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标题: [讨论帖]质测定中加校正因子的主成分自身对照法 [打印本页]

作者: bling 时间: 2011-11-15 14:41 标题: [讨论帖]质测定中加校正因子的主成分自身对照法

[讨论帖]质测定中加校正因子的主成分自身对照法的校正因子测定问题

大家来讨论一下吧：篇幅很长，我就不以附件的形式发上来了，只希望大家好好发表一下意见，提出你们已经积累的经验，指导一下后辈，万分感激了，当然，觉得本贴好的话，给我加分和投票吧？谢谢！！

杂质测定中加校正因子的主成分自身对照法：
在杂质研究中，因某一杂质与主成分在某一波长下的响应因子不在0.9-1.1范围内，可考虑采用加校正因子的主成分自身对照法。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需做校正因子的杂质，通常以主成分为参照，采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。（可以理解为校正因子具有法律效应的作用）
关于校正因子的理论知识如下：
色谱定量分析的依据是被测组分量与检测器的响应信号(峰面积或峰高)成正比。但是同一种物质在不同类型检测器上往往有不同的响应灵敏度；同样，不同物质在同一检测器上的响应灵敏度也往往不同，即相同量的不同物质产生不同值的峰面积或峰高。这样，各组分峰面积或峰高的相对百分数并不等于样品中各组分的百分含量。
色谱的检测器对不同物质有不同的响应，换句话说，1mg化合物A在检测器上能产生1000mAu的响应，但同样是1mg的化合物B在该检测器上也许就只能产生847mAu的响应，所以我们不能在检测器输出1000mAu的响应时就认定样品中一定含有1mg化合物，这时就必须引入定量校正因子。校正后的峰面积或峰高可以定量地代表物质的量，校正因子的作用就是反映某物质的量与检测器响应之间的关系。
定量校正因子分为两种：
1、绝对定量校正因子f；f=M/A，（其中M代表被测物质的量，A代表检测器信号响应，可以是峰面积或峰高），其意义为单位响应所反映的物质量。绝对定量校正因子，即单位峰面积所代表的物质量。这是以峰面积表示的定量校正因子，也可以用峰高来表示定量校正因子。此外，也有用它们的倒数来表示的，简称为响应值。绝对定量校正因子的值随色谱实验条件而改变，因而很少使用。
2、相对定量校正因子f'；f'=fi/fs=（Mi/Ai）/(Ms/As)=（Mi*As）/（Ms*Ai）,（其中i代表被测定物质，s代表选定的基准物质）。定义为某物质i与所选定的基准物质s的绝对定量校正因子（即单位峰面积所代表的物质的量）之比。
绝对定量校正因子一般用于外标法，相对定量校正因子一般用于内标法。
色谱法的含量测定中之所以要先用待测成分的对照品来建立校准曲线，然后才用这个曲线来计算待测样品中该化合物的含量，实际上就是在测定样品前先确定校正因子。日常操作中我们都是以：M标/A标=M样/A样直接计算样品含量了，所以没太注意有什么校正因子，事实上只要将公式作一个简单的变形：M样=A样*（M标/A标），不难看出式中的（M标/A标）其实正是定量校正因子f，那么M样=A样*f了。（简单来说可以理解为标准曲线的斜率)
所以，用面积归一化比法做含量测定时，不可简单地认为各成分的峰面积百分比就是它们的含量百分比哦，理由如上所述，各成分含量与响应的比例关系可不一定都相同啊！

作者: bling 时间: 2011-11-15 14:46

理论知识已经放在前面了，那就来实际操作的，在杂质分析的测定中，加校正因子的主成分自身对照法，那校正因子究竟怎么测定呢？
有几个问题需要明确的：
1、测定校正因子时，如何取主成分的浓度，如何取杂质的浓度？药典上说：精密称取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样测定计算。那“适量”是如何确定的呢？范围是多少？
2、主成分取几个浓度，杂质取几个浓度？要做线性吗？校正因子的测定浓度应该要在线性范围内？否则无法定量，而不同浓度进样的校正因子误差要符合什么要求？
3、需要求多少的F值（F值究竟是多大）才能够符合做标准的规定。因为是加校正因子的主成分的自身对照法，F值必须是在一定范围内是一个定数，才能写到标准里面去吧？
4、响应因子与校正因子是成倒数关系，计算响应因子是否需要做RSD，那计算响应因子的主成分和杂质的浓度是选择多少为合适？
5、测定相对校正因子是否需要做方法学验证？验证的内容有哪些？（线性范围？重复性？还有么？需要做线性吗？相似浓度下或线性范围内的校正因子的重复性是不是应该在2%以内？）
6、若已知杂质（合成的中间体，自己可以合成，但买不到对照品，只能做结构确认）无标准品，只用面积归一化法测定该物质的百分含量，再测水分、干燥失重、残渣作为必要的补充和扣除就可以了么？测定时首先准确称量主成分和已知杂质，然后将它们混合均匀进样，分别测出其峰面积，再进行计算。这样就可以了么？
7、测定校正因子后，操作方法可如下：
取供试品溶液和自身对照溶液，分别进样，测量供试品溶液色谱图上杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。
原理：C杂质=f*A杂质/（A供试品/C供试品）
杂质%=C杂质/C供试品*100%
因供试品溶液浓度大，误差大，采用自身对照法。
若为1%自身对照，则C杂质=f*A杂质/（A自对照/（C供试品/100））=f*A杂质*C供试品/A自/100
杂质%=f*A杂质*C供试品/A自/100/C供试品*100%=f*A杂质/A自*1%
若为2%自身对照，可以把上面的C供试品/100换为C供试品/50
杂质%=f*A杂质/A自*2%。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-15 14:47

查了很多的文献一直没有确切的测定杂质校正因子的方法，只凭药典后面那个公式是无济于事的，要确定校正因子我感觉需要有几个问题需要解决：
1、如何求f值，如何做方法学试验
2、如何保证在规定的限度内f值的一致性
3、如何保证f值的耐用性
4、如何保证f值的重现性
5、f值是一个范围还是一个定值，如果是个定值如何确定，有效数字有什么要求。

作者: hulu呼噜 时间: 2011-11-15 14:48

看看我这么说对你是否有点帮助：

对于杂质测定，校正因子法无疑有其积极、低碳、绿色的地方。方法也有很多种。我这里就以【相对响应因子法】为例，来表述众多测定相对响应因子方法中的一种，希望有点参考意义。

１、假如主成份为ＡＡＡ，经过研究之后发现某杂质Ｂ需要定量测定。（至于为什么需要定量测定，这个另说，可以送毕业Ｎ个烟酒生了。）

２、但是，该杂质Ｂ的获取途径相当困难，或者巴拉巴拉。。。。。。总之，就是不能确保提供对照品云云。

３、决定通过相对响应因子法测定它的量、相对保留时间来定位/定性。

４、那么，我们就穷尽一切方法，先得到有限的Ｂ，鉴定、评估纯度等等，按照一个【对照品ｑｕａｌｉｆｙ】应该的过程履行程序、、、、、

５、然后，在未来企图设定的【有关物质】测定方法的框架下，配制与之ＡＡＡ和Ｂ的溶液。例如，有关物质测定方法描述为：七七八八的稀释、配制之后，得到ＡＡＡ浓度大约为[Ａ]%的溶液，作为供试液。那么，我们就配制大约为[Ａ]％的１％～０.０２％范围的ＡＡＡ以及Ｂ的一系列溶液。
　　考察诸如：线性、重复性、精密度、准确度等。毕竟，我们这个杂质最终的目标是要定量的，所以，要求确认的东西就多点了。

６、考察完毕后，自然得到了ＡＡＡ和Ｂ在该情况下的浓度-面积之类的方程。

７、至于相对保留时间，咱就不多说了。
　　但是，对于相对响应因子，其实，用６得到的两个方程的斜率来除一下就可以了。

说明一下：
方法确定相对响应因子的方法当然有很多种，上面我提及的只是其中一种。
见到国使用该方法顺利得到ＦＤＡ关于Ｎ多品种（ＡＰＩ、ＤＰ）新药的上市批准。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-15 14:48

有几个问题还是需要搞明白的：
“但是，对于相对响应因子，其实，用６得到的两个方程的斜率来除一下就可以了。”这个应该指的是理想情况，两个方程中不但有斜率，还有截距，需要考虑到截距的影响。可以说，只有截距在允许的误差范围内，这个才适用。
杂质测定的浓度一般要求比较低的，在低浓度下线性方程的截距一般都是比较大的，这样A杂/A主并不是简单的K杂/K主的关系。
即便是在当前的系统条件下得到了一个f值，能保证在流动相配比、色谱柱批号的变化、仪器的变化时得到相同的f吗
对f值应该是有一定的要求的，不知道国外是怎么个要求的，方法学验证需要什么内容

作者: 2541 时间: 2011-11-15 14:48 标题: 回复 #5 redbutterfly 的帖子

对于截距的判断，
自然而然的在俩方程出来的时候进行判定了。截距除以该“直线”的最小浓度点的商，就是一个尺子之一。这事一个方程合理的基本要求。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-15 14:49 标题: 回复 #6 2541 的帖子

这还是不能解决截距如果影响很大校正因子的计算
截距不合理是客观存在的，而且这样的品种很多
举个例子，中国药典2010年版二部氨甲环酸有关物质检查，其中各杂质就规定了校正因子，但如果做氨甲环酸的自身对照的线性关系试验，得出的线性方程为：A= 228.53C + 2649.1，r=0.9992，最小浓度为30ug/ml，截距对面积的影响是27%。或者即使是按照审评中心黄晓龙老师的“有关物质分析方法验证的可接受标准简介”中要求截距应在100％响应值的25％以内，这个差别也是相当大的。所以直接以斜率比值来求校正因子是不科学的
个人认为杂质限度检查是一个限度检查，不是含量测定，所以f值要兼顾在我们所要求的浓度范围内保证杂质量的合理性，f值应该是一个综合了各方面因素有取舍而获得数值

作者: 小野花 时间: 2011-11-15 14:49

个人认为杂质限度检查是一个限度检查，不是含量测定。说是这么说的，不过有关物质方法学验证可是不单做专属性和检测限的。如果截距过大，可能有别的干扰，或者你的标准曲线最低点就要舍去了。F值跟色谱条件是捆在一起的，色谱柱的变化影响可能不太大，不过流动相的改变很可能造成大变化。尤其是一个有离子对另一个没有的时候，此时，就需要重新考察相对因子了。

作者: bling 时间: 2011-11-15 14:50

有一个比较简便的方法：
假设杂质的限度是0.5%，那就把主成分和杂质的浓度配成0.5%的浓度（同一溶液），连续进样6针，计算平均峰面积，峰面积相除就可以了。如杂质限度是0.5%，供试品浓度是0.2mg/ml，那就把主成分和杂质的浓度均配成1ug/ml，连续进样6针，计算峰面积，计算即得。
同时，采用校正因子的主成分自身对照法，要采用相对保留时间，必须要把柱子型号、牌子、粒度等参数写到标准里去，可以省去方法学验证了。
同时，用作测定校正因子的杂质，纯度系数必须为一个明确的值，如93%，97%都可以，即用面积归一化法测定该物质的百分含量，再测水分、干燥失重、残渣作为必要的补充和扣除，当然如果有容量法测定含量，两者比较，不要差异太大即可。

作者: ero11 时间: 2011-11-15 14:50

一个问题一个问题的回答
测定校正因子时，如何取主成分的浓度，如何取杂质的浓度？药典上说：精密称取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样测定计算。那“适量”是如何确定的呢？范围是多少？
答：杂质及主成分的浓度的确定：供试品溶液的浓度*限度%。

作者: ero11 时间: 2011-11-15 14:51

2和3、主成分取几个浓度，杂质取几个浓度？要做线性吗？校正因子的测定浓度应该要在线性范围内？否则无法定量，而不同浓度进样的校正因子误差要符合什么要求？

答：一个浓度就行，校正因子在0.8~1.2范围内。

作者: ero11 时间: 2011-11-15 14:52

2和3、主成分取几个浓度，杂质取几个浓度？要做线性吗？校正因子的测定浓度应该要在线性范围内？否则无法定量，而不同浓度进样的校正因子误差要符合什么要求？

答：一个浓度就行，校正因子在0.8~1.2范围内。

作者: ero11 时间: 2011-11-15 14:52

响应因子与校正因子是成倒数关系，计算响应因子是否需要做RSD，那计算响应因子的主成分和杂质的浓度是选择多少为合适？

答：响应因子需做RSD，浓度选着同（1）中的计算方法。

作者: ero11 时间: 2011-11-15 14:52

测定相对校正因子是否需要做方法学验证？验证的内容有哪些？（线性范围？重复性？还有么？需要做线性吗？相似浓度下或线性范围内的校正因子的重复性是不是应该在2%以内？）

答：无需做方法学验证。因为在有关物质检测时方法学都要做，没必要重复。

作者: ero11 时间: 2011-11-15 14:53

若已知杂质（合成的中间体，自己可以合成，但买不到对照品，只能做结构确认）无标准品，只用面积归一化法测定该物质的百分含量，再测水分、干燥失重、残渣作为必要的补充和扣除就可以了么？测定时首先准确称量主成分和已知杂质，然后将它们混合均匀进样，分别测出其峰面积，再进行计算。这样就可以了么？

答：依法标定杂质对照品即可。为何要混合进样？个人认为不妥。

以上是个人观点，欢迎同行讨论。

作者: redbutterfly 时间: 2011-11-15 14:53

有一个比较简便的方法：
假设杂质的限度是0.5%，那就把主成分和杂质的浓度配成0.5%的浓度（同一溶液），连续进样6针，计算平均峰面积，峰面积相除就可以了。如杂质限度是0.5%，供试品浓度是0.2mg/ml，那就把主成分和杂质的浓度均配成1ug/ml，连续进样6针，计算峰面积，计算即得。
同时，采用校正因子的主成分自身对照法，要采用相对保留时间，必须要把柱子型号、牌子、粒度等参数写到标准里去，可以省去方法学验证了。
同时，用作测定校正因子的杂质，纯度系数必须为一个明确的值，如93%，97%都可以，即用面积归一化法测定该物质的百分含量，再测水分、干燥失重、残渣作为必要的补充和扣除，当然如果有容量法测定含量，两者比较，不要差异太大即可。

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帮你顶一下哈。
把主成分和杂质浓度配成相同浓度的溶液其实就是利用了杂质是一个限度而不是定量的要求，我最高杂质限度都合格了你还能说什么吧？！
但感觉这样做是不严谨的，在小于或大于这个杂质量的时候f值是啥不知道，只是象征性的算出个数来，反正我最大杂质都合格了，比它小的还能不合格？
举个例子，当我们在进行质量研究的时候，不知道杂质的限度是多少，那怎么配杂质的浓度呢？总不能未卜先知吧，或稳定性完成要上报资料的时候我再补上，把以前的全部重新算一遍重写下记录吧

作者: qumm1985 时间: 2011-11-15 14:54

请哪位前辈给个比较正确的总结，好吗？
杂质测定法加校正因子的情况没做过，我看得有点晕，因为以前我在做有关物质测定时研究的比较少，因为是未知杂质，也没有杂质对照品，我们拟定它们的响应值是一致的不加校正因子的自身对照法。

作者: wsll 时间: 2011-11-15 14:54

大家对杂质分析要求不要太高，未知的永远大于已知的。其实，不论是杂质还是主成分，也不论是什么计算方法，我们要知道的结果就是含量；杂质要知道的也同样是含量。要准确知道含量，就必需用对照品法，这是最准确的。可是对于杂质，我们上哪去找杂质对照呀，所以就什么只身对照呀什么的了，没办法呀。

作者: yueban-1147 时间: 2011-11-15 14:55

自标有关物质对照品归一法含量大于95%以上，干燥失重与供试品相近，其实就按100%计算，如果含量少于95%，就要考滤水分，干燥失重，等，要进行合理的折算。

作者: HPLC使者 时间: 2011-11-15 14:56

感谢楼主的问题，我觉得其实说起来方法都可以理解，但是其中最最难的就在于获得有限的杂质对照品。

作者: 大白菜 时间: 2011-11-15 14:57

曾经做过，但是发现其实做耐用性时实验的设计方案很重要，还要多考虑仪器和柱子等差异，因为响应值与杂质的量的关系很大，尤其是相对响应因子，低浓度时线性的斜率不是很准，而且保留时间也会相差很大，这种方法的重现性很值得考察

作者: gemei0115 时间: 2011-11-15 14:58

来学习下吧，对有关物质的测定还是不很清楚

作者: yapuyapu 时间: 2011-11-15 14:58

RF（response factor）=A/C

if：RF1=A1/C1，RF2=A2/C2
then，RRF（1-2）=RF1/RF2=（A1/A2）*（C2/C1）

when you process the method validation of impurity,you can take the result of the linearity as the RRF.just the average value of the limit concentratin and the lower and the higer level,like80%,100%,120%.

when you cal the limit of the impurity,you only need the A1,A2 and the C2,then
C1=(1/RRF1-2)*A1/A2*C2

作者: 小糖块 时间: 2011-11-15 14:59

有没有响应因子或校正因子方面的指导原则？谁能提供传上来看看。

作者: skytree 时间: 2011-11-15 15:00

关注校正因子，最近做个杂质的校正因子，不同仪器的校正因子不太一致，困惑中啊

作者: zsxan1990 时间: 2011-11-15 15:00

耐用性试验应该要做的，还有重复性试验
另外，应该在+ -20%进行试验，看一下在此范围内校正因子的偏差如何，（主要考虑到配样误差选此浓度范围）如果基本一致，可选用此数值作为校正因子

作者: bling 时间: 2011-11-15 15:01 标题: 回复 #26 zsxan1990 的帖子

请问这个出处在哪里找到？依据是什么？

作者: ero11 时间: 2011-11-15 15:01

校正因子需在两套不同的液相色谱仪上做，那么每个系统要做几条线性呢？一条还是两条？

作者: 101010 时间: 2011-11-15 15:01

国外认证，比如符合FDA要求的【对照品ｑｕａｌｉｆｙ】的基本原则能否解读下呢？

因为对照品的标化值对于后续的计算真的非常的重要，目前杂质很难制备的通常都采用制备色谱法，只有几十mg左右，做错了十几万就没了。特别希望得到您的帮助！

另外若杂质对照品不含结晶水，标定中是否纯度大于95%以上，不用进行残渣等的折算，直接按纯度进行计算？

对于合成的纯度只有70-80%左右的杂质对照品能否拿来进行校正因子的计算呢？这时候线性方程仍然是能够得到的。

作者: chuntian1983 时间: 2011-11-15 15:02

最近正好遇到这样的问题，拜读了大家的帖子，

根据皮蛋的说法，我这样操作可以吗？

线性：配制大约为 [Ａ]％的１％～０.０２％范围的ＡＡＡ以及Ｂ的一系列混合溶液，比如配制了5个浓度，那我就用这5个浓度来做线性考察；

重复性：在１％～０.０２％范围内选以浓度，配制6份混合溶液，分别计算主成份与杂质的响应因子的平均值，用平均值计算F值；

中间精密度：变动日期、变动设备按“重复性”方法操作一次；

准确度：配制3个不同浓度的混合溶液，各测定3次，计算9次结果的相应因子的RSD值；

耐用性：不同厂牌、不同批号的同类型色谱柱，照“重复性”方法操作一次。

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