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标题: [讨论帖]高效液相中内标的作用 [打印本页]

作者: #问号# 时间: 2011-11-24 15:24 标题: [讨论帖]高效液相中内标的作用

[讨论帖]高效液相中内标的作用

最近在做药代动力学的实验，要做内标。我发现我和老板对内标的认知有些分歧。我认为计算出内标与被测物的比例后，就能用内标来计算样品中被测物含量。所以，我在样品定容时才加入内标，以确保内标的准确。但老板认为内标只是用来监控样品提取回收率的（method extraction recovery）的指标，内标应该在一开始就加入样品中和样品一起进行提取。样品的加样回收率我已经做过了，还有必要用内标来控制每次提取的回收率吗？
上网查了一下，国内的文章大多数时按我的想法做的。但国外的文章，维基百科就和老板的想法一样。搞得我现在都弄不清做内标的目的到底是什么？
规求高手指点！！

作者: ha111 时间: 2011-11-24 15:24

我想不管是内标还是外标，都是进行对照用，也就是为了测定样品，如果你的内标最后加，我想是不合适的，起不到对照的作用了，何必内加呢，直接外标得了，你说是不是？个人观点

作者: #问号# 时间: 2011-11-24 15:25

我现在是内标外标都做。都不知道有没有这个必要。所以想弄清楚做内标的意义是什么？
是为了定量，还是做提取回收率

作者: wood533 时间: 2011-11-24 15:26

当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的待测组分溶液使用同一份内标物质溶液时，则配制内标物质溶液不必精密称（量）取　　

采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。

需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。

作者: tuomu45 时间: 2011-11-24 15:26

药典上有写！

采用内标法，可以避免样品前处理及进样体积误差对测的影响！

所以，应该在提取前加入，你老板的方法应该是对，但是，目的不是为了回收率而是为了避免测定误差！

个人观点！供参考！

作者: bananapeople 时间: 2011-11-24 15:27

我想不管是内标还是外标，都是进行对照用，也就是为了测定样品，如果你的内标最后加，我想是不合适的，起不到对照的作用了，何必内加呢，直接外标得了，你说是不是？个人观点

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药典上有写！

采用内标法，可以避免样品前处理及进样体积误差对测的影响！

所以，应该在提取前加入，你老板的方法应该是对，但是，目的不是为了回收率而是为了避免测定误差！

个人观点！供参考！

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我举反对意见！

我觉得内标应该后加。

既然都是起到对照的作用，那如果提前加内标进去，怎么保证内标在提取过程中的损失与样品一致呢？如果不一致怎么做对照呢？

既然目的是为了避免样品前处理的误差就应该后加入，提前加入怎么避免？

希望大家各抒己见，我很想知道答案。。。。

作者: wanglaoshi 时间: 2011-11-24 15:30 标题: 回复 #6 bananapeople 的帖子

所以内标物才需要和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质，损失也基本一致

作者: H2O 时间: 2011-11-24 15:30

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9085

作者: 星星点灯 时间: 2011-11-24 15:31

药典上有写！

采用内标法，可以避免样品前处理及进样体积误差对测的影响！

所以，应该在提取前加入，你老板的方法应该是对，但是，目的不是为了回收率而是为了避免测定误差！

个人观点！供参考！

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我认为楼上说的很对

作者: qumm1985 时间: 2011-11-24 15:32

觉得这个问题应该不是很复杂啊

不管具体测定使用什么方法，都是为了测定结果的可靠性

那么如何来保证测定结果的可靠性呢

比如使用对照品，内标或外标

这样的道理其实跟空白的道理相类似吧

如果对照不跟样品进行同样的操作，用对照有何用？

同理对于空白的理解也是一样的

还有疑问？

作者: yes4 时间: 2011-11-24 15:32

同意先加，因为先加更准确！

作者: bananapeople 时间: 2011-11-24 15:33

个人认为应该是一起处理的，以免造成处理方式的不同而造成的结果的不准确，排除系统性的问题。

作者: 2541 时间: 2011-11-24 15:34

1、如果处理过程对内标没有影响

先加与后加对结果没有影响；加内标可以减小进样不准对结果的影响。

2、如果处理过程对内标有影响

(1)对照溶液不用同样处理，假如处理过程对内标有明显影响，比如处理后降低10%，将会使计算结果高10%。

(2)如果对照溶液与样品一样前处理，且空白无干扰，个人认为先加与后加对结果没有影响。

作者: dog002 时间: 2011-11-24 15:34

我觉得应该内加，因为以前实验室里是内加的

作者: 星星点灯 时间: 2011-11-24 15:35

应该先加内标再进行前处理。

理由：可能存在基质效应，即血样中本身含有的一些物质对分析物的测定结果有影响，可以是增强效应，也可以是抑制效应。先加内标，并将内标的出峰时间尽量控制在分析物附近，最后计算时，可抵消介质效应对分析物定量的影响。

建议楼主做一个基质效应验证。

作者: Ao7 时间: 2011-11-24 15:35

药典上有写！

采用内标法，可以避免样品前处理及进样体积误差对测的影响！

所以，应该在提取前加入，你老板的方法应该是对，但是，目的不是为了回收率而是为了避免测定误差！

个人观点！供参考！

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内标肯定是在提取前加入，没错的！同意此观点。

作者: newway 时间: 2011-11-24 15:36

肯定应该先加啊，讨论还这么激烈，这么多人不理解先加，呵呵，很不理解他们怎么不理解啊

不知道几楼的这个战友说的很对：

采用内标法，可以避免样品前处理及进样体积误差对测的影响！

所以，应该在提取前加入，你老板的方法应该是对，但是，目的不是为了回收率而是为了避免测定误差！

采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。

所以内标物才需要和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质，损失也基本一致

作者: zranqi_1 时间: 2011-11-24 15:36

学习各位大侠！！！我认为应该先加内标！

作者: yapuyapu 时间: 2011-11-24 15:37

我认为应先加内标,这样能够消除在样品处理时,各样品由于处理时造成的误差.如果后加的话,这种由于实验方法造成各样品中各浓度误差大小而不能够被消除.我在写文章时,查阅了很多文献,内标都是先加的.

作者: 粉色萤火虫 时间: 2011-11-24 15:38

假如我加x mg内标和样品一起提取，然后进高效测定Y物质含量，那计算时内标的量用多少带进去算？

作者: u234 时间: 2011-11-24 15:38

加内标在通常情况下是为了抵扣进样或提取等引起的误差。
1、提取误差，比如样品经过萃取、浓缩等等过程，这些过程中应该是有损失的，加入内标物质就是为了校正这种误差。比如做血药浓度时就往往要加入内标。
2、进样误差早期的液相色谱没有六通阀，更谈不上自动进样（比较有名的比如WATERS的U-6K进样器），进样体积就是进样针打入的体积，这个误差是非常大的，为了校正进样误差加入内标物质。现在液相色谱有了6通阀和自动进样器，进样误差问题得到了很好的解决，因此不再需要加入内标。绝大多数情况下加入内标是为了校正这个误差。很多加内标的药品标准都是早期制定的标准，这是由于当时仪器的限制不得以而为之。90年代以来液相就很少有新标准用内标法进行试验了。对于气相色谱而言进样误差是巨大的，如果不加内标几乎可以说无法定量测定。
内标选择有这么几个最基本的原则，性质稳定、与样品不反应、色谱行为与待测主分色谱行为相近且分离良好、还有就是内标的响应与主峰的响应相近。具体的可以看一下分析化学教科书。

仔细看完上述的，在何时加内标还有争议吗？

作者: 66+77 时间: 2011-11-24 15:39

我也认为应该先加.因为加内标就是为了控制监测在处理样品过程中样品的损失和误差,

起到同步损失的目的.我同意先加内标.

个人观点,仅供参考

作者: bananapeople 时间: 2011-11-24 15:39

假如我加x mg内标和样品一起提取，然后进高效测定Y物质含量，那计算时内标的量用多少带进去算？

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内标的量就用X mg带进去计算

内标的量加在对照中和样品中是一样的量，所以在计算中能够约去。

实际是依靠同样加的内标量在对照和样品中出峰面积的变化来修正处理误差和进样误差的

作者: xevin 时间: 2011-11-24 15:40

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作者: ha111 时间: 2011-11-24 15:40 标题: 回复 #24 xevin 的帖子

你的意思说，用来稀释处理的话，内标先加或者后加没有区别？

你觉得不需要加入操作这个因素？

还有系统误差呢？不考虑？

作者: 04906 时间: 2011-11-24 15:41

针对生物样品。目标成分通常含量低，采用内标法可以减小操作误差带来的巨大差异，可统一提高测定能力。方法上你老板是对的

作者: 101010 时间: 2011-11-24 15:41

内标应该在提取前加入,这样可以减少试验操作过程中的误差.

作者: tie8 时间: 2011-11-24 15:42

你的意思说，用来稀释处理的话，内标先加或者后加没有区别？

你觉得不需要加入操作这个因素？

还有系统误差呢？不考虑？

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指的是将样品和内标混合后，对该混合液进行的稀释（浓缩也是一样的道理，称之为浓度变化更合适）

没有考虑人为因素

加内标后再进行样品处理，就不需要再考虑处理过程中溶液体积变化（浓度的变化），不管这种变化可控或不可控，消除了部分系统误差

作者: 我佛慈悲 时间: 2011-11-24 15:43

你老板是对的。样品需要复杂前处理的时候，显然是有损耗的~如果定容时再加，虽然能算出你测试溶液中的浓度，但跟初始样品已经不一样了 hoho

作者: 王蜜蜜 时间: 2011-11-24 15:43

那我想歪个楼，那回收率是如何计算的？在你未知样品的时候,你需要测定未知样品的浓度。如果内标不是用来计算回收率的话，那么怎么计算回收率？

作者: langlang 时间: 2011-11-24 15:44

应该先加，不然没有可比性了

作者: ha111 时间: 2011-11-24 15:44

没把过程说清楚，见谅

指的是将样品和内标混合后，对该混合液进行的稀释（浓缩也是一样的道理，称之为浓度变化更合适）

没有考虑人为因素

加内标后再进行样品处理，就不需要再考虑处理过程中溶液体积变化（浓度的变化），不管这种变化可控或不可控，消除了部分系统误差

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那你觉得需要不需要考虑认为因素呢？

还有你是赞同先加呢还是后加？

作者: pencil菲 时间: 2011-11-24 15:45

体内药物分析，样品预处理过程中的损耗误差(一般为10 - 40%) ，内标的最大作用在于对这种损耗进行监控和校正。

作者: vcve 时间: 2011-11-24 15:45

药典上有写！

采用内标法，可以避免样品前处理及进样体积误差对测的影响！

所以，应该在提取前加入，你老板的方法应该是对，但是，目的不是为了回收率而是为了避免测定误差！

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个人观点！供参考！
十分正确，有些国内杂志发的药代做的很不规范。而且不仅要考察样品的回收率，还应同时考察内标的回收率。

作者: TNT 时间: 2011-11-24 15:45

本人也认为是从样品开始处理前就加进去，这样可以去除提取过程和进样的误差

作者: laughing妹 时间: 2011-11-24 15:46

药动属于体内药分，体内一般要先加内标，回收率用的是绝对回收率，即提取回收率。而体外做法一般都是你的那种做法，回收率一般做加样回收率

作者: huifeng0516 时间: 2011-11-24 15:46

个人认为，对于自动进样而前处理过程较复杂的样品，加入内标主要是排除前处理导致的误差，所以应该是先加的

作者: gemei0115 时间: 2011-11-24 15:47

内标就是防止误差，在取少量溶液时，因操作者产生的误差是不小的，或者有事溶液量不够，但有内标跟着，含量就可以成比例，计算出来。

作者: 66+77 时间: 2011-11-24 15:47

我觉得是你老板的对，样品在处理的过程中，被测成分就会相应的损失一些，之前加内标物，可以减少这些误差，使结果更准确。

作者: u234 时间: 2011-11-24 15:47

内标在样品前处理之前加入，起到的是校正处理方法和仪器的作用。而内标在进样分析的时候才加入则只起到了校正仪器误差的作用。其实没有特别大的大是大非的问题，当然前者比后者要更加准确一些。

作者: ending 时间: 2011-11-24 15:48

我也同意内标先加，这样做就可以尽量消除样品前处理对被测物质含量所造成的误差

作者: kewanqi2011 时间: 2011-11-24 15:48

我认为内标应先加；

原因：用内标法是为了校正和消除由于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。

作者: feima+ 时间: 2011-11-24 15:49

当然是先加内标了，不然加了还有什么意义？国内的文献不能尽信的，很多都是不规范的，按照指示是做不出来的

作者: hustwb 时间: 2011-11-24 15:49

我举反对意见！

我觉得内标应该后加。

既然都是起到对照的作用，那如果提前加内标进去，怎么保证内标在提取过程中的损失与样品一致呢？如果不一致怎么做对照呢？

既然目的是为了避免样品前处理的误差就应该后加入，提前加入怎么避免？

希望大家各抒己见，我很想知道答案。。。。

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先加是必须的，原因药典中已经说得很清楚了，后加没有任何意义，直接外标就是了，内标法的前提是选择的内标处理过程中的损失情况必须和样品成比例，否则你的方法学考察肯定过不去，过不去就想别的办法了，如果方法学考察能够成功，自然就没问题

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