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标题: 【求助】扫描电镜是否省掉真空干燥直接喷金 [打印本页]

作者: zouyou 时间: 2016-4-27 11:17 标题: 【求助】扫描电镜是否省掉真空干燥直接喷金

前段时间做了下扫描电镜，制片用的是别人文章里比较简化的方法：2.5%戊二醛4度固定过夜，磷酸缓冲液漂洗三次，然后逐级脱水30%、50%、70%、90%乙醇各一次，100%乙醇两次，每次20min，最后真空干燥后就喷金观察。我的菌是丝状真菌，制片的时候是从固体平板菌落上切一块长宽大约0.5mm的琼脂小块，进行固定脱水等，可是上电镜后发现孢子形态还好，但是菌丝都变形很严重，好的片子菌丝应该是饱满的，我做的都塌陷扁掉了，负责电镜的老师说是没固定好，但他不是做生物的所以也说不好到底怎么做，所以想请教下各位高手：
怎样才能得到质量较好的没变形的菌丝片子？
我的戊二醛是05年的，不知是否对固定有影响？
琼脂小块脱水完后还是平的，但是一真空干燥变卷曲了，是否省掉真空干燥直接喷金？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=44129

作者: 今生如此 时间: 2016-4-27 11:18 标题: 【回复】

我没做过电镜的，但是我做的石蜡切片的，也对此做过了解，我觉得是固定没有固定好，选择的非固定液不合适，或者固定时间不够，应该过看看文献，找相关的文献参考参考

作者: n111 时间: 2016-4-27 11:18 标题: 【回复】

选择的非固定液不合适是什么意思?
我固定过夜了啊，时间还不够吗？

作者: huali 时间: 2016-4-27 11:18 标题: 【回复】

生物组织内含水量高达80%左右，样品所含水分不利于维持镜筒真空，同时易导致镜筒污染，在观察时会产生放电现象，因此在扫描电镜生物样品的制备过程中，样品的脱水干燥十分重要。样品干燥时，因表面张力的作用易引起样品畸变甚至破坏其内部结构。常用的几种干燥方法各有其优缺点：空气干燥法和真空干燥法操作最简单但效果最差，只适用于含水少的毛发等组织，而大多数生物样品不宜采用此方法；目前应用最广的临界点干燥法则存在操作复杂和需要特殊设备等问题，另外还会带来一定的人工假象。对于含水的生物样品，采用脱水后在有机溶剂中冷冻干燥的方法效果更为理想，近年发展起来的化学冷冻干燥法就是一种比较有效的方法。丛有机溶剂中冷冻干燥样品，不产生结晶，升华快效果更好。

作者: yayayu 时间: 2016-4-27 11:19 标题: 【回复】

干燥方法：1.空气干燥：样品直接暴露于空气中，使脱水剂自然挥发；2.真空干燥：样品置于真空镀膜仪内，在镀膜仪抽低真空条件下，样品中的水分和脱水剂逐渐挥发。3.叔丁醇冷冻干燥：梯度乙醇脱水后的样品依次置于30%、50%、70%、90%和100%叔丁醇溶液（乙醇配制），每次10-15min, 再用液氮快速冷冻后放入真空镀膜仪中抽真空6-10hr

作者: 大大 时间: 2016-4-27 11:19 标题: 【回复】

我觉得不是干燥的问题，因为我是完全按照文章上讲的乙醇梯度脱水，30%、50%、70%、90%乙醇各一次，100%乙醇两次，每次20min。是不是戊二醛的问题呢？我用的是在实验室人05年在国药买的，刚看了下纯度属于BR。是不是有很大影响呢？必须要用电镜专用的吗？

作者: yazi 时间: 2016-4-27 11:19 标题: 【回复】

我只做过细菌和酵母的SEM，没有做过丝状真菌。我的方法和楼主大同小异，是用2~3%的戊二醛室温过夜固定。戊二醛是sigma电镜专用的。之后乙醇脱水，空气下干燥一到两天，最后喷金。我第一次做大肠杆菌的SEM时，由于只在4度固定了三个小时，照出来的都是坍塌的细菌，很像楼主的情况。由于硬件条件所限，我的所有分样品都是脱水后空气下干燥，到目前为止还没有发现干燥引起的异常。

作者: 女儿情 时间: 2016-4-27 11:20 标题: 【回复】

是不是我抽真空，菌受的外力太大了所以变形严重呢，下次也试下空气干燥，谢谢

作者: 灵魂 时间: 2016-4-27 11:20 标题: 【回复】

梯度脱水以后，放在叔丁醇里面置换，然后再冻干机上冻干就可以了啊，每一个步骤不要太快，尤其是在100%乙醇中千万别让乙醇干了，乙醇极易挥发，那样你的样品就直接在空气中了，在冻干机里多放一段时间。也许会好一些。你的问题已经解决了吗？可以将结果和改进的方法跟大伙分享一下啊。

作者: p1900 时间: 2016-4-27 11:21 标题: 【回复】

后来没再试，我跟你说的就差“叔丁醇置换”这一步，变形就很严重，置换很重要吗？

作者: yuanyuan 时间: 2016-4-27 11:21 标题: 【回复】

不好意思，没有再做实验室细菌效果都很好，就是真菌变形严重，但时间太紧了，也就没有再做

作者: 大大 时间: 2016-4-27 11:21 标题: 【回复】

感觉操作都是按规程来，出在试剂或处理的细节上的可能性比较大，但国内都是专人管理的，所以他们应该发挥比较稳定才对，除非他们经常出现这种结果，否则你可以重复一次吧。
这是我的一个结果。很丰满哦！

作者: xiaoxiaoai 时间: 2016-4-27 11:22 标题: 【回复】

文章中"真空干燥后就喷金观察"什么叫做"喷金"?我不懂请教老师.

作者: 美人鱼 时间: 2016-4-27 11:22 标题: 【回复】

你好，我现在要做这个，你最终从无水乙醇里吸了一点到盖玻片上吗，

作者: 青青草 时间: 2016-4-27 11:23 标题: 【回复】

这个很简单的原因，是因为你的脱水步骤是沿用免疫组化。。SEM脱水是不能这么脱的，减少脱水步骤和时间吧。另外，不妨试试常温干燥。不要冷干，因为脱水后，细胞内水分缺失，组织骨架结构其实是依赖蛋白质的完整性的，戊二醛的固定模式跟多聚甲醛不同，不能建立网格结构，而是纯粹的蛋白质构象改变。。冷干会导致细胞结构出现干瘪。
另外，如果你的样品胞外聚合物水溶性物质很多的话，建议用乙酸乙酯脱水。。酒精洗会洗掉大部分的胞外物质

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