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标题: [求助]分析方法开发的四大要项 [打印本页]

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:05 标题: [求助]分析方法开发的四大要项

[求助]分析方法开发的四大要项

大概在20年以前，美国化学学会出版的分析化学杂志刊登了一篇讨论分析方法开发的文章。这个杂志一般都是学术界发表文章。偶尔会刊登一些实用性的文章。这篇文章我记得非常清楚。讨论的就是分析方法开发的4S。这4S就是Specificity（专属性），Sensitivity（灵敏度），Speed（速度）还有就是$（费用）。其实任何分析方法开发，都需要考虑这4S。当初那篇文章也不知跑到那里去了，我就把我这几年工作上的经验，一起与大家分享。我相信很多大家一定都知道了。看看我说的是不是有道理。当然，还是希望大家加入讨论，分享大家的经验。

分析方法首先要注意的就是专属性。所谓专属性就是我们分析某一个化合物，所得到的分析信号必须是完全来自於这一个化合物本身所产生的信号。早年色谱不那么的盛行，我们就试图使用各种方法，取得这个化合物专属性的信号。譬如光谱中的某一个波长只对这个化合物发生吸收。我们也可以利用这个化合物氧化还原的特性而能够从电极上产生信号。还有就是利用化合物本身在热化学产生吸热放热的信号。慢慢的我们的色谱开展了。因为色谱的开发，可以把要分析的化合物从一个混合物中分开，而取得这个化合物的专属性而进行定性定量。目前在美国，色谱的应用已经排在天平，pH 计成为第三位最常用的分析仪器了。我相信主要的原因就是色谱很容易的就能够提供各个化合物的专属性。简单的说，所谓取得专属性其实就是处理样品的基质(Sample Matrix)产生的效应。如果把基质所造成的干扰除去，我们的分析物(Analyte)的专属性就自然出现了。也就是说我们可以化合物的对照品来定量定性。

灵敏度就是借着调动仪器的组成(Components)使我们能够得到最大的信号。或者借着化学反应使分析物能够产生柱前或柱后的衍生物，来增加灵敏度。当然我们谈到信号就要考虑到基线，也就是Signal/Noise 比例。就拿色谱来说，如果灵敏度高，我们所进样的样品量就小。想想一个最有效除去样品基质效应的最简单的办法就是稀释样品。所以，如果能够取得最高的灵敏度，实在是取得样品专属性一个最简单，又最快捷的方法。这也是我一再强调，当我们在做含量分析的时候，使用一个简单的等度，短时间的分离方法。然后尽量减低样品的进样量（但是需要考虑积分面积的重复性）。因为进样量小，即使有百分之一的杂质，恐怕也无法测出。当然，我们需要另外一个进样量大，时间長的梯度分离法来检测0.1%的杂质。在色谱方面，我们可以选择波长，也可以选择不同的检测器。看看我们用质谱来做微量的分析，以前繁杂的样品前处理程序都可以简化甚至省略，就是因为质谱的专属性及高灵敏度。

再来就是分析的速度。分析的时间长短是质检工作的重要一环。一系列的样品及对照品能够在短时间内完成，自然避免许多不必要的困扰。在色谱方面，缩短样品分析的时间方法就是从保留时间着手。可以用C8的柱子就不需要用C18。因为这两种柱子的基本选择性是相同的。样品只要有足够的保留时间就可以了。使用C8同时也可以减少乙腈的消耗量。做等度分离，柱子的长度一般用15厘米，4.6毫米口径。重点是样品是否可以完全溶解到流动相。在液相色谱，样品的溶液是很重要的。如果非极性超过了流动相，样品的溶液就具有流动相的功能。使用15 × 4.6 的柱子做等度分离，进样量一般是不超过20微升。一般一个样品的分析时间最好在5到8 分钟之内。至於应用到工艺方面的控制，分析的时间就需要更短。甚至样品必须连续注射，不断的有结果出来。这就是我们一般说的Process Analytical Technique (PAT，工艺分析技术)。这几年美国FDA一直在要求PAT。主要的原因就是从就基本工艺，也就是制药的过程来品控。想想也是有道理的。我们一个批次做出的片粒有好几万，甚至几十万。结果到最后我们的取样量只是微不足道的一小部分。如何来证明这些少量的取样可以代表整个的工艺产品。所以，慢慢的各种光谱分析的技术将应用到每一片制剂的检验。可见分析速度的重要性了。

最后就是花费了。分析样品的花费当然包刮了仪器本身，使用的各种化学试剂，人员的消耗，还有各种实验室运行的开销。就拿色谱来说，先期的投资购买最可靠，最耐用的仪器，自然是首要的条件。所谓工欲善其事，必先利其器。柱子也是一样。有了好的仪器，好的柱子，至少碰到问题的时候，可以帮助我们很快的摒除仪器与柱子这方面衍生的问题。基本上在做色谱发了问题，一个就是仪器部分，另外就是化学。仪器部分自然包刮了进样器，检测器，泵，数据系统，还有柱子。这一部分出了毛病，在美国一般的分析人员都是找仪器公司负责处理。一年的花费大概在一万美元左右，负责仪器的修护，保养，校正还有回答各种问题。一个电话，可以解决问题当时就解决了，不能解决的，修护人员24小时之内到达现场负责解决。柱子也有保险期。总之，时间就是金钱。一个分析的问题出现，分析员要立刻能够判断问题的症结所在而采取适当的步驺来解决问题。属于仪器部分的问题有仪器公司负责，其他的问题就得自己解决了。一个公司研究，开发部门的进展，和分析部门的运作是紧紧相扣的。如何彼此互相沟通，提高工作效率，自然是很重要的课题。以后再慢慢讨论。

作者: 云端ing 时间: 2011-11-5 11:08

说得好啊！
一个方法有用，可用，还要考虑是否方便经济，才是应用的可能。
只是，目前所有的方法都难很满足所有的要求罢，此中的平衡就是一个关键的问题了。

作者: 木槿 时间: 2011-11-5 11:08

我先讨论下速度和费用的问题。个人觉得，其实分析速度也应该属于费用的范畴来考虑，是人力成本的费用吧。
方法在开发过程中就应该考虑到方法的简便。过分繁琐的方法带来的是测量误差的增加，和人力成本的浪费。考虑包括了溶液配置，色谱系统，普通的色谱柱，出峰时间，分析时间等等。生产过程中，分析时间越短，得到的数据越快，降低了整个生产的风险。有次陪同一个专家去做残留溶剂的培训。当讲到该方法需要70分钟的分析时间时，该同志就把这个方法狠狠的批评了一番，虽然他是来给用户做该方法的培训的。末了，他推荐用户自己去开发方法吧。超过10分钟的分析时间是令人抓狂的。

花费。由于整个分析过程是很复杂的，多因素的影响。要求分析员能迅速地判断问题的来源是非常困难的。例如峰型差，是流动相，天平，ph计，进样器，柱还是别的原因，又包括了分析员在整个操作过程中是否有偏差存在。能迅速判断问题的分析员，是具备了良好的知识储备和丰富的经验的。
接着谈到仪器的保养和验证。这是一笔很大的费用。平均每一年一次的PM和验证的费用超过了仪器10%的价格。还要花费大量的人力和物力去管理和操作。可分析部门几乎是与所有的研发部门扣在一起的。它的风险也非常大。例如一台天平停止工作，将会使分析部门彻底停工，其他部门就只能等待，又例如天平存在很大的偏差，那所产生的所有的数据都要重新评估。如此产生的后果是不可想象的。
所以我们在考虑费用的时候，不能仅仅想的是如何节省。就像楼上所说的，“平衡”。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:11

我是百分之百同意“平衡”的说法。在分析方面不论多大的开销，跟人力比较起来都算是小数子。因此，一般实验室配备的永远都是有额外的各种仪器，以防备因故障而浪费人力的情形。换句话说，仪器坏了，还有后备的可以使用，但是要人员因为仪器故障而闲下来，那是不可原谅的管理失误。我说到节省，慢慢的变成一个重要的环节。举例来说，我们用下来的乙腈，处理五加仑（20升，包含水或其他的有机溶剂）的价钱大概要350美元左右。而且每年在增加。所以我说能够用C8就不要用C18。很早以前就已经提倡回原使用乙腈的流动相。好在目前至少色谱仪器的使用时间很长，有的过了20年还照样运转。看看美国大学研究所教授用的仪器，还一样在用。记得时常看到杂志上报导在做色谱花费，最大的就是仪器本身的购买，保养，认证等等，还有就是人员的花费。

作者: 66小飞侠 时间: 2011-11-5 11:14

4S的确是分析方法的四大要项，伴随着仪器的发展，很多经典的分析方法都要求我们好中取优，就拿当下很热门的液相色谱，一开始只是以制备色谱的功用进入实验员的科研范围，紧接着短短的时间，高效色谱仪器的开发，使得它在分析领域很广泛的应用，尤其是进来的UPLC必将带来一场分析方法的改革，更节省溶剂，更节约时间，更高效高速。

作者: 04906 时间: 2011-11-5 11:14

就专属性有个想法：
专属性不应该只限定在用完全分离来保证。质谱检测器选择离子检测时可以定量未完全分离的成分；相应的，紫外检测器下选择不同的检测波长也可以排除干扰；如果继续扩展一下，当未分离的干扰成分和待测成分浓度差异很大(或者对检测器的差异很大)时，那么将样品溶液稀释至一定的倍数，也应该可以排除这种(对定量)的干扰，不知道这个观点目前是否能被认可，或者再俗一点，审评中心能不能接受。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:15

就专属性有个想法：
专属性不应该只限定在用完全分离来保证。质谱检测器选择离子检测时可以定量未完全分离的成分；相应的，紫外检测器下选择不同的检测波长也可以排除干扰；如果继续扩展一下，当未分离的干扰成分和待测成分浓度差异很大(或者对检测器的差异很大)时，那么将样品溶液稀释至一定的倍数，也应该可以排除这种(对定量)的干扰，不知道这个观点目前是否能被认可，或者再俗一点，审评中心能不能接受。

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早年我们做分析方法就是提倡两种方法一是所谓的低进样low load 另外就是高进样high load。低进样的原理就是可以通过稀释，避免存在的干扰出现。高进样是去查看杂质等有关物质。不管国内国外，审评中心不同意总得给个不同意的说法。在美国还没有听说过不同意的。至少我经手的四个NDA都过了。

作者: 00无名指00 时间: 2011-11-5 11:16

现在和CDE基本上不打交道了，几年前有过类似的情况——众所周知，在复杂的复方中药中要想完全排除某些干扰(特别是极性较大的成分)几乎是不可能的；或者，某些特殊的赋形剂也可能影响主峰的测定——由于常量分析下对分析方法的准确度和精密度要求较生物样品测定等更高，这种干扰经常会带来困扰。当时的解决方法一般是在干扰的影响低于1%的情况下会选择稀释后测定，但是CDE的意见通常就是：建议研究单位继续考察色谱条件，以排除主峰位置的干扰
所以想咨询一下比较现实的案例——如果不涉及商业秘密的话。

比如说：
某浓度下主峰的峰面积是10000，而干扰峰的峰面积是100，此时干扰峰的信噪比是20；
如果稀释20倍，理论上应该不再有干扰——同时，理论上此时峰面积为500的主峰信噪比仍然数倍于20，即可以符合定量的要求。所以应该是排除了干扰的。如此的解释，通常CDE是无视的。
但是另一方面，这样的情况也可能意味着当绘制标准曲线时，高浓度下主峰中存在了干扰，因而可能导致线性的偏差，这样看似乎又不能完全排除干扰。

请赐教。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:16

QUOTE:

原帖由 00无名指00 于 2011-11-5 11:16 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
现在和CDE基本上不打交道了，几年前有过类似的情况——众所周知，在复杂的复方中药中要想完全排除某些干扰(特别是极性较大的成分)几乎是不可能的；或者，某些特殊的赋形剂也可能影响主峰的测定——由于常量分析下对分析方法 ...

我很能体会您的问题。复方的色谱我看过几个，的确存在您所说的情形。这也是我在写本篇讨论时没有考虑过到问题。您的提出，的确帮助了我的思考。我之所以提low load 方法，实际上并没有考虑到复方主峰的存在。一般化学药品主峰的纯度都在99%左右，所以主峰下存在其他杂质的情况是很难出现的。如果有了复方主峰干扰的情形，稀释可以应一时之急，但是基本上的同一时洗脱(co-elution)的问题还是存在的。所以，最近色谱一再强调Capacity的问题。就是在一个色谱定时间内到底可以分出多少峰。基本上，我还是认为要想办法把主峰分开。换柱子。最近沃特斯有一个柱子SunFire 就是Capacity比较大的柱子。如果一度空间分不出来，就要用两根柱子，把第一根柱子转换到第二根柱子。这就是所谓
Two Dimensional Chromatography 也就是所谓 Column Switching Technique。20年以前我还拿到一个这方面分析技巧的专利。目前美国 University of Minnesota 化学系教授Peter Carr
还是我研究所的同学，这几年发表一系列的文章。就是如何增加Peak Capacity 也就是如何增加分离度。也就是说把一个主峰从一根柱子转到另外一根柱子再行分离。做起来并不难。就是加一个six port valve。这些问题都是可以解决的。再次谢谢您的提问与讨论。

作者: 00无名指00 时间: 2011-11-5 11:17

继续分离我尝试过，我现在采用的方式是用几支Chromolith串起来——相对改动仪器，成本低一些，但那结果仍然就是“无限可分”。
所以有时候面对3支甚至更多的色谱柱串在一起，却仍然能分离出N多的东西，会产生这样一种困惑：分析方法在准确精密的同时，效率和成本也同样重要，对于一些可以通过检测器的选择性和稀释降低基质干扰的情况，追求完美的分辨率到底有多大的价值。
相柱切换技术这样的，是否科研意义更大于实际推广的价值？我一直认为色谱分析应该是一种可推广、具有很高实用价值的手段。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:18

继续分离我尝试过，我现在采用的方式是用几支Chromolith串起来——相对改动仪器，成本低一些，但那结果仍然就是“无限可分”。
所以有时候面对3支甚至更多的色谱柱串在一起，却仍然能分离出N多的东西，会产生这样一种困惑：分析方法在准确精密的同时，效率和成本也同样重要，对于一些可以通过检测器的选择性和稀释降低基质干扰的情况，追求完美的分辨率到底有多大的价值。
相柱切换技术这样的，是否科研意义更大于实际推广的价值？我一直认为色谱分析应该是一种可推广、具有很高实用价值的手段。

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我的感觉是我们可以借着使用多柱子来增加分离度，但是有一个先决条件就是样品本身的特性要了解清楚。譬如我们在做药动样品的时候，必须先把蛋白质给除掉，或者经过固态萃取样品前处理。这样对于同一类化合物，我们可以用不同方式来增加分离度。但是如果像中药复方样品，我们可能就把不同类的化合物放到一个固定的柱子及流动相，自然可以想象分离的困难了。如果有高分子的化合物存在，然后又与小分子在同一保留时间洗脱出来，而这些高分子本身就会有宽峰的出现，自然无论如何努力，恐怕用一根同样的柱子要完全分开是有困难的。因此，样品先前的处理就必须考虑了。想想看，目前的柱子的效率等等都年年在改善进步。要分离同类化合物不是一个难题。基本上只要改用流动相都应该可以解决。而且经过对於流动相酸碱度的控制，加上目前又有耐酸耐碱的柱子，分离不应该是难题。您提到的Chromolith柱子倒是过去10年开发出来的。我自己没有用过。到是希望知道与一般柱子的比较。谢谢您的回言与讨论。

作者: @STAR@ 时间: 2011-11-5 11:18

同样色谱柱联用不能分离，可以采用不同类型的色谱柱串联吧。难分离的东西很多，不过我这边大多通过调整色谱条件、更换色谱柱都解决了。

作者: 店小二 时间: 2011-11-5 11:19

请问前辈，液相色谱用过的废液，在国外怎么处理呢？是冲入下水道？还是交给环保部门？还是有收废液的公司做这样的业务？
望指点。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:20

请问前辈，液相色谱用过的废液，在国外怎么处理呢？是冲入下水道？还是交给环保部门？还是有收废液的公司做这样的业务？
望指点。

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所有有机溶剂都是放入塑料桶，让后定期有废料公司来收集处理。他们专门处理液体，固体化学废物。一切有机物是绝对禁止倒入下水道的。至少20年以前就不可以了。

作者: JQK 时间: 2011-11-5 11:20

现实的情况是我们的废液都会倒在下水道，我们自己都感到害怕，但是给环保部门联系，他们呢置之不理。而关于前一段时间讨论如何削减乙腈等有机溶剂的费用，我在国外的一个论坛上看到，其实比起溶剂的消耗人力成本可能占据更大的费用。但是国内就不一样了，但是我想在US可能废液的处理成本也会相对的高昂吧！
至于楼主说的2D分离，最近也很热门，或许以后会成为标准里通用的方法，但是按照我的观点，只要能够达到控制药品质量的要求就可以了！而中药以及复方药品的质量控制目前也没有好的办法，至于中国药典上给出一个下限，而且一个并不一定是有效成分的下限，在我工作的几年内发现效果几乎没有。因为不同厂家的含量差别可能有10倍甚至更高。
我想问一下前辈，我和国外的同行聊天的时候讨论指纹图谱的问题，但是他们给出的观点说这个方法根本没有可行的。不知道你的意见怎么样？毕竟2010年药典已经收录了这个方法！

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:25

废物的处理的费用是相当高昂。实验室内产生的垃圾都必须当作废物处理。最近我的实验室找废物处理公司处理了一个55加仑大桶内装的实验室垃圾（譬如手套，一次用吸管，等等），一个5加仑的有机溶液。费用一共是750美元。可是这是必须的。另外就是生物实验的废物是另外一种公司负责。费用也是不赀。

关于分析方法的要点是要能够重复。不管使用何种方法，要时时想到方法的重复性。不但是在自己的实验室，而且转换到其他实验室，也要很容易重复。方法复杂了，自然重复就比较困难。因此为啥要强调，减少人为操作的程序（自动化，automated) 来增加重复性的机会。

我们测定方法的可行性就是用标准品开始，所以有所谓的系统适合性等等。中药的复方是复杂的。这里面牵涉到的不止是方法的问题，主要是药材的控制。不是不可行，而是要首先控制药材。就像我们做化学药，原料药的重复性是首要的。有了控制化学原料药的办法，才能谈到最后药品的控制。不知道我是否了解您的问题。

作者: xue258 时间: 2011-11-5 11:36

请问前辈，我现在做的一个课题，有机相和缓冲液比例是40:60，每次都是用量筒量好后混合后用磷酸调节pH的，但是有一个问题就是保留时间有8.5分钟的，有9.5分钟的，还有9分钟的，请问这样问题大吗？

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:37

QUOTE:

原帖由 xue258 于 2011-11-5 11:36 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
请问前辈，我现在做的一个课题，有机相和缓冲液比例是40:60，每次都是用量筒量好后混合后用磷酸调节pH的，但是有一个问题就是保留时间有8.5分钟的，有9.5分钟的，还有9分钟的，请问这样问题大吗？ ...

我们一般配置流动向都是先把缓冲液配好以后，再和有机相混合。这样配置缓冲液的酸碱度比较准。试试看。

作者: www.1 时间: 2011-11-5 11:39

试验现在已经完成了，我这个条件做的只是含量和释放度，这样CDE会为难吗？

作者: 131415 时间: 2011-11-5 11:41

分析方法开发的4S就是Specificity（专属性），Sensitivity（灵敏度），Speed（速度）还有就是$（费用）。提得精辟！
但我有一疑问请教，为什么没有accuracy(准确性)呢？这一点不能保证的话开发的分析方法就没有价值咯，顺带说一句，目前新开发的分析方法过于片面追求创新性。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:42

分析方法开发的4S就是Specificity（专属性），Sensitivity（灵敏度），Speed（速度）还有就是$（费用）。提得精辟！
但我有一疑问请教，为什么没有accuracy(准确性)呢？这一点不能保证的话开发的分析方法就没有价值咯，顺带说一句，目前新开发的分析方法过于片面追求创新性。

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我的猜想是准确性，精确性都包挂在专属性与灵敏度里面了。对于追求创新没有啥不对。最重要还是重复性。要达到重复性就是要满足上面所提的四大要求。我们以前说KISS (keep it simple and stupid)。

作者: 131415 时间: 2011-11-5 11:43

重复性或再现性是准确性的前提，准确性应该包含重复性。不过我想，准确性具有物质或性质结构量的特征，与专属性强调物理、化学质的特征有所不同。所以，个人觉得一个成熟的好的分析方法应该具有适当的准确性。

作者: dog002 时间: 2011-11-5 11:44

曾经的色谱工作者再次学习！根据我的了解，国内中小制药企业色谱废液直接倒入下水道的不在少数.......呵呵

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:45

曾经的色谱工作者再次学习！根据我的了解，国内中小制药企业色谱废液直接倒入下水道的不在少数.......呵呵

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我想总是一个阶段一个阶段进步。美国环保署好像是在73年才成立的。一直到了80年代中期，我们实验室才禁止把废弃有机液排入地下水的。当初甲苯是个多么平常的溶剂，也随时倾倒。现在是严格管制使用。随着改革开放，环保意识的抬高，这些都会慢慢禁止的。也应该禁止。我以前工作的一个公司，在60年代把多氯苯环的化合物放在大铁桶里，埋在地下。经过多年的腐蚀，有机废物就流到地下，变成地下水。结果附近的居民很多得了癌症。诉求公司的赔偿都是上亿。今天不注意这些，日后造成的灾害也不是金钱所能弥补的。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:45

这篇文章发表在美国化学学会的Analytical Chemistry期刊上。那一年实在记不清楚了。应该是在80年代。

作者: #问号# 时间: 2011-11-5 11:46

虽然我不是学分析的,也来旁听一下.同时也弱弱地问一句,以下哪篇是前辈当时看中的?如果都不是,不知道这样会不会激起前辈久远的记忆?
Classification of analytical methods,John B. Phillips

Methods of determining the true accuracy of analytical methods,Howard Mark, Karl Norris, Philip C. Williams,

Validation of analytical methods,John K. Taylor

cuturl('http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac00236a002?prevSearch=Sensitivity%2BSpeed%2BSpecificity&searchHistoryKey=')

cuturl('http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac00180a004?prevSearch=Methods%2Bfor%2BChemical%2BAnalysis&searchHistoryKey=')

cuturl('http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac00257a001?prevSearch=%2528Methods%2Bfor%2BChemical%2BAnalysis%2529%2BAND%2B%255Btitle%253A%2BMethods%255D&searchHistoryKey=')

作者: am10 时间: 2011-11-5 11:46

抛开植化，单纯希望分析技术的进步就能解决复方的复杂分析，从技术上讲是不可行的，违反了指数爆炸定律的。
想想2D-GS能从一滴汽油中分析出1万种的成分，何况复方的水提取液。
不过这也不同于过去那种简单的样品前处理。个人感觉应当建立一个处理模式，类似系统溶剂之类的。
前辈讨论分析的问题总是能高屋建瓴，又一次学习了。
我们这里废的试剂倒是回收的，不过我问了他们回收后怎么处理，结果————还是倒下去的！呵呵

作者: damingxia0904 时间: 2011-11-5 11:47

KISS，呵呵，对我们CRO来讲真是真理啊！！！
我们的废液处理也是找专门公司，据说是焚烧了。但是洗玻璃器皿的铬酸溶液呢？虽然MSDS上说可以大量稀释后冲入下水道，但是这种重金属，冲的时候心里的负罪感非常强烈。现在我们准备淘汰这种用铬酸清洗的方法，不知前辈和诸位有没有什么推荐的洗剂？

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:48

虽然我不是学分析的,也来旁听一下.同时也弱弱地问一句,以下哪篇是前辈当时看中的?如果都不是,不知道这样会不会激起前辈久远的记忆?
Classification of analytical methods,John B. Phillips

Methods of determining the true accuracy of analytical methods,Howard Mark, Karl Norris, Philip C. Williams,

Validation of analytical methods,John K. Taylor

cuturl('http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac00236a002?prevSearch=Sensitivity%2BSpeed%2BSpecificity&searchHistoryKey=')

cuturl('http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac00180a004?prevSearch=Methods%2Bfor%2BChemical%2BAnalysis&searchHistoryKey=')

cuturl('http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac00257a001?prevSearch=%2528Methods%2Bfor%2BChemical%2BAnalysis%2529%2BAND%2B%255Btitle%253A%2BMethods%255D&searchHistoryKey=')

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谢谢您提供的资料。好像都不是。以后有时间我会去查一查的。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:49

应该是这篇文献吧.

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提到了我说的4S，这篇是后来发表的。我说的那篇发表的要早。谢谢。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:49

抛开植化，单纯希望分析技术的进步就能解决复方的复杂分析，从技术上讲是不可行的，违反了指数爆炸定律的。
想想2D-GS能从一滴汽油中分析出1万种的成分，何况复方的水提取液。
不过这也不同于过去那种简单的样品前处理。个人感觉应当建立一个处理模式，类似系统溶剂之类的。
前辈讨论分析的问题总是能高屋建瓴，又一次学习了。
我们这里废的试剂倒是回收的，不过我问了他们回收后怎么处理，结果————还是倒下去的！呵呵

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对复方的分析，您的说法是绝对正确的。事实上，分析方法实在是包含了样品的先前处理。我们当然希望拿个样品把它溶解就直接上样。当然那是最理想的情况。记得以前在大学念分析化学的时候，我们就学到要把样品放在酸碱中性情况下实行有机粗取。就算是萃取出来了，上柱子也还是有许多工作。最简单的就是咋知道都分出来了。根据测不准原理，恐怕要取得完整的物质平衡也不是那么容易。扯远了，不过，我始终觉得这一类属于开发性的问题都是可以解决的。您说要找一个新药，难。那是研究，也许一辈子也搞不出个名堂来。但是开发，就不同了。我做不出来，再找比我更高的手，慢慢的就出来了。在美国工作了30几年，我看到的是，当有一个开发上实际的问题需要解决的时候，那可是全心全力的去解决。以后找时间，我会找几个例子把它写出来与大家共享。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:50

KISS，呵呵，对我们CRO来讲真是真理啊！！！
我们的废液处理也是找专门公司，据说是焚烧了。但是洗玻璃器皿的铬酸溶液呢？虽然MSDS上说可以大量稀释后冲入下水道，但是这种重金属，冲的时候心里的负罪感非常强烈。现在我们准备淘汰这种用铬酸清洗的方法，不知前辈和诸位有没有什么推荐的洗剂？

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我很少用铬酸溶液来清洗玻璃器皿。不过以前做微量分析的时候，我们会把玻璃瓶硅化。对玻璃器皿我们一般就是买Fisher的清洁剂，然后放入专门清洗玻璃器皿的洗碗机清洗。重金属的废弃物也是有专门的废物公司处理的。

作者: 天蝎座 时间: 2011-11-5 11:51

我也不知道铬酸洗液怎么处理呢~~~~~~实验室好多，都绿了，又不敢倒掉~~~~~但不知道联系谁来处理~~~~~

作者: bluelake 时间: 2011-11-5 11:51

对水提取液的前处理，大多数还是采取这样两种方法，一种按照结构：黄酮，萜类，生物碱等，另一种按照分离顺序，石油醚部位，氯仿部位，乙酸乙酯部位等。基本的想法是简化，再简化。日本人搞出了个血清的方法。其实可以按照日本人的思路下去，比如沿着消化道，分别进行酸处理，微生物处理，半透膜处理等，此外还可沿着植物内部的结构与组织途径进行处理。
分析方法有时候遇到“无限可分”，往往说明前期的工作，药理跟踪和分离没有做好，而不仅仅是分析上的问题了。
当然，最尴尬的是好分析的没有效果，有效果的又难以分析，简直让人抓狂。
不好意思，跑题了。

作者: glass 时间: 2011-11-5 11:52

redbutterfly老师，能否将化合物氧化还原的特性化合物本身在热化学产生吸热放热的信号这一点说的详细点,谢谢!

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:53

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原帖由 glass 于 2011-11-5 11:52 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
redbutterfly老师，能否将化合物氧化还原的特性化合物本身在热化学产生吸热放热的信号这一点说的详细点,谢谢!

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您这个问题可真是把我给问倒了。氧化，还原是根据化合物在一定的电压之下完成。我们可以用化合物来完成，也可以用电极在电解槽中完成。我不知道，这种瞬间的氧化还原反应，如何在热化学实验中完成。技术上我也不知道有没有人去做。我做研究生的时候，那是70年代，我们曾经做过Spectro-electrochemical的实验。那是用两个Quartz Cell，当中把电极做成网状。然后放入光谱仪器。通电之后，我们可以取得单一化合物的氧化，还原光谱。有位教授　George Wilson 是这方面的发明者。在热化学方面，我们可以把高分子经过裂解之后，取得红外光谱等等。可是我就没听过您所说的氧化，还原与吸热，放热的实验。我会留意一下，看看是否有人在从事这方面的研究。如果您知道了，也告诉我一声。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:53

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作者: 小糖块 时间: 2011-11-5 11:54

有创意的想法。能否把这方面的资料让大家知道呢？
可用热分析来检测这个反应有点难。在溶液体系中，什么样的检测器能灵敏的地获得如此细微的变化？如何建立适当的参照体系？而且我们在分析过程中一定是一个复杂的体系，浓度非常低，热反应产生的体系温度变化非常细微。
氧化还原反应的检测方法一般是电压信号的判断，电压信号受外界环境的影响很小。可热体系受到的外界环境影响太多了。

作者: 药徒 时间: 2011-11-5 11:54

redbutterfly老师，自己做分析有4年了，一直想知道国外开发方法需要多长时间，几个人合作完成还是一个人负责，方法的好与不好有评价指标吗？

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:55

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原帖由药徒于 2011-11-5 11:54 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
redbutterfly老师，自己做分析有4年了，一直想知道国外开发方法需要多长时间，几个人合作完成还是一个人负责，方法的好与不好有评价指标吗？

您这个问题牵扯的范围很广，也是很好的问题。我自己做分析的方法做了32年。也在10个不同的公司管理分析部门。一般都是一个人负责一个方法，或多个方法。然后提出讨论，交换意见。开发方法的时间不一定，看经验等等。方法好坏，明眼人一看就知道了，可是个人看法也不尽相同。就是要有经验。一个方法的好坏是可以很清楚拿出来讨论的。不是硬说好就是好。每一个细节都可以提出讨论。这方面我自己的经验比较丰富，见的也多。也经常做做评论之类的工作。一个方法有许多因素，总要把每个环节控制好。譬如，仪器的功能就很重要，有了好的仪器可以省掉很多不必要的工作。柱子也很重要。最后就是化学原理了。如果，前面两个因素都控制住了，我们要注意的就是化学这一部分。不然，因素太多，变数也就太多。最后是越搞越糊涂。看看网上大家提的问题就知道了。我们做实验，就是要把变数减到最小。这样做起来就快而且准确。有时间，我会写写自己的心得与大家共享。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:56

氧化还原反应的检测方法一般是电压信号的判断，电压信号受外界环境的影响很小。可热体系受到的外界环境影响太多了。

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电化学实验也是相当灵敏的。外界的环境影响也非常大。您一定听过法拉第笼子吧。另外温度对电子流动是有极大影响的。所以温度的控制也是很总要的。还有就是电极表面的纯净度也是一个重要的关键。电压的改变速度可以很快，所以数据的收集也是很关键的。不过自从Microprocessor发明以来，这些问题都慢慢的解决了。

作者: ROSE李 时间: 2011-11-5 11:56

从您这里学了很多东西,简直是字字珠玑,希望能讲讲生物样品处理的时候那些精密度,日间差,RSD以及质控样品的由来，一直很迷惑，谢谢！还有就是体内样品的RSD的值放得很宽，然后一组动物的误差限又很长，怎么看待这个结果呢。当然我不是专做分析的，期待您的指点，谢谢

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 11:57

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原帖由 ROSE李 于 2011-11-5 11:56 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
从您这里学了很多东西,简直是字字珠玑,希望能讲讲生物样品处理的时候那些精密度,日间差,RSD以及质控样品的由来，一直很迷惑，谢谢！还有就是体内样品的RSD的值放得很宽，然后一组动物的误差限又很长，怎么看待这个结果呢。当然 ...

生物样品的误差一直是大家讨论的问题。大概十年以前FDA就出来一个以生物样品为主的方法开发验证的指导原则。我自己那年也参加了那个会议。每个方法不同，所以精确度与准确度是完全根据某一个特定方法而决定。这也就是方法验证的重要性。目前仪器方面LC/MS/MS的发展非常快。而且各方面的功能也在日新月异。我认为还是样品前的处理比较难控制。早年我们就做自动化。一般而言，样品处理能够自动化，误差就会相对的减小。譬如取样，萃取，固态分离等等都可以自动化。我以前的一位同事GrantShoenheard 在80年代就专门做这一方面的研究。有一个专门自动化仪器公司Zymark就是开发这些应用。

作者: 药徒 时间: 2011-11-5 11:58

9494，特别是对LC/MS/MS而言，可选址的流动相非常有限，源参数的优化也比较局限，制约方法，特别是重复性的主要部分就是在前处理了。如果遇到一些比较麻烦的化合物，比如在系统中有吸附的，哪就是噩梦了。生物分析的RSD放的宽，是因为没有更好的办法了。相对LC/MS/MS，大分子采用的免疫分析方法还更宽松，30％以上的都可以接受。
ccyting前辈参加的FDA指导原则一直是我们现在遵循的“金典”。不知老师对现在要求的incurred sample analysis 有何看法，这个东东实在是套在头上的紧箍咒啊。

作者: 药徒 时间: 2011-11-5 11:59

另外，想大家讨论下我们最近在开发risperidone的动物血浆中的LC/MS/MS方法，CAS 106266-06-2。采用普通C-18色谱柱的时候，似乎该化合物在柱上残留非常严重，试用了将近10个厂家的柱子后决定换为C8。

现在残留的情况似乎解决了，重复性由出问题了。如果一个run比较长，后面的QC样品总是偏高，如果在开始的时候进几针QCH，这种现象会基本消除，是色谱柱也需要“饱和”吗？

其实这个化合物的方法发表的文章，国内外都有，但几乎都没有提到这个问题，其中有一篇比较隐晦的说了两句，语焉不详。文献的可信度啊！！！

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 12:00

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原帖由药徒于 2011-11-5 11:59 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
另外，想大家讨论下我们最近在开发risperidone的动物血浆中的LC/MS/MS方法，CAS 106266-06-2。采用普通C-18色谱柱的时候，似乎该化合物在柱上残留非常严重，试用了将近10个厂家的柱子后决定换为C8。

现在残留的情况似乎解决 ...

cuturl('http://www.aapsj.org/articles/aapsj0903/aapsj0903040/aapsj0903040.pdf')

请看一下上列的文献，可以做为参考。分析的方法要求都是越来越严格。我一再强调几个一个重要的原则，就是要肯定自己所做的能叫别人心服口服。有问题提出来，要能够圆满的答复。这样就可以通过大家都鉴定了。要求越来越严，但是总是有道理而不是吓要求。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 12:00

另外，想大家讨论下我们最近在开发risperidone的动物血浆中的LC/MS/MS方法，CAS 106266-06-2。采用普通C-18色谱柱的时候，似乎该化合物在柱上残留非常严重，试用了将近10个厂家的柱子后决定换为C8。

现在残留的情况似乎解决了，重复性由出问题了。如果一个run比较长，后面的QC样品总是偏高，如果在开始的时候进几针QCH，这种现象会基本消除，是色谱柱也需要“饱和”吗？

其实这个化合物的方法发表的文章，国内外都有，但几乎都没有提到这个问题，其中有一篇比较隐晦的说了两句，语焉不详。文献的可信度啊！！！

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我以前在我的文章里提到，我们做一组分析，从头到尾都要确定系统适合性。就是要把QC标准品从头到尾，都要进样。一个新的柱子，有许多Active sites 。这些活性点，必须全部给遮盖，达到一个平衡点。通常我们就是打样品的标准品。一旦达到平衡之后，再进样的时候，看到的信号就是相对于打进去的样品了。可是当我们用高有机洗脱液清洗柱子的时候，可能这些原来已经平衡的柱子会打破平衡。所以也许又需要在重新建立平衡。

所有C18的柱子，选择性都是差不多的。只是C量的多少，还有颗粒大小，表面积大小不同而已。只要试着一个典型的C18柱子就够了。C18，C8本质上也差不多。只是用C8的时候，可用有机性较小的洗脱液。可是也要考虑样品的溶解度。目前市面上有许多的极性的逆相柱子，选择性就不同了。可以参考使用。液相不比气相，打进去的样品，不可能全部洗脱出来。所以如何使柱子在分离的过程中随时保持可逆性的平衡，这就是做色谱的最主要原理了。看起来很玄，其实就是我们学的普通化学。只要对一般的化学平衡有了彻底的了解，就能举一反三了。以后有时间再和大家一起慢慢的讨论。

作者: zsxan1990 时间: 2011-11-5 12:01

系统适应性(system suitability)的样品我们是在每个run开头走的，是流动相或相应有机溶液配制的。QC样品来自血样，也是从头到尾的，现在的问题是柱子上的所谓
active sites是用什么来覆盖？待检测物（analyte of interest）？还是血样中的基质（matrix），或者是基质影响了样品在柱上的平衡？如果run了几个样品后，用高有机相进1，2针，平衡就被打破，是否意味着方法不过完善呢？

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 12:02

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原帖由 zsxan1990 于 2011-11-5 12:01 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
系统适应性(system suitability)的样品我们是在每个run开头走的，是流动相或相应有机溶液配制的。QC样品来自血样，也是从头到尾的，现在的问题是柱子上的所谓
active sites是用什么来覆盖？待检测物（analyte of interest）？还是 ...

系统适应性应该用QC样品从头到尾来测试。柱子中的active sites 也都是用QC样品来控制。其实QC样品也是从血清样本配置的。当然，如果血清当中的基质成分与分析物一旦进入柱子自然对active sites有竞争的作用。当我们用高有机溶剂洗脱柱子的时候，自然有可能把所有可逆性的分子从固态相中移开。所以，再进样的时候，还是需要QC 样品来平衡柱子的。总之，整个色谱讲的就是化学平衡。当然控制化学平衡的因素很多，譬如热力学，动力学等等。如果从这几个方向去想，就容易融会贯通了。

作者: 大白菜 时间: 2011-11-5 12:02

对国内项目来说,对于进厂原料药和辅料检测方法如果按照药典方法作的话，是不是还要验证或确认呢？
线性考察的时候，溶液浓度可以低于定量限的浓度吗？

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-5 12:03

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原帖由 大白菜 于 2011-11-5 12:02 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
对国内项目来说,对于进厂原料药和辅料检测方法如果按照药典方法作的话，是不是还要验证或确认呢？
线性考察的时候，溶液浓度可以低于定量限的浓度吗？ ...

国内情形我不知道。在美国药典上的方法，基本上是不需要验证的。确认是需要的。线性考察，一般的溶液浓度都是在定量浓度以上（包刮）。否则定量的准确度与精确度就不好控制了。

作者: gemei0115 时间: 2011-11-5 12:04

大概在20年以前，……
…………
……一个公司研究，开发部门的进展，和分析部门的运作是紧紧相扣的。如何彼此互相沟通，提高工作效率，自然是很重要的课题。以后再慢慢讨论。

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这位老师，您好！你对于方法开发的4S讲解的非常好，我很受用，也让我同事一起学习了，非常感谢！
另外还想继续听您讲解关于您最后提到的一个公司的合成研究部门与分析部门之间如何更好地、有效地进行沟通的内容。盼望中……

作者: zzzz 时间: 2011-11-5 12:04

redbutterfly老师：您好。看到您的发的贴，受益良多。我也是做分析方法研发的，不过还是处于初级阶段，还有许多需要学习的地方。
有个问题想请教一下，请问老师，在分析方法验证中关于线性评估的指标，除了相关系数，Y-截距，回归线性斜率等，你们是否会对其他浓度级别相对100%浓度的RRF在一定范围的要求？如，杂质方法验证，其他浓度溶液响应相对100%标准浓度响应90.0-110.0%范围.
2)如果其他指标都通过标准，相关系数达到0.999以上，但是低限的RRF却未通过，如一个杂质线性研究范围在0.05%-1.0%之间，而0.05%此浓度的RRF只有80.0%，达不到90.0-110.0%范围，那么是否说这个方法在0.05%-1.0%之间不成线性吗？能否给低限浓度加一个校正因子，使之回到同等水平？
谢谢。

作者: wood533 时间: 2011-11-5 12:05

我以前在我的文章里提到，我们做一组分析，从头到尾都要确定系统适合性。就是要把QC标准品从头到尾，都要进样。一个新的柱子，有许多Active sites 。这些活性点，必须全部给遮盖，达到一个平衡点。通常我们就是打样品的标准品。一旦达到平衡之后，再进样的时候，看到的信号就是相对于打进去的样品了。可是当我们用高有机洗脱液清洗柱子的时候，可能这些原来已经平衡的柱子会打破平衡。所以也许又需要在重新建立平衡。

所有C18的柱子，选择性都是差不多的。只是C量的多少，还有颗粒大小，表面积大小不同而已。只要试着一个典型的C18柱子就够了。C18，C8本质上也差不多。只是用C8的时候，可用有机性较小的洗脱液。可是也要考虑样品的溶解度。目前市面上有许多的极性的逆相柱子，选择性就不同了。可以参考使用。液相不比气相，打进去的样品，不可能全部洗脱出来。所以如何使柱子在分离的过程中随时保持可逆性的平衡，这就是做色谱的最主要原理了。看起来很玄，其实就是我们学的普通化学。只要对一般的化学平衡有了彻底的了解，就能举一反三了。以后有时间再和大家一起慢慢的讨论。

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太解惑了，几年前，用色谱柱制备蛋白质
一般用5次以后就碱再生
再生后，第一次上样，出的色谱图总不是典型的色谱图
多上几次样后，就达到您说的这种平衡了
当时一直很困惑

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