分析测试百科

标题: [求助有关胰岛素的液相问题 [打印本页]

作者: xingyi08 时间: 2011-11-15 15:21 标题: [求助有关胰岛素的液相问题

[求助有关胰岛素的液相问题

我需要做高效液相检测胰岛素，2010版中国药典的方法如下：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（5～10μm）；0.2mol/L硫酸盐缓冲液（取无水硫酸钠28.4g，加水溶解后，加磷酸2.7ml，乙醇胺调节pH值至2.3，加水至1000ml）-乙腈（74∶26）为流动相，柱温为40℃；检测波长为214nm。
我有以下3个问题：
1.关于0.2mol/L硫酸盐缓冲液配制，是不是错了，应该先定容1000ml，再调节pH？
2.关于色谱柱，文献中大多采用ODS柱，实验室的色谱柱为Hipersil BDS C18柱，我是否能用？
3.查到Hipersil BDS C18的pH适用范围为2-9，如果流动相中0.2mol/L硫酸盐缓冲液的pH为2.3，对柱子的损害性较大吗？
希望能够帮忙解答，谢谢

作者: biabiade 时间: 2011-11-15 15:22

1：个人认为应该先定再调，不然ph不好调控。
2：可以，都是c18，先试试看，不行再试其他
3：最好不要超范围，但是实验还得做，损耗在所难免，用完注意养护即可。

作者: 2541 时间: 2011-11-15 15:22 标题: 回复 #2 biabiade 的帖子

1. 我觉得先调再定合适些，若配制1L的缓冲液，一般标准会要求加入900或是950mL水去溶解，再用酸或碱去调整pH值，最终用水定容，。你后加入的这部分水不会影响你的最终pH值，否则就不用称之为缓冲液了，这样做就保证了你的最终浓度是0.2mol/L硫酸盐缓冲液。先加入1000mL水再去定容的话，最终的浓度难以确定，因为标准无法说明到底加了多少乙醇胺才将pH值调至2.3。其实两种方式对于HPLC测定结果影响不大，但先定再调的话不利于标准的制定。

2,3基本同意biabiade战友。

作者: u234 时间: 2011-11-15 15:23

0.2mol/L硫酸盐缓冲液（取无水硫酸钠28.4g，加水溶解后，加磷酸2.7ml，乙醇胺调节pH值至2.3，加水至1000ml）-乙腈（74∶26）为流动相，------这说的很清楚的：加水至1000ml。

对于这个胰岛素流动相的配制，目前我正在研究的项目，其实，针对乙醇胺调ph一事，当你看美国药典时，你会发现，美国药典中是这样说的，“如有必要，用乙醇胺调ph至2.3”也就是说，在配制中，水相的ph值调整不一定会用到乙醇胺来进行调节，有时根本用不上乙醇胺这试剂，其水相ph就在2.3附近，我配水相时，未加乙醇胺时ph就在2.27或2.28，都用不上乙醇胺，就是用了，也是非常少的量，就算是用水先定容到1000ml后，再用乙醇胺来调ph值，对分析检测也没多大影响，原因之一我觉得首先你的量筒本身就存在一定的允许误差。其次，用乙醇胺调，其消耗量非常非常的少，可能就在你量筒的允许误差范围之内，相对而言可忽略不计。真正对药物出峰时间有影响的是无水硫酸钠的量，每次水相的配制，无水硫酸钠的量需称量准确，每次称量数据都最好不要有太大的差异（这关系到主峰出峰时间的差异）。

其次，你所考虑的问题，我觉得在方法学验证中的耐用性试验项下也可以得到答案。

作者: 2541 时间: 2011-11-15 15:23 标题: 回复 #4 u234 的帖子

流动相中，真正影响主峰出峰时间的是溶液的pH值。缓冲液的作用是使溶液稳定在某个值，加入水或少量的酸和碱都不会对其产生影响，对于无水硫酸钠的量无需特别准确。

作者: 马大牙 时间: 2011-11-15 15:24

我一直不太明白硫酸钠是不是缓冲盐？我也在做胰岛素，我是先定容到1000ml,然后再调ph值，我觉得这样PH更准一些，我也试验过按药典的方法做，PH差别不大，但是还是有一点差别的，ph值会到2.31。你也是一下，看看对不对。

作者: u234 时间: 2011-11-15 15:24

你说的ph对出峰时间有影响，这句话本事是没有错的。但我觉得你好像没有看明白我说的话的意思。也许是我表达的不够清楚。我的意思是说在溶液ph值即使在要求内（ph2.3）下，每次称量无水硫酸钠的量不同对其保留时间也是有影响的。比方说称量的无水硫酸钠的量一次28.4克不到，另一次28.5克不到，虽然最终ph都在2.3，但是还是会对主药出峰时间有影响，两次的主药出峰时间，差别不是很大，但会有所不同。这就是我说的“无水硫酸钠的量需称量准确，每次称量数据都最好不要有太大的差异”。

你所说的是缓冲盐的一个性质，和我说不是一码事。还有就是,如果这位战友感兴趣，你可以做下该药，你就会明白针对胰岛素这个药，我所说的话意思了。因为我在试验当中就遇到这情况，虽然最终水相ph都基本一致（大概ph2.28），但两次的保留时间就有一些差异（前提流动相的配制都是由同一人配制，每次配制都比较细致入微，尽量减少人为误差）。

关于这个问题，我不想和你争辩什么，也许不同药对其影响不同，我觉得不能一概而论。

作者: u234 时间: 2011-11-15 15:25

还有就是，用无水硫酸钠配制的水相，我觉得不应该叫缓冲盐，其只是加入盐而已，而不是缓冲盐，硫酸钠属于强酸强碱盐。

作者: u234 时间: 2011-11-15 15:25

给你举个在试验中遇到的情况，这个可以很好的诠释我说的话的意思：公司新来的同事，有天帮我配制该药的流动相，因不够谨慎，误将无水硫酸钠应称取28.4克，而称了28.0克，其他都一样的配制，最终水相ph也在2.30了，然后也开始样品分析了。当第二次，我自己来配制时,无水硫酸钠称的是28.4几克，也是同样的配制，最终水相ph也在2.29，进行样品分析时，发现保留时间相差好几分钟，就觉得奇怪，为此就查找原因，仔细观察她的试验记录后发现，是无水硫酸钠的量称错了，其他配制都没什么问题（当时是按我的记录本上的操作步骤进行，排除了不同配制方法的误差）。举这个例子，就是为了证明我说的对胰岛素而言，无水硫酸钠的量是对其保留时间有影响的。如果那位战友，还是觉得不靠谱，在该药上，坚持自己的观点，那只能建议你，你可以通过试验来判断了。

作者: 2541 时间: 2011-11-15 15:26 标题: 回复 #9 u234 的帖子

没有仔细分析，见笑了。胰岛素乃蛋白质也，属于两性物质，确实不能一概而论。以前没做过蛋白质，今天好好的研究了下，下面现学现卖，试着来说下该流动相的机理，欢迎战友们拍砖。
1. 首先，蛋白质与反相固定相的结合主要取决于蛋白质的极性，而低pH值能够使蛋白质质子化（pH为3.0时，几乎所有的蛋白质中的-COOH都不解离，也就是说，几乎所有的多肽和蛋白质在此时都显正电。）进而使其极性降低，与固定相结合增强。低pH还能抑制硅羟基的电离，降低拖尾。
2. 选择高浓度的硫酸钠，是为了增强胰岛素和固定相的疏水作用，也就是在一定程度上又增强了其保留时间。
另外，缓冲盐除了起缓冲作用还通过与胰岛素形成离子对进而改变其极性，这就是summerxq战友所说的，为什么硫酸钠称样量的改变会引起保留时间的变化。但0.4g会使结果差好几分钟感觉还是有点悬，因为两个条件不是在同一天做的吧，会不会有其他地方产生的影响不好说（这里我只是随便提下，我没做过，不再多说）

3. 选择乙腈，主要是考虑该条件在低波长下检测，乙腈的截止波长190nm，能够降低干扰，增强检测的灵敏度。并且乙腈粘度低，色谱峰宽小。

作者: 2541 时间: 2011-11-15 15:26

另外，对于这个硫酸盐缓冲液我也不是很理解，那三者是如何组成缓冲液的？很让我费解，还请各位战友踊跃发言。

作者: u234 时间: 2011-11-15 15:27

发现保留时间相差好几分钟”，试验是在同一液相色谱仪，同一根柱子下进行的。唯一不同的就是无水硫酸钠的量。

我把自己在试验中的一些体会和对其认识拿出来，和大家分享，对在胰岛素项目上有困惑的战友，或许会有所帮助和提示。在研究该项目的试验中还发现，胰岛素对流动相的极性非常的敏感，乙腈比例的细微变动都会引起保留时间的大变化，柱温也会对其保留时间有大的影响，5度的差异都会引起保留时间几分钟的差异，并且柱温高，保留时间靠后，原因我也在思考中。

作者: xingyi08 时间: 2011-11-15 15:27

非常感谢大家对我的建议和帮助，我想对我的实验帮助很大。另外目前我作了胰岛素在400~190nm的紫外扫描，分别采用了0.01M的盐酸溶液、PBS7.4的磷酸盐缓冲液以及流动相三种溶液作为溶剂，发现胰岛素的最大吸收波长几乎都在在195nm左右，觉得非常奇怪，我用的紫外是岛津UV-2550，也是按照规定操作的，这与胰岛素液相的检测波长214nm出入有点大，不知道是什么原因？还是仪器的原因？希望能再次得到各位的帮助，谢谢！

作者: bananapeople 时间: 2011-11-15 15:27

用标准溶液测试一下看，仪器设备是否需要校准了

具体方法，药典上好像有

作者: u234 时间: 2011-11-15 15:28

200--400nm属于紫外光区

欢迎光临分析测试百科 (http://bbs.antpedia.com/)