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标题: 【讨论帖】Autophagy（自噬） [打印本页]

作者: NBA 时间: 2016-4-14 11:08 标题: 【讨论帖】Autophagy（自噬）

自噬是近年来很热门的领域，搜了一下园子，发现没有这方面系统的介绍或讨论，但很多战友有这方面的疑问，加上本人最近对此也非常感兴趣，因此，借本版来专门讨论一下自噬（说实在的，自噬属于丁香园哪一个版块的范围我也选不好），与各位同行或有志于研究自噬的战友共同学习，也欢迎大家提出自己的看法，本人的目的就是交流。
自噬相关文献的全文——纳米盘下载key：123
内容：
1）什么是自噬？
包括自噬的定义、形态学特征、分子基础、调控等
2）自噬的意义
自噬与细胞存活、细胞死亡、疾病、衰老等的关系
3）怎么研究自噬？
主要谈谈怎么证明细胞发生了自噬，即自噬的判断标准和各种研究自噬的方法及局限性。

[ 本帖最后由 NBA 于 2016-4-14 16:21 编辑 ]

作者: yjf1026 时间: 2016-4-14 11:08

自噬的抑制
根据自噬形成的过程，自噬的抑制也分为不同的阶段，包括自噬的起始阶段，自噬泡和溶酶体融合阶段，以及溶酶体内的降解阶段。目前常用的一些抑制药物如下：
（1）对自噬体形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制剂（如3-MA, Wortmannin，LY294002等），这些药物均可干扰或阻断自噬体形成。3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine, 3-MA）是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，可特异性阻断Autophagy中自噬体的形成，被广泛用作Autophagy的抑制剂。另外，渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002 也可用作Autophagy的抑制剂。
（2）对自噬体与溶酶体融合的抑制：对自噬体与溶酶体融合过程进行阻断也能起着抑制自噬的作用，这些药物有巴伐洛霉素A1、长春碱、诺考达唑等。巴伐洛霉素A1（Bafilomycin A1）是一种来源于灰色链霉菌的大环内酯类抗生素，分子式C35H58O9，是空泡型H+-ATP酶的特异性抑制剂，具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤等作用。当突触小泡经历胞外分泌时，巴伐洛霉素A1可以避免小泡重新酸化。有研究表明，在已发生自噬的肿瘤细胞中加入巴伐洛霉素A1，可使蛋白降解被抑制，自噬体增多而自噬溶酶体数目减少，并且自噬体中的酸性磷酸酶的活性也明显降低，从而证明其阻断了自噬体与溶酶体的融合过程。这种阻断是可逆的，在去除了药物作用后，自噬体仍可以与溶酶体融合形成自噬溶酶体，继续自噬进程。
（3）对溶酶体降解的抑制: 自噬体与溶酶体融合后最终被溶酶体中的水解酶水解，它首先经过囊泡酸化，达到所需的PH值后经多种蛋白酶作用使囊内容物降解，降解产物在细胞内再循环利用。对溶酶体的降解进行抑制，使得被降解的囊泡内容物大量蓄积于溶酶体内，而不能释放出来进入细胞内再循环利用，这也同样起着抑制自噬的作用。因此，蛋白酶抑制剂，如E64d、Pepstatin A等，在抑制溶酶体降解的过程中发挥着自噬抑制剂的作用。E64d和Pepstatin A均属于蛋白酶抑制剂，二者以1：1的比例联用可以抑制自噬。有研究表明，在结肠癌细胞系中联用E64d及Pepstatin A，可明显抑制溶酶体的降解从而阻断自噬的进展，而自噬体的形成并没有受到明显影响。

作者: mamamiya 时间: 2016-4-14 11:08

楼主介绍的还挺详细，我现在也在做细胞自噬的课题，方法简单，但是要有效果也不容易。介绍一篇检测真核细胞细胞自噬的指导性文章，Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes，Autophagy 4:2, 151-175; 16 February 2008。这是200多位细胞自噬的专家署名的文章，对检测细胞自噬绝对有用。而且这几年文章发展看来，想证明细胞自噬越来越难，需要的实验越来越多。

作者: 04906 时间: 2016-4-14 11:10

自噬体的检测
自噬体的检测对研究自噬尤为重要①以透射电子显微镜下超微结构的形态学检测(俗称检测自噬体的金指标)。在透射电镜下可见损伤的细胞器如线粒体的肿胀变性，其周围出现空泡状双层膜样结构、继而双层膜环绕成自噬体、进而与溶酶体融合，消化，也可见自噬溶酶体内最终不能降解的残体等。
②自噬体膜标志性蛋白质的检测。自噬体膜上标志性蛋白质有Apgl2-Apg5结合体和微管相关蛋白1的轻链3(LC3)。Apgl2和Apg5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起，它定位在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。LC3是酵母菌自噬基因(Apg7/Apg8)在哺乳动物中的同源物，和前者相比，LC3除了定位在自噬体分隔膜上，也一直以和磷脂酰乙醇胺即脑磷脂(PE)结合的形式(LC3-PE)存在于自噬体形成各阶段的内外膜上，在自噬溶酶体膜上也可见。通过与绿色荧光蛋白(GFP)结合成Apgl2-Apg5-GFP、LC3-GFP，即可实现对自噬体的检测。
③单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。是自噬发生过程中分析分子水平机制的一种特异的检测自噬体方法。自噬体形成依赖的第二个泛素样结合系统(Apg8)是位于自噬囊泡膜上与IVIDC特异结合的生化标志，通过荧光染色，在荧光显微镜下可见核周区域阳性显色。④间接自噬体检测法。自噬溶酶体及其不能降解的产物—残体的检测。自噬体和溶酶体融合后，除上述的LC3-GFP法检测外，还有吖啶橙染色法。它是一种荧光染料作为非极性反胶态分子团的分子探针，在自噬溶酶体内酸性磷酸酶活性增强下显著着色。对残体的检测主要是对脂褐素颗粒的显微观察。

作者: NBA 时间: 2016-4-14 11:11

自噬的过程——从一张图片开始：
步骤1：细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似“脂质体”样的膜结构，然后不断扩张，但它并不呈球形，而是扁平的，就像一个由2层脂双层组成的碗，可在电镜下观察到，被称为Phagophore，是自噬发生的铁证之一。
步骤2：Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，包括细胞器，全部揽入“碗”中，然后“收口”，成为密闭的球状的autophagosome，我把它翻译为“自噬体”。电镜下观察到自噬体是自噬发生的铁证之二。有2个特征：一是双层膜，二是内含胞浆成分，如线粒体、内质网碎片等。
步骤3：自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（加了个“可”字，意思是这种情况不是必然要发生的）。
步骤4：自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。

图片附件: 80610355.jpg (2016-4-14 11:11, 46.66 KB) / 该附件被下载次数 167
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43583

作者: NBA 时间: 2016-4-14 11:12

最详细的介绍：Madame Curie Bioscience Database
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=eurekah.chapter.24952')
透射电镜下自噬的照片：

图片附件: 53866002.snap.jpg (2016-4-14 11:12, 98.62 KB) / 该附件被下载次数 135
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43584

作者: NBA 时间: 2016-4-14 11:14

上图的英文说明：

图片附件: 35546607.snap.jpg (2016-4-14 11:14, 53.53 KB) / 该附件被下载次数 118
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43585

作者: NBA 时间: 2016-4-14 11:15

自噬的特性：
1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。
2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。
3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。
4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别
5）“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。
6）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来（谁不喜欢留一手呢？）。
参考综述：
Autophagy fights disease through cellular self-digestion.pdf
cuturl('http://www.namipan.com/d/4c78fe31cb24080cd7630639c121cd71b24c9b56fbdf6300')

作者: NBA 时间: 2016-4-14 11:16

自噬相关基因（autophagy associated gene, ATG）：在自噬过程中到底有哪些蛋白的参与，即自噬相关蛋白的鉴定是目前自噬研究主要的任务。由于自噬研究的历史关系，很多基因在酵母和哺乳动物中有不同的命名。
在cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=eurekah.table.24964') 中介绍了一些较早发现的自噬相关基因，下面列出几个新近发现的：
1）bif-1（又叫Endophilin B1）和 UVRAG（ultraviolet irradiation resistance-associated gene）
相关文章：Bif-1 interacts with Beclin 1 through UVRAG and regulates autophagy and tumorigenesis.pdf
cuturl('http://www.namipan.com/d/75c245aa6c8cf8644c33bcf86e8c6ef8add3da69469e0e00')
2）VMP1 （Vacuole membrane protein 1）
相关文章：The Pancreatitis-induced Vacuole Membrane Protein 1 Triggers Autophagy in Mammalian Cells.pdf
cuturl('http://www.namipan.com/d/a4a74e47a1d515089558fe39db2177ff931ee8114a611e00')
3）DRAM （damage-regulated autophagy modulator）
相关文章：DRAM, a p53-Induced Modulator of Autophagy, Is Critical for Apoptosis.pdf
cuturl('http://www.namipan.com/d/69fee934467a3fc4b9a70b88c9292160a631c78f42111300')
4）TP53INP2 （Tumour Protein 53 Induced Nuclear Protein 2）
相关文章：The TP53INP2 Protein Is Required for Autophagy in Mammalian Cells.pdf
cuturl('http://www.namipan.com/d/40e5d3a2f6a0ec5fce4dc91c32880ae293201a582cf33500')
（由于不断有新的ATG蛋白被鉴定出来，本帖将不定期更新）

作者: NBA 时间: 2016-4-14 11:17

自噬过程的调控：
从上面总结的自噬特点中可以看出，自噬这一过程一旦启动，必须在度过危机后适时停止，否则，其非特异性捕获胞浆成分的特性将导致细胞发生不可逆的损伤。这也提醒我们在研究自噬时一定要动态观察，任何横断面的研究结果都不足以评价自噬的活性。
目前，已经报告了很多因素能诱导细胞发生自噬，如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等，这么多刺激信号如何传递的、哪些自噬蛋白接受信号、又有哪些自噬蛋白去执行等很多问题都还在等待进一步解答中。
关于传递自噬信号的通路目前比较肯定的有：
抑制类
1）Class I PI3K pathway （PI——phosphatidylinositol，磷脂酰肌醇）
与IRS (Insulin receptor substrate) 结合，接受胰岛素受体传来的信号（血糖水平高抑制自噬）
详细介绍参见：
维基百科 cuturl('http://en.wikipedia.org/wiki/Phosphoinositide_3-kinase')
cuturl('http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-biology/learning-center/pathfinder/pathway-maps/pi3k-signaling.html')
2）mTOR pathway（mammalian target of rapamycin）
mTOR在人类中的同源基因是FRAP1（FK506 binding protein 12-rapamycin associated protein 1），是一个丝/苏氨酸蛋白激酶。能接受多种上游信号，如Class I PI3K、IGF-1/2、MAPK，能感受营养和能量的变化。
详细介绍见：
cuturl('http://en.wikipedia.org/wiki/MTOR')
激活类
1）Class III PI3K
结构上类似于Class I PI3K，但作用相反。
接受上述信号的自噬蛋白：
目前都把焦点集中在beclin 1（酵母同源物为atg6），能与多种蛋白结合，如Vps34（Class III PI3K的催化亚单位），mTOR，BCL-2和BCLXL蛋白等，更多介绍请参阅OMIM：cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/dispomim.cgi?id=604378') 。
在【动态版】cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=154&id=14115812&sty=1') 中介绍了日本科学家最新的发现：beclin-1有可能成为人工干预自噬活性的靶点。
需注意的是，beclin-1是一个多功能蛋白，除了接受自噬信号，它还可以接受很多其它的信号对自噬进行调节，越来越多的证据表明，beclin-1可能是自噬的“守门人”。
自噬体的发生：
目前认为，自噬体的膜不是直接来源于高尔基体或内质网，而是在胞浆中重新生成的，但具体的机制尚不清楚。
当beclin-1被活化后，胞浆中先形成很多个membrane source（自噬体膜发生中心），在它们不断扩展的过程中（phagophore到autolysosome），VMP1蛋白由内质网和高尔基体转位到自噬体膜上（VMP1又叫TMEM49，已知唯一与自噬有关的跨膜蛋白），同时，MAP1-LC3由胞浆型（即LC3-I）转位到自噬体膜（即LC3-II），LC3这一转变过程可被Western Blot和荧光显微镜检测到，现已成为监测自噬体形成的推荐方法。
（更新中。。。）

作者: NBA 时间: 2016-4-14 11:19

自噬与细胞死亡的关系：
有必要说明一下的是，细胞死亡是一个非常复杂的过程，为了研究方便，需进行分类，但我们思考时不要局限于这些人为的分类，而应注重于现象本身来研究其背后的机制。
一直以来人们从不同角度、用不同方法来观察细胞的死亡，并把细胞的死亡方式分为2类：坏死和凋亡，因为两者有着明显的区别，其中最主要的区别之一就是细胞膜的通透性——坏死细胞的细胞膜丧失了完整性，内容物被释放出来，染料可自由进入细胞，而凋亡细胞保持完整，无内容物释放，染料也被排斥。很多实验亦根据这一原理来设计以区分坏死和凋亡，这将在后面一一介绍，如同刚刚说明的那样，这些实验只能说明细胞膜的通透性（必要条件，不是充分必要条件），而不能用来证实坏死细胞或凋亡细胞。
一般认为坏死是被动的，不可控的，而凋亡是主动的，可控的。为了强调这一点，凋亡被定义为程序性细胞死亡（program cell death，PCD）。但无论是坏死还是凋亡，都是一个过程，是需要时间的（尤其是凋亡，从启动到完成，细胞要执行很多反应），而且细胞死亡后都有“尸体”。
在研究自噬与凋亡的关系时，人们发现细胞死亡前胞浆中存在大量的自噬体或自噬溶酶体，但这样的细胞缺乏凋亡的典型特点，如核固缩（pyknosis）, 核破裂（karyorhexis）、细胞皱缩（shrinkage）、没有凋亡小体的形成等，被称为自噬样细胞死亡（autophagic cell death，ACD），它是一种新的细胞程序性死亡，为了与凋亡区别，被命名为Type II cell death，相应的，凋亡为Type I cell death，坏死为Type III cell death。
尽管这样，但对于自噬是否是细胞死亡的直接原因目前还存在很大的争议。到底是Cell death by autophagy（自噬引起死亡）还是Cell death with autophagy（死亡时有自噬发生，但不是直接原因）？
对此，自噬研究领域“大牛”级专家Levine Beth在一篇nature的Review中表达了自己的观点。
由于在形态学上2者无明显区别，但通过阻断自噬，观察细胞的结局可区分开来：Cell death by autophagy细胞存活，而Cell death with autophagy细胞死亡。
Autophagic cell death： the story of a misnomer.pdf
（更新中。。。）

作者: NBA 时间: 2016-4-14 11:26

自噬与肿瘤的关系：
与凋亡（在肿瘤细胞中一般都存在缺限）不同，自噬是被优先保留的。无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的。因为细胞中随时产生的“垃圾”（破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、错误合成或折叠错误的蛋白质等等）都需要及时清除，而这主要靠自噬来完成，因此，自噬具有维持细胞自稳的功能；如果将自噬相关基因突变失活，如神经元会发生大量聚集蛋白，并出现神经元退化。同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质又可为细胞提供一定的能量和合成底物，可以说，自噬就是一个“备用仓库” 。如Atg-5缺陷的小鼠在出生后喝上第一口奶之前就会饿死。更重要的是，自噬活性可在代谢应激（饥饿、生长因子缺乏、射线、化疗等）时大大增强
，表现为胞浆中迅速涌现大量自噬体，这一现象被称为“自噬潮”（autophagic flux），广泛用于自噬形成的监测。自噬潮为细胞度过危机提供了紧急的营养和能量支持，有利于细胞的存活。
鉴于自噬的上述作用，自噬可为肿瘤细胞带来几大好处：
1）肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机。
2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，而此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件。
由于自噬减少了肿瘤细胞在代谢应激时发生坏死的机会，而对于肿瘤细胞群体而言，需要一部分细胞发生坏死，以引发适度的炎症（有利于血管的长入、吸引免疫细胞分泌生长因子等）。研究发现，很多类型的肿瘤在代谢应激时会“组成性”活化PI3K信号以抑制自噬（由于凋亡通路已受阻，抑制自噬会促进坏死），但具体机制尚不清楚。
参考文献：
Autophagy and toll-like receptors：A new link in cancer cells.pdf
Autophagy fights disease through cellular self-digestion.pdf
Role and regulation of autophagy in cancer.pdf
Role of autophagy in cancer.pdf
Autophagy and Cell Death： No Longer at Odds.pdf
Autophagy and cancer： Dynamism of the metabolism of tumor cells and tissues.pdf
（更新中。。。）

作者: NBA 时间: 2016-4-14 11:27

+1 积分
热10楼
自噬的研究方法：
正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：
（一）自噬诱导剂
1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
3）Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2 -ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
5）Rapamycin：mTOR抑制剂
6）Xestospongin B/C：IP3 R阻滞剂
（二）自噬抑制剂
1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂
2）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）
除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。
细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：
1）观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV）
2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成：
由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
3）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成：
自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
（Note：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）
4）检测长寿蛋白的批量降解：非特异
5）MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。
6）CellTrackerTM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。
在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：
Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。
LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。
MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。
Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。
Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔
【Note：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS处理】
自噬与细胞死亡经常需一起考虑，下面介绍一些检测细胞死亡的方法：
（1）△ψm dissipation（线粒体跨膜电位的消失）：TMRM发红色荧光，DiOC6 （3）发绿色荧光。
（2）Phosphatidylserine Externalization（磷脂酰丝氨酸外翻）：Annexin V-FITC（绿色）染细胞膜，（3）检测线粒体产生的ROS：无荧光的HE（hydroethidine，氢化乙啶）可被ROS氧化为EthBr（ethidium bromide，溴乙啡啶），发红色荧光。NAO（nonyl acridine orange，烷化吖啶橙，可发荧光）能与非氧化的cardiolipin（心磷脂，可被ROS氧化）反应而失去荧光。
（4）线粒体IMS蛋白的释放：AIF，细胞色素c，分别用荧光二抗染色。
（5）Capase 3a 染色：用荧光二抗染色，胞浆弥散分布。
（6）细胞膜完整性检测：DAPI（蓝色）、Hoechst 33342或PI（红色）染核。胞膜完整的细胞（活细胞和早中期凋亡细胞）排斥，可联用annexin V。
【如何用实验区分Cell death by autophagy和Cell death with autophagy】
第一步：利用上述方法证实细胞死亡
第二步：证实细胞死亡前发生了自噬
第三步：在形态学上区别开“自噬样死亡”与凋亡
第四步：利用遗传学手段（反义RNA干扰Knockdown掉Atg基因或hVps34）或工具药抑制自噬
第五步：细胞存活则为Cell death by autophagy，反之，细胞死亡则为Cell death with autophagy。
参考文献：
Methods for Assessing Autophagy and Autophagic Cell Death.pdf
Cytosolic LC3 Ratio as a Sensitive Index of Macroautophagy in Isolated Rat Hepatocytes and H4-II-E Cells.pdf
（更新中。。。）

作者: 911 时间: 2016-4-14 11:29

很受益，也在从事相关研究，关于自噬的检测目前倾向于流量的评价，下面这篇文章相信是搞自噬的必读文献了：
Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes，Autophagy 4:2, 151-175; 16 February 2008
链接：
cuturl('http://d.namipan.com/d/a6c81bbd37bc69c46a3494e2a691336d6852d07b34a61400')

作者: hdmi 时间: 2016-4-14 11:30

Autophagy: auto=self, phagein=eat.

作者: hdmi 时间: 2016-4-14 11:31

这张图应该是目前关于Autophagy 最好的介绍了。

图片附件: 73817993.snap.jpg (2016-4-14 11:31, 94.41 KB) / 该附件被下载次数 128
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43586

作者: hdmi 时间: 2016-4-14 11:31

Programmed cell death (PCD)≠ Apoptosis
Type I:Apoptosis
Type II:autophagy!

作者: 911 时间: 2016-4-14 11:35

自噬小体的增多有两种可能：一是形成增加即自噬被诱导；另外一种是自噬体成熟受抑即自噬体不能和溶酶体结合。该怎么来判断呢？
另外，我们在神经系统中检测LCⅡ，使用western blotting，好像不怎么灵敏，还是因为它存在的时间较短？

作者: wanglaoshi 时间: 2016-4-14 11:35

自噬与肿瘤的关系可能是双重的。①对不同的细胞，自噬的作用可能不同。②相同的细胞在不同的外部因素作用时，自噬的作用可能不同。③在肿瘤发生发展的不同阶段，自噬的作用可能不同[Levine Bet al., 2004]。肿瘤生长的早期阶段自噬增强，是由于此时肿瘤的血管化作用不足，癌细胞的营养供给有限，需要通过自噬为自身提供营养。肿瘤进入发展阶段后基因变异积累，使包括 Beclin 1在内的众多抑癌基因失活，自噬活力降低。④对单个细胞和对整个肿瘤阻滞的作用可能不同[Degenhardt et al., 2006]。自噬功能不全的细胞易于坏死，但是坏死组织产生的细胞因子（包括部分生长因子）反而会促进肿瘤的生长。上述各种假设均有待证实。肿瘤为细胞分化障碍性的疾病已得到肯定，但自噬在肿瘤细胞的分化抑制过程中起着什么样的作用，自噬水平提高是抑制分化甚至导致去分化还是促进分化等问题尚未解决。

作者: join 时间: 2016-4-14 11:36

根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞自噬主要可分为三种方式 [Crotzer et al., 2005]：大自噬（Macroautophagy）、微自噬（Microautophagy）和分子伴侣介导的自噬 (Chaperone-mediated autophagy)。

作者: memory 时间: 2016-4-14 11:37

cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez')
自噬领域的牛人一Beth Levine
cuturl('http://www.utsouthwestern.edu/utsw/cda/dept131456/files/181499.html')

作者: memory 时间: 2016-4-14 11:38

以autophagy命名的杂志
cuturl('http://www.landesbioscience.com/journals/autophagy/')

作者: memory 时间: 2016-4-14 11:39

自噬体的检测
自噬体的检测对研究自噬尤为重要①以透射电子显微镜下超微结构的形态学检测(俗称检测自噬体的金指标)。在透射电镜下可见损伤的细胞器如线粒体的肿胀变性，其周围出现空泡状双层膜样结构、继而双层膜环绕成自噬体、进而与溶酶体融合，消化，也可见自噬溶酶体内最终不能降解的残体等。
②自噬体膜标志性蛋白质的检测。自噬体膜上标志性蛋白质有Apgl2-Apg5结合体和微管相关蛋白1的轻链3(LC3)。Apgl2和Apg5在翻译后就像单个分子一样共价结合在一起，它定位在自噬体双层隔离膜的整个延长阶段。LC3是酵母菌自噬基因(Apg7/Apg8)在哺乳动物中的同源物，和前者相比，LC3除了定位在自噬体分隔膜上，也一直以和磷脂酰乙醇胺即脑磷脂(PE)结合的形式(LC3-PE)存在于自噬体形成各阶段的内外膜上，在自噬溶酶体膜上也可见。通过与绿色荧光蛋白(GFP)结合成Apgl2-Apg5-GFP、LC3-GFP，即可实现对自噬体的检测。
③单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。是自噬发生过程中分析分子水平机制的一种特异的检测自噬体方法。自噬体形成依赖的第二个泛素样结合系统(Apg8)是位于自噬囊泡膜上与IVIDC特异结合的生化标志，通过荧光染色，在荧光显微镜下可见核周区域阳性显色。④间接自噬体检测法。自噬溶酶体及其不能降解的产物—残体的检测。自噬体和溶酶体融合后，除上述的LC3-GFP法检测外，还有吖啶橙染色法。它是一种荧光染料作为非极性反胶态分子团的分子探针，在自噬溶酶体内酸性磷酸酶活性增强下显著着色。对残体的检测主要是对脂褐素颗粒的显微观察。

作者: memory 时间: 2016-4-14 11:40

自噬的抑制
根据自噬形成的过程，自噬的抑制也分为不同的阶段，包括自噬的起始阶段，自噬泡和溶酶体融合阶段，以及溶酶体内的降解阶段。目前常用的一些抑制药物如下：
（1）对自噬体形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制剂（如3-MA, Wortmannin，LY294002等），这些药物均可干扰或阻断自噬体形成。3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine, 3-MA）是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，可特异性阻断Autophagy中自噬体的形成，被广泛用作Autophagy的抑制剂。另外，渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002 也可用作Autophagy的抑制剂。
（2）对自噬体与溶酶体融合的抑制：对自噬体与溶酶体融合过程进行阻断也能起着抑制自噬的作用，这些药物有巴伐洛霉素A1、长春碱、诺考达唑等。巴伐洛霉素A1（Bafilomycin A1）是一种来源于灰色链霉菌的大环内酯类抗生素，分子式C35H58O9，是空泡型H+-ATP酶的特异性抑制剂，具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤等作用。当突触小泡经历胞外分泌时，巴伐洛霉素A1可以避免小泡重新酸化。有研究表明，在已发生自噬的肿瘤细胞中加入巴伐洛霉素A1，可使蛋白降解被抑制，自噬体增多而自噬溶酶体数目减少，并且自噬体中的酸性磷酸酶的活性也明显降低，从而证明其阻断了自噬体与溶酶体的融合过程。这种阻断是可逆的，在去除了药物作用后，自噬体仍可以与溶酶体融合形成自噬溶酶体，继续自噬进程。
（3）对溶酶体降解的抑制: 自噬体与溶酶体融合后最终被溶酶体中的水解酶水解，它首先经过囊泡酸化，达到所需的PH值后经多种蛋白酶作用使囊内容物降解，降解产物在细胞内再循环利用。对溶酶体的降解进行抑制，使得被降解的囊泡内容物大量蓄积于溶酶体内，而不能释放出来进入细胞内再循环利用，这也同样起着抑制自噬的作用。因此，蛋白酶抑制剂，如E64d、Pepstatin A等，在抑制溶酶体降解的过程中发挥着自噬抑制剂的作用。E64d和Pepstatin A均属于蛋白酶抑制剂，二者以1：1的比例联用可以抑制自噬。有研究表明，在结肠癌细胞系中联用E64d及Pepstatin A，可明显抑制溶酶体的降解从而阻断自噬的进展，而自噬体的形成并没有受到明显影响。

作者: NBA 时间: 2016-4-14 11:43

根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞自噬主要可分为三种方式 [Crotzer et al., 2005]：大自噬（Macroautophagy）、微自噬（Microautophagy）和分子伴侣介导的自噬 (Chaperone-mediated autophagy)。

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大自噬（Macroautophagy）即我们说的自噬（autophagy）
微自噬（Microautophagy）：是指溶酶体主动、直接吞噬胞浆成分的一种方式。
分子伴侣介导的自噬 (Chaperone-mediated autophagy，CMA)：一些分子伴侣，如hsc70，能帮助未折叠蛋白转位入溶酶体。
另外，几个与phage相关的概念：
吞噬（phagocytosis）：细胞主动吞掉胞外的细菌、碎片、或其它细胞。
吞饮（pinocytosis）：胞外的液体
异噬（heterophagy）：吞噬、吞饮的统称，强调所吞内容物来自细胞外，它们都是单层膜的液泡。
自噬体（autophagosome）形成后，可与吞噬泡或吞饮泡融合，然后再与溶酶体融合，但这一过程的证实还需更多的实验来支持。

作者: NBA 时间: 2016-4-14 11:45

自噬小体的增多有两种可能：一是形成增加即自噬被诱导；另外一种是自噬体成熟受抑即自噬体不能和溶酶体结合。该怎么来判断呢？
另外，我们在神经系统中检测LCⅡ，使用western blotting，好像不怎么灵敏，还是因为它存在的时间较短？

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自噬体增多，也就是“自噬潮”出现的原因一是形成增多，二是与溶酶体融合受阻（如使用了氢化氯喹或氯喹，另外，溶酶体的酶抑制剂和质子泵抑制剂的使用亦有可能影响溶酶体与自噬体或异噬泡的融合），使自噬体不能降解而积聚，这种积聚造成的自噬体增多的效应要大于自噬体诱导剂效应的数倍之多。
鉴于这样的原因，单纯的GFP-LC3荧光斑点增多不足以作为自噬激活的证据，可联用多个方法来判断：
1）加用自噬体与溶酶体融合的抑制剂，如氯喹，观察自噬潮的变化。
2）或加用LC3和溶酶体示踪物在荧光显微镜下观察共定位情况。
3）或Knockdown掉LAMP-2基因（溶酶体膜蛋白）。
4）检测胞浆长寿蛋白的降解。
Western Blot检测LC3时除了上述的原因外，还有几个需考虑到的地方：
1）抗体的亲和力：有报道认为LC3抗体对II型LC3的亲和力较高
2）结合于自噬体内层膜的LC3-II在与溶酶体结合后被降解。
3）自噬过程很快，一个自噬体从产生到降解仅需2~3个小时或更短，其中自噬体形成阶段更迅速，数分钟即可完成，而溶酶体降解阶段耗时相对较长。因此，设置多个检测时间点（time frame）是非常重要的。

作者: u76mp 时间: 2016-4-14 11:46

虽然我也在做关于Autophagy的研究，但我预感到，这是个深渊。
虽然我期待我们能因此而攻克肿瘤，但希望太渺茫！

作者: langlang 时间: 2016-4-14 11:46

楼主介绍的还挺详细，我现在也在做细胞自噬的课题，方法简单，但是要有效果也不容易。介绍一篇检测真核细胞细胞自噬的指导性文章，Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes，Autophagy 4:2, 151-175; 16 February 2008。这是200多位细胞自噬的专家署名的文章，对检测细胞自噬绝对有用。而且这几年文章发展看来，想证明细胞自噬越来越难，需要的实验越来越多。

作者: NBA 时间: 2016-4-14 11:48

自噬现在作为细胞研究的热点领域，自然与其特殊的作用有关，但不能把其作为解决以前不能解决之问题的“万金油”，这一倾向在发现凋亡、miRNA后出现过。
我们有时候需要跳出这个圈子来看圈子里的问题。
当细胞所处的环境发生改变时会发生什么样的反应？
1）适应：通过内部的调整，达到一个新的平衡点，继续存活。
2）不适应：通过内部的调整，无法平衡，死亡。
问题来了，怎么死的？因为现在人们可以观察到至少3种死亡方式：坏死、凋亡、自噬样死亡。死了就死了，分那么多方式干吗？我想，有必要分清楚这3种死亡方式的不同和好处：
坏死一般认为是刺激过于剧烈，细胞没时间也没法修复，被动死亡，内容物释放。
凋亡是众所周知的主动的、不可逆的死亡，个人认为，（1）引起凋亡的刺激与引起坏死的刺激在强度上应该弱一点。（2）“主动”的意思就是死了比活着好。对谁好（有利）呢？凋亡细胞自己已经死了，那么只可能是周围的细胞了。确实如此，凋亡时细胞被“切碎”，里面的成分纷纷变成了熟的“易消化”的食物，以方便周围细胞易摄取。因此，凋亡应该是一个群体水平的概念，是群体应对不利因素时依靠牺牲部分个体来维持群体继续存活的机制。
自噬样死亡到目前为止还只是一种现象，因为我们只知道细胞自噬样死亡时胞浆中存在大量液泡，且在形态学上与凋亡有一定的区别，而对自噬与死亡的因果关系尚不清楚，更不知道它对群体有什么好处、与凋亡相比刺激信号有什么不同。就目前的研究进展来说，自噬是肯定的，鉴定和监测方法也较成熟，但自噬样死亡是模糊的，鉴定比较困难，且尚需生理情况下和临床的研究证据来支持。
不肯定的、模糊的地方也就是值得研究和探讨的地方，大致有：
1）继续进行自噬相关蛋白的鉴定及功能研究（不应局限于自噬）
2）自噬过程本身的机制研究（比如捕获胞浆成分的特异性问题、膜的发生、自噬相关蛋白的转位及组装）
3）自噬的调控（包括自噬激活信号到beclin-1之间的传递通路及相关调控蛋白的鉴定、自噬固有过程本身的调控）
4）明确自噬与细胞存活、死亡的关系（是属于内部调整的范畴还是细胞命运的结局？）
当这些基础性研究完成了，应用性研究的前景才会明朗。

作者: shenkunjie 时间: 2016-4-14 11:48

以autophagy命名的杂志
cuturl('http://www.landesbioscience.com/journals/autophagy/')

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我们这边投过几篇，知名度不是太高，毕竟是新办的。
该杂志影响因子开始有6-7分，去年降到4点多，变化比较大，今年的也不知道还会不会降。

作者: wiwi 时间: 2016-4-14 11:49

这周刚看到一篇关于自噬的文章，里面有种细胞Saos-2 TetOn PUMA-inducible没弄明白干什么用的，希望前辈解惑，谢谢

作者: 831226 时间: 2016-4-14 12:00

自噬小体的增多有两种可能：一是形成增加即自噬被诱导；另外一种是自噬体成熟受抑即自噬体不能和溶酶体结合。该怎么来判断呢？
另外，我们在神经系统中检测LCⅡ，使用western blotting，好像不怎么灵敏，还是因为它存在的时间较短？
自噬体增多，也就是“自噬潮”出现的原因一是形成增多，二是与溶酶体融合受阻（如使用了氢化氯喹或氯喹，另外，溶酶体的酶抑制剂和质子泵抑制剂的使用亦有可能影响溶酶体与自噬体或异噬泡的融合），使自噬体不能降解而积聚，这种积聚造成的自噬体增多的效应要大于自噬体诱导剂效应的数倍之多。
鉴于这样的原因，单纯的GFP-LC3荧光斑点增多不足以作为自噬激活的证据，可联用多个方法来判断：
1）加用自噬体与溶酶体融合的抑制剂，如氯喹，观察自噬潮的变化。
2）或加用LC3和溶酶体示踪物在荧光显微镜下观察共定位情况。
3）或Knockdown掉LAMP-2基因（溶酶体膜蛋白）。
4）检测胞浆长寿蛋白的降解。
Western Blot检测LC3时除了上述的原因外，还有几个需考虑到的地方：
1）抗体的亲和力：有报道认为LC3抗体对II型LC3的亲和力较高
2）结合于自噬体内层膜的LC3-II在与溶酶体结合后被降解。
3）自噬过程很快，一个自噬体从产生到降解仅需2~3个小时或更短，其中自噬体形成阶段更迅速，数分钟即可完成，而溶酶体降解阶段耗时相对较长。因此，设置多个检测时间点（time frame）是非常重要的。
学习ing

作者: ns5fan 时间: 2016-4-14 12:01

这周刚看到一篇关于自噬的文章，里面有种细胞Saos-2 TetOn PUMA-inducible没弄明白干什么用的，希望前辈解惑，谢谢

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简单说就是一个条件表达系统
TetOn系统：在四环素衍生物doxycyclin存在的情况下，基因表达。——所载的基因毒性较大时最有用
TetOff系统：在四环素衍生物doxycyclin存在的情况下，基因不表达——所载的基因很重要时最有用

作者: 8s5g 时间: 2016-4-14 12:02

楼主，能否建立一个AUTOPHAGY的群啊，或者我们做这个方向的能有个什么组织，以方便交流。
另外，我们学校没有买Autophagy杂志，所以不能下载autophagy上的文章。
那位兄弟能有什么好方法，感谢交流推荐。

作者: any333 时间: 2016-4-14 12:03

楼主，建个***吧，有关autophagy的，大家可以相互学习啊呵呵

作者: 00无名指00 时间: 2016-4-14 12:04

请问：有没有关于兔子的自噬相关基因抗体？

作者: XYZQ 时间: 2016-4-14 14:15

学习了，高手们的见地就是不一样，希望斑竹能搞个细胞死亡方式的汇总，比如说坏死、凋亡、自体吞噬及entosis等各种死亡方式的比较，我第一个支持啊！

作者: wiwi 时间: 2016-4-14 14:15

有个问题, 根据战友的解释. (我还没有具体查过文献) 自噬似乎只是在胞浆发生的一系列变化. 与细胞核相关的讨论似乎从未见过, 在图中, 细胞核也只是被孤令令的摆在一个不起眼的位置, 任凭胞浆内是多么的热闹. 难道细胞核内确实没有任何变化吗? 还是目前没有人研究而被忽略了呢?

作者: NBA 时间: 2016-4-14 14:16

QUOTE:

原帖由 wiwi 于 2016-4-14 14:15 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
有个问题, 根据战友的解释. (我还没有具体查过文献) 自噬似乎只是在胞浆发生的一系列变化. 与细胞核相关的讨论似乎从未见过, 在图中, 细胞核也只是被孤令令的摆在一个不起眼的位置, 任凭胞浆内是多么的热闹. 难道细 ...

问得好！
细胞核在任何时候都是不能忽视的，只是目前对自噬的研究刚刚重视，对核的功能研究较少，但已经有人在做了。
若从自噬调控的角度，包括参与自噬过程本身的各种蛋白的合成和自噬上游和下游的信号传递，都需要细胞核的参与。因为自噬相关蛋白大部分都是可诱导蛋白，自噬被诱导时需从头转录和翻译，其中某些蛋白的翻译可能还受miRNA的调控。本人对此亦感兴趣，欢迎继续讨论和交流。

作者: purrr 时间: 2016-4-14 14:17

是呀, 除了蛋白的表达调控. 个人猜想在能量缺失的过程下, 细胞核的功能, 形态, 染色质或DNA的分布也应该会有一定的分子和形态学上的变化. 正如调亡时有染色质凝聚, DNA剪切这些变化一样. 只是未必会这么剧烈.
请问现在确实没人做过自噬中DNA是个什么状态吗? 应该不难吧.

作者: boom 时间: 2016-4-14 14:17

本人最近就在做自噬，用EBSS处理细胞9hr，发现EBSS处理的细胞大量漂起，WB检测LC3I-LC3II的变化，发现对照组两条带都有，而EBSS组只有LC3II的条带。该如何解释？另外我用别的细胞以一种药物处理，本来想看看该药物是否能诱导自噬发生的，结果却发现是对照和处理组都有两条条带，是否说明自噬用LC3检测假阳性率很高？我用的是SIGMA的anti－LC3B的抗体

作者: SO2 时间: 2016-4-14 14:18

重新审视细胞器的结构和若干细胞器纵横交错构成的功能也许是一个趋势。细胞器系统研究对下是蛋白质，核酸等生物大分子执行功能的具体结构，向上是组成细胞这个基本的生物学功能单位的基础。

作者: 米西11米西 时间: 2016-4-14 14:19

大家说得都太好了,原来做自噬的能人也这么多啊

作者: BUK 时间: 2016-4-14 14:20

cuturl('http://www.nibs.ac.cn/?act=view&id=2081')
2009年4月08日，我所张宏实验室在《Autophagy》杂志上在线发表题为“Selective autophagic degradation of maternally-derived germline P granule components in somatic cells in C. elegans ”的文章。
2009年4月08日，我所张宏实验室在《Autophagy》杂志上在线发表题为“Selective autophagic degradation of maternally-derived germline P granule components in somatic cells in C. elegans ”的文章。
该文章指出在早期胚胎分裂过程中，残留在体细胞胞质中的有聚集倾向的P颗粒成分PGL-1和PGL-3通过自体吞噬作用被清除掉。包括VPS-34/BEC-1复合体在内的自体吞噬相关蛋白失去功能后会导致体细胞中PGL-1和PGL-3聚集形成PGL颗粒。这种PGL颗粒的形成是由SEPA-1介导的。这种自体吞噬介导的选择性降解蛋白聚合体在线虫发育过程中有重要的生理作用。
赵玉为该文章的第一作者，论文的其他作者还有本所的田娥。张宏博士为本文的通讯作者。该项研究由科技部863项目资助，在北京生命科学研究所完成

作者: ilovegaga 时间: 2016-4-14 14:21

Autophagy enhances the presentation of endogenous viral antigens on MHC class I molecules during HSV-1 infection
NATURE IMMUNOLOGY ,2009,March
作者推测包裹HSV的自噬体膜来源于核膜
Figure 1. HSV-1 induces the formation of autophagosome-like structures
from the nuclear envelopes of infected macrophages.

图片附件: 81970776.snap.jpg (2016-4-14 14:21, 97.9 KB) / 该附件被下载次数 10
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43587

作者: ilovegaga 时间: 2016-4-14 14:25

Figure 2. The four-layered membrane structures that emerge from the nuclear envelope have autophagosome-like features.

图片附件: 27402224.jpg (2016-4-14 14:25, 56.72 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43588

作者: NBA 时间: 2016-4-14 14:26

作者推测包裹HSV的自噬体膜来源于核膜

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关于自噬体膜的来源一直都没有搞清楚，这是新的提法，找全文看看作者的证据是什么？

作者: 芙蓉宫主 时间: 2016-4-14 14:27

站友们做westen 都用哪个公司的抗体, 自噬的抗体哪个公司的质量最好?
最近我订了ABGENT公司的一个LC-3怎么没做出来?
到底是因为抗体质量问题,还是动物种属差异?

作者: redbutterfly 时间: 2016-4-14 14:28

QUOTE:

原帖由 芙蓉宫主 于 2016-4-14 14:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
站友们做westen 都用哪个公司的抗体, 自噬的抗体哪个公司的质量最好?
最近我订了ABGENT公司的一个LC-3怎么没做出来?
到底是因为抗体质量问题,还是动物种属差异? ...

我使用过NOVUS的抗体，感觉还不错，也使用过CST的抗体，效果不行，也是没做过来，看说明书，好像不同细胞系有不同的差别，但是LC3好像是进化保守的，不知道为什么会有这么大的差异。

作者: redbutterfly 时间: 2016-4-14 14:28

QUOTE:

原帖由 boom 于 2016-4-14 14:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
本人最近就在做自噬，用EBSS处理细胞9hr，发现EBSS处理的细胞大量漂起，WB检测LC3I-LC3II的变化，发现对照组两条带都有，而EBSS组只有LC3II的条带。该如何解释？另外我用别的细胞以一种药物处理，本来想看看该药物是否能诱导自噬发 ...

一般EBSS处理3个小时就可以了，不过好像和细胞类型有关，有的细胞可能需要较长的时间，我的推测可能是因为各个细胞的自噬水平不一样的，还要自己摸条件。一般LC3抗体对LC3II型特异性较高，所以会出现两条带，LC3检测不是只看I型和II型，而是看两者比值的变化情况。检测细胞自噬应该多种方法一起检测，推荐用透射电镜观察，最直观可靠。

作者: NBA 时间: 2016-4-14 14:29

QUOTE:

（1）用EBSS处理细胞9hr，发现EBSS处理的细胞大量漂起：
——细胞饿了9h，可能死的差不多了（不一定是饿死的）。
（2）WB检测LC3I-LC3II的变化，发现对照组两条带都有，而EBSS组只有LC3II的条带
——LC3II增高，LC3I降低，提示自噬的发生，最好还有LC3荧光斑点形成的图片（LC3-II/LC3-I比值和LC3荧光斑点计数均为自噬的监测指标），但要确切的证据还需做透射电镜。
（3）对照和处理组都有两条条带
——建议在合适的时间框内连续监测LC3-II/LC3-I比值和LC3荧光斑点计数的变化
初步看来你的结果倾向于有自噬的发生，但需把实验做到位，必需的证据要补充。

作者: NBA 时间: 2016-4-14 14:29

站友们做westen 都用哪个公司的抗体, 自噬的抗体哪个公司的质量最好?
最近我订了ABGENT公司的一个LC-3怎么没做出来?
到底是因为抗体质量问题,还是动物种属差异?

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出现阴性结果要看阳性对照，怀疑假阳性要看阴性对照，不知你做了对照没有？
商品化的抗体一般来说质量是有保证的，需注意它的使用范围和条件。

作者: 雪原 时间: 2016-4-14 14:30

自噬相关基因（autophagy associated gene, ATG）：在自噬过程中到底有哪些蛋白的参与，即自噬相关蛋白的鉴定是目前自噬研究主要的任务。由于自噬研究的历史关系，很多基因在酵母和哺乳动物中有不同的命名。
在cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=eurekah.table.24964')中介绍了一些较早发现的自噬相关基因，下面列出几个新近发现的：
1）bif-1（又叫Endophilin B1）和 UVRAG（ultraviolet irradiation resistance-associated gene）
相关文章：Bif-1 interacts with Beclin 1 through UVRAG and regulates autophagy and tumorigenesis.pdf
cuturl('http://www.namipan.com/d/75c245aa6c8cf8644c33bcf86e8c6ef8add3da69469e0e00')
2）VMP1 （Vacuole membrane protein 1）
相关文章：The Pancreatitis-induced Vacuole Membrane Protein 1 Triggers Autophagy in Mammalian Cells.pdf
cuturl('http://www.namipan.com/d/a4a74e47a1d515089558fe39db2177ff931ee8114a611e00')
3）DRAM （damage-regulated autophagy modulator）
相关文章：DRAM, a p53-Induced Modulator of Autophagy, Is Critical for Apoptosis.pdf
cuturl('http://www.namipan.com/d/69fee934467a3fc4b9a70b88c9292160a631c78f42111300')
4）TP53INP2 （Tumour Protein 53 Induced Nuclear Protein 2）
相关文章：The TP53INP2 Protein Is Required for Autophagy in Mammalian Cells.pdf
cuturl('http://www.namipan.com/d/40e5d3a2f6a0ec5fce4dc91c32880ae293201a582cf33500')
（由于不断有新的ATG蛋白被鉴定出来，本帖将不定期更新）
......

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最近在做上面写的第三篇的DRAM基因相关内容，感觉关于自噬和凋亡之间的CROSSTALK比较复杂，值得深究。

作者: 雪原 时间: 2016-4-14 14:33

站友们做westen 都用哪个公司的抗体, 自噬的抗体哪个公司的质量最好?
最近我订了ABGENT公司的一个LC-3怎么没做出来?
到底是因为抗体质量问题,还是动物种属差异?

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我们实验室经常做LC3，要注意的是转膜时间，转长了就转过头了。动物种属在抗体说明书上有写。

作者: ukonptp 时间: 2016-4-14 14:33

Biofish站友，一直在关注autophagy. 您的这个讨论做得很好。看到下面的这篇文章我很感兴趣，但链接提示已不在，可再上传否？谢谢。
Autophagy and toll-like receptors：A new link in cancer cells.pdf

作者: 箭头儿 时间: 2016-4-14 14:37

最近也要开始做自噬相关的东西，要买抗体，做WB检测LC3I-LC3II，不知哪家的抗体比较好？santa的怎么样？
恳请过来人指点一下

作者: 8s5g 时间: 2016-4-14 14:37

这周刚看到一篇关于自噬的文章，里面有种细胞Saos-2 TetOn PUMA-inducible没弄明白干什么用的，希望前辈解惑，谢谢

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我看了篇文献，是Sao-2 TetOn P53-inducible的细胞。就是指细胞中如果在平常状态下是没有这种基因，但用doxycycline(Dox)土霉素进行诱导后就有基因表达了，是国外用的很多的一种类型的细胞，好像国内的实验室周围用的不多。DRAM, a p53-Induced Modulator of Autophagy, Is Critical for Apoptosis。我说的细胞就是在这篇文章当中使用的。本人主要研究DRAM，如果有类似研究目标的同仁可以PM后共同进步。

作者: 8s5g 时间: 2016-4-14 14:37

有个问题, 根据战友的解释. (我还没有具体查过文献) 自噬似乎只是在胞浆发生的一系列变化. 与细胞核相关的讨论似乎从未见过, 在图中, 细胞核也只是被孤令令的摆在一个不起眼的位置, 任凭胞浆内是多么的热闹. 难道细胞核内确实没有任何变化吗? 还是目前没有人研究而被忽略了呢?

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肯定有很多联系的啊，比如我们最近的实验当中所使用的Beclin 1就是通过出核才发挥调节自噬的作用的啊。

作者: 8s5g 时间: 2016-4-14 14:38

最近也要开始做自噬相关的东西，要买抗体，做WB检测LC3I-LC3II，不知哪家的抗体比较好？santa的怎么样？
恳请过来人指点一下

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好像MBL(medical&biological laboratories)的还可以的。我们都用这个。

作者: 8黑眼圈8 时间: 2016-4-14 14:40

今年Autophagy的IF回升到了5.497，也算是我们研究自噬同仁的好消息啊，呵呵。

作者: 如影随形 时间: 2016-4-14 14:40

Cell death by autophagy细胞存活，Cell death with autophagy细胞死亡这一概念提出，为细胞死亡方式多样性增加新证据。我坚信细胞死亡归宿是多样的，正如人死亡并非单一方式，可死于战争、疾病、意外等一样。

作者: vvmmoy 时间: 2016-4-14 14:41

最近也要开始做自噬相关的东西，要买抗体，做WB检测LC3I-LC3II，不知哪家的抗体比较好？santa的怎么样？
恳请过来人指点一下

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sigma的Anti-LC3B antibody produced in rabbit (1) L7543，做western很好，而且效价很高，可以重复使用很多次。不过压LC3湿转的话，220毫安左右，转膜时间不要超过2小时。

作者: bohe221 时间: 2016-4-14 14:41

把自噬理解成细胞部分或细胞局部凋亡比较好。

作者: idea2011 时间: 2016-4-14 14:42

请问高手们：
现阶段认为自噬在肿瘤的不同阶段的作用不同，那能否在实验室内用肿瘤细胞系体现出肿瘤发展的不同阶段？有没有什么好办法体现呢？
我想研究抑癌基因对肿瘤不同阶段的影响，以及其作用信号通路有无变化？不知道有没有这方面的研究？

作者: 9900 时间: 2016-4-14 14:42

楼主，能否建立一个AUTOPHAGY的群啊，或者我们做这个方向的能有个什么组织，以方便交流。
另外，我们学校没有买Autophagy杂志，所以不能下载autophagy上的文章。
那位兄弟能有什么好方法，感谢交流推荐。
感谢biofish的辛勤劳动和精辟分析！

作者: 9900 时间: 2016-4-14 14:42

(y)如果有MDC具体的步骤就更好了，我找了好多地方都没有。

作者: 8princess8 时间: 2016-4-14 14:43

自噬体的发生过程
根据酵母自噬体的发生过程可分为：
① 自噬的诱导，雷帕霉素作用的靶位点(Target ofrapamycin，TOR)是氨基酸、ATP和激素的感受器，它在调节细胞生长和自噬的发生过程有重要作用。与bcl一2作用的蛋白beclin一1可以促进缺乏自噬作用的酵母细胞巾的自噬作用；此外，GDP结合的G蛋白亚基Gai3是自噬的活化因子，高浓度cAMP也会诱导自噬的发生。
② 自噬体的形成，在酵母中发现臼噬体的形成依赖于两个泛素样结合系统一Apgl2一Apg5和Apg8系统。这种蛋F{系统的高度保守性已被实验证明，在人类发现的自噬基因有Beclin 1hApg5、hApgl2。
③ 自噬体的运输、融合，Rho家族涉及细胞骨架，与自噬体的运输有关。内噬体的融合机制与SNARE蛋白Vam3、Vam7、Vti1、SecI9等密切相关。Atg7p通过Atg2p附着于微管，Aut2p还导管素Tublp、Tub2p相互作用，以完成自噬体向溶酶体的运输。④ 自噬体的裂解，在此起重要作用的有Atgl 5和Atg22。Atgl 5通过多囊泡小体途径向小囊泡转运，这种蛋白最终起着脂肪酶相似的作片j。与Atgl5相比，Atg22是一种囊泡内膜蛋内，其只对自噬体降解起作用。

作者: 8princess8 时间: 2016-4-14 14:43

自噬的调控机制
1 依赖mTOR(mammalian target of rapamyein)途径的自噬
mTOR作为氨基酸、ATP、生长因子、胰岛素等的感受器，对细胞生长具有重要调节作用，抑制自噬的发生，发挥“门卫(gatekeeper)”作用。mTOR的上下游信号转导途径较为复杂，mrI'oR上游通路：胰岛素、生长因子(胰岛素样生长因子，血小板源性生长因子和表皮生长因子等)合于跨膜胰岛素受体或酪氨酸激酶受体(IR，RTK)后，激活I型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class I PI3K)，使PIP被磷酸化为PIP3，PIP3结合于Akt／PKB和它的活化分子PDK1；mTOR下游通路：mTOR活性抑制时，促进自噬体形成，在酵母中是通过Atgl和Atgl3去磷酸化而促进下游自噬信号，在人类中的机制尚不明了。
2 不依赖mTOR途径的自噬
经典的自噬抑制剂3一甲基腺嘌呤(3-MA)通过抑制Class11IPI3K(hVps30)的活性抑制自噬形成，siRNA导致ClassIllPI3K活性的下降大大减少了细胞中自噬的发生，因为Class I PI3K的产物PI3P是自噬抑制信号，Class111PI3K的产物PIP为激活信号，另外抑癌基因PTEN可以水PI3P，所以它也是一个促自噬因子。此外，Atg6的哺乳动物同源体beclinl和抑癌基因VRAG作为自噬正调控子，抗凋亡因子bcl-2作为自噬负调控子共同参与组成Class 111PI3复合物调控自噬。GTP结合的G蛋白亚基God3是自噬的抑制因子，而GDP结合的God3蛋白则是自噬的活化因子。GAIP(G alpha interacting protein)作为RGS(regulators of G—protein signaling)家族成员之一，通过God3蛋白加速GTP的水解，促进自噬的发生。另外死亡相关蛋白激酶(death．associated protein kinase，DAPK)和DAPK相关蛋白激酶(DAPK．related protein kinase·1，DRP一1)在肿瘤细胞中也可诱导自噬。还有实验发现胰岛素，氨基酸等通过激活p38MAPK(p38a)而抑制自噬，且不依赖于mTOR途径。PKA、casein激酶II、MAP激酶、calcium途径也存在于自噬过程错综复杂的调控网络中，但其机制还不甚清楚。

作者: 8princess8 时间: 2016-4-14 14:44

呵呵，多谢版主提醒呀！
【补充参考文献】自噬的调控机制
1.朱伦，陈增良．mTOR的结构与功能[J]．国际病理科学与临床
杂志，2006，26(1)：31-34．
ZHU Lun，CHEN Zeng—liang．Structure and function of mammali·
an target of rapamycin[J]．Int Pathol Clin Med，2006，26(1)：31-34．
2.Guertin D A ，Sabatini D M．An expanding role for mTOR in cancer
[J]．Trends Mol Med，2005，ll(8)：353-361．
3.Meijer A j．Codngno P．Signalling and autophagy regulation in
health，aging and disease[J]．Mol Aspects Med，2006，27(5-6)：4l1-425．
4.Ng G，Huang J．The Significance of autophagy in cancer[J]．Mol
Carcinog，2005，43(4)：183—187．

作者: 66+77 时间: 2016-4-14 14:44

请问各位搞自噬的前辈，有没有用过3-MA做实验的？
3-MA是用什么溶剂溶的？溶解性大不大，最高能配到哪个浓度？
急需/
希望有用过的指点一下，多谢了/

作者: 33号 时间: 2016-4-14 14:44

3-MA用PBS溶解，储存浓度为100 mmol/L，其冷却时有沉淀，使用
前加热到50度左右1分钟使之溶解

作者: join 时间: 2016-4-14 14:46

3-MA最大工作浓度是10mM,一般DMSO的终浓度是千分之一，所以我配成了10M，但是溶解不了！！！
请问大家用DMSO配的时候怎么配的呢？
谢谢了。

作者: seven7 时间: 2016-4-14 14:46

3-MA应该是用PBS配更合适吧，用DMSO配的是雷帕霉素啊

作者: 911 时间: 2016-4-14 14:47

3-MA用PBS溶解，储存浓度为100 mmol/L，其冷却时有沉淀，使用
前加热到50度左右1分钟使之溶解

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这个方法确实管用，但有点担心加热到50度，3-MA会不会失效或者效用减低啊？

作者: 喇叭花 时间: 2016-4-14 14:47

文献有用DMSO配置的，不知道怎么实现的，因为DMSO在培养液中的浓度不能超过千分之一嘛
我昨天用基础培养基配置的，感觉还可以

作者: 喇叭花 时间: 2016-4-14 14:48

我用10mM 3－MA处理细胞24 h后发现细胞与对照相比长得慢多了，请问你们呢，细胞反应大吗？

作者: dreaming 时间: 2016-4-14 14:48

各位同仁：
请问免疫荧光法检测自噬特异性蛋白LC3的表达，用那些抗体较好呀？抗体名称、品牌、价位？谢谢！

作者: 冰儿0109 时间: 2016-4-14 14:48

有战友买过哪家的3-MA（3－甲基腺嘌呤），麻烦给个联系方式，我也想购买。

作者: 雪花子 时间: 2016-4-14 14:49

Sigma的，直接去它的网站搜就行了

作者: 鸽子不哭 时间: 2016-4-14 14:49

请问Beclin 1蛋白有多大？

作者: flower@@ 时间: 2016-4-14 14:50

请问，sigma的6-Amino-3-methylpurine就是3-MA吗？

作者: finger 时间: 2016-4-14 14:50

请问为何做自嗜的也不少，但是我查不到一篇中文文献呢？
难道都发到外国去了？

作者: finger 时间: 2016-4-14 14:51

我想做PPI通过影响肿瘤细胞自嗜从而改善恶液质的试验
不知道有多少可行性
盼高人指点！

作者: 9900 时间: 2016-4-14 15:24

https://qianyi.tmall.com/category-1108697451.htm?spm=a220o.1000855.w10886262-13858837023.6.NThQnT&catName=%C3%BF%D6%DC%C8%FD%C9%CF%D0%C2&catId=1108697451&search=y&orderType=newOn_desc&scene=taobao_shop

作者: 555444 时间: 2016-4-14 15:25

请问高手们：
现阶段认为自噬在肿瘤的不同阶段的作用不同，那能否在实验室内用肿瘤细胞系体现出肿瘤发展的不同阶段？有没有什么好办法体现呢？
我想研究抑癌基因对肿瘤不同阶段的影响，以及其作用信号通路有无变化？不知道有没有这方面的研究？
同问！

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小弟最近想试看看在肝癌的发生过程中，自噬发生的情况。但是查了很多文献，都是动物模型的，我觉得还是先从细胞着手。请教各位老师有没有什么方法（最好是化学药物处理）能够诱导肝细胞快速的发生癌变呢？然后试着看看自噬在这过程中的变化和作用。万分感谢！

作者: 101010 时间: 2016-4-14 15:26

请问高手们：
现阶段认为自噬在肿瘤的不同阶段的作用不同，那能否在实验室内用肿瘤细胞系体现出肿瘤发展的不同阶段？有没有什么好办法体现呢？
我想研究抑癌基因对肿瘤不同阶段的影响，以及其作用信号通路有无变化？不知道有没有这方面的研究？
同问！

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小弟最近想试看看在肝癌的发生过程中，自噬发生的情况。但是查了很多文献，都是动物模型的，我觉得还是先从细胞着手。请教各位老师有没有什么方法（最好是化学药物处理）能够诱导肝细胞快速的发生癌变呢？然后试着看看自噬在这过程中的变化和作用。万分感谢！

作者: fklo83 时间: 2016-4-14 15:27

请问大家有Beclin 1的干扰序列吗，谢谢

作者: coolcool 时间: 2016-4-14 15:28

（一）自噬诱导剂
1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
3）Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
5）Rapamycin：mTOR抑制剂
6）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
问题：自噬诱导中，制造饥饿能不能用无血清培养基代替Earle's平衡盐溶液?多谢

作者: yhn 时间: 2016-4-14 15:28

单纯用PBS配溶解不了啊，是不是需要先用DMSO配制高浓度再用PBS稀释阿
？麻烦赐教

作者: one 时间: 2016-4-14 15:29

用WB检测LC3I/II，我怎么就做不出3-MA及wortmanninr的药物抑制呢？有些时间和浓度貌似还有诱导迹象啊。恳请前辈们指点。。。

作者: any333 时间: 2016-4-14 15:29

（一）自噬诱导剂
1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
3）Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
5）Rapamycin：mTOR抑制剂
6）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
问题：自噬诱导中，制造饥饿能不能用无血清培养基代替Earle's平衡盐溶液?多谢
不能。因为培养液中有氨基酸。血清的有效成分主要是各种蛋白和多肽以及其他生物活性物质。

作者: queen 时间: 2016-4-14 15:31

太好了本来还以为是孤军奋战！我刚开始研究生实验想问下版主关于ATG9这个基因编码的是个跨膜蛋白它运输膜物质到PAS 楼主认为会有哪些基因影响ATG9的运输呢？还有对于研究ATG9运输机制的探索有什么好的建议吗？

作者: queen 时间: 2016-4-14 15:32

sigma的Anti-LC3B antibody produced in rabbit (1) L7543，做western很好，而且效价很高，可以重复使用很多次。
不过压LC3湿转的话，220毫安左右，转膜时间不要超过2小时。
这个western貌似很有trick啊大家还有啥建议的吗
包括提蛋白谢谢

作者: 水母 时间: 2016-4-14 15:32

请问，sigma的6-Amino-3-methylpurine就是3-MA吗？
是啊，同问，请问各位都是多少钱订的呢？多谢

作者: 水母 时间: 2016-4-14 15:33

一般EBSS处理3个小时就可以了，不过好像和细胞类型有关，有的细胞可能需要较长的时间，我的推测可能是因为各个细胞的自噬水平不一样的，还要自己摸条件。一般LC3抗体对LC3II型特异性较高，所以会出现两条带，LC3检测不是只看I型和II型，而是看两者比值的变化情况。检测细胞自噬应该多种方法一起检测，推荐用透射电镜观察，最直观可靠。

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请问只用透射电镜观察得到的结果可靠吗？有哪位同志已经做过电镜的？能否指点一下啊

作者: mamamiya 时间: 2016-4-14 15:34

我是研究凋亡的但是电镜观察到很多不好解释的现象可能与自噬有关

作者: gogo 时间: 2016-4-14 15:34

自是抑制剂3-MA在哪家公司买啊？SIGMA的好像挺贵，有没有用过的？请哪位大虾指教一下，太贵的怕最后做不出老板不答应

作者: any333 时间: 2016-4-14 15:36

不知有人用过3-MA抑制动物自噬的吗？怎么用？3-MA用于细胞培养倒是不少啊。谢

作者: 831226 时间: 2016-4-14 15:36

请教：有没有人做植物方面关于自噬的呢？3-MA的浓度怎么来控制呢？
谢谢前辈们来指导！

作者: 蒲公英 时间: 2016-4-14 15:37

请问，sigma的6-Amino-3-methylpurine就是3-MA吗？
是啊，同问，请问各位都是多少钱订的呢？多谢

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我刚定了3-MA，1400多

作者: 8princess8 时间: 2016-4-14 15:39

有两个问题，一直困扰着我，其实也都是最基本的问题，
【1】自噬和吞噬有什么根本区别？
巨噬细胞内有没有自噬现象？
如果有，如何与吞噬相鉴别？
在xenophagy没有被发现之前，可以用“吞噬内源物质”和“吞噬外源物质”来简单的界定，但是当有了xenophagy后，这种界定是否还靠的住呢？
如果不能这么界定了，那么自噬和吞噬的最本质区别又是什么呢？
其实紧接着的就是第二个问题，“巨噬细胞内有没有自噬现象？”“如果有，在形态结构和分子上如何与自噬相互鉴别呢？而且巨噬细胞内是否会同时存在自噬现象和吞噬现象共存的“现象”呢？
如果真的可以共存的话，那么接着的问题就是，如何区分这种共存的“囊泡”结构？
以及，细胞内为何要“自噬”与“吞噬”共存呢？在巨噬细胞中，那种现象占主要呢？
自噬在其中主要起什么作用，吞噬在其中又起什么作用呢？
我没有看过相关文献，不知道有哪位高手看过相关文献，来帮忙给释疑，不胜感激！！！
用一张模式图来显示下我们常规认为的“自噬”和“吞噬”

图片附件: 43170451.jpg (2016-4-14 15:39, 45.11 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43594

作者: 宁小胡 时间: 2016-4-14 15:40

【2】LC3-I和LC3-II这两个蛋白质分子，在结构上有何区别？LC3-I转化为LC3-II的催化酶是什么？限速酶是什么？以及LC3-II时怎么结合到自噬体膜上的？
LC3-I的来源是什么？基础水平下，LC3-I表达不表达，以及分布于何处？
LC3-I是自噬被诱导时临时合成的呢，还是基础情况下就存在于细胞中？
以及LC3-I是否还有其他的功能呢？
呵呵，这个问题可能不太合适，但是也是我很想知道的，不知道现在有没有相关的研究和文献呢？

作者: iii_ii 时间: 2016-4-14 15:40

我先说一下我的观点，自噬能不能在一定程度上看做“吞噬”现象的延伸呢？
说白了，自噬其实就是一种“吞噬”现象，只不过发生的细胞种类不同，形成的膜结构相对不同，但是从功能上说，是否可以认为，是细胞发育后残存的类似于吞噬细胞的“吞噬”功能呢？吞噬细胞是干细胞在分化中“吞噬”功能被特地放大的“细胞”，而其他细胞虽然经过分化后虽然其他功能被“特化放大”了，但是仍然残留一些“吞噬”功能，包括“清除自身物质重复利用”和“清除细胞周围的物质重复利用”的能力呢？
也就是说，是否“吞噬”和“自噬”概念和功能之间存在着“交叉区域”呢？
甚至二者都可以互相影响呢？
没有根据，凭空猜想的，不知道有没有做相关研究的，还请不吝赐教，谢谢！！！

作者: 9900 时间: 2016-4-14 15:41

谢谢!学习了,我师姐以前想做自噬,结果细胞送电镜检查,一次也没有看到什么,说是看不到超微结构,一团黑,不知道怎么回事?请问谁做过电镜看到自噬了?谢谢,想交流下

作者: 9900 时间: 2016-4-14 15:41

太好了本来还以为是孤军奋战！我刚开始研究生实验想问下版主关于ATG9这个基因编码的是个跨膜蛋白它运输膜物质到PAS 楼主认为会有哪些基因影响ATG9的运输呢？还有对于研究ATG9运输机制的探索有什么好的建议吗？
据本人所知，Atg9是酵母中唯一明确的自噬相关膜蛋白。Atg9位于PAS和其周围的区域，并往来于其间。Atg11、Atg23和Atg27帮助Atg9从外周来到PAS，而Atg1-Atg13复合物、Atg2、Atg18和PtdIns3K complex则有利于Atg9从PAS到外周。Atg9的来回穿梭可能与膜脂转运有关、且其动态的自我聚合可能参与了新生自噬体膜的扩展。
在哺乳动物中，当自噬被诱导后，mAtg9从高尔基体外侧网络（TGN）转运到晚期内体（与LC3共定位），mAtg9的这种重新分布依赖ULK1和人Atg13，具体有什么作用并不清楚。
需指出的是：（1）自噬体的起源或自噬体膜的发生目前并不清楚，最大的障碍就是自噬体膜上蛋白成分比其它膜少（为什么？），至今还未鉴定到特异的膜蛋白。因此，现在用一个非膜蛋白LC3/Atg8来标识自噬体。（2）酵母和其它高等真核生物的自噬体形成模式存在差异，酵母中自噬体的发生有个固定的位置——PAS，而后者似乎是随机、多个位点。自噬体形成包括成核、延伸、扩展、闭合几个阶段，（酵母）Atg9参与延伸和扩展，但本身并不定位到自噬体膜上。
至于如何去研究Atg9，这是个大话题。因为研究自噬需要很多昂贵的仪器和试剂，一般的研究机构不具备这样的条件和实力。Atg9的功能非常特殊（穿梭），目前的了解远未深入。大体研究范围包括参与膜脂运输的具体机制、物种间同源蛋白的鉴定、互作蛋白的鉴定、上游调控信号通路的鉴定、Atg9异常与疾病的关系等等。
欢迎交流

作者: NBA 时间: 2016-4-14 15:42

有两个问题，一直困扰着我，其实也都是最基本的问题，
【1】自噬和吞噬有什么根本区别？
【2】第二个问题，“巨噬细胞内有没有自噬现象？”“如果有，在形态结构和分子上如何与自噬相互鉴别呢？而且巨噬细胞内是否会同时存在自噬现象和吞噬现象共存的“现象”呢？
如果真的可以共存的话，那么接着的问题就是，如何区分这种共存的“囊泡”结构？
以及，细胞内为何要“自噬”与“吞噬”共存呢？在巨噬细胞中，那种现象占主要呢？
自噬在其中主要起什么作用，吞噬在其中又起什么作用呢？
......

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1）自噬和吞噬有什么根本区别？
打个比方：吞噬就像是吃饭，自噬就是你不吃饭的时候起作用。
两者在诱导因素、信号传递、蛋白成员、生物学意义等方面均存在差异，但又存在联系，如2者可以融合，都可以为细胞提供能量等。
2）自噬在真核生物中是非常保守的，具体到人的各类细胞（甚至包括肿瘤细胞），自噬功能仍被保留。但吞噬是某些特殊类型细胞才具有的功能（巨噬细胞的吞噬功能最强）。因此，吞噬和自噬是巨噬细胞都具备的功能，但在生理条件下，两者是否可以同时发生需要证据。人为刺激可以同时诱导，且吞噬泡和自噬体有时候可以先融合，然后再与溶酶体融合。
3）在形态学上2者均是双层膜球状结构，区别主要是融合前：a.内容物不同：吞噬泡为外源性物质，如大分子蛋白、细菌、或细胞碎片等。b.大小不同：吞噬泡较大，而自噬体一般都较小（普通光镜下不可见）。在实验中，吞噬功能检测经常采用的是加入荧光微球。

作者: caihong 时间: 2016-4-14 15:42

请问下自噬抑制剂3-MA怎么溶解啊？说明书上是用DMF溶解，可是这个DMF对细胞有毒性吗？希望各位大虾给予解答，不胜感激

作者: yonger 时间: 2016-4-14 15:43

这是最新期的autophagy上的自噬相关术语汇编
【Autophagy. 2010 May 6;6(4).】，个人通过求助得来的，呵呵
我想凡是做自噬的可能都会用得着，所以传上来，大家看看，希望对大家有帮助
也希望大家有好资料，一起共享

作者: 831226 时间: 2016-4-14 15:43

1、关于自噬的检测手段有多种，如电镜，GFP-LC3,免疫印记等等。那么，在一个实验里面，到底该用到哪些检测手段才能算说明自噬存在的问题。
2、本人想做大鼠脑组织的线粒体自噬（在体实验），请问可否有高手能提供一个检测的方案？

作者: 8princess8 时间: 2016-4-14 15:43

大家好，我想请教个问题。现在认为autophagy在细胞中是保守的，那么我们在诱导肿瘤细胞autophagy模型时，可以用任何一种细胞了吗？有什么肿瘤细胞更适合用来进行autophagy研究吗？

作者: vvmmoy 时间: 2016-4-14 15:44

我现在也在搞这个东东，感觉自噬就是个沼泽啊，陷进去就拔不出来了

作者: INK 时间: 2016-4-14 15:44

请教各位：
自噬对细胞的存活到底是有利还是有害？

作者: milkdog 时间: 2016-4-14 15:44

如果更早看见这个就好了。谢谢分享。
关于autophagy调节的通路部分，总结的都是经典的调节点（ mTOR and PI3K) . 还有1个最近的热点是 p53 对autophagy 的调节。我不是大牛，但在做这方面的试验。把我知道的写下来希望可以对别人也有写帮助。
1。p53 是最有人气的抑癌基因。同时 p53 还参与更多的细胞生命活动（如 ageing, 代谢）最近有报道证明 p53 对 autophagy 也有调节作用。
2。先有报道说在cancer cells 中 p53 表达争多的同时 autophagy 出现。诱导出现的autophagy 作用有不同的解释 A, 是cancer cell 的保护机制用来清除damaged 的蛋白和细胞器；B, 是 cancer cell 的死亡机制 cell death by autophagy ( 借用楼主的总结）。两种解释都各有证据。证明方法也很简单就是 knockdown ATG gene 或者给于 autophagy inhibitor 之后在给于药物处理看细胞的死亡和对比组是多了还是少了。
3。最近有报道说 p53 的表达降低也可以诱导 autophagy ( cancer cell 和 normal cell 中都有证据。研究发现起作用的是细胞质中的 p53 而不是细胞核中的p53. 关于机制， p53 激活 AMPK， AMPK 抑制经典 autophagy 调节点 mTOR 从而诱导 autophagy.
参考文献：
1。 Regulation of autophagy by cytoplasmic p53
Nat Cell Biol. 2008 June ; 10(6): 676–687. doi:10.1038/ncb1730.
2。p53: The Janus of autophagy?
nature cell biology volume 10 number 6 JUNE 2008
3。Stabilization and activation of p53 downregulates mTOR signaling through AMPK
in mantle cell lymphoma
Leukemia (2009) 23, 784–790

作者: 9900 时间: 2016-4-14 15:45

楼主辛苦了！请问一下，你认为autophagy在生殖细胞肿瘤方面最新研究热点是什么？谢谢

作者: cj_mondy 时间: 2016-4-14 15:46

大家好，我现在也在做关于自噬方面的，以前用了santa 公司的 MAP-lc3，sc-16755。很难做出来，但最终还是做出来了，但重复性不好。现在又换了一个CST的一个抗体，#4108，但一次也没有做出来象说明书上的那样的两条带。我使用的是半干转，0.22um的PVDF膜 15V电压，48、30分钟都试过。
请各位前辈指点！谢谢！

作者: kulee 时间: 2016-4-14 15:46

刚接触自噬，很感兴趣；我想请假一下楼主：
“自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解”；那之后的溶酶体是怎样的状态？？
多谢！

作者: windboy 时间: 2016-4-14 15:47

大家好，我现在也在做关于自噬方面的，以前用了santa 公司的 MAP-lc3，sc-16755。很难做出来，但最终还是做出来了，但重复性不好。现在又换了一个CST的一个抗体，#4108，但一次也没有做出来象说明书上的那样的两条带。我使用的是半干转，0.22um的PVDF膜 15V电压，48、30分钟都试过。
请各位前辈指点！谢谢！
......

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我用的是novus的抗体，做的还不错。转膜是湿转，0.22的PVDF 300MA，20分钟。

作者: NBA 时间: 2016-4-14 15:48

刚接触自噬，很感兴趣；我想请假一下楼主：
“自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的“货物”也被降解”；那之后的溶酶体是怎样的状态？？
多谢！
......

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这确实是个问题，估计有2种结局：（1）与细胞膜融合，内容物排出；（2）不排出，留在细胞内形成色素沉着。
本人推测以第二种为主。
如老年性神经元退行性病变现在被理解为降解能力下降，其实也可以理解为降解后的废物积聚。究竟是那种成分多一点，是值得去研究的。

作者: any333 时间: 2016-4-14 15:48

看到此贴如获至宝，和前辈们学了很多东西。我是今年由临床转向细胞生物学的新手博士。老板的课题很多，主要方向集中于mitochondrial apoptosis和autophagy/mitophagy。由于缺乏细胞生物学实验的基础，目前初始阶段主要还是集中于文献和技术的学习。
对于未来课题方向的选择，我有些迷茫，特向各位前辈请教。
可以这两个都是专业中比较吸引人的方向，我个人也很感兴趣。但是据实验室前辈介绍，apoptosis已经不能算做新兴课题，据说国外的兴起还是在上世纪90年代；而autophage/mitophage在实验条件的稳定控制方面会存在一定困难，等等。
目前我还缺乏对这两个方向的全方面认识，希望有经验的前辈能拨冗为我做出一些分析。从临床转向基础，加之我校对博士学位的要求是SCI5.8，5年之内没文章就拿不到学位。未来的困难可想而知。即便如此，我希望能尽我所能做出一些差强人意的成果，不要出现毕业无学位的悲剧。
晚辈谢过。

作者: 831226 时间: 2016-4-14 15:48

AUTOPHAGY 国内搞这个的人多吗？？
我们学校有个团队专门做这个，有几个老师好还是蛮牛的！！在AUTOPHAGY 法国几篇那时候影响因子6.多呢
感觉这个好有前途啊就像现在的调亡一样不过现在可能还没有受到那么大的重视！！但愿AUTOPHAGY 能给人类肿瘤和其他疾病带来福音…………期待成果！！！！

作者: xyw5 时间: 2016-4-14 15:49

自噬小体的增多有两种可能：一是形成增加即自噬被诱导；另外一种是自噬体成熟受抑即自噬体不能和溶酶体结合。该怎么来判断呢？
另外，我们在神经系统中检测LCⅡ，使用western blotting，好像不怎么灵敏，还是因为它存在的时间较短？

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我也在神经细胞系SH-SY5Y中，发现LC3二型WESTERN条带很浅，有文章报道神经细胞中自噬体的清除是很快的，不知是否这样。第一个问题，自噬体和溶酶体融合障碍大多都是加入了溶酶体抑制剂，或者KNOCKDOWM 溶酶体蛋白如LAMP2，生理性的自噬体和溶酶体融合障碍也存在，如何区分，如果自噬流量增加，那么溶酶体的活性也会增强，还可以检测自噬的不同阶段的变化，如早期的PHAGEPORE，或用自噬的抑制剂如3-MA，WORTMANIE等，如果加入抑制剂后二型又增多，可能提示自噬通路是正常的，如果不是这样，可能提示自噬通路部畅通。总之，LC3二型一个指标不足以反映自噬，还需要别的蛋白，综合评价自噬的状况。

作者: wanglaoshi 时间: 2016-4-14 15:49

有没有人在做MDC染色啊？最近在染色，总是染不上。

作者: wanglaoshi 时间: 2016-4-14 15:50

大家用Rapamycin/3-MA 诱导/抑制培养细胞的自噬的时候，用的培养基的血清浓度多少啊？
我最近western blot检测LC3-1/2，Rapamycin诱导（2%FBS DMEM）不同时间，没有检测到LC3-2，很奇怪。
Rapamycin是用DMSO配制的，作用浓度100 NMOL/L

作者: wanglaoshi 时间: 2016-4-14 15:51

大家好，我现在也在做关于自噬方面的，以前用了santa 公司的 MAP-lc3，sc-16755。很难做出来，但最终还是做出来了，但重复性不好。现在又换了一个CST的一个抗体，#4108，但一次也没有做出来象说明书上的那样的两条带。我使用的是半干转，0.22um的PVDF膜 15V电压，48、30分钟都试过。
请各位前辈指点！谢谢！
......

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我用的湿转，110V，90min.之前以为小蛋白转印的时间要缩短的，用过60min,40min,30min,20min,结果都检测不到条带，用了90min就有了。

作者: 8s5g 时间: 2016-4-14 15:51

3-MA用PBS溶解，储存浓度为100 mmol/L，其冷却时有沉淀，使用
前加热到50度左右1分钟使之溶解

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请问刚买来的3-MA粉末怎么保存？是常温吗？配好后的怎么保存？整个过程怎么弄？谢谢！

作者: 3.14 时间: 2016-4-14 15:52

自噬相关文献的全文——纳米盘下载key：123
请问如何下载？地址是什么？
非常感谢

作者: langlang 时间: 2016-4-14 15:52

花了几个小时的时间从头到尾看了一遍，简直是太好了，希望从事自噬相关研究的达人继续继续分享宝贵的动态

作者: 8princess8 时间: 2016-4-14 15:55

研究细胞信号通路的人路过
此帖子给了很大帮助，初入这一块，等我研究了信号通路与AUTOPHAGY再来与各位大人分享~

作者: mercedes 时间: 2016-4-14 15:55

请问做自噬，蛋白提取用哪个公司的试剂盒好？

作者: yonger 时间: 2016-4-14 15:56

请教各位大侠，自噬诱导的检测时间一般都是设定在多少的？从几分钟到2小时么？

作者: 45778 时间: 2016-4-14 15:56

自噬小体在光镜下能看到吗？

作者: ns5fan 时间: 2016-4-14 15:56

我也是做这方面的实验，可惜我比你还差劲，我只是个研究生，没那么大的要求

作者: bbc 时间: 2016-4-14 15:57

【2】LC3-I和LC3-II这两个蛋白质分子，在结构上有何区别？LC3-I转化为LC3-II的催化酶是什么？限速酶是什么？以及LC3-II时怎么结合到自噬体膜上的？
LC3-I的来源是什么？基础水平下，LC3-I表达不表达，以及分布于何处？
LC3-I是自噬被诱导时临时合成的呢，还是基础情况下就存在于细胞中？
以及LC3-I是否还有其他的功能呢？
呵呵，这个问题可能不太合适，但是也是我很想知道的，不知道现在有没有相关的研究和文献呢？
......

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了解的就写上，大家探讨。
结构上的区别在于LC3-I在激活后，C端被剪切C从而形成LC3-II。
基础水平下，LC3-I表达，我已发表的大鼠脑内和现在准备发表的肿瘤细胞中都有基础性表达，所以，在基础情况下就存在于细胞中。我最近文章的共聚焦显微镜结果表明，基础水平下，LC3多数分布于自噬体上，小部分分布于溶酶体中。而一些刺激过后，则相反。
文章如果贴上来的话，可能有版权问题，请各位要参考的请自己下载，或者短信我。
1. p53 mediates mitochondria dysfunction-triggered autophagy activation
and cell death in rat striatum.[Autophagy 5:3, 339-350; 1 April 2009]
2. Down-Regulation of Bcl-2 Enhances Autophagy Activation and Cell Death Induced by Mitochondrial Dysfunction in Rat Striatum.Journal of Neuroscience Research 87:3600–3610 (2009)

作者: bbc 时间: 2016-4-14 15:57

我用10mM 3－MA处理细胞24 h后发现细胞与对照相比长得慢多了，请问你们呢，细胞反应大吗？

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对于一般的细胞，3-MA的影响是比较明显的。可能因为第一它有一定的细胞毒性，第二3-MA
抑制了PI3K途径，从而可能影响p53表达，对细胞的分化有影响。

作者: xuuuu 时间: 2016-4-14 15:57

缺氧条件下能诱导自噬，请问一下，细胞培养如何建立缺氧环境？

作者: bbc 时间: 2016-4-14 15:59

QUOTE:

原帖由 xuuuu 于 2016-4-14 15:57 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

缺氧条件下能诱导自噬，请问一下，细胞培养如何建立缺氧环境？

我们实验室有一个缺氧装置，是老板从美国买回来的，类似一个脸盆大小的封闭塑料装置。按照比例通入氮气和二氧化碳，就能建立缺氧环境。如果能保证容器和通气管子的密闭性，自制一个也未尝不可。

作者: ALALA 时间: 2016-4-14 15:59

好强大的版块求教
我是新手，打算做饥饿诱导肿瘤细胞自噬，文献提到的EBSS是配的还是可以现买的？
还有，如果放无氨基酸无血清培养诱导又说3h，也有说12h的，收集细胞后铺板测cck-8的时候是用全营养培养基还是用EBSS啊？？

作者: zbboom 时间: 2016-4-14 16:00

Ebss 可以买。
关于starvation的时间，需要摸索一下，因为不同细胞反应不同，有的半小时如HCT116，有的要过夜如SAOS2。

作者: 龙小好汉 时间: 2016-4-14 16:00

看了自噬逐渐进入了大家的研究视野啦，就像早先的凋亡一样。我也一直关注和学习着自噬相关进展，但是始终感觉到目前还没有一个真正稳定检测自噬的方法，现如今研究的自噬基本上都是在细胞株模型上的人为干预下进行的自噬研究，并没有直接从病人来源的细胞或组织真正观察到自噬（比如从肿瘤病人中分出的肿瘤细胞或组织，当然也有些文献利用免疫组织化学的方法检测了LC-3，Beclin-1的表达）我想请问楼主或其他同道，有谁能否讲解下能否直接从病人体内分出组织或细胞来直接观察到自噬的发生？

作者: tewank 时间: 2016-4-14 16:01

看了自噬逐渐进入了大家的研究视野啦，就像早先的凋亡一样。我也一直关注和学习着自噬相关进展，但是始终感觉到目前还没有一个真正稳定检测自噬的方法，现如今研究的自噬基本上都是在细胞株模型上的人为干预下进行的自噬研究，并没有直接从病人来源的细胞或组织真正观察到自噬（比如从肿瘤病人中分出的肿瘤细胞或组织，当然也有些文献利用免疫组织化学的方法检测了LC-3，Beclin-1的表达）我想请问楼主或其他同道，有谁能否讲解下能否直接从病人体内分出组织或细胞来直接观察到自噬的发生？

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免疫组化就能检测，但是检测的临床意义不大，科研还是有价值的。国内已经有人做过宫颈癌细胞的autophagy的检测。检测Autopahgy的方法有3种。第一种是电镜的检测，比较贵而且繁琐，但是是检测的金标。第二种是LC3的检测，用pcr和WB都科可以。第三种是同位素标记的长周期蛋白降解的检测。还有一种是用MDC检测，特异性不好。这是我现在所了解的，用的比较多的是电镜检测和LC3的检测。希望对您能有所帮助。俺也是接触过这个领域，略知一二。不足之处，欢迎大家批评指正。

作者: sunbent 时间: 2016-4-14 16:01

我先说一下我的观点，自噬能不能在一定程度上看做“吞噬”现象的延伸呢？
说白了，自噬其实就是一种“吞噬”现象，只不过发生的细胞种类不同，形成的膜结构相对不同，但是从功能上说，是否可以认为，是细胞发育后残存的类似于吞噬细胞的“吞噬”功能呢？吞噬细胞是干细胞在分化中“吞噬”功能被特地放大的“细胞”，而其他细胞虽然经过分化后虽然其他功能被“特化放大”了，但是仍然残留一些“吞噬”功能，包括“清除自身物质重复利用”和“清除细胞周围的物质重复利用”的能力呢？
也就是说，是否“吞噬”和“自噬”概念和功能之间存在着“交叉区域”呢？
甚至二者都可以互相影响呢？
没有根据，凭空猜想的，不知道有没有做相关研究的，还请不吝赐教，谢谢！！！
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autophagy不是吞噬，不是一个通路。我问过我的辅导教师，他是这样跟我说的，吞噬是细胞用细胞膜包裹外源的物质，但是Autopahgy是细胞内来源不明（有的认为是来自高尔基体，有的认为是来自内质网等，但是没有确切的说法）的膜类物质包裹细胞内的物质（长周期蛋白，已经进入细胞内的细菌，等）。这就是区别。如果细菌在胞外有细胞包裹就是吞噬。但是同样是细菌如果是在细胞内被包裹就是AUTOPHAGY.这也是我现在的理解范围，欢迎大家拍砖。

作者: sunbent 时间: 2016-4-14 16:02

有两个问题，一直困扰着我，其实也都是最基本的问题，
【1】自噬和吞噬有什么根本区别？
巨噬细胞内有没有自噬现象？
如果有，如何与吞噬相鉴别？
在xenophagy没有被发现之前，可以用“吞噬内源物质”和“吞噬外源物质”来简单的界定，但是当有了xenophagy后，这种界定是否还靠的住呢？
如果不能这么界定了，那么自噬和吞噬的最本质区别又是什么呢？
其实紧接着的就是第二个问题，“巨噬细胞内有没有自噬现象？”“如果有，在形态结构和分子上如何与自噬相互鉴别呢？而且巨噬细胞内是否会同时存在自噬现象和吞噬现象共存的“现象”呢？
如果真的可以共存的话，那么接着的问题就是，如何区分这种共存的“囊泡”结构？
以及，细胞内为何要“自噬”与“吞噬”共存呢？在巨噬细胞中，那种现象占主要呢？
自噬在其中主要起什么作用，吞噬在其中又起什么作用呢？
我没有看过相关文献，不知道有哪位高手看过相关文献，来帮忙给释疑，不胜感激！！！
用一张模式图来显示下我们常规认为的“自噬”和“吞噬”
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【1】自噬和吞噬有什么根本区别？
根本区别就是吞噬细胞外源还是内源的物质。
巨噬细胞内有没有自噬现象？这个肯定是有的。
如果有，如何与吞噬相鉴别？主要靠autophagy一些特异性的分子标记如LC3，beclin-1
在xenophagy没有被发现之前，可以用“吞噬内源物质”和“吞噬外源物质”来简单的界定，但是当有了xenophagy后，这种界定是否还靠的住呢？
很好的问题，这个我不知道。但是除了这些形态上的区别外，autophagy的分子标记应该是最根本的区别，它有给事中autophagy相关的蛋白。
如果不能这么界定了，那么自噬和吞噬的最本质区别又是什么呢？
根本的区别就是在分子上的区别，当然作用也是不一样的。
其实紧接着的就是第二个问题，“巨噬细胞内有没有自噬现象？”“如果有，在形态结构和分子上如何与自噬相互鉴别呢？而且巨噬细胞内是否会同时存在自噬现象和吞噬现象共存的“现象”呢？
巨噬细胞有autophagy，也可能有吞噬共存。他们的作用可能有交叉，但是也有各自特有的作用。
如果真的可以共存的话，那么接着的问题就是，如何区分这种共存的“囊泡”结构？
一般电镜检测，如果有，可以做免疫电镜，或者做western来鉴别。
以及，细胞内为何要“自噬”与“吞噬”共存呢？在巨噬细胞中，那种现象占主要呢？
autophagy主要是骑着维护细胞的稳态的作用，比如长周期蛋白的降解，不能用泛素化的途径来降解，所以autophagy就发挥它的作用了。比如老年痴呆，就是大脑内的蛋白不能降解，导致的疾病。肿瘤，外来的细菌都可以认为是多余的蛋白，autophagy就是处理这些多余的蛋白的。如果autophagy有了问题，就有了疾病。
自噬在其中主要起什么作用，吞噬在其中又起什么作用呢？
我觉得autophagy主要是维护细胞的稳态，主要是蛋白质方面的。吞噬主要是处理外来的蛋白，而且只是初步的处理。

作者: sunbent 时间: 2016-4-14 16:03

请问刚买来的3-MA粉末怎么保存？是常温吗？配好后的怎么保存？整个过程怎么弄？谢谢！

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买来后可以在负三十度保存，最好是现配现用。如果用不完可以保存在负三十度。
在保存试剂中，一般粉末类的常用就在四度保存，时间长就在负三十度。
一般说明书上会写明。

作者: sunbent 时间: 2016-4-14 16:03

自噬小体在光镜下能看到吗？

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肯定不行的。光镜下只能看到细胞的轮廓，以及细胞核。其他细胞器需要用电镜才能观察到。
如果用荧光显微镜，有标记各种细胞器的探针，了解的有内质网，线粒体，溶酶体，细胞核，高尔基体等，都可以做荧光标记。

作者: sunbent 时间: 2016-4-14 16:04

autophagy不是吞噬，不是一个通路。我问过我的辅导教师，他是这样跟我说的，吞噬是细胞用细胞膜包裹外源的物质，但是Autopahgy是细胞内来源不明（有的认为是来自高尔基体，有的认为是来自内质网等，但是没有确切的说法）的膜类物质包裹细胞内的物质（长周期蛋白，已经进入细胞内的细菌，等）。这就是区别。如果细菌在胞外有细胞包裹就是吞噬。但是同样是细菌如果是在细胞内被包裹就是AUTOPHAGY.这也是我现在的理解范围，欢迎大家拍砖。

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觉得你评价的挺合理的。自噬主要的生理功能是将胞质中的大分子物质和一些细胞内源性底物在单位膜包裹的囊泡中大量降解，实现再循环，以维持细胞自身的稳定。而在自噬的分类中，不管是大自噬，小自噬还是CMA，都需要溶酶体，吞噬主要是对外界物质的摄入，过程中同样也需要溶酶体。一般体细胞吞噬作用较少，而免疫细胞，巨噬细胞的话，吞噬作用比较明显，而同时，内部也进行着自噬过程。因为细胞也需要内部的新陈代谢。

作者: u234 时间: 2016-4-14 16:04

我们实验室经常做LC3，要注意的是转膜时间，转长了就转过头了。动物种属在抗体说明书上有写。

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请问您实验做LC3都用的是哪个公司的抗体呢，最近要订，做人的细胞

作者: u234 时间: 2016-4-14 16:04

自噬的特性：
1）自噬是细胞消化掉自身的一部分，即self-eating，初一看似乎对细胞不利。事实上，细胞正常情况下很少发生自噬，除非有诱发因素的存在。这些诱发因素很多，也是研究的热门。既有来自于细胞外的（如外界中的营养成分、缺血缺氧、生长因子的浓度等），也有细胞内的（代谢压力、衰老或破损的细胞器、折叠错误或聚集的蛋白质等）。由于这些因素的经常性存在，因此，细胞保持了一种很低的、基础的自噬活性以维持自稳。
2）自噬过程很快，被诱导后8min即可观察到自噬体（autophagosome）形成，2h后自噬溶酶体（autolysosome）基本降解消失。这有利于细胞快速适应恶劣环境。
3）自噬的可诱导特性：表现在2个方面，第一是自噬相关蛋白的快速合成，这是准备阶段。第二是自噬体的快速大量形成，这是执行阶段。
4）批量降解：这是与蛋白酶体降解途径的显著区别
5）“捕获”胞浆成分的非特异性：由于自噬的速度要快、量要大，因此特异性不是首先考虑的，这与自噬的应急特性是相适应的。
6）自噬的保守性：由于自噬有利于细胞的存活，因此无论是物种间、还是各细胞类型之间（包括肿瘤细胞），自噬都普遍被保留下来（谁不喜欢留一手呢？）。
参考综述：
Autophagy fights disease through cellular self-digestion.pdf
cuturl('http://www.namipan.com/d/4c78fe31cb24080cd7630639c121cd71b24c9b56fbdf6300')
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请问不经过诱导，正常的细胞的这种很低的基础的自噬活性能否检测到？

作者: u234 时间: 2016-4-14 16:05

我用的湿转，110V，90min.之前以为小蛋白转印的时间要缩短的，用过60min,40min,30min,20min,结果都检测不到条带，用了90min就有了。

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请问您LC3用的是哪个公司的？谢谢

作者: fei1226com 时间: 2016-4-14 16:05

貌似现在所有与肿瘤有关的研究都可以和自噬沾边

作者: jude 时间: 2016-4-14 16:06

请教楼主和各位大虾：
氯喹是自噬抑制剂，可是为什么在LC3A/B的western检测中，都被用作阳性对照呢？似乎是阴性对照才符合逻辑啊？

作者: bohe221 时间: 2016-4-14 16:07

请教楼主和各位大虾：
氯喹是自噬抑制剂，可是为什么在LC3A/B的western检测中，都被用作阳性对照呢？似乎是阴性对照才符合逻辑啊？
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你说的是CQ么？因为CQ blocked the degradation/fusion of lysosome. so the LC3 II can not be degraded. When you do the LC3 flux analysis, CQ is used as synthesis control. 你说的阳性不是autophagic activity阳性，应该是LC3II增加(LC3II增加可不见得是阳性哦）

作者: fei1226com 时间: 2016-4-14 16:09

谢谢回答。我是说的LC3的western检测之阳性对照，因为我买的抗体的specification提供的阳性对照组就是CQ组表达显著增强。阁下提醒得好，LC3增加当然不一定是自噬活性增加，再次感谢！
继续请教阁下和各位大虾：
1.如果想确认是否自噬活性增强，哪些分子指标比较靠谱？又怎样检测比较准确？LC3的western检测结果与那些指标组合起来分析可以较好地判断自噬活性变化？
2.都说电镜是金标准，我觉得除了找到autophagosome有定性作用之外，其定量其实是很不靠谱的，有文章说是要数autophagy的数目，我实际干过这个活，觉得尤其不靠谱。因为标本处理给你的超薄切片sample在你的总体中是个什么地位完全不清楚，你再去随机计数多少个autophagosomes,即使数得清也没意义，何况根本不容易数清，因为只有典型的早中期autophagosome可以被辨认出来，很早期和晚期的autophagosome其实是认不出来的。更何况，不同的细胞出现自噬的时间点不一样，怎么好比较呢？
3.如果确定了分子标记，用western检测好还是流式检测比较好？各有什么优缺点？
问题很初级，承蒙各位见笑了，望不吝赐教！谢谢！

作者: iii_ii 时间: 2016-4-14 16:13

AUTOPHAGY 国内搞这个的人多吗？？
我们学校有个团队专门做这个，有几个老师好还是蛮牛的！！在AUTOPHAGY 法国几篇那时候影响因子6.多呢
感觉这个好有前途啊就像现在的调亡一样不过现在可能还没有受到那么大的重视！！但愿AUTOPHAGY 能给人类肿瘤和其他疾病带来福音…………期待成果！！！！

作者: lyxsqs 时间: 2016-4-14 16:14

自噬小体的增多有两种可能：一是形成增加即自噬被诱导；另外一种是自噬体成熟受抑即自噬体不能和溶酶体结合。该怎么来判断呢？
另外，我们在神经系统中检测LCⅡ，使用western blotting，好像不怎么灵敏，还是因为它存在的时间较短？

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我也在神经细胞系SH-SY5Y中，发现LC3二型WESTERN条带很浅，有文章报道神经细胞中自噬体的清除是很快的，不知是否这样。第一个问题，自噬体和溶酶体融合障碍大多都是加入了溶酶体抑制剂，或者KNOCKDOWM 溶酶体蛋白如LAMP2，生理性的自噬体和溶酶体融合障碍也存在，如何区分，如果自噬流量增加，那么溶酶体的活性也会增强，还可以检测自噬的不同阶段的变化，如早期的PHAGEPORE，或用自噬的抑制剂如3-MA，WORTMANIE等，如果加入抑制剂后二型又增多，可能提示自噬通路是正常的，如果不是这样，可能提示自噬通路部畅通。总之，LC3二型一个指标不足以反映自噬，还需要别的蛋白，综合评价自噬的状况。

作者: lyxsqs 时间: 2016-4-14 16:14

谢谢回答。我是说的LC3的western检测之阳性对照，因为我买的抗体的specification提供的阳性对照组就是CQ组表达显著增强。阁下提醒得好，LC3增加当然不一定是自噬活性增加，再次感谢！
继续请教阁下和各位大虾：
1.如果想确认是否自噬活性增强，哪些分子指标比较靠谱？又怎样检测比较准确？LC3的western检测结果与那些指标组合起来分析可以较好地判断自噬活性变化？
2.都说电镜是金标准，我觉得除了找到autophagosome有定性作用之外，其定量其实是很不靠谱的，有文章说是要数autophagy的数目，我实际干过这个活，觉得尤其不靠谱。因为标本处理给你的超薄切片sample在你的总体中是个什么地位完全不清楚，你再去随机计数多少个autophagosomes,即使数得清也没意义，何况根本不容易数清，因为只有典型的早中期autophagosome可以被辨认出来，很早期和晚期的autophagosome其实是认不出来的。更何况，不同的细胞出现自噬的时间点不一样，怎么好比较呢？
3.如果确定了分子标记，用western检测好还是流式检测比较好？各有什么优缺点？
问题很初级，承蒙各位见笑了，望不吝赐教！谢谢！
......

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就是因为缺少真正的标准，所以，才出现那么多的检测方法。你说LC3II靠谱？P62靠谱？都有反例。只能多做几个不同的指标来同时说明。我打觉得long-lived protein degradation 可信度更大。
据说电镜数av还是挺可信的，至少在这个时间点上有比较意义。至于早期晚期，我就不知道怎么去数了。

作者: lorri 时间: 2016-4-14 16:15

请问大家还做过LC3B的免疫组化的啊？在肾小管上皮有反应吗？

作者: TAT 时间: 2016-4-14 16:17

对自噬了解很少，看起来有些吃力呢。收藏了先，以后好好看！
一个小问题，请高手不吝赐教啦，我用AnnexinV/PI双染法检测到了凋亡，这有可能是autophagy么？我能不能肯定他就是type I cell death，而不是type II呢？
如果有可能是type II, 有什么可靠又实惠的方法来区分呢，谢谢！

作者: 9900 时间: 2016-4-14 16:17

QUOTE:

原帖由 TAT 于 2016-4-14 16:17 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
对自噬了解很少，看起来有些吃力呢。收藏了先，以后好好看！
一个小问题，请高手不吝赐教啦，我用AnnexinV/PI双染法检测到了凋亡，这有可能是autophagy么？我能不能肯定他就是type I cell death，而不是type II呢？
如果有可能是type I ...

所谓大自噬是二型程序性细胞死亡是稍早期一点的说法，现在已经不赞成这样的观点了。人们在研究一个新现象时由于所知太少，总是想用熟知的理论来解释它。自噬在研究进展中已经显示出及其复杂的特性，完全不能简单化，只能具体现象具体描述，看看以后资料多了能否总结出一些共性来。如果你是做这个研究的话，建议你多看最新的外文文章，尤其不要看国内综述。如果看了，也不要把它当做理论依据，应该及时看最新的外文文献更新观点，否则从设计课题到实施研究都是在错误的前提下进行，费钱费力，没有更糟糕的了。做新东西就是这样。

作者: 911 时间: 2016-4-14 16:18

麻烦问一下诸位我做LC3 的时候经常出现三条带，可是不知道怎么来确定是那两条带，能给个建议吗

作者: memory 时间: 2016-4-14 16:20

我们的LC3抗体也是三条带，根据分子量判断后两条带是LC3-1和LC3-2，主要看LC3-2有没有变化，有变化就是。

作者: chengjie79 时间: 2016-4-14 16:20

想请教一个问题，帖子中前段说道：MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。后段有人又讲到单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。是自噬发生过程中分析分子水平机制的一种特异的检测自噬体方法。究竟这种方法的可靠性有多少？

作者: NBA 时间: 2016-4-14 16:21

QUOTE:

原帖由 chengjie79 于 2016-4-14 16:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
想请教一个问题，帖子中前段说道：MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。后段有人又讲到单丹(磺)酰戊二胺(MDC)染色法。是自噬发生过程中分析分子水平机制的一种特异 ...

那要看你的实验目的啊。所有实验在了解其原理之后，就看你的实验目的是什么，才能知道可靠性。如果你是想证明自噬是否得到增强或减弱，只靠这个实验，其可靠性小于百分之个位数。原因就如你所说，它完全没有自噬特异性。如果你已经有比较充足的其他证据证明自噬的效应得到了增强或减弱，做这个是分解代谢最后的效应强度，这个实验make sense啊。
最初进行自噬的研究确实有点令人困惑，原因在于没有金标准。打个比喻说，没有找到结核杆菌之前，你只能搞到发热，盗汗，血沉快，消瘦，食欲下降，咳嗽，等等现象，甚至还有胸片显示肺部阴影。但你有多大把握做出肺结核的诊断呢？我们只能说你的证据收集的越多离正确的诊断结果越近。而自噬是一个动态的细胞代谢现象，没有一个象结核杆菌这样的金标准，只能靠完整的过程检测来反映。也就是说要证明自噬效应的增强和减弱，你要找到从自噬体形成到自噬溶酶体再到蛋白质降解的一整套证据都match，你的论证才算比较够给力。
说了这么多，希望不是把你越搞越糊涂了，呵呵。

作者: xueyouzhang 时间: 2016-4-14 16:21

我做的B16细胞和MCF-7细胞的LC3B的Western-blot检测，配置的15%的分离胶，湿转250mA，60min，条带还不错，MDC染色结果确实不好解释

作者: remonte 时间: 2016-4-14 16:23

请问您每孔的上样蛋白总量是多少微克？湿转恒压大概是多少呢？

作者: milkdog 时间: 2016-4-14 16:23

我是用无血清培养液配3-MA，配成200mM的，用之前60度加热，一旦降温很容易析出晶体，所以用之前一定保证完全溶解

作者: milkdog 时间: 2016-4-14 16:24

请问您每孔的上样蛋白总量是多少微克？湿转恒压大概是多少呢？

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50ug吧，我现在用半干转，15v，30-40min

作者: milkdog 时间: 2016-4-14 16:24

我现在也在搞这个东东，感觉自噬就是个沼泽啊，陷进去就拔不出来了

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同意，细胞不自噬，我想自噬

作者: NBA 时间: 2016-4-14 16:25

“氯喹是自噬抑制剂，可是为什么在LC3A/B的western检测中，都被用作阳性对照呢？似乎是阴性对照才符合逻辑啊？”
氯喹能提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3不能按时降解，表现为LC3荧光长时间的保留或WB中LC3条带变粗。

作者: vcve 时间: 2016-4-14 16:26

请教一个问题：想用GFP-LC3检测LC3点状分布，但看大多数文献用的都是2000年EMBO J 上日本人发表的文章里的那个质粒，它是rat来源的，用来转人的细胞，是不是比人源来的LC3更好？还是人的这个载体（cDNA）很难弄出来？

作者: toy 时间: 2016-4-14 16:26

向大家请教一下：文献上说：自噬过程的信号调控其中有①I型PI3K/Akt/mTOR信号途径：I 型PI3K 是自噬的负调节分子，抑制自噬的发生。②III 型PI3K 复合物可诱导自噬的发生。自噬抑制剂3- 甲基腺嘌呤3-MA 通过抑制III 型PI3K 的活性抑制自噬形成。自噬特异性抑制剂有：“3-MA是PI3K 的抑制剂，可特异性阻断细胞自噬过程中自噬泡与溶酶体的融合，被广泛用作细胞自噬的抑制剂。另外，Wortmannin、LY294002和巴弗洛霉素A1也可用作细胞自噬的抑制剂。”3-MA 、Wortmannin、LY294002都是PI3K的特异性抑制剂，那它们同样也抑制I型PI3K/Akt/mTOR信号途径呀，结果不是增加了自噬吗？难道是因为它们没有抑制III 型PI3K 复合物作用强，所以最终说它们是细胞的自噬作用的抑制剂？我是个新手，也许问的会有些幼稚，望各位大侠们指点！

作者: TAT 时间: 2016-4-14 16:27

RNAi的非特异作用是否会影响自噬的发生？使用慢病毒konckdown基因A，构建稳转株，但是细胞在培养过程中发现基因A不再konckdown了，而western检测发现，konckdown的细胞株LC3-II水平低于对照组（我的假设是基因A可能参与自噬的发生）。我的问题是，LC3-II水平的降低是不是RNAi的非特异作用引起的？请高手指点

作者: sistis 时间: 2016-4-14 16:27

现在自噬研究是越来越热了，国内刚刚起步，我们正在开展相关的研究，苦于条件还不成熟，只能做一些浅显的研究，希望多交流！

作者: idea2011 时间: 2016-4-14 16:27

请教各位师兄，我想一名小硕，想做一个大鼠的创伤模型，然后分别使用3-MA和雷帕霉素，观察创伤后的免疫炎症状态，不知道靠不靠谱，请各位不吝赐教。

作者: ukonptp 时间: 2016-4-14 16:28

QUOTE:

原帖由 idea2011 于 2016-4-14 16:27 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请教各位师兄，我想一名小硕，想做一个大鼠的创伤模型，然后分别使用3-MA和雷帕霉素，观察创伤后的免疫炎症状态，不知道靠不靠谱，请各位不吝赐教。 ...

不靠谱的概率远远大于靠谱的概率。

作者: vvmmoy 时间: 2016-4-14 16:28

我们实验室有做线粒体自噬的，线粒体自己吃自己，清除垃圾的线粒体，对机体有一定的积极作用。

作者: 11_hjx 时间: 2016-4-14 16:28

请教一下大家有关于micro RNA与细胞自噬之间研究的。
我的实验情况大致是，化合物作用于癌细胞通过电镜找到自噬体，稍后又从RNA水平及蛋白质水平进行验证（目前做了两个，一是LC3，另一个是Beclin1），上调的都比较明显。现在教授们有意向表明看能不能从micro RNA中找到一些有价值的信息。请教各位有什么好的意见，万分的感谢。

作者: 65urh 时间: 2016-4-14 16:28

beclin 1 的分子量60kd

作者: kulee 时间: 2016-4-14 16:29

为什么我做的LC-3的免疫荧光，细胞核内会有高表达啊？

作者: cocacola 时间: 2016-4-14 16:29

是突变体吗，是不是外运受阻了？

作者: shkudo 时间: 2016-4-14 16:29

新人报到一下。另外向各位大大请教一下：我做的western blot 检测LC3为什么只出现一条条带？用的是NOVUS公司的LC3B抗体，BIO-RAD的电泳仪，湿转恒流100MA，分别试了18MIN,30MIN,40MIN，后面二个都是单条条带；以前用90V，90MIN没条带出现。请各位大大指导

作者: shkudo 时间: 2016-4-14 16:30

各位同仁：
请问免疫荧光法检测自噬特异性蛋白LC3的表达，用那些抗体较好呀？抗体名称、品牌、价位？谢谢！

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MBL公司货号为PM036的LC3抗体做IF效果很好，价位大概在两三千吧

作者: shkudo 时间: 2016-4-14 16:30

新人报到一下。另外向各位大大请教一下：我做的western blot 检测LC3为什么只出现一条条带？用的是NOVUS公司的LC3B抗体，BIO-RAD的电泳仪，湿转恒流100MA，分别试了18MIN,30MIN,40MIN，后面二个都是单条条带；以前用90V，90MIN没条带出现。请各位大大指导

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做LC3的western需要用15%的胶，另外，要用小于60v的电压跑全程，NOVUS的抗体我没有用过，我用的MBL的效果很不错

作者: flower@@ 时间: 2016-4-14 16:31

做LC3的western需要用15%的胶，另外，要用小于60v的电压跑全程，NOVUS的抗体我没有用过，我用的MBL的效果很不错

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你好，你说要用60V的电压跑全程是指电泳的时候吗？那转膜时间呢？我用的是湿转。非常感谢你的指导

作者: xueyouzhang 时间: 2016-4-14 16:31

我想请教大家，如果你们需要knockdown一个autophagy的基因，特异性抑制autophagy，你们会选择哪一个？
beclin-1? ATG5? ATG12? ATG3? ATG7?
感觉没有一个好的

作者: wood533 时间: 2016-4-14 16:31

做LC3的western需要用15%的胶，另外，要用小于60v的电压跑全程，NOVUS的抗体我没有用过，我用的MBL的效果很不错

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12% 的胶一样可以的

作者: 吉吉0120 时间: 2016-4-14 16:32

请教各位师兄，我打算毕业论文做自噬相关基因ATG16L1和IRGM与克罗恩病的相关性，我需要从哪些方面着手，有经验的大哥大姐些给点意见，谢谢了，小弟感激不尽

作者: dodoit 时间: 2016-4-14 16:32

想在Sigma订rapamycin，结果居然受限制了。各位同胞，还有哪儿的药比较可靠吗？

作者: lyxsqs 时间: 2016-4-14 16:32

想请问各位大侠，有没有使用氯喹做自噬抑制剂时的浓度是多少？大约多长时间观察结果更好？万分感谢了

作者: shenkunjie 时间: 2016-4-14 16:33

请教：gfp-lc3融合怎么做，是不是比较麻烦，有没有直接做好的抗体卖的

作者: standup 时间: 2016-4-14 16:33

各位大侠：最近做中药诱导胃癌SGC7901细胞产生的自噬课题，MTT的步骤已经完成，但下面做Western Blot不会了，最主要的是不知道买什么抗体了，自噬的上、下游通路的蛋白最主要的是哪个？根据这些蛋白应该买什么抗体啊？哎——真没了头绪，请各位大侠帮帮忙哈!谢谢，再次深表感谢...

作者: 龙小好汉 时间: 2016-4-14 16:34

准备做这个方面的内容，感觉没有多少头绪啊，研究神经细胞的用什么细胞多呢？autophagy抗体的基本上是兔的，是差不多的吗？

作者: #甜# 时间: 2016-4-14 16:34

弱弱地问各位前辈一个问题，搜LC3的抗体和引物的时候出现LC3A、LC3B、LC3C，用途倒是差不多，请问有什么区别吗？买哪一种比较好?

作者: popo520 时间: 2016-4-14 16:34

大家有没有做内皮细胞自噬的?在用药物刺激之前要使细胞同步化，一般是饥饿24小时，但是饥饿本身又可引起自噬，做细胞自噬时要怎样使细胞同步化呢？请大家指教。。。

作者: any333 时间: 2016-4-14 16:36

版主及各位兄弟姐妹：大家好，有谁有biofish发布的关于Autophagy的一张详细的彩图(好像是2007.2那期)的原图及文章啊？

作者: wanglaoshi 时间: 2016-4-14 16:37

请教各位了，我想要做MDC染色用荧光显微镜观察自噬体，可是不知道这个染色液怎么配制？

作者: lagua123 时间: 2016-4-14 16:38

免疫组化就能检测，但是检测的临床意义不大，科研还是有价值的。国内已经有人做过宫颈癌细胞的autophagy的检测。检测Autopahgy的方法有3种。第一种是电镜的检测，比较贵而且繁琐，但是是检测的金标。第二种是LC3的检测，用pcr和WB都科可以。第三种是同位素标记的长周期蛋白降解的检测。还有一种是用MDC检测，特异性不好。这是我现在所了解的，用的比较多的是电镜检测和LC3的检测。希望对您能有所帮助。俺也是接触过这个领域，略知一二。不足之处，欢迎大家批评指正。

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大侠好，请教，我要在体外实验中检测某蛋白对自噬的调节作用，上调或下调？
①用电镜、WB测LC3-IIB、吖啶橙染色做FACS三种方法够不够？
②后两种方法都要加溶酶体蛋白酶抑制剂吗？
十分感谢！

作者: 土坷垃 时间: 2016-4-14 16:38

请教各位达人，自噬相关的BECLIN 1和LC3的抗体用哪家的好，价格大概是多少？

作者: owanaka 时间: 2016-4-14 16:38

大侠好，请教，我要在体外实验中检测某蛋白对自噬的调节作用，上调或下调？
①用电镜、WB测LC3-IIB、吖啶橙染色做FACS三种方法够不够？
②后两种方法都要加溶酶体蛋白酶抑制剂吗？
十分感谢！
......

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够了，其实电镜和WB就够了，吖啶橙染色不是很特异（MDC染色也不是很特异），如果WB不行，有FACS或者免疫荧光也行，WB和免疫荧光和流式都要用到LC3抗体标记。

作者: niangao1980 时间: 2016-4-14 16:39

各位大虾们我也想问关于研究自噬同步化的问题，体外实验是否要进行同步化，如何操作？做LC3的WB时应何时加溶酶体抑制剂（E－64d和pepstatin A）? 是不是同步化后先加溶酶体抑制剂，过几个小时再加干预的东东呢？还有有的文献上说E－64d和pepstatin A各加10μM，而有的文献说各加10μg/ml，到底是用哪种浓度呢？

作者: 9妖9 时间: 2016-4-14 16:40

受用了，谢谢楼主！我做的就是自噬和肿瘤！关于那个共定位的不太明白！还有就是自噬的阳性对照药是雷帕霉素吗？

作者: milkdog 时间: 2016-4-14 16:43

我们用MBL的LC3抗体，60V跑的15%胶，以前能做出两条带来，最近忽然就不行了，只有一条带，几个人试了好几次，也不知道什么原因。

作者: any333 时间: 2016-4-14 16:44

我想请教大家，如果你们需要knockdown一个autophagy的基因，特异性抑制autophagy，你们会选择哪一个？
beclin-1? ATG5? ATG12? ATG3? ATG7?
感觉没有一个好的
......

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在我的知识层面上，一般使用Atg5的敲除比较常用，用来表征大自噬的下降。

作者: greenbee 时间: 2016-4-14 16:44

小弟刚刚最近开始做aotophagy，想请教各位大侠一下：
做western的时候需要的蛋白量大约多少细胞（巨噬细胞）能提取出来呀？
谢谢！

作者: 131415 时间: 2016-4-14 16:45

QUOTE:

原帖由 greenbee 于 2016-4-14 16:44 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

小弟刚刚最近开始做aotophagy，想请教各位大侠一下：
做western的时候需要的蛋白量大约多少细胞（巨噬细胞）能提取出来呀？
谢谢！

我一般采用：5*10^5细胞，80ul蛋白裂解液，上样20ul。

作者: greenbee 时间: 2016-4-14 16:45

QUOTE:

原帖由 131415 于 2016-4-14 16:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我一般采用：5*10^5细胞，80ul蛋白裂解液，上样20ul。

非常感谢！还有一个问题，直接把细胞裂解提取总蛋白上样就行吗？

作者: 131415 时间: 2016-4-14 16:46

QUOTE:

原帖由 greenbee 于 2016-4-14 16:45 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

非常感谢！还有一个问题，直接把细胞裂解提取总蛋白上样就行吗？

不客气，是的。

作者: vvmmoy 时间: 2016-4-14 16:47

准备做ahtophagy,把前面的帖子一口气看完，受益匪浅。谢谢了！

作者: vvmmoy 时间: 2016-4-14 16:48

上图~~~~~~~~~~~

图片附件: 60289054.snap.jpg (2016-4-14 16:48, 155.45 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43598

作者: memory 时间: 2016-4-14 16:50

各位大侠，小妹是新手，我想检测我的药物能不能抑制过度的自噬，从而保护自噬造成的死亡，这想法可行嘛？还有要是行，我要用WB检测LC3B，是不是各组都要加氯喹抑制其降解呢？

作者: xyw5 时间: 2016-4-14 16:50

感兴趣，想问大家有没有用CQ的，订的哪家的，试问一下，我们临床上作为抗疟药使用的氯喹能否替代从试剂公司订购的CQ呀。

作者: yes4 时间: 2016-4-14 16:51

大家好！请问一下低浓度血清培养肝癌细胞可以造成细胞自噬和内质网应激状态吗?如果可以，有没有办法保持相对稳定的低浓度血清培养液状态，避免不同浓度对实验的影响！小弟刚做实验，了解甚少，请各路大侠指教！谢谢！！！

作者: 9900 时间: 2016-4-14 16:51

楼主神明，给大家提供了这么好的平台学习autophay.
gfp-lc3质粒，请问哪家公司有卖的？或者请好心的战友转让一些。

作者: bongte 时间: 2016-4-14 16:52

大家好！
问一个非常基础的问题，希望大家不吝赐教，万分感谢！！
GFP-LC3是MAP1LC3A还是MAP1LC3B呢，多谢大家了！！
还有LC3-I和GFP-LC3的LC3是一个东西么，再次感谢！

作者: owanaka 时间: 2016-4-14 16:53

我做自噬有一段时间了，前段时间做了蛋白p62，应该在80KD左右的条带，但是在130KD以上还有一个条带，每次都很清楚，不知道是神马？p62有什么特定结合的蛋白么？我现在知道p62是泛素化途径里的，标记蛋白降解的，但是为什么每次都是在固定的位置多出一条WB的条带啊。难道是传说中的二聚体？求解。。。

作者: owanaka 时间: 2016-4-14 16:53

还有就是那个公司的LC3抗体不错啊？我以前用的ABcam公司的，一段时间以后就不行了，很悲催啊！

作者: 8princess8 时间: 2016-4-14 16:55

请教楼主一个问题，LC3-II在WB定量分析时应该分析LC3-II/actin 还是LC3-II/LC3I？08年Autophagy 上那篇guideline上提了一句有文章建议用LC3-II/actin，现在有共识吗？

作者: 45778 时间: 2016-4-14 16:55

各位老师能否指点本人看一张电镜图片呢？红色箭头所示（A,B,C,D）是否是自噬泡呢？万分感激

图片附件: 28570241.snap.jpg (2016-4-14 16:56, 77.56 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43600

作者: yhn 时间: 2016-4-14 16:56

QUOTE:

原帖由 45778 于 2016-4-14 16:55 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
各位老师能否指点本人看一张电镜图片呢？红色箭头所示（A,B,C,D）是否是自噬泡呢？万分感激

要看你这是什么细胞，如果是巨噬细胞或者其他细胞免疫的细胞类型，就不好说了，如果不是，A，C和D应该都是自噬囊泡。个人观点，供参考

作者: 45778 时间: 2016-4-14 16:56

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原帖由 yhn 于 2016-4-14 16:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

要看你这是什么细胞，如果是巨噬细胞或者其他细胞免疫的细胞类型，就不好说了，如果不是，A，C和D应该都是自噬囊泡。个人观点，供参考

谢谢您这是肺癌细胞A549，您可知道空泡（B）是什么东西?

作者: yhn 时间: 2016-4-14 16:57

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原帖由 45778 于 2016-4-14 16:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

谢谢您这是肺癌细胞A549，您可知道空泡（B）是什么东西?

我也拿不准，但C和D肯定是自噬体，建议你拿去找搞超微病理的老师看一下

作者: jingling845 时间: 2016-4-14 16:57

有没有与风湿病相关的内容？介绍些此类文献

作者: jingling845 时间: 2016-4-14 16:58

12% 的胶一样可以的

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那您的电泳条件是什么样的？

作者: jingling845 时间: 2016-4-14 16:58

我使用过NOVUS的抗体，感觉还不错，也使用过CST的抗体，效果不行，也是没做过来，看说明书，好像不同细胞系有不同的差别，但是LC3好像是进化保守的，不知道为什么会有这么大的差异。

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我们也用的是NOVUS，但是没有做出来，能把您电泳和转膜的条件说一下，虚心请教

作者: 9900 时间: 2016-4-14 16:59

CELL:新研究揭示自噬与肿瘤发生之间的关系
来自于：生物通 2011-10-08 有 334次阅读分享 (0) 编辑:陈蒙
文献标题：Beclin1 Controls the Levels of p53 by Regulating the Deubiquitination Activity of USP10 and USP13
文献出处：Cell. 2011 Sep 30
期刊影响因子：31.152
PMID:21962518
近日来自中国科学院上海有机化学研究所、美国哈佛大学医学院、北卡罗来纳大学教堂山分校的研究人员通过系列实验，揭示了自噬相关蛋白Beclin 1对p53蛋白水平的调控作用和相关分子机制，为进一步深入了解自噬与肿瘤发生之间的关系提供了重要信息。这一研究成果在线发表在9月30日的《细胞》（Cell）杂志上。
来自美国哈佛大学医学院的袁钧英教授和中国科学院上海有机化学研究所马大为研究员为这篇文章的共同通讯作者。袁钧英教授是著名的华人科学家，与施一公，饶毅等齐名。她一直从事细胞死亡的相关研究，2005年发现了一种细胞非调亡性的程序性死亡，英文称为necroptosis，是国际权威之一。她还获得了美国卫生研究所（NIH）颁发了的NIH主任先驱奖（Director's Pioneer Award）。2000年起任哈佛大学医学院终生教授，2004年被复旦大学国家重点实验室管理委员会批准为遗传工程国家重点实验室海外客座教授。
细胞自噬（autophagy）是继细胞凋亡（apoptosis）后，生命科学领域的又一热门研究方向。文献数量在近年来呈爆炸式增长，在2006年以前相关文献大约1500条，而从2007年到2010年9月短短三年文献宣布量即到达大约4400条。自噬是由 Ashford 和 Porter 在 1962 年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的，是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体（autophagosome），并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新的一个分解代谢过程。自噬作为一种进化上非常古老和保守的代谢途径，参与调节细胞物质的合成，降解和重新利用之间的代谢平衡，影响参与到生物生命过程的方方面面。
在细胞自噬研究中，与肿瘤的关系是一大重点。目前不少实验室聚焦于细胞水平和分子水平自噬系统变化与肿瘤发生发展相关性的研究。Beclin 1基因是第一个确认的哺乳动物自噬基因，也是第一个确认在自噬的溶酶体降解途径中起肿瘤抑制作用的基因。有研究报道Beclin 1基因缺陷可导致多种恶性肿瘤的发生，然而科学家们对于其分子信号机制并不是很清楚。
在这篇文章中，研究人员利用高通量筛选技术发现了一种有效的自噬小分子抑制剂spautin-1。他们证实spautin-1可通过抑制泛素特异性肽酶USP10 和USP13对Beclin1的去泛素化作用，促使Beclin 1和Vps34复合物降解，从而抑制细胞发生自噬。随后在更深入的USP10 、USP13与Beclin1的相互作用分子机制研究中，研究人员惊奇地发现它们之间并非仅存在USP10 和USP13对Beclin1的去泛素化作用，Beclin1亦可转而影响USP10 和USP13的去泛素化活性，从而对p53蛋白水平进行调控。
新研究不仅为我们提供了一个开发抗癌药物的有潜力的先导化合物，同时揭示了联系肿瘤抑制因子p53 和自噬相关基因Beclin1的一条重要的分子信号通路，为进一步深入了解自噬与肿瘤发生之间的关系提供了重要信息。

作者: 9900 时间: 2016-4-14 16:59

来源：上海有机化学研究所 2011-10-13
人体自身的免疫系统是对抗各种疾病的根本所在，药物只是起到辅助作用。人体有两类免疫系统：天然免疫和获得性免疫。获得性免疫发现得较早，例如“人痘”、疫苗，都是为这套系统“量身订做”的；而天然免疫，直到1998年后才真正开始被人们逐渐认识。科技不断进步，人们对天然免疫系统的研究越来越深入，从而也发现了细胞的自噬能力对肿瘤治疗的重大作用。
9月30日，《细胞》杂志发表了中国科学院上海有机化学研究所和哈佛大学医学院等单位联合完成的研究进展。文章报道了一种具有高选择性和高活性的细胞自吞噬抑制剂的发现，以及利用这个小分子探针，第一次揭示了两种重要的抑癌蛋白p53和Beclin1之间的内在联系的结果。

具有高选择性和高活性的细胞自吞噬制剂的发现
细胞自吞噬是细胞依靠溶酶体降解胞内物质的统称。细胞处于饥饿时通过自吞噬降解蛋白质和细胞器，获得维持生存所必需的氨基酸、脂肪酸和核酸等营养物质。细胞自吞噬还负责细胞的自我净化，通过降解和重复利用细胞内老旧蛋白和细胞器，维持细胞内环境稳定和代谢平衡。细胞自吞噬在生物体生长发育、细胞分化及对环境应激的应答方面极为关键，在防治某些疾病如肿瘤、神经退行性疾病以及对抵抗病原微生物的感染和延缓衰老、延长寿命等方面都发挥重要作用。因此，研究其作用机制不仅可以进一步了解生命的奥秘，同时也为一些疾病的治疗提供新的思路。能够特异性地调控自吞噬过程小分子是细胞自吞噬机制研究中非常重要的工具。目前，高效、特异、低毒的细胞自吞噬抑制剂还很缺乏，因此发展理想的细胞自吞噬抑制剂十分重要。
上海有机所马大为课题组与哈佛大学医学院教授、上海有机所兼职研究员袁钧瑛的课题组合作，通过筛选和进一步的结构优化，发现了一种高效并具有高选择性的细胞自吞噬小分子抑制剂，命名为Spautin-1。科研人员发现，该小分子通过对两个去泛素酶——USP10和USP13选择性抑制，促进Beclin1蛋白泛素化水平增高，进而引起III型磷脂酰肌醇三磷酸激酶复合物的降解。III型磷脂酰肌醇三磷酸激酶复合物Vps34/Beclin1是细胞自吞噬信号通路中重要的调控元件。该复合物主要负责催化磷脂酰肌醇转化为3-磷酸磷脂酰肌醇。其中，Vps34是一种典型的III型磷脂酰肌醇三磷酸激酶。Beclin1作为一个重要的抑癌基因，在人类乳腺癌，卵巢癌和前列腺肿瘤等多种癌症中出现变异或者基因单拷贝缺失。泛素-蛋白酶体系是细胞内一种重要的蛋白降解途径，去泛素酶通过控制蛋白的泛素化水平，调节蛋白通过蛋白酶途径的降解。有趣的是，他们发现Beclin1也调控这两个去泛素酶的稳定性。因为USP10同时也是p53蛋白的去泛素酶，所以III型磷脂酰肌醇三磷酸激酶复合物对去泛素酶的影响也调控着p53蛋白的水平。
这些结果不仅为细胞自吞噬研究提供了重要的研究工具，也揭示了两种重要的抑癌蛋白p53和Beclin1之间的不为人知的内在联系，为人类发展新的癌症治疗药物提供了重要信息。作为“化学生物学”这个新兴的交叉学科的一个成功例子，该项工作将会促进更多的生物学家和化学家从事该交叉科学领域的研究。
该工作得到了中国科学院创新团队国际合作伙伴计划项目、国家自然科学基金委员会重大国际合作项目以及重大研究计划项目的支持。
延伸报道：台“中研院”发现:致命疾病与细胞自噬作用有关
据“中央社”报道，肿瘤、感染与免疫、心血管疾病等致命疾病，都与“细胞自噬”作用有关。台湾“中研院”22日发表研究成果，找出细胞自噬体形成分子机转，将有助日后治疗细胞自噬失调相关疾病药物开发。 (责任编辑：Alina)

作者: 9900 时间: 2016-4-14 17:01

台“中研院”生物化学研究团队最近找出细胞自噬体形成分子机转，发现一种名为“肌凝蛋白-II”的分子蛋白扮演关键角色。“中研院”表示，此新发现将有助日后治疗细胞自噬失调相关疾病的药物开发。
此研究由生物化学研究所助理研究员陈光超及博士生唐弘文所做，成果已在16日发表于国际重要学术期刊《欧洲分子生物学研究期刊》(EMBO Journal)；这项研究结果也被2月份的“自然分子细胞生物学评论”(Nature Reviews Molecular Cell Biology)选为重点报道。
(责任编辑：Alina)

作者: 9900 时间: 2016-4-14 17:02

细胞自噬作用是真核细胞中一种高度保守的降解过程。在这一过程中，细胞质中的内含物包括蛋白聚合体以及组织、器官等会被一个双层膜结构的囊泡包裹，这个囊泡叫做自噬小体，自噬小体形成后即被运送到液泡或溶酶体中被降解，其中的物质被循环利用。这一过程可以协助细胞在各种压力胁迫状态下得到缓解。
2010年6月11日，北京生命科学研究所张宏实验室在Cell杂志上以Featured Article形式发表题为“C. elegans screen identifies autophagy genes specific to multicellular organisms.”的文章。
对于细胞自噬作用分子机制的了解几乎都来源于对酵母的研究。但是我们对于真核高等生物中特异的重要自噬组分却知之甚少。本文中，我们利用线虫作为模式生物进行遗传筛选，得到了4个多细胞动物特异的自噬基因，分别命名为epg-2, -3, -4, -5 (ectopic PGL granules)。epg-2编码线虫特异的蛋白，epg-3, -4, -5编码的蛋白在哺乳动物中很保守，但在酵母中却没有。遗传分析证明这四个基因分别作用于自噬作用的不同步骤。 EPG-2调控PGL颗粒被自噬小体的特异识别和运输，而哺乳动物中的同源基因EPG-3/VMP1, EPG-4/EI24, EPG-5/mEPG5也被证实参与饥饿诱导的自噬作用。VMP1是通过控制Ω小体的形成时间来调控自噬小体的形成。EI24 和 mEPG5 是形成可降解的自噬-溶酶小体所必需的。这项研究为让我们对高等生物中自噬机制有了进一步了解，自噬小体的形成需要经过诱导，延伸以及成熟的过程。我们建立了线虫这一多细胞生物的遗传研究模型，来分析自噬的通路。本文的研究提供了一个遗传学研究的平台，帮助我们理解和研究在哺乳动物细胞中基础水平的自噬作用以及选择性自噬通路。同期Cell杂志专门为该文发表了一篇题为“Autophagy shows its animal side.”的评述文章。
北京生命科学研究所博士生田烨，技术员李志鹏，清华大学的胡晚秋和NIBS博士生任海燕为该文章共同第一作者，论文的其他作者有田娥，赵玉，路群，黄鑫欣，杨培国，李昕，王晓晨博士，匈牙利的Attila L. Kovács博士。清华大学的俞立博士和北京生命科学研究所的张宏博士为本文的共同通讯作者，项研究由科技部863项目资助，在北京生命科学研究所完成。
Cell DOI:10.1016/j.cell.2010.04.034
C. elegans Screen Identifies Autophagy Genes Specific to Multicellular OrganismsYe Tian, Zhipeng Li, Wanqiu Hu, Haiyan Ren, E. Tian, Yu Zhao, Qun Lu, Xinxin Huang, Peiguo Yang, Xin Li, Xiaochen Wang, Attila L. Kovács, Li Yu, Hong Zhang
The molecular understanding of autophagy has originated almost exclusively from yeast genetic studies. Little is known about essential autophagy components specific to higher eukaryotes. Here we perform genetic screens in C. elegans and identify four metazoan-specific autophagy genes, named epg-2, -3, -4, and -5. Genetic analysis reveals that epg-2, -3, -4, and -5 define discrete genetic steps of the autophagy pathway. epg-2 encodes a coiled-coil protein that functions in specific autophagic cargo recognition. Mammalian homologs of EPG-3/VMP1, EPG-4/EI24, and EPG-5/mEPG5 are essential for starvation-induced autophagy. VMP1 regulates autophagosome formation by controlling the duration of omegasomes. EI24 and mEPG5 are required for formation of degradative autolysosomes. This study establishes C. elegans as a multicellular genetic model to delineate the autophagy pathway and provides mechanistic insights into the metazoan-specific autophagic process.

作者: xueyouzhang 时间: 2016-4-14 17:03

请问现在还有没有人做肿瘤细胞自噬性死亡的课题？

作者: xueyouzhang 时间: 2016-4-14 17:03

谢谢您这是肺癌细胞A549，您可知道空泡（B）是什么东西?

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脂滴

作者: INK 时间: 2016-4-14 17:03

B图左右两侧的应该都是自噬溶酶体

作者: 嗅嗅 时间: 2016-4-14 17:04

自噬的研究方法：
正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：
（一）自噬诱导剂
1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
3）Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
5）Rapamycin：mTOR抑制剂
6）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
（二）自噬抑制剂
1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂
2）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）
除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。
细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：
1）观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV）
2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成：
由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。
3）利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成：
自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。
（Note：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）
4）检测长寿蛋白的批量降解：非特异
5）MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。
6）CellTrackerTM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。
在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：
Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。
LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。
MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。
Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。
Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔
【Note：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS处理】
自噬与细胞死亡经常需一起考虑，下面介绍一些检测细胞死亡的方法：
（1）△ψm dissipation（线粒体跨膜电位的消失）：TMRM发红色荧光，DiOC6（3）发绿色荧光。
（2）Phosphatidylserine Externalization（磷脂酰丝氨酸外翻）：Annexin V-FITC（绿色）染细胞膜，（3）检测线粒体产生的ROS：无荧光的HE（hydroethidine，氢化乙啶）可被ROS氧化为EthBr（ethidium bromide，溴乙啡啶），发红色荧光。NAO（nonyl acridine orange，烷化吖啶橙，可发荧光）能与非氧化的cardiolipin（心磷脂，可被ROS氧化）反应而失去荧光。
（4）线粒体IMS蛋白的释放：AIF，细胞色素c，分别用荧光二抗染色。
（5）Capase 3a 染色：用荧光二抗染色，胞浆弥散分布。
（6）细胞膜完整性检测：DAPI（蓝色）、Hoechst 33342或PI（红色）染核。胞膜完整的细胞（活细胞和早中期凋亡细胞）排斥，可联用annexin V。
【如何用实验区分Cell death by autophagy和Cell death with autophagy】
第一步：利用上述方法证实细胞死亡
第二步：证实细胞死亡前发生了自噬
第三步：在形态学上区别开“自噬样死亡”与凋亡
第四步：利用遗传学手段（反义RNA干扰Knockdown掉Atg基因或hVps34）或工具药抑制自噬
第五步：细胞存活则为Cell death by autophagy，反之，细胞死亡则为Cell death with autophagy。
参考文献：
Methods for Assessing Autophagy and Autophagic Cell Death.pdf
Cytosolic LC3 Ratio as a Sensitive Index of Macroautophagy in Isolated Rat Hepatocytes and H4-II-E Cells.pdf
（更新中。。。
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我想请教下Earle's 平衡盐溶液需要什么样的才能制造饥饿？里面的成分需要哪些？现在生物公司提供的有很多种样品，不知道如何选择

作者: 00无名指00 时间: 2016-4-14 17:04

我刚入手，请问各位前辈有没有用乳鼠大脑细胞做自噬的啊？

作者: 04906 时间: 2016-4-14 17:05

我以后的课题就这个方向的，正在加紧这方面的学习，非常感谢前辈的总结，对我非常有帮助

作者: xyw5 时间: 2016-4-14 17:05

Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激,请问上述三种诱导剂诱导内质网应激的靶点是什么？

作者: 101010 时间: 2016-4-14 17:06

各位老师，有用免疫荧光检测自噬的吗？我用sigma公司的LC3抗体检测的，但好像染出来不像。。。不知道怎么回事，急死了。

作者: 911 时间: 2016-4-14 17:06

楼主真是个好人啊，资源共享。新手入门，多多指教！
请问下自噬对肿瘤来说是不是利弊共存呢，到底是怎么一种关系呢。。。纠结

作者: 911 时间: 2016-4-14 17:07

对自噬了解很少，看起来有些吃力呢。收藏了先，以后好好看！
一个小问题，请高手不吝赐教啦，我用AnnexinV/PI双染法检测到了凋亡，这有可能是autophagy么？我能不能肯定他就是type I cell death，而不是type II呢？
如果有可能是type II, 有什么可靠又实惠的方法来区分呢，谢谢！
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降低药物作用时间，做个wb 测LC 3 看看就知道了。

作者: PINK 时间: 2016-4-14 17:07

我想用GFP融合蛋白观察自噬，有没有哪位大侠之前做过的，能提点建议，万分感谢！还有，费用大约需要多少啊？

作者: PINK 时间: 2016-4-14 17:07

其实在qq里有看见自噬的群~

作者: yes4 时间: 2016-4-14 17:09

楼主好。我刚注册丁香网。非常想学习自噬。
看见你推荐的，最详细的介绍：Madame Curie Bioscience Database
cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=eurekah.chapter.24952') 。以及接下来相关的英文文献链接，不知道该如何下载阅读，还请指教。
急需。谢谢。

作者: xueyouzhang 时间: 2016-4-14 17:09

牛人太多了，学习了，有人做过骨骼肌的么？

作者: SO2 时间: 2016-4-14 17:09

向大家请教一下：文献上说：自噬过程的信号调控其中有①I型PI3K/Akt/mTOR信号途径：I 型PI3K 是自噬的负调节分子，抑制自噬的发生。②III 型PI3K 复合物可诱导自噬的发生。自噬抑制剂3- 甲基腺嘌呤3-MA 通过抑制III 型PI3K 的活性抑制自噬形成。自噬特异性抑制剂有：“3-MA是PI3K 的抑制剂，可特异性阻断细胞自噬过程中自噬泡与溶酶体的融合，被广泛用作细胞自噬的抑制剂。另外，Wortmannin、LY294002和巴弗洛霉素A1也可用作细胞自噬的抑制剂。”3-MA 、Wortmannin、LY294002都是PI3K的特异性抑制剂，那它们同样也抑制I型PI3K/Akt/mTOR信号途径呀，结果不是增加了自噬吗？难道是因为它们没有抑制III 型PI3K 复合物作用强，所以最终说它们是细胞的自噬作用的抑制剂？我是个新手，也许问的会有些幼稚，望各位大侠们指点！
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刚接触自噬，我也有相同的疑问，并且我想知道3-MA 、Wortmannin、LY294002作为抑制自噬的自噬调控剂，用哪个比较好一点（肿瘤细胞），3-MA虽然很经典，但是不是比较旧，也有听说它用起来不好溶解什么的，请各位大虾帮忙解答一下，谢谢啦！

作者: viviwang1987 时间: 2016-4-14 17:10

小弟刚刚最近开始做aotophagy，想请教各位大侠一下：
做western的时候需要的蛋白量大约多少细胞（巨噬细胞）能提取出来呀？
谢谢！

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你好，同做巨噬细胞，请问你用的是哪个细胞系？

作者: 555444 时间: 2016-4-14 17:10

自噬的抑制剂有哪些，哪些是刚发现的？

作者: pore 时间: 2016-4-14 17:10

请问纳米盘里的文章怎么下载？谢谢~

作者: 小野花 时间: 2016-4-14 21:17

要看你这是什么细胞，如果是巨噬细胞或者其他细胞免疫的细胞类型，就不好说了，如果不是，A，C和D应该都是自噬囊泡。个人观点，供参考

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请教：如果是巨噬细胞或者其他免疫细胞会是什么情况呢？谢谢！

作者: yapuyapu 时间: 2016-4-14 21:17

不能说对照组LC3 检测有两条带就说明假阳性，有的细胞本身的自噬程度就高，比如Hela细胞的本底自噬程度就高，Western blot实验中应该用实验组和对照组的有LC3-II/LC3-I或LC3-II/Actin的比值变化来说明是否诱导，抑制自噬

作者: baidukk 时间: 2016-4-14 21:19

各位老师我是一名大2的本科生能不能介绍下Atg5-12这个复合物的发现过程是否有相关文献

作者: youreyes 时间: 2016-4-14 21:19

刚接触自噬，我也有相同的疑问，并且我想知道3-MA 、Wortmannin、LY294002作为抑制自噬的自噬调控剂，用哪个比较好一点（肿瘤细胞），3-MA虽然很经典，但是不是比较旧，也有听说它用起来不好溶解什么的，请各位大虾帮忙解答一下，谢谢啦！

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3-MA使用的效果不好,Wortmannin和LY294002的原理差不多，就是试剂的稳定性有差异，LY294002好一点，但是使用效果最明显的是氯喹，简称CQ，也是自噬抑制剂，但是作用原理不一样，抑制自噬体的降解，WB结果表现为LC3-2条带增强

作者: youreyes 时间: 2016-4-14 21:19

请问纳米盘里的文章怎么下载？谢谢~

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下载纳米机器人，然后下载

作者: viviwang1987 时间: 2016-4-14 21:20

请教各位，最近一直在做自噬，我用的是肝癌细胞HepG2，WB的结果发现即使在本底水平，LC3的表达量都很高，而且I和II型都多，不知道是怎么回事，另外我用1%的氧气低氧诱导8h，自噬的变化也不明显。

作者: eve_49 时间: 2016-4-14 21:20

各位好！本人刚开始接触自噬，还在努力学习中，弱弱问一下关于神经元细胞线粒体自噬，与神经元细胞自噬，两者之间有什么关系呢？线粒体是它的一个细胞器，线粒体自噬应不同于神经元自噬，那么以对脑的功能而言哪个发挥的作用更多一些呢？还是不同情况不同对待？？请教各位大虾，谢谢！

作者: vvmmoy 时间: 2016-4-14 21:20

真的很受益啊，谢谢各位前辈~
有没有人可以提供给晚辈一篇关于自噬的同一篇中文与英文文献呢？
谢谢啦~

作者: kulee 时间: 2016-4-14 21:21

QUOTE:

原帖由 vvmmoy 于 2016-4-14 21:20 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

真的很受益啊，谢谢各位前辈~
有没有人可以提供给晚辈一篇关于自噬的同一篇中文与英文文献呢？
谢谢啦~

你自己不会去pubmed查吗？
“同一篇中文与英文文献”？是看不懂英文文献还需要翻译吗？

作者: WHO? 时间: 2016-4-14 21:21

请教各位，3-MA用PBS溶解后需要推滤除菌么？我是做细胞实验的

作者: shanzhapia696 时间: 2016-4-14 21:21

请教各位，LC3-I和II型中应该是I型分子量（16kD）比II型（14kD）大吗？我怎么是做出来一个逐渐增强的条带，但是有一个很浅的条带在下面的小分子区域呢？

作者: glass 时间: 2016-4-14 21:22

请教各位，最近一直在做自噬，我用的是肝癌细胞HepG2，WB的结果发现即使在本底水平，LC3的表达量都很高，而且I和II型都多，不知道是怎么回事，另外我用1%的氧气低氧诱导8h，自噬的变化也不明显。

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低氧8h的时候，cell还是在完全培养基中吗？单纯低氧可能比较温和，不会引起明显的自噬变化。你有没有做过低氧后的WB？有差吗？

作者: PINK 时间: 2016-4-14 21:23

请教大家，加药前用3-MA预处理细胞1小时后，加药的时候还需要加3-MA么？就是预处理完后加药的时候把3-MA去掉还是保留（或者重新加让其和药物一起作用）？

作者: 鹅鹅鹅 时间: 2016-4-14 21:23

3-MA预处理后，去掉和保留的文献都有提到，我也在纠结中，往战友们赐教

作者: chengjie79 时间: 2016-4-14 21:24

有谁知道自噬的动态过程可以循环吗？

作者: october7 时间: 2016-4-14 21:24

可以循环是什么意思？能具体点吗？

作者: hold住 时间: 2016-4-14 21:25

3-MA预处理后，去掉和保留的文献都有提到，我也在纠结中，往战友们赐教

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你用过3-MA么？我已经试验过了，用5mM的3-MA预处理2h，加药保留3-MA，12h后细胞就死光光了，去掉3-MA细胞就没死，看来应该是去掉，正确的使用方法还在验证中，望高手们指教

作者: am10 时间: 2016-4-14 21:25

我用10mM 3-MA预处理后细胞全部死了，可能要去掉，但HBX protein upregulate Beclin1 to induce autophagy 这篇文章中明确说了没有去掉，你是用的什么细胞？？

作者: 红袖添香 时间: 2016-4-14 21:26

我用的是A549细胞，看来不同的细胞对3-MA的反应不同

作者: cbou876 时间: 2016-4-14 21:26

近期开始做自噬的相关研究，比较困惑，读后收获匪浅，谢谢biofish。在做流式细胞数检测MDC的阳性率，确认阳性比率增加，但是不成时间依赖性和剂量依赖性。不知道其可能的原因，以及可以直接不做依赖性，直接加抑制剂做Western blot。

作者: 麦丽素1986 时间: 2016-4-14 21:27

小弟最近要做自噬阻断实验，奎宁和氯化铵哪个效果好点，还有去哪里买的到啊？求高手帮个忙指点下

作者: baidukk 时间: 2016-4-14 21:28

有没有战友做自噬和神经退行性疾病之间的关系？一起交流下

作者: bring 时间: 2016-4-14 21:29

开始研究自噬啦！各位前辈多多指教啊！请问在石蜡标本中能不能观察到自噬的形态或检测到自噬的相关蛋白？

作者: 65urh 时间: 2016-4-14 21:29

新手学习自噬，请问各位做冰冻切片的免疫荧光染色，哪家公司的LC3-B的抗体好些呢？

作者: 星星点灯 时间: 2016-4-14 21:30

请问可以用免疫组化检测Beclin1和LC3吗？及具体步骤。我用的是外周血单个核细胞，能做细胞涂片的免疫组化吗？

作者: cj_mondy 时间: 2016-4-14 21:30

请问可以用免疫组化检测Beclin1和LC3吗？及具体步骤。我用的是外周血单个核细胞，能做细胞涂片的免疫组化吗？

作者: XYZQ 时间: 2016-4-14 21:31

各位大侠，细胞饥饿的开始阶段LC3-II会下降是什么原因？有人知道吗

作者: 王薇薇安 时间: 2016-4-14 21:31

小于60V跑全程,估计需要四个小时左右吧,在电泳液里浸泡这么长时间,条带都得弥散了吧

作者: #问号# 时间: 2016-4-14 21:31

战友们好：
本人想开始做亚低温对缺血再灌注后大鼠海马细胞线粒体自噬的影响，有同道么？

作者: #问号# 时间: 2016-4-14 21:32

我把问题罗列一下：
1.缺血再灌注和亚低温到底对脑细胞自噬有无影响。
2.如果有影响，最佳的观测时间是什么时候？
3.用什么方法检测自噬，目前我所用的是透射电镜和WB检测beclin和LC3，是否能说明问题？
4.问题的扩展：自噬和凋亡有无联系？也就是I型和II型死亡有无联系。
谢谢。

作者: ffooll 时间: 2016-4-14 21:32

你好，最近做的课题与细胞自噬有关，开始研究这个问题，很多地方都不清楚，我在电镜下观察到类似吞噬小泡的结构，疑问在于胞吞作用（endocytosis）和细胞自噬（autophagy）在投射电镜下观察形态有什么区别？谢谢了

作者: xuuuu 时间: 2016-4-14 21:33

我们实验室经常做LC3，要注意的是转膜时间，转长了就转过头了。动物种属在抗体说明书上

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我最近做自噬的western，老是做不出来，怀疑有可能转过了，用的200mA，90分钟，可是看别人做的都转2小时都没问题，请问你一般转膜是什么条件

作者: xuuuu 时间: 2016-4-14 21:33

我最近做自噬的western，老是做不出来，怀疑有可能转过了，用的200mA，90分钟，可是看别人做的都转2小时都没问题，请问你一般转膜是什么条件

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这好像太久了吧...150mA半个小时

作者: 8s5g 时间: 2016-4-14 21:34

QUOTE:

原帖由 xuuuu 于 2016-4-14 21:33 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我们实验室经常做LC3，要注意的是转膜时间，转长了就转过头了。动物种属在抗体说明书上

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我最近做自噬 ...

试试70min

作者: qumm1985 时间: 2016-4-14 21:34

有没有哪位大侠能够把自己比较成熟的做western测LC3的步骤写下来啊，前面有同志说60v电泳，神呐，15%的胶噢。转膜这个玩意，也是众说纷纭，快的慢的，电压大的小的，真是糊涂啊，我最近做，都是100v电泳1个小时，半干转70mA20min，但是没做出结果来停滞不前，在园子里看了半天帖子，也没有得到要领啊

作者: ssonglikihi 时间: 2016-4-14 21:34

受教了，最近在找自噬和电磁辐射相关的文章，哪位前辈在做相关的研究可以一起交流

作者: iii_ii 时间: 2016-4-14 21:35

我们实验室经常做LC3，要注意的是转膜时间，转长了就转过头了。动物种属在抗体说明书上有写。

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请问你LC3转膜条件能否说一下，我200ma ，2小时转，0.2umPVDF膜，没看见条带。谢谢

作者: one 时间: 2016-4-14 21:35

急急急急急求教：应用电镜观察自噬情况，如何判定自噬活跃，目前有没有标准，例如，多少培视野下可见多少个自噬小体，有没有判定的标准，我现在在搞一篇文章，如何来界定电镜视野中肿瘤组织中，自噬处于活跃状态，具体看到多少个自噬体，可称为活跃

作者: mybioon 时间: 2016-4-14 21:35

电子透视电镜可以定性分析，因为在制备样品中只能切60-70nm的样品，然后观察，一次观察中不能确保样品中的自噬体就能代表整体细胞或组织的自噬体水平，所以要多次切片观察，个人观点可能说的不对，仅供参考

作者: chengjie79 时间: 2016-4-14 21:35

MDC法检测自噬时，采用什么溶解MDC呀，哪位大侠可以指点下

作者: bbc 时间: 2016-4-14 21:36

求助：我想买GFP-LC3，请问哪家的好，货号是多少？谢谢

作者: lagua123 时间: 2016-4-14 21:36

准备做HL-60细胞自噬的电镜，想请教下各位前辈：悬浮生长的细胞怎么做电镜标本？看到的参考方法都是贴壁生长的，二者有什么区别？谢谢啦

作者: 8s5g 时间: 2016-4-14 21:36

求助miRNA和autophagy相关的文献，不胜感激！！！
cuturl('http://www.nature.com/leu/journal/v26/n8/full/leu201265a.html')
cuturl('http://www.nature.com/onc/journal/vaop/ncurrent/full/onc2012167a.html')

作者: pou 时间: 2016-4-14 21:37

各位前辈好，我从头到尾把帖子看了一遍真是受益匪浅，最近我也在做自噬方面的课题，自己看了很多文献，大部分都是研究细胞自噬的，我研究的是大鼠肠组织缺氧自噬，有几个问题想请教各位前辈：
1.自噬活化剂雷帕霉素和自噬抑制剂3-MA诱导和抑制自噬的最佳浓度是多少？
2.给予大鼠相应自噬调控剂后，如果想在最佳时间相内观察到自噬，何时处死大鼠取肠组织比较好？
3.我想测的自噬相关蛋白是LC3II和P62蛋白，大家用的最多的方法是Western blot，能否用免疫组化？两种方法者哪个更简便、效果好？如果用Western blot牵扯怎样将肠组织切块降解提取蛋白的问题，如何操作比较好？
我刚在进行研究的开题阶段，也许提的问题不好，请各位前辈帮忙解答，多谢！

作者: DNA 时间: 2016-4-14 21:37

Rapamycin 和3-MA的浓度不同细胞不一样，你可能自己要摸索一个最佳的浓度，关于autophagy inhibitor 3-MA因不是特异的所以使用的时候可能要大剂量，最近有个spautin-1的药（不知道有没有写错）抑制效率比3-MA，可以尝试下

作者: WHO? 时间: 2016-4-14 21:37

最近做LC3的western，用的novus NB-2220和sigma L7534的抗体用的12%的胶 0.2的NC膜，就很模糊的一条带，而且背景一直很高，求高手指点。。。。急

作者: mybioon 时间: 2016-4-14 21:38

我也将加入自噬的行列，在这看到了很多有用的东东，谢谢大家分享，还希望多指点

作者: idea2011 时间: 2016-4-14 21:38

请问各位做自噬的前辈，质子泵抑制剂作为工具药阻断自噬体与溶酶体融合的具体机制是什么？是通过PI3K/mTOR途径，还是仅仅改变溶酶体内pH值就可以起到干扰融合的效果？谢谢！

作者: 大海啊故乡 时间: 2016-4-14 21:38

自噬抑制剂的单独应用一般情况下都会导致肿瘤细胞的凋亡，所以，个人觉得通过药物抑制自噬来评价自噬对肿瘤细胞凋亡的影响，这种方法不慎恰当

作者: yayya 时间: 2016-4-14 21:39

新人报到一下。另外向各位大大请教一下：我做的western blot 检测LC3为什么只出现一条条带？用的是NOVUS公司的LC3B抗体，BIO-RAD的电泳仪，湿转恒流100MA，分别试了18MIN,30MIN,40MIN，后面二个都是单条条带；以前用90V，90MIN没条带出现。请各位大大指导

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我做的是老鼠的组织样本，湿转横流， 60分钟。抗体是1：1000稀释过夜的

作者: yayya 时间: 2016-4-14 21:39

试试70min

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我做自噬也是70min转，可以的，100mA, 但是我们显影是用Odessy的荧光通道，背景总是很高，不知道怎么解决？

作者: yayya 时间: 2016-4-14 21:39

CELL:新研究揭示自噬与肿瘤发生之间的关系
来自于：生物通 2011-10-08 有 334次阅读分享 (0) 编辑:陈蒙
文献标题：Beclin1 Controls the Levels of p53 by Regulating the Deubiquitination Activity of USP10 and USP13
文献出处：Cell. 2011 Sep 30
期刊影响因子：31.152
PMID:21962518
近日来自中国科学院上海有机化学研究所、美国哈佛大学医学院、北卡罗来纳大学教堂山分校的研究人员通过系列实验，揭示了自噬相关蛋白Beclin 1对p53蛋白水平的调控作用和相关分子机制，为进一步深入了解自噬与肿瘤发生之间的关系提供了重要信息。这一研究成果在线发表在9月30日的《细胞》（Cell）杂志上。
来自美国哈佛大学医学院的袁钧英教授和中国科学院上海有机化学研究所马大为研究员为这篇文章的共同通讯作者。袁钧英教授是著名的华人科学家，与施一公，饶毅等齐名。她一直从事细胞死亡的相关研究，2005年发现了一种细胞非调亡性的程序性死亡，英文称为necroptosis，是国际权威之一。她还获得了美国卫生研究所（NIH）颁发了的NIH主任先驱奖（Director's Pioneer Award）。2000年起任哈佛大学医学院终生教授，2004年被复旦大学国家重点实验室管理委员会批准为遗传工程国家重点实验室海外客座教授。
细胞自噬（autophagy）是继细胞凋亡（apoptosis）后，生命科学领域的又一热门研究方向。文献数量在近年来呈爆炸式增长，在2006年以前相关文献大约1500条，而从2007年到2010年9月短短三年文献宣布量即到达大约4400条。自噬是由 Ashford 和 Porter 在 1962 年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的，是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体（autophagosome），并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新的一个分解代谢过程。自噬作为一种进化上非常古老和保守的代谢途径，参与调节细胞物质的合成，降解和重新利用之间的代谢平衡，影响参与到生物生命过程的方方面面。
在细胞自噬研究中，与肿瘤的关系是一大重点。目前不少实验室聚焦于细胞水平和分子水平自噬系统变化与肿瘤发生发展相关性的研究。Beclin 1基因是第一个确认的哺乳动物自噬基因，也是第一个确认在自噬的溶酶体降解途径中起肿瘤抑制作用的基因。有研究报道Beclin 1基因缺陷可导致多种恶性肿瘤的发生，然而科学家们对于其分子信号机制并不是很清楚。
在这篇文章中，研究人员利用高通量筛选技术发现了一种有效的自噬小分子抑制剂spautin-1。他们证实spautin-1可通过抑制泛素特异性肽酶USP10 和USP13对Beclin1的去泛素化作用，促使Beclin 1和Vps34复合物降解，从而抑制细胞发生自噬。随后在更深入的USP10 、USP13与Beclin1的相互作用分子机制研究中，研究人员惊奇地发现它们之间并非仅存在USP10 和USP13对Beclin1的去泛素化作用，Beclin1亦可转而影响USP10 和USP13的去泛素化活性，从而对p53蛋白水平进行调控。
新研究不仅为我们提供了一个开发抗癌药物的有潜力的先导化合物，同时揭示了联系肿瘤抑制因子p53 和自噬相关基因Beclin1的一条重要的分子信号通路，为进一步深入了解自噬与肿瘤发生之间的关系提供了重要信息。
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虽然现在才看到，不过还是要谢谢这么好的资源提供

作者: yayya 时间: 2016-4-14 21:40

3-MA用PBS溶解，储存浓度为100 mmol/L，其冷却时有沉淀，使用
前加热到50度左右1分钟使之溶解

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我最近做MDC 发现也是非常难溶，请问有什么好建议吗？

作者: 987789 时间: 2016-4-14 21:40

本人也在做自噬，有以下发现：自噬标志性相关分子LC3的western条带与细胞种类有关系，原代神经元跑出的条带LC3Ⅰ杂带很多，LC3Ⅱ也很难跑出来！而类神经元细胞系或者肿瘤细胞则跑出来很漂亮!离体细胞比在体细胞好跑得多！

作者: panda王 时间: 2016-4-14 21:41

我最近才做细胞自噬机制方面的东西，请问大侠某种药物促进细胞自噬已经证明其存在，请问有什么方法研究其机制。

作者: 04906 时间: 2016-4-14 21:41

非常好！我也推荐个好网站，上面有很多TEM的好照片
cuturl('http://www.uni-mainz.de/FB/Medizin/Anatomie/workshop/EM/EMpLysoE.html')

作者: shanzhapia696 时间: 2016-4-14 21:42

我也做的自噬，买的CST的LC3B抗体，不好用啊

作者: shanzhapia696 时间: 2016-4-14 21:42

有哪位大侠知道人外周血单个核细胞可以进行免疫荧光的的实验吗，谢谢了

作者: utt0989 时间: 2016-4-14 21:43

这张图应该是目前关于Autophagy 最好的介绍了。

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这张图总结得相当详细啊。请问战友有没有高清版本的或者这张图的原下载地址？

作者: shanzhapia696 时间: 2016-4-14 21:44

最近做LC3的western，用的novus NB-2220和sigma L7534的抗体用的12%的胶 0.2的NC膜，就很模糊的一条带，而且背景一直很高，求高手指点。。。。急

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你用15的胶试试呢，我用15%的，SIGMA l7534，一直都出。背景高的话，你是不是二抗浓度高或是时间长了？

作者: shanzhapia696 时间: 2016-4-14 21:44

我也做的自噬，买的CST的LC3B抗体，不好用啊

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SIGMA L7543好用，你可以试试，有小包装25微的

作者: flower@@ 时间: 2016-4-14 21:44

SIGMA L7543好用，你可以试试，有小包装25微的

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多谢指点，这个抗体25微升需要多少钱啊

作者: qumm1985 时间: 2016-4-14 21:45

刚刚看到这个帖子！尽管有点晚（晚了3年好像），不过终究是看到了，非常实用，相信对于在国内辛辛苦苦研究自噬的人一定会有帮助的，仔细学习中！中间有的页没看全，不知道楼主有没有建立自噬的群，知道的战友告知一下群号啊，多谢了！

作者: rfv 时间: 2016-4-14 21:46

大师们，我做LC3的western，一直没做出条带，大家能说一下你们的电泳和转膜的条件吗？或者有其他注意的地方？万分感谢

作者: 雪花子 时间: 2016-4-14 21:46

cuturl('http://www.keygentec.com.cn/details/180172.html')，这个挺清晰的

作者: baidukk 时间: 2016-4-14 21:47

谢谢各位的分享，想问一下，有没有专门做线粒体自噬的，或者有没有跑线粒体自噬相关蛋白的，Bnip3，怎么跑不出来呢，提的是全蛋白，急求帮助呀，谢谢。。。

作者: WHO? 时间: 2016-4-14 21:47

好帖子，有做神经元自嗜的想法，可是不知道可行度怎样，从0开始，挑战一下。

作者: 831226 时间: 2016-4-14 21:48

各位大侠，小妹是新手，我想检测我的药物能不能抑制过度的自噬，从而保护自噬造成的死亡，这想法可行嘛？还有要是行，我要用WB检测LC3B，是不是各组都要加氯喹抑制其降解呢？

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你好，我也是一名新手，我想请问一下您，你做的自噬加了氯喹的吗？加的剂量如何？加了之后多久观察？谢谢，不胜感激！

作者: one 时间: 2016-4-14 21:49

我用10mM 3-MA预处理后细胞全部死了，可能要去掉，但HBX protein upregulate Beclin1 to induce autophagy 这篇文章中明确说了没有去掉，你是用的什么细胞？？

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我最近也再用3MA，感觉3MA作用时间太长就毒副作用太大，细胞存活率下降。但是我western检测LC3，发现3MA（5mM,10mM）给药大概3h，自噬抑制作用不明显。很困惑。另外，做自噬的时候是用什么血清浓度的培养基呢？

作者: bring 时间: 2016-4-14 21:51

谢谢回答。我是说的LC3的western检测之阳性对照，因为我买的抗体的specification提供的阳性对照组就是CQ组表达显著增强。阁下提醒得好，LC3增加当然不一定是自噬活性增加，再次感谢！
继续请教阁下和各位大虾：
1.如果想确认是否自噬活性增强，哪些分子指标比较靠谱？又怎样检测比较准确？LC3的western检测结果与那些指标组合起来分析可以较好地判断自噬活性变化？
2.都说电镜是金标准，我觉得除了找到autophagosome有定性作用之外，其定量其实是很不靠谱的，有文章说是要数autophagy的数目，我实际干过这个活，觉得尤其不靠谱。因为标本处理给你的超薄切片sample在你的总体中是个什么地位完全不清楚，你再去随机计数多少个autophagosomes,即使数得清也没意义，何况根本不容易数清，因为只有典型的早中期autophagosome可以被辨认出来，很早期和晚期的autophagosome其实是认不出来的。更何况，不同的细胞出现自噬的时间点不一样，怎么好比较呢？
3.如果确定了分子标记，用western检测好还是流式检测比较好？各有什么优缺点？
问题很初级，承蒙各位见笑了，望不吝赐教！谢谢！
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这个2是正解，如果使用电镜结果，只能是定性的显示，排除诸如免疫组化或细胞形态观察的假阳性。并且对电镜操作要求高，对电镜照片的解读也需要经验。

作者: INK 时间: 2016-4-14 21:51

感谢博主和大侠们的精心留言，学习到不少知识，受益匪浅，请问各位大侠有没有骨骼肌方面的自噬好文章可以推荐的呢？

作者: wood533 时间: 2016-4-14 21:51

感觉大家都是在做离体的细胞，也没有做在体研究中的，我准备用3-MA腹腔注射大鼠一个月，看看神经的自噬的变化，大家觉得可行吗，望大家积极回复啊

作者: summerxx 时间: 2016-4-14 21:52

我是做自噬的新手。老板让开题，可是我现在都不知道该怎么做，总觉得我想的人家都做过了。人家没做的我的实验室条件也没有。师姐师兄有什么想法能点点小妹我吗~~急啊~我都哭死了~自噬研究的好多~~

作者: qqq111 时间: 2016-4-14 21:52

请教用氯喹做自噬抑制剂，是先将细胞和氯喹孵育一段时间，如6h，然后再将氯喹去掉再加其他的药物，还是将氯喹和这个药物在培养基里和细胞一直孵育啊？，谢谢做过的前辈指点啊

作者: 00无名指00 时间: 2016-4-14 21:53

弱弱地问各位前辈一个问题，搜LC3的抗体和引物的时候出现LC3A、LC3B、LC3C，用途倒是差不多，请问有什么区别吗？买哪一种比较好?

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用抗LC3B

作者: 04906 时间: 2016-4-14 21:54

各位同仁，我在研究药物对肝细胞L02的毒性，确定L02细胞发生了凋亡，但我想研究下药物是否对肝细胞产生了自噬，在给药设计上我设计空白组，EBSS饥饿组，给药组，请问我需要设计自噬抑制组（3-MA)吗？

作者: october7 时间: 2016-4-14 21:54

谁能下载autophagy杂志的文章啊？
cuturl('http://www.landesbioscience.com/journals/autophagy/article/24111/?nocache=669585426')

作者: DDD 时间: 2016-4-14 21:55

我做了一个新化合物抗肿瘤作用，MTT结果显示IC50为纳摩尔级别的，但是检测凋亡周期都没作用，我怀疑是不是发生自噬了，把化合物和自噬抑制剂氯喹30微摩尔每升同时加入细胞后，发现MTT结果和没加抑制剂的一样，这个能说明细胞未发生自噬吗，请各位多多指教

作者: yayya 时间: 2016-4-14 21:55

不知道有哪位站友可以提供比较清晰的有关于“自噬发生全过程的信号通路”的解释？这个我一直为之费神，与之纠缠了很久的问题，希望有人可以给与解答~谢谢~

作者: qqq111 时间: 2016-4-14 21:56

请问大家，超标达某基因后LC3-II表达较对照组显著增加，请问有没有类似的参考文献？谢谢

作者: flyxx05 时间: 2016-4-14 21:56

有哪位大神知道autophagy这篇杂志的补充材料一般怎么下载

作者: PCR 时间: 2016-4-14 21:56

最近在做自噬，用WBLC3不出，beclin 1出的也很浅，但是用15%的分离胶，转膜条件300MA，120v,70min，1抗用的CST的LC3A/B,但是LC3一点都没出，beclin 1出的一般，抗体浓度都是1：500，求教师兄师姐，有什么建议么。。。真的好头疼

作者: greenbee 时间: 2016-4-14 21:57

QUOTE:

原帖由 PCR 于 2016-4-14 21:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

最近在做自噬，用WBLC3不出，beclin 1出的也很浅，但是用15%的分离胶，转膜条件300MA，120v,70min，1抗用的CST的LC3A/B,但是LC3一点都没出，beclin 1出的一般，抗体浓度都是1：500，求教师兄师姐，有什么建议么。。。真的好头疼 ...

我也在做这两个指标，LC3B：15%分离胶，湿转30V 70min，或者50V 1h（以前的研究生摸的条件），我试过30V 70min，可以出（但有的会出三个条带，不好解释）
BECN：10%分离胶，湿转50V 2h，条带非常细，抗体是abcam的，1：1000和1：500条带都很细。

作者: pencil菲 时间: 2016-4-14 21:58

求救呀求救，我要买beclin1的抗体，查的是abcam公司，但是他给出的图片分子量都在52，不是应该在60吗？

作者: join 时间: 2016-4-14 21:58

我是做自噬的新手。老板让开题，可是我现在都不知道该怎么做，总觉得我想的人家都做过了。人家没做的我的实验室条件也没有。师姐师兄有什么想法能点点小妹我吗~~急啊~我都哭死了~自噬研究的好多~~

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你老板是什么领域？建议你先读一些自噬相关的综述，在结合你老板的研究领域来设计课题

作者: join 时间: 2016-4-14 21:59

求救呀求救，我要买beclin1的抗体，查的是abcam公司，但是他给出的图片分子量都在52，不是应该在60吗？

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CST的beclin1抗体蛮好用的，确切说beclin1抗体是51.8kDa

作者: u76mp 时间: 2016-4-14 21:59

各位大大，不知道谁用过3-ma和RAPA，网上查和说明书好多也不一样，而且大家加的RAPA都多少浓度，刺激多长时间？？？我加的RAPA15nM，24h。不过貌似自噬不是很明显

作者: 泉水叮咚 时间: 2016-4-14 22:00

各位战友，有没有人用3MA抑制自噬24h出现自噬升高的。我也知道这不太可能，但我做了好几次都是升高的，有人可以解释下吗

作者: 泉水叮咚 时间: 2016-4-14 22:00

自噬的调控机制
1 依赖mTOR(mammalian target of rapamyein)途径的自噬
mTOR作为氨基酸、ATP、生长因子、胰岛素等的感受器，对细胞生长具有重要调节作用，抑制自噬的发生，发挥“门卫(gatekeeper)”作用。mTOR的上下游信号转导途径较为复杂，mrI'oR上游通路：胰岛素、生长因子(胰岛素样生长因子，血小板源性生长因子和表皮生长因子等)合于跨膜胰岛素受体或酪氨酸激酶受体(IR，RTK)后，激活I型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class I PI3K)，使PIP被磷酸化为PIP3，PIP3结合于Akt／PKB和它的活化分子PDK1；mTOR下游通路：mTOR活性抑制时，促进自噬体形成，在酵母中是通过Atgl和Atgl3去磷酸化而促进下游自噬信号，在人类中的机制尚不明了。
2 不依赖mTOR途径的自噬
经典的自噬抑制剂3一甲基腺嘌呤(3-MA)通过抑制Class11IPI3K(hVps30)的活性抑制自噬形成，siRNA导致ClassIllPI3K活性的下降大大减少了细胞中自噬的发生，因为Class I PI3K的产物PI3P是自噬抑制信号，Class111PI3K的产物PIP为激活信号，另外抑癌基因PTEN可以水PI3P，所以它也是一个促自噬因子。此外，Atg6的哺乳动物同源体beclinl和抑癌基因VRAG作为自噬正调控子，抗凋亡因子bcl-2作为自噬负调控子共同参与组成Class 111PI3复合物调控自噬。GTP结合的G蛋白亚基God3是自噬的抑制因子，而GDP结合的God3蛋白则是自噬的活化因子。GAIP(G alpha interacting protein)作为RGS(regulators of G—protein signaling)家族成员之一，通过God3蛋白加速GTP的水解，促进自噬的发生。另外死亡相关蛋白激酶(death．associated protein kinase，DAPK)和DAPK相关蛋白激酶(DAPK．related protein kinase·1，DRP一1)在肿瘤细胞中也可诱导自噬。还有实验发现胰岛素，氨基酸等通过激活p38MAPK(p38a)而抑制自噬，且不依赖于mTOR途径。PKA、casein激酶II、MAP激酶、calcium途径也存在于自噬过程错综复杂的调控网络中，但其机制还不甚清楚。
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小弟刚开始接触自噬，有些不懂，PIP3与PI3P是否为同一蛋白？ ClassIII PI3K的产物PIP与Class I PI3K 的底物PIP是否为同一蛋白，如是同一蛋白，那就是说 Class111 PI3K的产物PIP可以被Class I PI3K磷酸化

作者: 987789 时间: 2016-4-14 22:00

最近有一篇文章要补充细胞自噬试验，用荧光显微镜看细胞自噬，怎么好像看的不明显，看不出来什么样子才是细胞自噬？
想用流式细胞仪检测自噬率，有没有什么要注意的（第一次做）？细胞接种浓度？药物作用时间？MDC浓度及作用时间？MDC染液去除后要不要用PBS清洗？固定剂多聚甲醛的浓度和时间？处理好了直接就可以上机了？流式细胞仪的条件是什么？
一些试验中很具体的东西。时间也比较紧，希望哪位大侠能详细解答一下，万分感谢。

作者: wanglaoshi 时间: 2016-4-15 10:10

各位老大、各位牛人，有做破骨细胞自噬的吗？小弟有事请教~

作者: 8s5g 时间: 2016-4-15 10:11

有人做脊髓损伤的自噬吗？

作者: mogu 时间: 2016-4-15 10:11

自噬都做了这么多年了，大家觉得自噬还有得做吗？做自噬还有前途吗？

作者: any333 时间: 2016-4-15 10:13

自噬跟凋亡相比开始的时间不长吧而且今年的诺贝尔奖外界预测的就是自噬和甲基化虽然最终没有入围但起码说明它的重要性

作者: mamamiya 时间: 2016-4-15 10:16

从第1页一直看完16页，只有两个人问到关于gfp-lc3的获得途径的问题，难道广大战友们都没遇到这个问题吗？我现在也要用gfp-lc3来检测自噬，可是找不到购买途径啊，求大侠们指点一二，或者转给小妹一些，感激不尽啊

作者: one 时间: 2016-4-15 10:18

你好，我在文献里看到，autophagy和autophagic flux，文献里确定了某种物质具有autophagy作用，还要进一步确定它是否具有autophagic flux作用，我想问问autophagy和autophagic flux有什么区别吗？谢谢~

作者: langlang 时间: 2016-4-15 10:19

不知道哪位实验室有RFP-GFP-LC3的质粒哦，求馈赠或购买，万分感谢

作者: langlang 时间: 2016-4-15 10:21

自噬既有利也有害的

作者: 65urh 时间: 2016-4-15 10:21

刚读研究生，对自噬还不太了解，想问一下双重免疫荧光标记肾细胞LC3II，一抗和二抗一般用什么？谢谢了……

作者: wu11998866 时间: 2016-4-15 10:22

无意间发现这个版，真的喜出望外啊，收获真的很大，感谢各位慷慨分享。我最近也在做关于自噬的课题，不知各位前辈能否提供些自噬和脂肪肝有关的资料啊，不胜感激！

作者: kulee 时间: 2016-4-15 10:22

可以只用west blotting检测p62蛋白来说名字是的强弱吗

作者: kulee 时间: 2016-4-15 10:23

可以只检测p62蛋白来证明自噬的强弱吗？

作者: am10 时间: 2016-4-15 10:24

各位前辈你们好，我有一个疑问还请大家解答。
3-MA是PI3K class1和PI3K class3的抑制剂，像PI3K class1是自噬的抑制通路，如果抑制了这个通路是不是会在一定程度上又促进了自噬呢？
另外，如果实验中发现PI3K class1通路下降，自噬水平上升，那么是再选择PI3K的抑制剂作为自噬抑制剂是不是就不太合适了呢，请大家解答，谢谢~~

作者: 3.14 时间: 2016-4-15 10:24

自噬相关基因：Beclin、ATG7、ATG6、mTOR、mRFP-GFP-LC3、MAPK等，我们这里有大量，有需要的可以和我交换，谢谢

作者: queen 时间: 2016-4-15 10:25

受益匪浅！最近也在做大鼠脑组织的自噬wb，15%的胶60V跑完全程，采用半干转30min，用0.22的膜，marker基本都在膜上，但是压片以后一直只有一条带，用的MBL抗LC3，稀释1:1000，有木有哪位大神可以解释下，不胜感激！

作者: zhy平平 时间: 2016-4-15 10:25

An important agenda for futureresearch will involve clarifying the genetic and cell-physiologic conditions thatdictate when and how autophagy enables cancer cells to survive or causes themto die.（Douglas Hanahan, Robert A.Weinberg. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell, 2011, 144: 646-674.）
未来研究的重点之一是，阐明是什么样的遗传和生理条件决定自噬何时以及怎样使得肿瘤细胞生存或死亡。
Critical issues also remain with regardto autophagy in therapeutics and diagnostics. Effective indicators orbiomarkers for autophagy activity are not currently available. Such markers areimportant to determine autophagic activity in the disease setting, particularlywhen monitoring drug effectiveness during autophagy-modulating therapy.Furthermore, the autophagy-modulating drugs currently available are notstrictly specific, and the development of more specific drugs will be required.Likewise, although the upregulation of autophagy could be theoretically beneficialfor eliminating aggregate-prone proteins, damaged mitochondria, andintracellular bacteria, how these selective autophagic pathways can bestimulated is another challenging issue. (Noboru Mizushima, Masaaki Komatsu. Autophagy:Renovation of Cells and Tissues. Cell, 2011, 147, 728-741.)
关于自噬研究的关键问题依然是其在诊断和治疗中的应用。目下尚无有效地反映自噬活性的生物标志物。反映特定疾病中自噬活性的标志物，尤其是在自噬调节治疗中监测药物有效性的标志物，尤为重要。此外，现有的自噬调节治疗并不具有严格的特异性，我们需要开发特异性更高的药物。同样，虽然自噬上调理论上有助于清除易聚集的蛋白（折叠异常的蛋白）、受损线粒体、以及胞内病原体，然而怎样激活这些选择性的自噬通路有待解决。

作者: ns5fan 时间: 2016-4-15 10:25

请问P62在自噬中的地位，研究自噬需要检测这个指标吗?

作者: 8princess8 时间: 2016-4-15 10:27

本人刚刚接触自噬方面的研究，有没有大神介绍几篇关于自噬的综述啊~！！

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我也是新入门的小硕，深感自噬像黑洞一样，越看越觉得复杂~~
Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes 这个是2008年版本的
Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy这个是2012年版本的

作者: 66+77 时间: 2016-4-15 10:30

最近在做LC3-B，求各位指点一下western条件，用的是湿转，抗体是Millipore的。

作者: 2541 时间: 2016-4-15 10:31

我最近也再用3MA，感觉3MA作用时间太长就毒副作用太大，细胞存活率下降。但是我western检测LC3，发现3MA（5mM,10mM）给药大概3h，自噬抑制作用不明显。很困惑。另外，做自噬的时候是用什么血清浓度的培养基呢？

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深有同感，我用的药物处理肿瘤，已经明确LC3B-II的蛋白增高，然后用3mA预处理，可LC3蛋白还是很高啊，根本没法抑制住，困惑中。。。

作者: 2541 时间: 2016-4-15 10:32

不知道哪位实验室有RFP-GFP-LC3的质粒哦，求馈赠或购买，万分感谢

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同求啊，找公司买好贵。

作者: 2541 时间: 2016-4-15 10:33

最近在做LC3-B，求各位指点一下western条件，用的是湿转，抗体是Millipore的。

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我们用的CST的LC3B抗体，配一只可以用好几个月。转膜是250mA，2h。12%的胶足够。80-120v电泳。

作者: XYZQ 时间: 2016-4-15 10:33

想问问大家，转染过长链非编码的细胞（稳转），想做WB看自噬相关蛋白的表达（LC3，Bcl1，Atg7，P62），应该怎么选取时间点，时间点的选取与加条件培养液的时间有关吗

作者: owanaka 时间: 2016-4-15 10:33

顶起来，一口气看完了，真是不错！
想请教下大家用earle’s盐溶液诱导自噬是做多少时间点的呢，我是在小鼠巨噬细胞中研究，谢谢！

作者: xuuuu 时间: 2016-4-15 10:34

楼主非常专业！大赞！
我想问一些问题：
1、Beclin 1在自噬中到底扮演着什么样的角色？它在自噬过程中有哪些具体的作用啊？我们知道beclin 1是一个肿瘤调控因子，主要还参与自噬的调控过程，但大多介绍都是在大自噬，那它在小自噬中是否也参与了呢？
2、阿尔茨海默氏症和帕金森病中分别是什么自噬参与为主呢？
3、大自噬与小自噬最主要的区别是什么？
希望的到各位大神的指导！！！谢谢

作者: mamamiya 时间: 2016-4-15 10:35

关于自噬性细胞死亡（autophagic celldeath, ACD）这一观点，目前仍然存有争议。Beth Levine认为：自噬性细胞死亡的定义本身具有理论缺陷，名不副实。因为这一现象的发现是在电镜下，发现细胞死亡的同时伴有大量的自噬体聚集。因此并不能区别是自噬引起细胞死亡（cell death byautophagy）还是细胞死亡同时伴有自噬（cell death withautophagy）。这只是一个文字游戏，诱导人们认为这一细胞死亡是由自噬引起，其实它仅仅描述了细胞死亡的同时伴有自噬。但是现有的证据也无法否定自噬性细胞死亡这一观点。因此，作者说，如果要引用这一观点，须有足够的数据支持。

作者: eor 时间: 2016-4-15 10:36

从头看到尾，收益匪浅，最近在做自噬的免疫荧光，由于经费的问题，我只是用LC3抗体做细胞免疫荧光，检测内源性LC3A/B的变化情况，出现了和09年一位战友一样的问题，就是免疫荧光显示LC3点状聚集均在核内，胞浆中的荧光呈均匀的弥散状态，这是为什么呢，LC3也是一类蛋白质，不应该也在核糖体及内质网的作用下合成么，怎么会跑到核内呢？

作者: PINK 时间: 2016-4-15 10:36

应该是非特异性的吧！我做组织的IHC染色，也有胞核着色的，但是调整一下显色时间等，就好了。所以我估计是非特异性的着色

作者: 911 时间: 2016-4-15 10:36

自噬抑制剂3-MA用DMSO溶解还是PBS溶解，新手，求指教，不甚感激。

作者: ero11 时间: 2016-4-15 10:37

自噬在心血管方面的作用，自噬与低氧环境的关系?

作者: ququer787 时间: 2016-4-15 10:39

想请教下大家用earle’s盐溶液诱导自噬是做多少时间点的呢？同请教

作者: okhaha 时间: 2016-4-15 10:39

实验小白，求染自噬体的具体流程

作者: #问号# 时间: 2016-4-15 10:40

我准备研究自噬，想问个问题，没有任何处理的癌细胞会发生自噬吗？

作者: owanaka 时间: 2016-4-15 10:40

本人欲做自噬方面的实验，用western blotting检测自噬水平，各位前辈推荐下LC3B哪个厂家口碑好啊。万分感谢。

作者: tears 时间: 2016-4-15 10:40

诱导细胞自噬的条件很多：
1. 饥饿
2. 自噬诱导剂，如雷帕霉素等
3. 化学药物，如某些化疗药
4. 肿瘤环境
等等
细胞出现自噬只是研究的第一步，发现现象。真正开始自噬相关的研究所要牵涉的工作非常多：自噬发生的机制？自噬对于细胞本身是正向作用还是反向作用？自噬的动态变化？自噬与细胞凋亡、坏死的关系.......
一句话，任重而道远

作者: idea2011 时间: 2016-4-15 10:42

请问自噬流增加是不是意味着自噬增加，这篇文章中“The histone H4 lysine 16 acetyltransferase hMOF
regulates the outcome of autophagy，doi:10.1038/nature12313”感觉说的是自噬流增加，自噬减弱呢，有点糊涂，求解释

作者: yhn 时间: 2016-4-15 10:42

我们也在做自噬这方面的，才刚开始，用的方法很基础也就是Western和PCR，只是想观察在某种情况下自噬是上调还是下调，只是一直没搞清楚Lc3-1和Lc3-2的关系，望版主给予指点，万分感谢！

作者: XYZQ 时间: 2016-4-15 10:43

想请教版主几个问题：我们在做H9C2心肌细胞低糖诱导的自噬模型，理论上自噬会在3h的时候表达量达到高峰，为什么我们做的几个时间点3h 6h 12h 24h，自噬随着饥饿时间的增加是呈递增趋势的，包括做了Beclin1也是相同的趋势，这个问题一直困扰着我，希望各位大神能给予我一些启发和帮助，谢谢啦

作者: one 时间: 2016-4-15 10:43

收益匪浅，再次更新细胞自噬指南，仅供参考
Coming soon to a journal near you-The updated guidelines for the use and interpretation of assays for monitoringautophagy.
链接cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25208091')

作者: TAT 时间: 2016-4-15 10:43

自噬抑制剂3-MA用DMSO溶解还是PBS溶解，新手，求指教，不甚感激。

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PBS。母液浓度我用的是166.7 mM。3MA在浓度太高和温度低时不容易溶解。所以要用足够PBS加热才能溶解。

作者: 101010 时间: 2016-4-15 10:44

自噬的抑制
根据自噬形成的过程，自噬的抑制也分为不同的阶段，包括自噬的起始阶段，自噬泡和溶酶体融合阶段，以及溶酶体内的降解阶段。目前常用的一些抑制药物如下：
（1）对自噬体形成的抑制：主要是PI3K通路的抑制剂（如3-MA, Wortmannin，LY294002等），这些药物均可干扰或阻断自噬体形成。3-甲基腺嘌呤（3-Methyladenine, 3-MA）是磷脂酰肌醇3激酶的抑制剂，可特异性阻断Autophagy中自噬体的形成，被广泛用作Autophagy的抑制剂。另外，渥曼青霉素（Wortmannin）、LY294002 也可用作Autophagy的抑制剂。
（2）对自噬体与溶酶体融合的抑制：对自噬体与溶酶体融合过程进行阻断也能起着抑制自噬的作用，这些药物有巴伐洛霉素A1、长春碱、诺考达唑等。巴伐洛霉素A1（Bafilomycin A1）是一种来源于灰色链霉菌的大环内酯类抗生素，分子式C35H58O9，是空泡型H+-ATP酶的特异性抑制剂，具有抗菌、抗真菌、抗肿瘤等作用。当突触小泡经历胞外分泌时，巴伐洛霉素A1可以避免小泡重新酸化。有研究表明，在已发生自噬的肿瘤细胞中加入巴伐洛霉素A1，可使蛋白降解被抑制，自噬体增多而自噬溶酶体数目减少，并且自噬体中的酸性磷酸酶的活性也明显降低，从而证明其阻断了自噬体与溶酶体的融合过程。这种阻断是可逆的，在去除了药物作用后，自噬体仍可以与溶酶体融合形成自噬溶酶体，继续自噬进程。
（3）对溶酶体降解的抑制: 自噬体与溶酶体融合后最终被溶酶体中的水解酶水解，它首先经过囊泡酸化，达到所需的PH值后经多种蛋白酶作用使囊内容物降解，降解产物在细胞内再循环利用。对溶酶体的降解进行抑制，使得被降解的囊泡内容物大量蓄积于溶酶体内，而不能释放出来进入细胞内再循环利用，这也同样起着抑制自噬的作用。因此，蛋白酶抑制剂，如E64d、Pepstatin A等，在抑制溶酶体降解的过程中发挥着自噬抑制剂的作用。E64d和Pepstatin A均属于蛋白酶抑制剂，二者以1：1的比例联用可以抑制自噬。有研究表明，在结肠癌细胞系中联用E64d及Pepstatin A，可明显抑制溶酶体的降解从而阻断自噬的进展，而自噬体的形成并没有受到明显影响。
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自噬抑制剂Wortmannin及LY294002 说是PI3K/AKT的抑制剂，但抑制PI3K/AKT/mTOR不是激活自噬吗？还是这两个有其他的作用靶点

作者: 101010 时间: 2016-4-15 10:44

本人欲做自噬方面的实验，用western blotting检测自噬水平，各位前辈推荐下LC3B哪个厂家口碑好啊。万分感谢。

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CST的，没得说。配一支可以用3个月至少。

作者: mamamiya 时间: 2016-4-15 10:45

我们也在做自噬这方面的，才刚开始，用的方法很基础也就是Western和PCR，只是想观察在某种情况下自噬是上调还是下调，只是一直没搞清楚Lc3-1和Lc3-2的关系，望版主给予指点，万分感谢！

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Following synthesis, the C-terminal fragment of rat LC3 is cleaved immediately by Atg4,a cysteine protease. The cleavage yields its cytosolic form LC3-I and exposes the carboxyl terminal Gly.LC3-I is further activated by Atg7 (an E1-like enzyme),transferred to Atg3 (an E2-like enzyme), and ?nally modi?ed to a membrane-bound form, LC3-II . LC3-II is localized to autophagosomal membranes and made this protein an autophagosomal marker .LC3-II also has been identi?ed to be a phosphatidylethanolamine (PE)-conjugated form (LC3-PE) [10], like its yeast homologue Atg8 (Atg8-PE) [13]. LC3-PE is in turn delipidated by Atg4B. Recently, the solution structure of LC3-I was determined and it was divided into N- and C-terminal subdomains. The N-terminal subdomain of LC3 is essential for its binding of tubulin and microtubules, suggesting that LC3 can act as an adaptor protein between microtubules and autophagosomes.
希望对你有所帮助

作者: 33号 时间: 2016-4-15 10:45

各位前辈，请教一下LC3B的western，电泳和转膜的条件

作者: 911 时间: 2016-4-15 10:47

做western blot，LC3B做出了三个条带，一个是LC3B I，一个是LC3B II，另一个呢？求高手解答！

作者: 911 时间: 2016-4-15 10:47

各位前辈，请教一下LC3B的western，电泳和转膜的条件

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说一下我的吧，电泳是恒压，80v 20min，压倒浓缩胶和分离胶的交界处；然后100v 80min。转膜是半干转，也是恒压，20v 20min。

作者: jude 时间: 2016-4-15 10:48

我是做自噬的新手，请问一般多少浓度的雷帕霉素诱导多长时间能产生自噬？我现在在摸这个浓度不知道怎么做？用什么检测比较直观和快，求大神指导

作者: XYZQ 时间: 2016-4-15 10:48

请教有人做过用雷帕霉素诱导自噬吗？

作者: XYZQ 时间: 2016-4-15 10:48

请问确认自噬情况除了WB检测LC3外，还要加什么方法确认啊？？

作者: 00无名指00 时间: 2016-4-15 10:49

QUOTE:

原帖由 XYZQ 于 2016-4-15 10:48 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问确认自噬情况除了WB检测LC3外，还要加什么方法确认啊？？

WB是定量测定。建议你看看这篇文章，对于自噬的定量、定性检测讲解的很详细。
Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring
autophagy in higher eukaryotes.

作者: 3.14 时间: 2016-4-15 10:50

刚刚接触自噬，想和大家请教一个问题。就是使用免疫荧光检测GFP-LC3融合蛋白的时候，可以使用普通荧光显微镜吗？因为条件限制，没办法使用激光共聚焦显微镜进行观察。求指教~
万分感谢！！！

作者: INK 时间: 2016-4-15 10:50

大神，请问
LC3A和LC3B与LC3I和LC3II有什么关系？是不是仅仅是命名不同？

作者: 911 时间: 2016-4-15 10:51

万分感谢各位前辈^_^。本人最近一直在跑western,但是一直只有一条条带，大概30kd左右。用的是santa公司的MAP-LC3，货号sc-16755.用15的胶，25mA跑两个半小时，转膜用300mA转50分钟，请问条件有需要改进的吗？还有一个问题，EBSS分含钙镁和不含钙镁两种，各位用了哪一种。谢谢大家！

作者: sunnyB 时间: 2016-4-15 10:51

刚刚接触自噬，想和大家请教一个问题。就是使用免疫荧光检测GFP-LC3融合蛋白的时候，可以使用普通荧光显微镜吗？因为条件限制，没办法使用激光共聚焦显微镜进行观察。求指教~
万分感谢！！！

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我用普通荧光拍过，但是我们的到40倍就不清楚了，20倍就不能数自噬体数目，很郁闷，，，激光共聚焦还在维修中，唉。。。

作者: hulu呼噜 时间: 2016-4-15 10:51

QUOTE:

原帖由 sunnyB 于 2016-4-15 10:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
刚刚接触自噬，想和大家请教一个问题。就是使用免疫荧光检测GFP-LC3融合蛋白的时候，可以使用普通荧光显微镜吗？因为条件限制，没办法使用激光共聚焦显微镜进行观察。求指教~
万分感谢！！！

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就是40倍时是不清楚但是能够模糊数一数自噬体个数？20倍确实低了点啊。普通荧光效果看来有点勉强~
谢谢哈~都没接触过，现在有点概念了呐

作者: sunnyB 时间: 2016-4-15 10:52

QUOTE:

原帖由 hulu呼噜 于 2016-4-15 10:51 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

就是40倍时是不清楚但是能够模糊数一数自噬体个数？20倍确实低了点啊。普通荧光效果看来有点勉强~
谢谢哈~都没接触过，现在有点概念了呐

我现在也是还在摸索这个浓度，看文献中用的各不相同呢。之前看论坛有人推荐是工作液100nM。还在试

作者: sunnyB 时间: 2016-4-15 10:53

模糊，数不了~

作者: 8黑眼圈8 时间: 2016-4-15 10:53

也是刚开始学自噬，额文献看的太少了不知道什么样的结果算好的惭愧

作者: 8黑眼圈8 时间: 2016-4-15 10:55

大神，请问
LC3A和LC3B与LC3I和LC3II有什么关系？是不是仅仅是命名不同？

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貌似是的动物的和人的蛋白的命名不同，分子量好像也有点差异

作者: 8黑眼圈8 时间: 2016-4-15 10:55

大家一般用什么溶解E64D 和胃酶抑素A？

作者: 阳光树 时间: 2016-4-15 10:56

感觉大家都是在做离体的细胞，也没有做在体研究中的，我准备用3-MA腹腔注射大鼠一个月，看看神经的自噬的变化，大家觉得可行吗，望大家积极回复啊

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老师，您后来3MA大鼠腹腔注射顺利吗？效果怎么样？

作者: toy 时间: 2016-4-15 10:57

同问，在KA 诱导的大鼠海马神经元中自噬什么时间点最强？

作者: 天蓝蓝 时间: 2016-4-15 10:58

请教各位大牛，PI3K/AKT/mTOR是抑制自噬，但是好多关于癫痫的动物模型中，在24小时，该通路活化，akt以及mTOR均活化，但自噬是增加的？
还有PI3K/AKT/mTOR抑制剂LY294002，抑制一类和三类PI3K，按理说应该激活自噬，但是为什么LY294002是自噬抑制剂？

作者: 3.14 时间: 2016-4-15 10:58

求助于各位大神，荧光倒置显微镜检测自噬时，gfp和rfp各出现在什么阶段？由于什么原因出现或者没有出现在某个阶段？如果可以请附上文献。感激不尽

作者: langlang 时间: 2016-4-15 10:58

QUOTE:

原帖由 3.14 于 2016-4-15 10:58 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
求助于各位大神，荧光倒置显微镜检测自噬时，gfp和rfp各出现在什么阶段？由于什么原因出现或者没有出现在某个阶段？如果可以请附上文献。感激不尽 ...

额我觉得一般情况下只要有自噬就都会有的吧只是量和比例的问题。。。

作者: ztonyc 时间: 2016-4-15 10:59

WB是定量测定。建议你看看这篇文章，对于自噬的定量、定性检测讲解的很详细。
Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring
autophagy in higher eukaryotes.

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Guidelines for the use and interpretation ofassays for monitoring autophagy.[Autophagy. 2012
这是新的吧 2012的好多啊 100页都不敢开始看

作者: viviwang1987 时间: 2016-4-15 10:59

各位大神，请问用EBSS饥饿做阳性对照，是宫颈癌细胞，一般需要处理几小时？处理后可以直接电镜观察吗？

作者: TAT 时间: 2016-4-15 11:00

大家做抑制自噬的siRNA一般选哪个基因进行干扰呢？beclin 1可以吗

作者: 00无名指00 时间: 2016-4-15 11:00

透射电镜是自噬检测的金标准。我也是做这个

作者: daod 时间: 2016-4-15 11:00

我做大鼠血管内皮细胞体外细胞培养的，想问一下，大家干预此类细胞一般雷帕霉素和3-MA的用量是多少啊？

作者: daod 时间: 2016-4-15 11:03

我现在也是还在摸索这个浓度，看文献中用的各不相同呢。之前看论坛有人推荐是工作液100nM。还在试
回复：【求助】雷帕霉素（rapamycin）处理细胞的使用方法？ - 丁香园论坛
这里有讨论的
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我用大鼠的主动脉内皮细胞体外培养的，干预浓度一直没弄清楚，你们呢搞清楚了吗？雷帕霉素用多少啊？

作者: ztonyc 时间: 2016-4-15 11:03

我怀疑某药物是通过促进自噬导致了我的目的蛋白减少，所以我打算用CQ抑制自噬后在观察目的蛋白的变化情况。可是不知道CQ的使用方法。是先加氯喹预处理后再加药物处理，还是一直一起处理？或者是先用药物处理后再加氯喹处理？？HEK293细胞。求高手指教

作者: bluelake 时间: 2016-4-15 11:03

研究自噬的推荐LC3双标的腺病毒，同时带有RFP和GFP标记，实时监测自噬流。汉恒生物在这方面做的很好，还有AAV的LC3双标，活体观察自噬。听说最近LC3双标的腺病毒有优惠活动，有ipad送。

作者: 2541 时间: 2016-4-15 11:03

大家好，初来乍到，我的课题也跟自噬相关，近期正在做细胞自噬检测，通过RFP-GFP-LC3转染细胞，干预后观察拍照看自噬体。结果如下，不知道大家的图都做的怎么样？Ps：居然拍到一个好有爱的细胞核～;

图片附件: 16068692.jpg (2016-4-15 11:04, 68.5 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43607

作者: 555444 时间: 2016-4-15 11:04

能否问问自噬相关蛋白是膜蛋白抽提试剂抽提还是胞浆蛋白试剂抽提

作者: XYZQ 时间: 2016-4-15 11:04

想问一下大家，有木有用GEP-LC3转基因大鼠的，求指导交流。

作者: XYZQ 时间: 2016-4-15 11:06

大家好，初来乍到，我的课题也跟自噬相关，近期正在做细胞自噬检测，通过RFP-GFP-LC3转染细胞，干预后观察拍照看自噬体。结果如下，不知道大家的图都做的怎么样？Ps：居然拍到一个好有爱的细胞核～;

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你这图做的不错啊！用的啥质粒？求一个

作者: xuuuu 时间: 2016-4-15 11:07

家好，初来乍到，我的课题也跟自噬相关，近期正在做细胞自噬检测，通过RFP-GFP-LC3转染细胞，干预后观察拍照看自噬体。结果如下，不知道大家的图都做的怎么样？Ps：居然拍到一个好有爱的细胞核～;

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我咋就做不出来这种效果，转都转不进去同求质粒

作者: 911 时间: 2016-4-15 11:07

大家好，初来乍到，我的课题也跟自噬相关，近期正在做细胞自噬检测，通过RFP-GFP-LC3转染细胞，干预后观察拍照看自噬体。结果如下，不知道大家的图都做的怎么样？Ps：居然拍到一个好有爱的细胞核～;

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你用的是哪家公司的自噬腺病毒，还是自己包的？我的效果比起你差很多额，有图有真相，我就不想"吐槽了"
了

图片附件: 47881310.jpg (2016-4-15 11:07, 5.52 KB) / 该附件被下载次数 13
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43608

作者: any333 时间: 2016-4-15 11:08

这是师兄推荐我到汉恒那边买的自噬LC3双标腺病毒，做出来的效果还是不错的，很好奇其他人的LC3的图是啥样子的？？？

作者: any333 时间: 2016-4-15 11:08

大家好，初来乍到，我的课题也跟自噬相关，近期正在做细胞自噬检测，通过RFP-GFP-LC3转染细胞，干预后观察拍照看自噬体。结果如下，不知道大家的图都做的怎么样？Ps：居然拍到一个好有爱的细胞核～;

我咋就做不出来这种效果，转都转不进去同求质粒
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汗，我用的不是质粒，是自噬双标腺病毒～～～

作者: any333 时间: 2016-4-15 11:08

大家好，初来乍到，我的课题也跟自噬相关，近期正在做细胞自噬检测，通过RFP-GFP-LC3转染细胞，干预后观察拍照看自噬体。结果如下，不知道大家的图都做的怎么样？Ps：居然拍到一个好有爱的细胞核～;

你这图做的不错啊！用的啥质粒？求一个

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唉，我用的不是质粒，是病毒

作者: shenkunjie 时间: 2016-4-15 11:09

有关于自噬与EAE发病机制的相关文献么，找了好久也没找到，麻烦帮帮忙！

作者: linlinstar 时间: 2016-4-15 11:09

各位有没有做线粒体自噬的？请问要说明肿瘤细胞是否发生线粒体自噬都测那些指标？？

作者: linlinstar 时间: 2016-4-15 11:10

我们也在做自噬这方面的，才刚开始，用的方法很基础也就是Western和PCR，只是想观察在某种情况下自噬是上调还是下调，只是一直没搞清楚Lc3-1和Lc3-2的关系，望版主给予指点，万分感谢！

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LC3合成之后是前提LC3 pro-LC3；然后立刻C末端被ATG4水解切割掉一段多肽，暴露甘氨酸，这个是LC3-I，胞浆分布。自噬过程中，LC3-I在ATG7和ATG12-ATG5-ATG16L作用下（和泛素修饰过程很像），与磷脂酰乙醇胺共价结合，这个才是LC3-II，结合在自噬体膜上。LC-II由于磷脂酰乙醇胺的修饰，导致电荷的变化，使得迁移率更快，所以SDS-PAGE中显得分子量比LC3-I小

作者: vcve 时间: 2016-4-15 11:11

3-MA使用的效果不好,Wortmannin和LY294002的原理差不多，就是试剂的稳定性有差异，LY294002好一点，但是使用效果最明显的是氯喹，简称CQ，也是自噬抑制剂，但是作用原理不一样，抑制自噬体的降解，WB结果表现为LC3-2条带增强

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请问CQ你一般用多少浓度？不知道你有没有啊用过BAF，我用50nM，作用24 h，细胞就变得晶莹剔透的了，不知道你们是否也是这种情况

作者: yhn 时间: 2016-4-15 11:11

最近在做LC3 WB，抗体是sigma公司的，但是出条带很不稳定，想请教给位蛋白的上样量是多少，抗体稀释的比例是多少？

作者: yhn 时间: 2016-4-15 11:12

这个像不像发生了自噬？

图片附件: 79041042.png (2016-4-15 11:12, 22.75 KB) / 该附件被下载次数 15
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43609

作者: yhn 时间: 2016-4-15 11:12

QUOTE:

原帖由 yhn 于 2016-4-15 11:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
这个像不像发生了自噬？

大家怎么看？

作者: bbc 时间: 2016-4-15 11:13

请问CQ你一般用多少浓度？不知道你有没有啊用过BAF，我用50nM，作用24 h，细胞就变得晶莹剔透的了，不知道你们是否也是这种情况

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不同的细胞用的浓度不一样，你可以做个CQ细胞毒性预实验再确定。BAF没用过。

作者: @木木@ 时间: 2016-4-15 11:14

请问，我刚做真菌的自噬。想转化GFP-ATG8作为标记，ATG8可以用内源的吗？

作者: cj_mondy 时间: 2016-4-15 11:15

不同的细胞用的浓度不一样，你可以做个CQ细胞毒性预实验再确定。BAF没用过。

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CQ 我觉得50，高了我觉得30~40比较合适。我的个人之谈。

作者: XYZQ 时间: 2016-4-15 11:15

请问LC3B抗体哪家比较好用？sigma的L7543怎么样啊？

作者: 555444 时间: 2016-4-15 11:15

最近自噬很火啊！我的项目也涉及到一点自噬，不知道自噬GFP-RFP-LC3双标腺病毒大家有没有用过？一般买哪个公司的？有一家公司一直在推这个产品，还送ipadmini，我有意想买，不知道感染心肌效果怎么样，感染之后多久可以观察自噬？

作者: vcve 时间: 2016-4-15 11:16

战友们我刚刚开始做自噬~请多指教！
我想问问大家转染EGFP-LC3后24小时接毒感染细胞，一般多久观察荧光会发生汇聚成点的现象呢？？？大家用电镜观察自噬又是多久收片进行观察呢~？谢谢啦！亲们~

作者: rfv 时间: 2016-4-15 11:16

哪位大神有线粒体自噬的信号通路图啊，给小弟来个啊，多谢！

作者: wiwi 时间: 2016-4-15 11:16

有人做脊髓损伤的自噬吗
请问前辈有做脊髓损伤的LC3检测吗？
我做了很久LC3都只有一条带，不知道哪里出错了。很苦恼，能否告之LC3的转膜条件？

作者: wiwi 时间: 2016-4-15 11:17

LC3α/β 请问这个抗体做出来的条带是LC3I/II嘛出来的也是一个比率吗

跑出来是这个求高手分析一下

图片附件: 68507618.png (2016-4-15 11:17, 56.47 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=43610

作者: 33号 时间: 2016-4-15 11:17

新人一枚，刚开始涉及自噬，没有一点头绪，看到楼主这篇文章，顿时觉得至少有东西看了，学习中，非常感谢楼主辛勤整理！！！

作者: wawa 时间: 2016-4-15 11:17

新手勿喷求问CQ的具体使用方法比如我要做个6h 24h 48h 处理组加了50umol 那期间要不要再加CQ 因为考虑药物的半衰期问题

作者: ero11 时间: 2016-4-15 11:18

各位有没有做动脉粥样硬化中巨噬细胞自噬的？求咨询求商量

作者: bluelake 时间: 2016-4-15 11:18

LC3ii 每次能跑出来 LC3i有时不能；放假之前能跑出来回来之后就跑不出来

作者: wawa 时间: 2016-4-15 11:18

是，但是好像你的条带跑得不是很开

作者: 831226 时间: 2016-4-15 11:19

请问LC3B抗体哪家比较好用？sigma的L7543怎么样啊？

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CST，sigma都可以

作者: 831226 时间: 2016-4-15 11:19

LC3ii 每次能跑出来 LC3i有时不能；放假之前能跑出来回来之后就跑不出来

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我也遇到了，配新的试试结果！

作者: 831226 时间: 2016-4-15 11:20

LC3α/β 请问这个抗体做出来的条带是LC3I/II嘛出来的也是一个比率吗

跑出来是这个求高手分析一下
......

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我跑出来的也是这样子。

作者: HPLC使者 时间: 2016-4-15 11:21

LC3α/β 请问这个抗体做出来的条带是LC3I/II嘛出来的也是一个比率吗

跑出来是这个求高手分析一下
......

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你这个是不是药物对LC3B本身的表达量就有影响，如果是的话，可以考虑用LC3BII和actin的比值，可以加入atg7的si,抑制LC3BI向LC3BII的转化，看看药物对LC3B本身的作用。

作者: wu11998866 时间: 2016-4-15 11:21

有没有自噬抑制剂的确切定义，谁个可以定义一下。并说明其对肿瘤的作用？

作者: viviwang1987 时间: 2016-4-15 11:22

请问大家，WB检测LC3，药物时间剂量依赖性地增加LC3II/LC3I,但是p62也是上调的，怎么解释呀？
还有谁能告诉我电镜下的这些事什么东西，是不是自噬泡？

作者: viviwang1987 时间: 2016-4-15 11:23

说明impaired autophagic flux

作者: tears 时间: 2016-4-15 11:23

学到很多，谢谢大家。但还是不明确，研究抗肿瘤药物作用时，自噬抑制剂3-MA需要在加药前预处理细胞细胞吗？需要作用一段时间后去除3-MA吗，感谢赐教

作者: 45778 时间: 2016-4-15 11:24

自噬可以人为手动触发么？

作者: 云端ing 时间: 2016-4-15 11:24

氯喹可以阻断自噬，到底是通过抑制自噬体与溶酶体融合，还是影响溶酶体水解酶的作用，两者机制应该是不一样的，我搜文献怎么不一致呢，求解。

作者: boom 时间: 2016-4-15 11:24

检测自噬流要使用巴伐洛霉素A1抑制自噬溶酶体形成，求助大家使用的浓度？我用100nM，24小时后心肌细胞有一部分脱壁，状态也不好。

作者: xueyouzhang 时间: 2016-4-15 11:24

求助，为什么我的LC32总是比LC31高这么多，正常不是应该LC31多一些吗？我做的是鸡的成纤维细胞系DF-1.

作者: 45778 时间: 2016-4-15 11:25

在文献中看到这一句，百思不得其解，向大家请教一下。Cells treated with chloroquineþ+epirubicin showed high levels of accumulated LC3BII protein, indicating that autophagic flux is inhibited in these cells and may at least in part contribute to the observed reduction in viability。从氯喹的抑制自噬的机理方面，我是这样理解的：氯喹破坏溶酶体的功能抑制自噬，所以LC3B-II在细胞内堆积。可是这篇文献前面检测细胞株的基础自噬水平时也提到，increased levels of LC3B-II in the presence of bafilomycin A1 indicated that epirubicin treatment induces autophagic flux。那到底LC3B-II升高是提示自噬发生了还是被抑制了？

作者: gmjghh 时间: 2016-4-15 11:25

我是自噬研究方面的新手，请问3-MA应用于Jurkat细胞系抑制自噬的剂量范围多少？3-MA预处理是怎么做的？

作者: xuuuu 时间: 2016-4-15 11:26

请教各位大侠，想做某种药物促进自噬，在指标的检测时间上如何确定？请大家给予指教

作者: summerxx 时间: 2016-4-15 11:26

刚开始做自噬，想请教各位前辈加药前用3-MA预处理多久就可以达到抑制自噬的效果呢？

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