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标题: 内标的用量如何确定??? [打印本页]

作者: zhufangwei 时间: 2007-11-13 19:52 标题: 内标的用量如何确定???

我打算用内标的方法定量,可是缺乏这方面的经验.我看帖子上说做标准曲线内标浓度为标曲最高浓度的1\3~1\5,那么在计算CCα和CCβ的时候,我设定0.3,0.45,0.6ppb,内标加多少呢,做添加回收的时候内标要又加多少呢,这有讲究吗???大家进来讨论一下哈!!!
如果要做标准曲线,做多残留的话,是用混和标准液做呢,还是一个一个药物做.大家来交流一下经验啊!!!

[ 本帖最后由 zhufangwei 于 2007-11-13 21:18 编辑 ]

作者: fsciq 时间: 2007-11-13 19:52

在残留分析中，加入同位素内标物多是从实验一开始就加进去。
所以，加入内标物可以校正整个分析全过程可能产生的误差。
若做得好，理论上用内标物校正后回收率应该是100%。
但在实际分析过程中，特别是在动物源食品中的药残分析，由于基质的复杂性所以回收率一般不会太好。
若不用内标，回收率往往波动很大，甚至超出残留分析回收率的允许范围。
所以，加入内标就是为了改善回收率和方法的稳定性。

实际操作时，不考虑内标的回收。
将被测物的值直接与内标值比较计算。

在实验中内标还有一个功能，那就是检验你这次实验是否正常。
如果在最后的仪器检测中内标都没出来，你就需要好好检查一下你的实验那里出问题了，
如：试剂、净化柱、仪器等。

作者: white-rabbit 时间: 2007-11-15 21:35

我打算用内标的方法定量,可是缺乏这方面的经验.我看帖子上说做标准曲线内标浓度为标曲最高浓度的1\3~1\5,那么在计算CCα和CCβ的时候,我设定0.3,0.45,0.6ppb,内标加多少呢,做添加回收的时候内标要又加多少呢,这有讲究吗???大家进来讨论一下哈!!!
如果要做标准曲线,做多残留的话,是用混和标准液做呢,还是一个一个药物做.大家来交流一下经验啊!!!

内标是用来标定样品前处理过程和仪器的稳定性的，如标定样品前处理过程和仪器的稳定性，在样品未处理前加入，如仅标定仪器的稳定性，可在样品处理后加入。标准曲线和样品内标为同一浓度。内标的加入量同化合物和内标的质谱响应有关，因为内标法定量用的是目标化合物和内标的峰面积比或峰高比，最高点的比值不能太大，最低点的比值不能太小，比值太小太大都会影响定量的准确性。如果线性范围比较窄，内标一般为标曲最高点化合物响应值的1/2~2/3之间时的浓度，如果线性范围比较宽，内标浓度应适当降低，照顾低点的响应。
标准曲线,做多残留的话,可以用混和标准液，不会相互干扰。
内标一般选择同目标化合物性质相近的化合物，并且稳定，系统无吸附的化合物。

作者: zhufangwei 时间: 2007-11-16 14:41 标题: 回复 #2 white-rabbit 的帖子

标准曲线和样品内标一定要为同一浓度吗?我在处理样品过后打算浓缩5倍的,那么做标准曲线的时候是在添加浓度5倍的基础上做的

作者: mass 时间: 2007-11-18 00:56

考虑到这条曲线的线性范围比较小，因此对内标的量要求不高，只要浓度不在检测限附近就好（以免增加误差）。如果是多组分检测，当然是用混标好呀，可以节省很多时间呢。

作者: zhufangwei 时间: 2007-11-19 20:53

我的意思是说我做的标准曲线是放大5倍(相对于添加的药物浓度,因为我做前处理之后要浓缩的),那么添加在组织里的内标浓度是不是相对与标曲用的内标浓度缩小5倍???

作者: shark 时间: 2007-11-20 08:49

你说得对，在测定时，样品和内标在一个浓度范围是最好的。

作者: fsciq 时间: 2007-11-20 14:42

做残留分析一般线性范围不必太宽，通常2个数量级就够了。
一般根据被测物MRL，线性在1/2MRL～50MRL。
就色－质分析而言，内标物选择有2种，
一种是与被测物相同化合物的氘代物，
另一种是与被测物性质相近的化合物，如同系物。
对于残留分析，最好选用氘代物。
内标物的响应值与不测物的响应值常常不一样，具体到内标物的浓度，通常可以这样确定：
选择其某一浓度内标物的峰面积或峰高与被测物MRL峰面积或峰高相当即可（一般可比MRL稍高一些）。
因为，这个浓度与被测物的峰面积或峰高接近，定量较准，而且检测时这个值又比较稳定。

每种被测物用一个对应的氘代内标物定量最好，但实现起来比较困难。
所以，性质相近的一类被测物用一个内标物就可以了。
但如果性质相差比较大，就应该一类被测物选一个内标物。

作者: zhc609 时间: 2007-11-20 20:13

具体浓度应根据样品的实际浓度来定,一般在其附近就行了.

作者: masscharge 时间: 2007-11-21 00:46 标题: 回复 #5 zhufangwei 的帖子

被您绕来绕去的，差点搞糊涂。
内标法是消除整个实验过程的系统误差,包括前处理过程,仪器分析方法等,所以内标是在样品前处理前加入，不管是您用来做标准曲线的样品还是代测样品。

请注意，用来做标准曲线的样品是将标准物添加在和待测样品相同基质的空白基质中做的，而不是直接用标准溶液做的。所以不要考虑什么浓缩5倍，10倍的问题。希望我的解释您能考虑。

作者: masscharge 时间: 2007-11-21 00:52 标题: 内标物添加

直接用标准溶液做标准曲线去计算实际样品的含量是不对的。有很多因素需要考虑，不管是内标法还是外标法。
所以，在所有的做标准曲线的“标样”和待测样品中，前处理前加入相同含量的内标物。

作者: zhufangwei 时间: 2007-11-21 12:51 标题: 回复 #9 masscharge 的帖子

如果内标在前处理之前加的话，那药物的回收率怎么算呢，内标也会在提取过程损失的？？？

作者: masscharge 时间: 2007-11-23 22:54 标题: 回收率计算

回收率是用基质样品中代测物的峰面积与相同浓度的标准溶液中代测物的峰面积的比值直接计算的，和内标没有关系的。
你想啊，如果回收率也是用代测物与内标物的峰面积的比值去计算，采用同位素内标时，回收率还用做吗？不用做大多都是100％左右了。

作者: zhufangwei 时间: 2007-11-26 12:54 标题: 回复 #12 masscharge 的帖子

还是不太明白,如果在检测样品时加入了内标,算回收率的时候又不用,那加它干嘛,不就是外标法了吗???
标准曲线纵坐标是标准溶液峰面积与内标峰面积比,横坐标是标准溶液浓度,在算回收率的时候要用到标准曲线的啊???

"回收率是用基质样品中代测物的峰面积与相同浓度的标准溶液中代测物的峰面积的比值直接计算的，和内标没有关系的。"那还要内标干嘛啊???

作者: shark 时间: 2007-11-27 12:03

加内标的好处和优点就在于，只要内标的性质和目标化合物接近，则可以免除在样品处理过程中回收率和样品处理所产生的偶然误差，直接得到样品处理前的实际含量。

对楼主这个问题来说，内标在提取过程中有损失，药物也会有同样比例的损失！所以不会影响定量结果的。

作者: masscharge 时间: 2007-12-5 15:12 标题: 下次有机会去你们实验室，给你一份资料

下次有机会去你们实验室，给你一份资料，找时间看看。
还有就是见面再聊吧，聊聊定量方面的一些基础知识。

作者: troy.tper.lee 时间: 2007-12-11 13:38 标题: 内标法

大家好！我是今天刚注册的，很高兴能一起交流。主要从事小分子化学药物液相色谱质谱定量，使用质谱有5年的历史，也一直做药代动力学试验。希望与大家共同进步。关于内标法，我说几条吧，下面的贴子是从别处转的定义。

什么叫内标法?怎样选择内标物? 内标法是一种间接或相对的校准方法。在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。内标法在气(液)相色谱定量分析中是一种重要的技术。使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。当然，在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。

作者: troy.tper.lee 时间: 2007-12-11 13:49 标题: 内标用量如何确定？

大家最初讨论的是内标用量如何确定？看到大家比较关注浓度，我个人认为有几点可以讨论：
1）内标用量应参照响应值或响应强度，我们试验一般选择内标响应与标准曲线中间点稍微偏高一点响应比较接近的浓度。此时即能兼顾较低浓度，也能利用面积积分。
2）我个人认为如果能排除提取过程和质谱离子化过程或液相检测影响的话，药代动力学试验中内标浓度不需太严格，只要是个恒定的量，因为都是要与内标进行比值的，所以最终还会准确定量的。
3）至于内标的回收率，越接近100%越好，但液液萃取法往往很难接近100%，个人认为只要稳定且不要太低即可，太低的话最好是改换提取体系。
4）内标不能太高，蛋白沉淀法和SPE提取率较高，往往接近或超过100%，如果超过100%太多，则回收率系统处理方法或计算有问题。（前两天主任审药就遇到此问题，都130%）

作者: troy.tper.lee 时间: 2007-12-11 14:01 标题: 内标的加入时间？

我分析了一下大家讨论的，和我们以前同事之间讨论结果比较了一下：总体上说大家比较支持一开始就加入内标，这样做的好处是可以消除整个方法的所有系统误差，而且也起到了内标真正的意义；但个人认为进样前加入内标主要看实际情况，比如说你试验中前处理过程对内标提取不稳定或是总出一些古怪的问题，而且内标又特难选择，前处理采用外标法样品状况特别稳定。此时可以处理完后加入内标，用于校正进样和离子化（质谱）中的系统误差。如果整个试验内标很难选择的话，外标法也是个可选的方法，但药审指导原则是这么说的：提倡使用内标法。

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