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标题: 【求助】关于蛋白质谱鉴定的问题 [打印本页]

作者: n111 时间: 2016-4-28 10:50 标题: 【求助】关于蛋白质谱鉴定的问题

最近在做原核，表达出了一个蛋白，大小与目的蛋白预测大小相符，本身连接上了HIS标签，经过镍柱纯化，成功挂柱洗脱。于是准备进行蛋白质谱鉴定，想进一步确定的确为目的蛋白。质谱样品为经过SDS-PAGE电泳之后切下来的片段，从制胶到最后切胶的过程中一直佩戴了手套，但是最终的鉴定结果竟然是角蛋白，这让我想当迷惑，找不出原因，希望路过的大大们可以提点一下，多谢各位啦

作者: 小女人@ 时间: 2016-4-28 10:51 标题: 【回复】

楼主你好我也有同样的问题跟你一模一样请问知道是啥原因了吗怎么解决的呢

作者: 兔子 时间: 2016-4-28 10:51 标题: 【回复】

做质谱角蛋白污染很难控制，带手套只能防止手上的角蛋白污染，但如果手套换的不勤快，在反复摘手套的过程中有相当大的可能性把手套外表污染，进而污染样品。
另外还有头屑的角蛋白也容易污染样品
不过表达纯化的样品就算有角蛋白污染也不至于检测不到目的蛋白
如果你的结果只有角蛋白的话，建议看看是不是表达质粒有问题，如果移码了，就很可能检测不到

作者: 小妖精@ 时间: 2016-4-28 10:51 标题: 【回复】

第一看要看一下你跑的胶，目的蛋白的量怎么样，如果本身条带很浅很细，那很容易受到污染蛋白的影响，质谱鉴定过程中是很难保证完全没有非样品信号，有的非样品峰如角蛋白的峰、酶自切峰还可以作为内标校准峰，所以并不是什么坏事情。质谱鉴定时的信号本身就是一个此消彼长的过程，如果你的目的蛋白的含量高就会把污染蛋白肽段的信号压制下去，获得更多的样品信号峰，从而获得更可信的鉴定结果。所以如果发现目标蛋白量小，就加大上样量。
第二酶解过程中的影响，如果你的酶解过程有问题，你再多的样品量也没有用。如果酶没有进入胶内，没有切到样品蛋白，那自然就只能切到胶外的污染角蛋白。所以要仔细检查酶解过程有没有闪失，这个是关键。
希望对你有帮助，good luck

作者: malong 时间: 2016-4-28 10:52 标题: 【回复】

在整个实验过程中不仅要带无粉乳胶手套，还要戴口罩，最好戴帽子，另外，检测你的试剂有没有污染，切胶的一套工具用超纯水洗干净。

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