根据分子量大小和等电点的不同，会采取不同的分离纯化工艺。不同的分离纯化工艺会导致细胞蛋白残留量和组成上的较大差异。只有根据不同的生产工艺，制备工艺特异的细胞蛋白标准品和特异的抗血清，建立相应的检测方法，才能更真实反应供试品的’细胞蛋白残留量。”

作者: shanzhapia696 时间: 2016-4-11 22:28

商业化的HCP kit检测的结果只能代表通用的那些HCP的含量和比例，但是每个项目都有其特异的HCP比例，且各个蛋白对HCP的检测干扰程度不一样，所以见了专属的HCP检测方法是非常必要的。我们公司申报的一个产品，就被CDE要求补充特异的HCP检测方法。

作者: ukonptp 时间: 2016-4-11 22:28

HCP抗体制备很少有免疫老鼠制备抗体的。cygnus试剂盒及abcam公司中的HCP抗体是羊多抗或兔多抗，这样的好处很明显，一次制备量可以够用几年甚至上十年，也避免不同制备批次间的差异。如后期工艺稳定，考虑工艺特异性，可另外再制备工艺特异性抗体，适合申报注册等。工艺特异抗原的制备，就是空白菌经过相同的发酵及纯化条件处理后所得，当然，纯化至哪一步，这个就得具体问题，具体分析了，不建议到最后一步，虽然针对性会更强，但不能保证不会缺失部分HCP，建议层析一步或两步，目的蛋白纯度达到一定要求就可以了。
HCP制备中免疫原性差异的问题是难以避免的，abcam公司针对大肠低分子量HCP的抗体，货号为ab181642，大家可以了解下。
对了，关于专属性验证问题，我们这里只考察了基质的影响。其实，houjinglhy 所说的也不错，可找其他相关蛋白验证，如你是CHO HCP试剂盒，是不是可以检测大肠或酵母的HCP，看是否存在交叉反应？

作者: 8s5g 时间: 2016-4-11 22:28

专属性就是找一些市售的抗体药物或无关蛋白看看它的交叉反应吧。CNKI上有几篇做疫苗的宿主蛋白残留方法学的文章是这么做的，你可以参考下。但不知道这个对重组单抗适不适应。
一般宿主蛋白对照品都是通过裂解或冻融宿主细胞制备的。中检院的意思是你需要把通过裂解或冻融提取的宿主蛋白在你的整个工艺流程中走一遍，最后通过富集来获得“特异性的宿主蛋白”标准品。首先你的知道怎么富集宿主蛋白，其次你得要大量的宿主蛋白和工艺量才能获得足量的宿主蛋白。这个类似于化药里面自制杂质对照品一样。真要这么做代价也太大了吧。。。还有你引用的这些话是从文件里看到的吗？何种渠道得知的

作者: hulu呼噜 时间: 2016-4-11 22:29

这个地方的专属性指的是做你的缓冲液基质的影响，抗体特异性是试剂盒要证明针对细胞宿主蛋白的。

作者: 大桃子同学 时间: 2016-4-11 22:29

QUOTE:

原帖由 8s5g 于 2016-4-11 22:28 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

专属性就是找一些市售的抗体药物或无关蛋白看看它的交叉反应吧。CNKI上有几篇做疫苗的宿主蛋白残留方法学的文章是这么做的，你可以参考下。但不知道这个对重组单抗适不适应。
一般宿主蛋白对照品都是通过裂解或冻融宿 ...

中检院一篇旧的文献中看到的。上周在研讨会上听到Cygnus 3rd Generation CHO HCP kit在CHO-K、CHO-S、DG44三种细胞系中的检出率均只有60%左右，是通过2D WB和LCMSMS两种方法比较的。如果回收率60%左右，专属性验证是否就通不过了？如果Cygnus的试剂盒升级了，换用同种升级的试剂盒是否还要重新验证？

作者: 8s5g 时间: 2016-4-11 22:30

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中检院一篇旧的文献中看到的。上周在研讨会上听到Cygnus 3rd Generation CHO HCP kit在CHO-K、CHO-S、DG44三种细胞系中的检出率均只有60%左右，是通过2D WB和LCMSMS两种方法比较的。如果回收率60%左右，专属性验证是否 ...

你这个说的是属于检测灵敏度吧，专属性考察溶液或其他物质对方法的干扰

作者: toy 时间: 2016-4-11 22:30

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一般好像都是用Cygnus的试剂盒检测HCP的，专属性问题可以用293细胞株的宿主蛋白作为对照说明对CHO细胞株的专属性。
HCP蛋白制备，可以用稳定细胞株的空白宿主细胞株转染对应的空载体然后筛选到细胞株（不直接用宿主细胞株，这样可以更全面的说明HCP），进行补料培养取上清进行制备HCP（HCP的制备方法各显神通）。将制备好的HCP进行定量（蛋白定量方法很多种），用定量好的HCP来建立验证检验HCP的方法。

作者: 大桃子同学 时间: 2016-4-11 22:30

说错了，这个应该归于准确性。因为HCP标准品是试剂盒提供的，跟自己产品中HCP肯定有差异，我们要确认是Cygnus的这个试剂盒能否检出我们自己产品中所有种类的HCP？因为我们用的CHO-S表达系统，根据上图Millipore的实验研究，其检出率只有50~65%，是不是就说明我们用这个试剂盒进行检测放行时，它的检测结果是低于真实值的？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43532

作者: 大桃子同学 时间: 2016-4-11 22:31

说错了，这个应该归于准确性。因为HCP标准品是试剂盒提供的，跟自己产品中HCP肯定有差异，我们要确认是Cygnus的这个试剂盒能否检出我们自己产品中所有种类的HCP？因为我们用的CHO-S表达系统，根据上图Millipore的实验研究，其检出率只有50~65%，是不是就说明我们用这个试剂盒进行检测放行时，它的检测结果是低于真实值的？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43533

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作者: 831226 时间: 2016-4-11 22:32

专属性强的自然是自建ELISA方法，而不是商品化通用型ELISA试剂盒。

国外有些品种报产阶段，要利用自己的宿主（含空载体）免疫动物，获得的抗血清，分离纯化的多克隆抗体制备ELISA试剂盒。这些多克隆抗体自然是针对自己的宿主，但是这个方法也有局限性。1）开发周期半年以上，且成本过高。2）免疫动物获得多克隆抗体，只针对高免疫原性HCP。对于低免疫选型HCP，存在漏检的可能。
当然，除了ELISA外，也有2D-page，LC-MS等方法，但是这些还未在工业界广泛使用
不了解。国内报产阶段的HCP是否要求建立专属性方法。

作者: ukonptp 时间: 2016-4-11 22:32

我觉得millipore的ppt讲的两种方法对比其实是两个事情：LCMSMS比较的是试剂盒提供的HCP和自己发酵产生HCP的表达谱差异。2DWB比较的是试剂盒提供的抗体覆盖自己发酵产生HCP的能力。抗体亲和力、蛋白免疫原性的原因覆盖不了这么多蛋白，当然会比LCMSMS结果覆盖率低。
millipore银染的300多种蛋白也比cygnus号称的能检出CHO HCP 700多种蛋白低很多。（不确定是不是用的cygnus盒子）这些可以发给cygnus技术支持问问。
其实不管检出率多少，参考6L所说方法，如果用自己制备CHO HCP定量作为标品，用商业化试剂盒检测，能得到相对浓度，是否可行了？

作者: one 时间: 2016-4-11 22:33

现在CDE 生物制品药学部都有建议这么做建立过程特异性的HCP检测方法。
下面这张PPT是白玉老师在“生物类似药研发与评价”研讨班上分享的案例。
她就列举了采用商业HCP试剂盒做临床前研究导致临床试验失败的案例。
现在建立过程特异性的HCP检测方法越来越被认可，但是应该也不是强制要求。

图片附件: 87775201.snap.jpg (2016-4-11 22:33, 96.87 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43535

作者: yyaxw84 时间: 2016-4-11 22:34

中检院一篇旧的文献中看到的。上周在研讨会上听到Cygnus 3rd Generation CHO HCP kit在CHO-K、CHO-S、DG44三种细胞系中的检出率均只有60%左右，是通过2D WB和LCMSMS两种方法比较的。如果回收率60%左右，专属性验证是否就通不过了？如果Cygnus的试剂盒升级了，换用同种升级的试剂盒是否还要重新验证？

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准确度试验，回收率60%我觉得太低了吧换了试剂盒肯定是要重新做验证的

作者: tie8 时间: 2016-4-11 22:34

我好想记得10年左右，欧盟批了一个生长激素的类似药。审批过程中，就是宿主蛋白超标，后来为此专门增加了一步纯化工艺。此前，06年也是生长激素的类似药就没有获批。
CDE老师讲解的是不是这个案例呀

作者: yyaxw84 时间: 2016-4-11 22:34

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我好想记得10年左右，欧盟批了一个生长激素的类似药。审批过程中，就是宿主蛋白超标，后来为此专门增加了一步纯化工艺。此前，06年也是生长激素的类似药就没有获批。
CDE老师讲解的是不是这个案例呀 ...

她没说听你这么一说应该就是这个吧

作者: 7437654 时间: 2016-4-11 22:35

国内申报临床阶段的我所了解的绝大多数是商业化试剂盒，之前申报生产的也是商业化试剂盒，现在技术审评会提出要求采用特异的自制试剂盒，貌似现阶段也没说死这个事。

作者: 7437654 时间: 2016-4-11 22:35

QUOTE:

是的，就是这个案例

作者: xyw5 时间: 2016-4-11 22:36

商业化的HCP kit检测的结果只能代表通用的那些HCP的含量和比例，但是每个项目都有其特异的HCP比例，且各个蛋白对HCP的检测干扰程度不一样，所以见了专属的HCP检测方法是非常必要的。我们公司申报的一个产品，就被CDE要求补充特异的HCP检测方法。

作者: BUK 时间: 2016-4-11 22:36

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商业化的HCP kit检测的结果只能代表通用的那些HCP的含量和比例，但是每个项目都有其特异的HCP比例，且各个蛋白对HCP的检测干扰程度不一样，所以见了专属的HCP检测方法是非常必要的。我们公司申报的一个产品，就被CDE要求补 ...

对呀，自己开发特异性ELISA成本太高。有什么解决办法么

作者: xyw5 时间: 2016-4-11 22:36

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对呀，自己开发特异性ELISA成本太高。有什么解决办法么

成本高也没办法啊，毕竟咱做的是药啊，何况这点成本跟做药比起来已经算是很少很少啦。只能做，不然符合不了CDE的要求，啥都白费了，您说呢？

作者: BUK 时间: 2016-4-11 22:37

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成本高也没办法啊，毕竟咱做的是药啊，何况这点成本跟做药比起来已经算是很少很少啦。只能做，不然符合不了CDE的要求，啥都白费了，您说呢？

我的意思，你们选择免疫动物，多抗做ELISA，还是用其他方法

作者: 987789 时间: 2016-4-11 22:37

这个我具体也不是很清楚，我是做纯化的，但大概思路应该差不多吧，就是用空载体表达无蛋白上清，进行全HCP的提取，然后注射入小鼠体内，接着提取多抗吧

作者: BUK 时间: 2016-4-11 22:38

但是，我琢磨了下，免疫小鼠，抗血清量太少了。除非是做单克隆抗体，做单抗又不适用于宿主蛋白检测。
所以，应该是免疫大型动物。

作者: 987789 时间: 2016-4-11 22:38

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但是，我琢磨了下，免疫小鼠，抗血清量太少了。除非是做单克隆抗体，做单抗又不适用于宿主蛋白检测。
所以，应该是免疫大型动物。

如果自己免疫制备HCP抗体，其中捕获抗体（Picture antibody）和检测抗体都一样要免疫动物吗？

作者: BUK 时间: 2016-4-11 22:38

我理解，捕获抗体为宿主蛋白免疫动物获得的多抗。

作者: 雪花子 时间: 2016-4-11 22:39

如果自己免疫制备HCP抗体，其中捕获抗体（Picture antibody）和检测抗体都一样要免疫动物吗？

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捕获的抗体需要，待检测的抗体就不需要啦

作者: 雪花子 时间: 2016-4-11 22:39

QUOTE:

这个具体不是很清楚，但是我觉得小型的也够用啦，毕竟检测都是ng级别的啊，提取一批多抗怎么也得mg级别的吧

作者: INK 时间: 2016-4-11 22:39

都是高手，学习了。我最近也在做Cygnus F550 CHO HCP ELISA kit的方法学验证，听这么一说感觉好复杂。特异的HCP检测方法开发的话需要半年吧，半年时间有点长呀。

作者: vera+ 时间: 2016-4-11 22:40

商业化的HCP kit检测的结果只能代表通用的那些HCP的含量和比例，但是每个项目都有其特异的HCP比例，且各个蛋白对HCP的检测干扰程度不一样，所以见了专属的HCP检测方法是非常必要的。我们公司申报的一个产品，就被CDE要求补充特异的HCP检测方法。

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你们的这个品种是什么阶段，申报临床还是申报生产？
据我了解，申报临床很多还是采用的商业化试剂盒，审评意见会要求你今后采用专属的HCP，但是不清楚是不是当成发补意见的，必须补充后才批。

作者: yyaxw84 时间: 2016-4-11 22:41

你们的这个品种是什么阶段，申报临床还是申报生产？
据我了解，申报临床很多还是采用的商业化试剂盒，审评意见会要求你今后采用专属的HCP，但是不清楚是不是当成发补意见的，必须补充后才批。

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申报临床，是要补充后才批的，现在评审中心的老师越来越专业，越来越严格了

作者: nikonun 时间: 2016-4-11 22:42

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你们的这个品种是什么阶段，申报临床还是申报生产？
据我了解，申报临床很多还是采用的商业化试剂盒，审评意见会要求你今后采用专属的HCP，但是不清楚是不是当成发补意见的，必须补充后才批。
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看来现在很多工作都提前到申报临床阶段料，原来很多高要求都是申报生产才严格的。
那发补时间是有限制的，短时间能完成么，貌似免疫动物需要的时间比较长。
想了解现在一般都是如何制备特异性的HCP检测试剂盒的？

作者: yyaxw84 时间: 2016-4-11 22:42

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原帖由 nikonun 于 2016-4-11 22:42 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

看来现在很多工作都提前到申报临床阶段料，原来很多高要求都是申报生产才严格的。
那发补时间是有限制的，短时间能完成么，貌似免疫动物需要的时间比较长。
想了解现在一般都是如何制备特异性的HCP检测试剂盒的？ ...

具体的我就不是很清楚了，主要这块不是我负责的。不过流程应该大致相似吧，就是先捕获到无目的蛋白的全宿主蛋白，然后进行动物体内免疫，然后收获腹水进行纯化并进行滴度检测。

作者: mogu 时间: 2016-4-11 22:42

HCP的特异性抗体的制备总是一个值得探讨的问题，就是HCP是怎么来的很重要，HCP的特异性抗体是相对的。
HCP中各个蛋白丰度及免疫原性不同，HCP特异抗体就有差别。
所以想知道是否有人看过国外的文献或者国外监管是如何看待这一块的。

作者: yapuyapu 时间: 2016-4-11 22:43

HCP抗体制备很少有免疫老鼠制备抗体的。cygnus试剂盒及abcam公司中的HCP抗体是羊多抗或兔多抗，这样的好处很明显，一次制备量可以够用几年甚至上十年，也避免不同制备批次间的差异。如后期工艺稳定，考虑工艺特异性，可另外再制备工艺特异性抗体，适合申报注册等。工艺特异抗原的制备，就是空白菌经过相同的发酵及纯化条件处理后所得，当然，纯化至哪一步，这个就得具体问题，具体分析了，不建议到最后一步，虽然针对性会更强，但不能保证不会缺失部分HCP，建议层析一步或两步，目的蛋白纯度达到一定要求就可以了。
HCP制备中免疫原性差异的问题是难以避免的，abcam公司针对大肠低分子量HCP的抗体，货号为ab181642，大家可以了解下。
对了，关于专属性验证问题，我们这里只考察了基质的影响。其实，houjinglhy 所说的也不错，可找其他相关蛋白验证，如你是CHO HCP试剂盒，是不是可以检测大肠或酵母的HCP，看是否存在交叉反应？

作者: shanzhapia696 时间: 2016-4-11 22:43

突然纠结出一个问题，申报临床和申报生产阶段工艺不同，特异的HCP检测试剂盒应该也不同。
如果按照坛友说的，宿主蛋白制备需要空载体细胞经过全部或者前几部纯化步骤获得，那是否意味着工艺变更就要考虑宿主蛋白可能发生改变，anti-HCP试剂盒可能就要更新，例如国内通常的做法是申报临床阶段支持到临床I和II，之后临床III和生产研究要更改工艺，并且锁定工艺，此时无论工艺或者规模都发生改变，那特异性HCP试剂盒是否也应重新评估或者重新制备。

作者: qqq111 时间: 2016-4-11 22:43

申报临床，是要补充后才批的，现在评审中心的老师越来越专业，越来越严格了

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现在申报临床如果用Cygnus 的试剂盒检测HCP残留已经不批了吗？

作者: wzqzy 时间: 2016-4-11 22:44

专属性强的自然是自建ELISA方法，而不是商品化通用型ELISA试剂盒。

国外有些品种报产阶段，要利用自己的宿主（含空载体）免疫动物，获得的抗血清，分离纯化的多克隆抗体制备ELISA试剂盒。这些多克隆抗体自然是针对自己的宿主，但是这个方法也有局限性。1）开发周期半年以上，且成本过高。2）免疫动物获得多克隆抗体，只针对高免疫原性HCP。对于低免疫选型HCP，存在漏检的可能。
当然，除了ELISA外，也有2D-page，LC-MS等方法，但是这些还未在工业界广泛使用
不了解。国内报产阶段的HCP是否要求建立专属性方法。
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请教版主，F550 CHO HCP ELISA kit的标准曲线不是直线，应该怎么验证它的线性？还有就是线性范围是验证试剂盒说明书上写的1-100ng/mL，还是选择中间的某浓度（比如50ng/mL）的50%-150%（25-75ng/mL）来做？谢谢！

作者: wzqzy 时间: 2016-4-11 22:45

商业化的HCP kit检测的结果只能代表通用的那些HCP的含量和比例，但是每个项目都有其特异的HCP比例，且各个蛋白对HCP的检测干扰程度不一样，所以见了专属的HCP检测方法是非常必要的。我们公司申报的一个产品，就被CDE要求补充特异的HCP检测方法。

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请问你们最后是自己开发HCP检测方法了吗？谢谢！

作者: yyaxw84 时间: 2016-4-11 22:45

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原帖由 wzqzy 于 2016-4-11 22:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
商业化的HCP kit检测的结果只能代表通用的那些HCP的含量和比例，但是每个项目都有其特异的HCP比例，且各个蛋白对HCP的检测干扰程度不一样，所以见了专属的HCP检测方法是非常必要的。我们公司申报的一个产品，就被CDE要求补充 ...

是的，不过之后我就跳槽了呵呵所以接下来的具体事情也不是很清楚了

作者: 8s5g 时间: 2016-4-11 22:45

感觉开发自己特异性的HCP ELISA试剂盒简直就是一个无底洞，其实采用空载体表达的CHO细胞株的HCP用来制备试剂盒也是有缺陷的，最科学的就是按照正常生产流程把获得产品中的HCP进行富集然后再用来免疫动物，哈哈，这种折腾谁能承受？

作者: ukonptp 时间: 2016-4-11 22:46

按照正常生产流程走一把，收集HCP进行富集，还是有漏洞的，小蛋白的免疫原性就是差，覆盖还是有问题。
更改工艺后，HCP检测试剂盒重新评估，确实是个无底洞。

作者: 大桃子同学 时间: 2016-4-11 22:46

现在应该很多公司都在使用商品化的CHO HCP检测试剂盒，对于专属性的验证我们内部讨论觉得在辅料和非CHO细胞来源的细胞上清或表达产物中检测为阴性，证明没有非特异性结合就可以了。
关于使用2D-WB或LCMSMS来研究该试剂盒所针对的自己的生产用CHO细胞系的HCP覆盖率多少，有条件的可以做下，但参考意义不大，因为其结果只是表明该商品化试剂盒能覆盖到的宿主细胞蛋白种类而并不是含量（或许你做出来的覆盖率只有30%但是这30%种类的蛋白在你的最终产品的所有残留HCP中质量占90%，那么该试剂盒的准确性也能达到90%）。
所以最好的办法还是只有根据不同的生产工艺，制备工艺特异的细胞蛋白标准品和特异的抗血清，建立相应的检测方法，才能更真实反应供试品的’细胞蛋白残留量。也就是通过裂解或冻融提取自己生产用的CHO宿主蛋白在你的整个工艺流程中走一遍，最后通过富集来获得工艺特异的宿主细胞蛋白标准品并用之免疫动物获得其特异的抗体，以此建立自己的检测方法。但是这条路耗时耗钱耗精力一般的公司还真不好做。
从另一方面看市面上商品化HCP检测试剂盒已如此普及，如果已有使用这类商品化试剂盒在FDA或SFDA申报成功或已上市的先例，那我觉得大家就可以放心的使用这些试剂盒。

作者: chenshuanhe 时间: 2016-4-11 22:47

QUOTE:

原帖由 大桃子同学 于 2016-4-11 22:46 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
现在应该很多公司都在使用商品化的CHO HCP检测试剂盒，对于专属性的验证我们内部讨论觉得在辅料和非CHO细胞来源的细胞上清或表达产物中检测为阴性，证明没有非特异性结合就可以了。
关于使用2D-WB或LCMSMS来研究该试剂盒 ...

好深奥，你们现在项目审完了没？目前只是中检院提出了复核意见吧，具体药审上什么意见呢。特异性检测确实准确度较高，但难度不小，商品化试剂盒覆盖率才刚过百分之五十，估计药审上难以认可，具体可行的方法还要像前辈学习，不知道首句专属性验证的方法代表什么意思，不是很懂

作者: 04906 时间: 2016-4-11 22:47

现在应该很多公司都在使用商品化的CHO HCP检测试剂盒，对于专属性的验证我们内部讨论觉得在辅料和非CHO细胞来源的细胞上清或表达产物中检测为阴性，证明没有非特异性结合就可以了。
关于使用2D-WB或LCMSMS来研究该试剂盒所针对的自己的生产用CHO细胞系的HCP覆盖率多少，有条件的可以做下，但参考意义不大，因为其结果只是表明该商品化试剂盒能覆盖到的宿主细胞蛋白种类而并不是含量（或许你做出来的覆盖率只有30%但是这30%种类的蛋白在你的最终产品的所有残留HCP中质量占90%，那么该试剂盒的准确性也能达到90%）。
所以最好的办法还是只有根据不同的生产工艺，制备工艺特异的细胞蛋白标准品和特异的抗血清，建立相应的检测方法，才能更真实反应供试品的’细胞蛋白残留量。也就是通过裂解或冻融提取自己生产用的CHO宿主蛋白在你的整个工艺流程中走一遍，最后通过富集来获得工艺特异的宿主细胞蛋白标准品并用之免疫动物获得其特异的抗体，以此建立自己的检测方法。但是这条路耗时耗钱耗精力一般的公司还真不好做。
从另一方面看市面上商品化HCP检测试剂盒已如此普及，如果已有使用这类商品化试剂盒在FDA或SFDA申报成功或已上市的先例，那我觉得大家就可以放心的使用这些试剂盒。
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其实是大家肯定都想用商业化试剂盒来做，但之前的帖子也聊过，虽然都是CHO细胞，每家的CHO也不一样，这样带来的问题就比较多。如果审评不认可，那你就是花费再多也要做。
之前了解很多都是采用商业化试剂盒来做的，但也确实有坛友提到审评发补，并且要自制试剂盒，这样时间就比较长，所以想知道目前审评的态度或者基于什么考虑的。
细胞蛋白的制备是个永无完美的话题，例如有的说蛋白不容易拿到，CHO细胞裂解后过个靠前面步骤的柱子即可；有的说过完整个步骤，蛋白量少，但可以多准备点；有的说即使过完所有步骤，有的小蛋白还是免疫原性差，不能完全覆盖，是不是再富集一下或者别的手段增强免疫。

作者: 9妖9 时间: 2016-4-11 22:48

看了大家的讨论，我有个疑问，如果CHO细胞裂解上清作为抗原制备的多抗，能100%覆盖抗原，是不是就不没什么必要去根据工艺做特异性抗体了呢？那只要制备出全覆盖的多抗就可以吧

作者: yyaxw84 时间: 2016-4-11 22:48

QUOTE:

原帖由 9妖9 于 2016-4-11 22:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

看了大家的讨论，我有个疑问，如果CHO细胞裂解上清作为抗原制备的多抗，能100%覆盖抗原，是不是就不没什么必要去根据工艺做特异性抗体了呢？那只要制备出全覆盖的多抗就可以吧 ...

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达不到100%的这个水平的，首先分子量小的那部分蛋白免疫原性太差，很难产生抗体。
其次空载的CHO细胞和你实际构建的细胞株活性也有差异性，得到的hcp蛋白不可能100%一致。

作者: one 时间: 2016-4-11 22:49

既然分子量小的那部分蛋白免疫原性太差，很难产生抗体，那么换句话说，在人体内也很难产生抗体，就可以不做为有害物质考虑了。

空载的CHO细胞纯化出来的HCP蛋白，确定是和实际构建且纯化时是一致的么？蛋白之间的相互作用不用考虑了么？

检测毕竟是辅助手段，在源头控制宿主蛋白含量才是问题本质，至于是否能全部检测出来，现阶段的检测手法问题无法做到的事，是不是可以不纠结这个问题了呢？因为我们的目的是为了控制宿主蛋白含量，而不是为了检测宿主蛋白含量。

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