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标题: 【求助】关于抗体电荷异构体之间是否存在相互转化问题 [打印本页]

作者: hulu呼噜    时间: 2016-4-13 12:41     标题: 【求助】关于抗体电荷异构体之间是否存在相互转化问题



如题,碰到的个问题,我用制备型HPLC分别分离收集酸碱性异构体,按照主峰峰谷收集,之后进行浓缩,去分析型检测,所用柱子介质一致,只是体积不同。如图所示 结果虽然酸性异构体中酸性组分明显变多,但仍存在目的组分。目的组分纯度将近100,收集的碱性异构体更加神奇,酸性组分与碱性组分均增加。,目的组分的出现比较合理,收集碱性组分时,不应该还存在酸性组分。所以请教各位大神,是否有看到类似文献说 酸碱性异构体之间会相互转换 ?
我个人知识,也许会有转换,比如C端赖氨酸存在显碱性峰,过程中被切除变成酸性异构体? 只是原先结果显示该蛋白赖氨酸已经大部分被切除


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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43560


作者: 555444    时间: 2016-4-13 12:42


不知你上样量是多大,还有你的分析方法好像不好吧,看过很多色谱图,很少看见像你这样的色谱图,均向右倾斜,并且,右面几乎不拖尾,一般的色谱图要是拖尾都是右变的;另外酸碱组分很难分开的,等电点一般就差0.1,不过如果你分离方法好的话,还是可以得到的,见过文献上的分析图谱,分离效果不错,后面2个碱性峰的保留时间能相差1min左右,人家用的是WCX。

作者: 04906    时间: 2016-4-13 12:42


楼主提出了一个很有意思的问题。综合楼主和楼上站友们的意见,我的看法如下:
色谱左拖尾很可能是由于样品浓缩后上样量太大引起的。
酸碱组分在第一步分离的效果确实不够好,但是无论如何差,都不能解释为何“碱性异构体更加神奇,酸性组分与碱性组分均增加”
上述貌似神奇的现象很可能确如楼主推测的:“酸碱性异构体之间会相互转换”。至少碱性成分可以转化为酸性成分。在楼主浓缩过程中,有些影响酸碱性异构体的成分(如铜离子)会大大增加,从而导致碱性成分转化为酸性成分。
支持文献:cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3242844/')
上述文献相关关键结果:“While the acidic charge variant profile remained unchanged for all copper concentrations, the relative abundance of certain basic peaks increased with increasing copper concentration over the range tested。”
单抗电荷异构体的形成原因有很多(Heterogeneity in mAbs is represented by charge variants, typically caused by deamidation, isomerization, succinimide formation, oxidation, sialylation, N-terminal pyroglutamic acid or C-terminal lysine (Lys) clipping)。所以有许多可能的因素会导致碱性成分转化为酸性成分。

作者: XYZQ    时间: 2016-4-13 12:42

无图无真相,楼主有图谱吗?感觉不太可能会转化的,你的实验具体是怎么设计的,分别收集三个峰再去IEC分析?
作者: 00无名指00    时间: 2016-4-13 12:42

建议把图贴上来,大家好分析
作者: HPLC使者    时间: 2016-4-13 12:43

不知你上样量是多大,还有你的分析方法好像不好吧,看过很多色谱图,很少看见像你这样的色谱图,均向右倾斜,并且,右面几乎不拖尾,一般的色谱图要是拖尾都是右变的;另外酸碱组分很难分开的,等电点一般就差0.1,不过如果你分离方法好的话,还是可以得到的,见过文献上的分析图谱,分离效果不错,后面2个碱性峰的保留时间能相差1min左右,人家用的是WCX。
作者: one    时间: 2016-4-13 12:43


应该不转化,好像根本没分开

作者: 牢骚科科长    时间: 2016-4-13 12:43


楼主提出了一个很有意思的问题。综合楼主和楼上站友们的意见,我的看法如下:
色谱左拖尾很可能是由于样品浓缩后上样量太大引起的。
酸碱组分在第一步分离的效果确实不够好,但是无论如何差,都不能解释为何“碱性异构体更加神奇,酸性组分与碱性组分均增加”
上述貌似神奇的现象很可能确如楼主推测的:“酸碱性异构体之间会相互转换”。至少碱性成分可以转化为酸性成分。在楼主浓缩过程中,有些影响酸碱性异构体的成分(如铜离子)会大大增加,从而导致碱性成分转化为酸性成分。
支持文献:cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3242844/')
上述文献相关关键结果:“While the acidic charge variant profile remained unchanged for all copper concentrations, the relative abundance of certain basic peaks increased with increasing copper concentration over the range tested。”
单抗电荷异构体的形成原因有很多(Heterogeneity in mAbs is represented by charge variants, typically caused by deamidation, isomerization, succinimide formation, oxidation, sialylation, N-terminal pyroglutamic acid or C-terminal lysine (Lys) clipping)。所以有许多可能的因素会导致碱性成分转化为酸性成分。

作者: tuomu45    时间: 2016-4-13 12:44


现在主流的测电荷异质性是通过离子柱来分析,但是它的分辨率达不到我们理想中的要求(峰之间完全分离),但是这是现状,所以技术还有待进一步发展。既然分辨率达不到完全分离,那么表明组分之间没有完全分离,完全有可能酸性峰有碱性峰,碱性峰中有酸性峰(如果做过纯化,可能理解会更深刻)。个人认为,这种情况很正常。另外酸性峰,主峰,碱性峰不是纯物质,它们是一堆混合物,他们之间含量的变化是很复杂的。一点个人浅见。

作者: hulu呼噜    时间: 2016-4-13 12:44


这个问题略久了,首先感谢各位战友的积极回答。 对于这个课题,后续又做了一些研究。 本人经过脱K之后发现,碱性峰比例相应减少(仍存在),而酸性第一个峰的比例明显上升,表明此酸性峰中确由碱性峰的一个成分脱K而来,另外碱性峰中并非只是一个翻译后修饰导致,而是一个混合物。对于是什么导致的翻译后修饰,样品正在送检打质谱,待日后再讨论。
ylhuang0502 说得现象以及文献我之前也有阅读过,因为我这里是纯化,用的制剂纯品,并不涉及培养液中的铜。
为了得到足够纯的样品,将第一次纯化的再重复分离,样品纯度上升不少,,但依然存在上述的现象。 将碱性组分一直往后收集,收集完不浓缩,直接分析,仍能见到约有10%的主峰。这个现象也说明,酸碱性质相近,在这样的分离条件下,(HPLC,WCX-10柱子)不能完全分离。
综上,出现最开始的情况,两种因素都存在,分离效果不佳以及转化问题。

作者: TAT    时间: 2016-4-13 12:44

这个问题略久了,首先感谢各位战友的积极回答。 对于这个课题,后续又做了一些研究。 本人经过脱K之后发现,碱性峰比例相应减少(仍存在),而酸性第一个峰的比例明显上升,表明此酸性峰中确由碱性峰的一个成分脱K而来,另外碱性峰中并非只是一个翻译后修饰导致,而是一个混合物。对于是什么导致的翻译后修饰,样品正在送检打质谱,待日后再讨论。
ylhuang0502 说得现象以及文献我之前也有阅读过,因为我这里是纯化,用的制剂纯品,并不涉及培养液中的铜。
为了得到足够纯的样品,将第一次纯化的再重复分离,样品纯度上升不少,,但依然存在上述的现象。 将碱性组分一直往后收集,收集完不浓缩,直接分析,仍能见到约有10%的主峰。这个现象也说明,酸碱性质相近,在这样的分离条件下,(HPLC,WCX-10柱子)不能完全分离。
综上,出现最开始的情况,两种因素都存在,分离效果不佳以及转化问题。
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又看到楼主的图谱了,仔细看了下,第1个碱性峰是单K,第2个碱性峰是双K,一般要求仿制药是第1个碱性峰的含量大于第2个碱性峰的,楼主的含量反过来了,我们现在也遇到这个问题了;另外,又遇到个大问题:放大到50L时,碱性成分增到了20%,以前做的小试研发工艺是除去酸性成分后碱性是符合要求的,现在碱性占的比例变大,就不好办了,酸性成分比碱性成分好处理,现在还得重新研究工艺除去碱性成分,希望上游放大到100L又出现了新的酸碱比例。
作者: 8princess8    时间: 2016-4-13 12:45

又看到楼主的图谱了,仔细看了下,第1个碱性峰是单K,第2个碱性峰是双K,一般要求仿制药是第1个碱性峰 ...

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国内单抗研究的通病,不必说细胞株,也不必说培养基,单是短短的培养工艺一带,就有无限的问题。
作者: 1221    时间: 2016-4-13 12:45

lz,保留时间校过的吧?看到那条红线了。
1个K,2个K的峰,应该是能轻松分开的,lz梯度可以再优化。
PGK,P Amidated的一样导致碱性峰。

作者: wiwi    时间: 2016-4-13 12:46

又看到楼主的图谱了,仔细看了下,第1个碱性峰是单K,第2个碱性峰是双K,一般要求仿制药是第1个碱性峰的含量大于第2个碱性峰的,楼主的含量反过来了,我们现在也遇到这个问题了;另外,又遇到个大问题:放大到50L时,碱性成分增到了20%,以前做的小试研发工艺是除去酸性成分后碱性是符合要求的,现在碱性占的比例变大,就不好办了,酸性成分比碱性成分好处理,现在还得重新研究工艺除去碱性成分,希望上游放大到100L又出现了新的酸碱比例。

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图谱看的不是很清楚。第一个第二个碱性峰是不是含K的峰要看CPB酶切之后的结果的,有可能第一个峰是P-amidated的峰,第二个碱性峰才是1k,而2K则很小。所以也有可能第二个碱性峰高于第一个碱性峰。我们做的就有这样的
另外说到放大后的酸碱比例出现变化我们也经常碰到,酸性峰还可以通过后期纯化降低,碱性峰就有点困难,我们当时碰到的问题就是1K的峰太高,导致件碱性峰一直超标

作者: BUK    时间: 2016-4-13 12:46

lz,保留时间校过的吧?看到那条红线了。
1个K,2个K的峰,应该是能轻松分开的,lz梯度可以再优化。
PGK,P Amidated的一样导致碱性峰。

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弱弱的问下,PGK和P Amidated具体代表什么意思?
我的理解是磷酸甘油酸激酶和脱酰胺,对吗?

作者: BUK    时间: 2016-4-13 12:47

lz,保留时间校过的吧?看到那条红线了。?1个K,2个K的峰,应该是能轻松分开的,lz梯度可以再优化。?PGK,P Amidated的一样导致碱性峰。?
弱弱的问下,PGK和P Amidated具体代表什么意思? ?我的理解是磷酸甘油酸激酶和脱酰胺,对吗?

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你是真可爱还是逗我们的玩的,看文献之前做蛋白要懂序列的,PGK是C末端的三个氨基酸缩写,另外一个东东是缺失GK,P氨基酸被amidated了。
作者: BUK    时间: 2016-4-13 12:47



QUOTE:
原帖由 BUK 于 2016-4-13 12:47 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
lz,保留时间校过的吧?看到那条红线了。?1个K,2个K的峰,应该是能轻松分开的,lz梯度可以再优化。?PGK,P Amidated的一样导致碱性峰。?
弱弱的问下,PGK和P Amidated具体代表什么意思? ?我的理解是磷酸甘油酸激酶和脱酰胺,对吗?

= ...

好吧,关于PGK我想多了
作者: 简森si    时间: 2016-4-13 12:48

国内单抗研究的通病,不必说细胞株,也不必说培养基,单是短短的培养工艺一带,就有无限的问题。

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我赞同你的观点,发现做发酵的根本不懂发酵,出现问题后,发酵人员和所谓的海龟工作15年大领导提出的解决方法真是笑死人,完全不是在理论之上的,最后看不下去了,我们做纯化的才给他们提出解决方案,唉,悲哀啊

作者: 8princess8    时间: 2016-4-13 12:48

类似的事我们见多了,很多海归都这样,真正懂的还是牛的,但是很多所谓的大海龟就根本不懂工艺,只是做过研究而已。或者贬低做工艺人员的价值,天天吹牛自己多创新。
细胞培养工艺是个大学问,抗体纯化上很多问题不好解决,培养上小道道太多了。

作者: 101010    时间: 2016-4-13 12:49


这个话题有点意思啊,有持续的关注。charge variants的分离我觉得还是displacement chromatography效果最好。另外,这个图谱确实不正常,整体偏右。现在国内做抗体药的,都没有人是全部都懂的,做培养的也许只知道发酵,但是对蛋白质的性质完全不了解,做纯化的也未必深度了解蛋白质。药物分析这块呢多数是以前做小分子的,后来转做大分子,方法虽然大同小异,但是蛋白质的复杂性决定了分析的复杂。每个部分如果没有一个牛人支持,基本就搞不成。7楼这个确实很有意思,我以前确实碰到过这种蛋白,离子柱可以分得很好,但是后面每一个单独组分再分析又变了,不过这样的抗体确实没碰到过。按道理,抗体的charge variant虽然有多种成因,但是在下游纯化完成后最容易发生的也就是oxidation和deamidation了,有些可能还有Asp的isomerization啥的。如果真像7楼说的,倒是可以分析抗体里面是否含有这种金属离子导致构象出现了变化。

作者: PINK    时间: 2016-4-13 12:49

有没有这种可能,5转为2,6转为4或3,蛋白酶污染了,纯属瞎猜,转“Physicochemical characterization of Remsima®”。
Rituximab
cuturl('http://d.dxy.cn/detail/8018838')
Remicade
cuturl('http://d.dxy.cn/detail/7455129')


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作者: 04906    时间: 2016-4-13 12:49

楼上的能提供一下infliximab的文献吗?谢谢额!
作者: windboy    时间: 2016-4-13 12:50

这个话题有点意思啊,有持续的关注。charge variants的分离我觉得还是displacement chromatography效果最好。另外,这个图谱确实不正常,整体偏右。现在国内做抗体药的,都没有人是全部都懂的,做培养的也许只知道发酵,但是对蛋白质的性质完全不了解,做纯化的也未必深度了解蛋白质。药物分析这块呢多数是以前做小分子的,后来转做大分子,方法虽然大同小异,但是蛋白质的复杂性决定了分析的复杂。每个部分如果没有一个牛人支持,基本就搞不成。7楼这个确实很有意思,我以前确实碰到过这种蛋白,离子柱可以分得很好,但是后面每一个单独组分再分析又变了,不过这样的抗体确实没碰到过。按道理,抗体的charge variant虽然有多种成因,但是在下游纯化完成后最容易发生的也就是oxidation和deamidation了,有些可能还有Asp的isomerization啥的。如果真像7楼说的,倒是可以分析抗体里面是否含有这种金属离子导致构象出现了变化。
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请教大牛displacement chromatography都有用到啥displacer?能做到多大规模?
作者: 3.14    时间: 2016-4-13 12:50

图谱看的不是很清楚。第一个第二个碱性峰是不是含K的峰要看CPB酶切之后的结果的,有可能第一个峰是P-amidated的峰,第二个碱性峰才是1k,而2K则很小。所以也有可能第二个碱性峰高于第一个碱性峰。我们做的就有这样的
另外说到放大后的酸碱比例出现变化我们也经常碰到,酸性峰还可以通过后期纯化降低,碱性峰就有点困难,我们当时碰到的问题就是1K的峰太高,导致件碱性峰一直超标
......

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感觉你说的不错,第一个是有可能是P Amidated,是需要看酶切后的结果;另外,后期纯化酸性峰是容易去除,而碱性峰则难以去除,主要是因为两则的浓度相差太大,酸性一般占34%左右,而碱性占15%以下,在同样的阳离子条件下,浓度与出峰的先后顺序导致除去难以程度不同,个人观点。
作者: 3.14    时间: 2016-4-13 12:52



QUOTE:
原帖由 PINK 于 2016-4-13 12:49 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
有没有这种可能,5转为2,6转为4或3,蛋白酶污染了,纯属瞎猜,转“Physicochemical characterization of Remsima®”。
Rituximab
cuturl('http://d.dxy.cn/detail/8018838')
Remicade
cuturl('http://d.dxy.cn/detail/7455129') ...

请问,你是用的N2000软件吧?
作者: hulu呼噜    时间: 2016-4-13 12:52



QUOTE:
原帖由 3.14 于 2016-4-13 12:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请问,你是用的N2000软件吧?

并不是,,就用的agilent chemstation。
作者: PINK    时间: 2016-4-13 12:53

http://d.dxy.cn/detail/7455129
已有,之前早已上传,其实抗体的经典的就那么几篇,是否是可以找个人把抗体的链接文章都整合下,进行分类,例如培养类、纯化类、质量研究、USP及国内标准、生物类似物类便于大家学习。或者把这些帖子汇总起来,便于学习。
我不做生物类似物,但我特别喜欢生物类似物的研究文章,感觉能悟出一些思路或者想法出来。

作者: hulu呼噜    时间: 2016-4-13 12:53

电荷异构体的课题也做完啦,感谢各位战友给予的帮助。
最终分离的样品
对于最初提的问题,做个总结,欢迎补充讨论。
1、分离方法:最开始分离电荷异构体时,考虑过用置换色谱(displacement chromatography),也有相应的文献参考,找到了置换剂,但置换剂过贵,且仍需检测置换剂的残留,最终放弃这个方法,改用半制备的离子交换柱,与分析型的一致,也有利于直观观察收集。 不过此方法收集量小,做常规分析够用。 若准备做细胞活性分析及动物实验,建议直接去探索置换色谱吧。 分离后,样品的保存很关键,后续的检测方法条件也值得推敲。
2、关于图谱偏右: 偏右的原因还是因为上样量亦或是分离条件受限,尝试过降低上样量,峰型对称因子变好,但由于微小的组分分辨差,导致比例差异大。 尝试过加大洗脱液离子强度,也同样能形成不拖尾的峰,但同样也易使碱性峰被洗脱,影响分析结果。 综上,受限于离子性质过近,某些翻译后修饰量甚小,选择分离条件时要平衡这些因素。个人感觉,原则上能表征CQA,同时方法耐受性、重复性等等均符合。
3、酸碱性成因: 24楼 jackieustc 提到了类克的酸碱性峰主要的形成原因,但如氧化、异构化等并未提及。 我所做的抗体 结果显示,酸性峰主要由脱酰胺、唾液酸、蛋氨酸组氨酸氧化 、异构化等,碱性峰主要有赖氨酸、氧化、多聚、man5等导致,酸碱性峰中性糖差异也显著,如G0 G1F man5,这些中性糖是否会通过构象影响与柱子的结果,现在也不得而知,已有多篇报道,并未得到一致结果。
4、酸碱性峰的转化:关于转化,主要牵扯到的是哪种翻译后修饰占主导。如唾液酸使抗体带负电,而赖氨酸会使抗体增加一个正电荷,若抗体同时存在唾液酸及赖氨酸,情况又会是如何? 两个赖氨酸存在下,会增大两个电荷,因而主要是碱性效应。 若在培养纯化等过程,赖氨酸被切除,碱性异构体就会转化成酸性异构体。7楼提到的CU离子,最终影响的也是赖氨酸的形成。 在课题中遇到酸碱性异构体中255位蛋氨酸氧化明显、经CPB处理后,碱性减少,酸性第一峰比例增加;经双氧水处理后,酸性第一峰同样增加显著。 这些现象似乎就能说明,对于此抗体255位蛋氨酸氧化导致构象改变,形成酸性异构体,但若末端赖氨酸存在,正电荷效应更加显著,最终主要显示碱性峰效应。受限于仪器条件,证明过程并为深入研究。
几点建议: 1、 关注聚体,聚体主要显示碱性,对离子分布、疏水分布及后续的活性实验都有很大影响。因为做碱性分析时,最好排除聚体干扰。
2、 疏水色谱在行业内并为得到较好的应用,但是其在表征PTM尤其是异构化,氧化等作用很显著。
3、 多读文献,由于PTM太过复杂,文献的积累很重要。当年提这个问题时啥都不懂,看了不下百篇文献后,很多问题都已经心中有底,只缺实验验证。

作者: #碧海潮生#    时间: 2016-4-13 12:54



QUOTE:
原帖由 hulu呼噜 于 2016-4-13 12:53 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
电荷异构体的课题也做完啦,感谢各位战友给予的帮助。
最终分离的样品
对于最初提的问题,做个总结,欢迎补充讨论。
1、分离方法:最开始分离电荷异构体时,考虑过用置换色谱(displacement chromatography),也有相应的文献参考,找 ...

太牛了,先挺后细细品味。
但是对你的课题来说,转化的原因呢,如何从碱性变成酸性的,氧化会形成酸性峰,但是末端的赖氨酸没那么容易掉的啊。如果赖氨酸不掉,单单氧化按你的描述,应该仍是碱性的。

作者: #碧海潮生#    时间: 2016-4-13 12:54

几点建议: 1、 关注聚体,聚体主要显示碱性,对离子分布、疏水分布及后续的活性实验都有很大影响。因为做碱性分析时,最好排除聚体干扰。
聚体出峰在碱性位置,甚至还要靠后,活性成倍增加。

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能排除当然最好。实际上很难,蛋白一般在离子交换层析过程中也会产生聚合。
作者: hulu呼噜    时间: 2016-4-13 12:55

聚体出峰在碱性位置,甚至还要靠后,活性成倍增加。
能排除当然最好。实际上很难,蛋白一般在离子交换层析过程中也会产生聚合

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嗯 对的,做了各种生物学活性、各类FcrR 及FcRn的活性研究,影响都很大,有些甚至出现了钩端效应。
在选择原料上,选择聚体最少的。 因为分离之后会富集,若碱性占10,1%的聚体经过富集后就能达到10%。
所以 最好做这个实验之前先经分离,可以用凝胶,可以用离子交换(分辨率高的介质,聚体可单独成峰)

作者: am10    时间: 2016-4-13 12:55

赞一个一年时间做出了这么多心得。
关于第3条我想假如一个抗体同时存在1个K以及发生了脱酰胺/蛋氨酸氧化,那抗体是否会显示存在在主峰里?

作者: hulu呼噜    时间: 2016-4-13 12:56



QUOTE:
原帖由 am10 于 2016-4-13 12:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
赞一个一年时间做出了这么多心得。
关于第3条我想假如一个抗体同时存在1个K以及发生了脱酰胺/蛋氨酸氧化,那抗体是否会显示存在在主峰里?

首先 关于氧化对电荷的影响,主要是改变构象。因而转变成 酸性或者碱性都有可能。
若一个抗体存在一个K,同时发生了一个脱酰胺,似乎正负电荷抵消,出现在主峰处。但其实不然,我个人觉得应该是碱性的。赖氨酸在末端,正电荷的增强效应远大于在侧链的天冬氨酸。 为何这么说,可以看看类克cIEF图,存在一个K,pI在7.47,主峰7.34,K导致的偏移是0.13。 类克的第一第二个峰差异在于第一个峰同时发生了脱酰胺,产生的偏移0.7(peak1=7.16,peak=7.23)可见K产生的偏移效果远大于脱酰胺产生的偏移。 我不知道这么解释是否牵强。可以再看看其他抗体的电荷分布情况。 即使有量也很少,很难被分离出来。脱酰胺整体的大概占5%,既有K又发生脱酰胺的少之又少。

作者: hulu呼噜    时间: 2016-4-13 12:56

太牛了,先挺后细细品味。
但是对你的课题来说,转化的原因呢,如何从碱性变成酸性的,氧化会形成酸性峰,但是末端的赖氨酸没那么容易掉的啊。如果赖氨酸不掉,单单氧化按你的描述,应该仍是碱性的。

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我课题探究的是电荷异构体的影响,,用的是成品。这之后的转化就如你说得脱K其实也不常见,主要还是氧化、脱酰胺等等。脱K,还是主要发生在细胞培养阶段。
我做的氧化实验,当初的设计是考察氧化的影响,并不是做转化研究。用的是不含酸碱性的主峰,双氧水氧化,看最终形成什么。 由于他本身不含K,所以最终形成了酸性峰。

作者: loli    时间: 2016-4-13 12:56

恭喜lz把这些峰都分开了。
我们也做过,像1楼那样的图,可以认为是没分开,而不是直接转化的,转化的在stress的时候可能发生的比较多。
另外酸峰建议lz去过个boronate的柱子,一定会发现有glycation的。

作者: hulu呼噜    时间: 2016-4-13 12:57



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原帖由 loli 于 2016-4-13 12:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
恭喜lz把这些峰都分开了。
我们也做过,像1楼那样的图,可以认为是没分开,而不是直接转化的,转化的在stress的时候可能发生的比较多。
另外酸峰建议lz去过个boronate的柱子,一定会发现有glycation的。 ...

嗯对的,酸性峰中有部分唾液酸。我最终通过糖苷酶酶切后再进行IEC分析,以及2-AB标记后,鉴定糖型的方法,比例了酸碱性峰糖型的差异。 另外你指的GLYCATION(加糖作用)还是glycosylation(糖基化)
作者: zhenxin    时间: 2016-4-13 12:57



QUOTE:
原帖由 hulu呼噜 于 2016-4-13 12:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

嗯对的,酸性峰中有部分唾液酸。我最终通过糖苷酶酶切后再进行IEC分析,以及2-AB标记后,鉴定糖型的方法,比例了酸碱性峰糖型的差异。 另外你指的GLYCATION(加糖作用)还是glycosylation(糖基化) ...

glycation,不是glycosylation.
作者: loli    时间: 2016-4-13 12:58

聚体出峰在碱性位置,甚至还要靠后,活性成倍增加。
能排除当然最好。实际上很难,蛋白一般在离子交换层析过程中也会产生聚合

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一般产生的是共价键还是非共价聚体,还有为什么活性成倍增加,有无文献参考学习下。
作者: loli    时间: 2016-4-13 12:58

一般产生的是共价键还是非共价聚体,还有为什么活性成倍增加,有无文献参考学习下。

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不好意思,我这也没有文献。同事做的结果,我也只是听说。
作者: hulu呼噜    时间: 2016-4-13 12:59

聚体出峰在碱性位置,甚至还要靠后,活性成倍增加。
能排除当然最好。实际上很难,蛋白一般在离子交换层析过程中也会产生聚合
一般产生的是共价键还是非共价聚体,还有为什么活性成倍增加,有无文献参考学习下。
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这里的多聚体主要是共价键,通过电泳疏水分子筛等手段鉴定猜测,主要是crd区二硫键错配导致。非共价的,在变性电泳中不错检测出来。有文献报道,我自己的实验结果也应征。文献改天找找再传。聚体会增加总亲合力,使活性增大。
作者: loli    时间: 2016-4-13 12:59



QUOTE:
原帖由 hulu呼噜 于 2016-4-13 12:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
聚体出峰在碱性位置,甚至还要靠后,活性成倍增加。
能排除当然最好。实际上很难,蛋白一般在离子交换层析过程中也会产生聚合
一般产生的是共价键还是非共价聚体,还有为什么活性成倍增加,有无文献参考学习下。
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CDR区域时结合抗原的,要是通过共价连接问题,一种可能改变构象导致亲合力增加,一种可能是抗体变成二价或者多价导致亲合力增加。但是CDR区功能区域要是改变,也可能结合出现问题,亲合力可能降低。
作者: tudou85    时间: 2016-4-13 13:00

一年多过去了,看到这么多战友持续关注,感到很欣慰。电荷异构体的课题也做完啦,感谢各位战友给予的帮助。

最终分离的样品
对于最初提的问题,做个总结,欢迎补充讨论。
1、分离方法:最开始分离电荷异构体时,考虑过用置换色谱(displacement chromatography),也有相应的文献参考,找到了置换剂,但置换剂过贵,且仍需检测置换剂的残留,最终放弃这个方法,改用半制备的离子交换柱,与分析型的一致,也有利于直观观察收集。 不过此方法收集量小,做常规分析够用。 若准备做细胞活性分析及动物实验,建议直接去探索置换色谱吧。 分离后,样品的保存很关键,后续的检测方法条件也值得推敲。
2、关于图谱偏右: 偏右的原因还是因为上样量亦或是分离条件受限,尝试过降低上样量,峰型对称因子变好,但由于微小的组分分辨差,导致比例差异大。 尝试过加大洗脱液离子强度,也同样能形成不拖尾的峰,但同样也易使碱性峰被洗脱,影响分析结果。 综上,受限于离子性质过近,某些翻译后修饰量甚小,选择分离条件时要平衡这些因素。个人感觉,原则上能表征CQA,同时方法耐受性、重复性等等均符合。
3、酸碱性成因: 24楼 jackieustc 提到了类克的酸碱性峰主要的形成原因,但如氧化、异构化等并未提及。 我所做的抗体 结果显示,酸性峰主要由脱酰胺、唾液酸、蛋氨酸组氨酸氧化 、异构化等,碱性峰主要有赖氨酸、氧化、多聚、man5等导致,酸碱性峰中性糖差异也显著,如G0 G1F man5,这些中性糖是否会通过构象影响与柱子的结果,现在也不得而知,已有多篇报道,并未得到一致结果。
4、酸碱性峰的转化:关于转化,主要牵扯到的是哪种翻译后修饰占主导。如唾液酸使抗体带负电,而赖氨酸会使抗体增加一个正电荷,若抗体同时存在唾液酸及赖氨酸,情况又会是如何? 两个赖氨酸存在下,会增大两个电荷,因而主要是碱性效应。 若在培养纯化等过程,赖氨酸被切除,碱性异构体就会转化成酸性异构体。7楼提到的CU离子,最终影响的也是赖氨酸的形成。 在课题中遇到酸碱性异构体中255位蛋氨酸氧化明显、经CPB处理后,碱性减少,酸性第一峰比例增加;经双氧水处理后,酸性第一峰同样增加显著。 这些现象似乎就能说明,对于此抗体255位蛋氨酸氧化导致构象改变,形成酸性异构体,但若末端赖氨酸存在,正电荷效应更加显著,最终主要显示碱性峰效应。受限于仪器条件,证明过程并为深入研究。
几点建议: 1、 关注聚体,聚体主要显示碱性,对离子分布、疏水分布及后续的活性实验都有很大影响。因为做碱性分析时,最好排除聚体干扰。
2、 疏水色谱在行业内并为得到较好的应用,但是其在表征PTM尤其是异构化,氧化等作用很显著。
3、 多读文献,由于PTM太过复杂,文献的积累很重要。当年提这个问题时啥都不懂,看了不下百篇文献后,很多问题都已经心中有底,只缺实验验证。
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楼主能把酸2和碱1峰分开,值得庆贺。我想问下,用的填料类型和柱长高度,可否告知?有没有使用特别的试剂?
另外,楼主提到糖型差异会引起碱性峰的比例增加,是将碱性峰做过糖谱分析的吗?

作者: bamboo16    时间: 2016-4-13 13:00


检测时,样品不同缓冲体系(比如说处方筛选时),会不会影响出峰峰型及酸碱分布?需不需要换成跟平衡液一致的缓冲液在上样?

作者: 911    时间: 2016-4-13 13:01



总结的很到位啊。离子交换制备收集酸性峰,主峰和碱性峰然后分别研究也是认识电荷异质性的有效手段。你提到的酸碱峰糖型差异问题,我在我们的两个项目也碰到了,也是反映在G0FG1F和Man5。聚体的话,我们并不明显,酸主碱可能就零点几的差异。你提到的PTM差异主要是LC-MS数据,有一点不知你是否注意,往往酸峰和碱峰某一个有差异的后修饰其实差的不会很大,比如脱酰胺我们完整抗体是10%比例,原以为分离制备得到酸性峰会和碱性峰会相差很大超过50%吧,结果真实结果差的并不多,这也反映之前战友提到的酸峰和碱峰是一个混合物,是所有后修饰或是构像的贡献叠加而成。此外,K的糖化不知在你们LC-MS data是否有体现,这也是呈现酸性峰的,酸峰往往糖化比例会多。而且酸性峰往往有更多的不完整片段(CE-SDS的HHL,HH),这一点不知你这个项目是否也是如此。

作者: zwsyrt    时间: 2016-4-13 13:01

恭喜lz把这些峰都分开了。
我们也做过,像1楼那样的图,可以认为是没分开,而不是直接转化的,转化的在stress的时候可能发生的比较多。
另外酸峰建议lz去过个boronate的柱子,一定会发现有glycation的。
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应该是会有差异的。请问你们也是做硼酸盐亲和柱分析吗?我们只是在LC-MS上看到糖化,更严谨的定量数据确实是要用液相分析柱,目前正在考察柱子和方法





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