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标题: [分享]Caco-2细胞培养的一点重要经验 [打印本页]

作者: 四福晋 时间: 2011-12-1 15:42 标题: [分享]Caco-2细胞培养的一点重要经验

[分享]Caco-2细胞培养的一点重要经验（转载）

这个细胞对生长环境的要求非常之高。除了大家熟知的培养液条件的苛刻外（此不详述，又不懂的可留言问），对生长的空间问题要求比较高。

在每一次传代消化的时候，要消化足够长的时间，要不停地在镜下观察细胞的消化状态。因为这个细胞长的比较厚，所以消化比较困难。需要耐心。而消化的结果应该是保证足够多的细胞都是成单个状态而不是抱团或者成片。对于这一点，常规消化是比较难做到的。所以需要采取点特殊措施，我一般是这样做的：

首先吸干净原培养基，加入PBS洗，至少洗两遍，第二遍可以时间长一点，起到一定浸润作用，然后吸走，加入少量含EDTA的胰酶（以下简称YE）润洗，快速润洗完细胞生长面后吸走，然后加入适量的YE（我个人一般较常用量多加0.5-1ml），进行充分的消化，保持在镜下适时观察。待较多细胞被消化下来悬浮于消化液中，大部分细胞边缘皱缩变清晰后，用吸管吸出消化液入离心管中加入适量培养基，常规离心5分钟左右，离心完毕倾倒上清，加入新鲜培养基吹打均匀，然后置于新的小培养瓶中培养。原培养瓶中加入培养基吹打，细胞吹下来之后，适当多吹打几次细胞悬液以使细胞单个分离均匀。然后分瓶传代，原瓶加入新培养基继续培养。

很关键的一点就是将YE的消化细胞悬液加培养基离心后培养，因为这里面的细胞基本上都是被消化下来的单个单个细胞，Caco-2细胞单个单个的生长会比抱团的生长的好很多。传入新的培养瓶中之后你可以与原瓶进行比较。当然若细胞消化的好的话，这点可以舍弃掉。

提醒;一定要用好的胰酶！这点钱一定得花！

希望对大家有用。

作者: 园丁## 时间: 2011-12-1 15:43

不错不错,可惜我现在不做这个细胞了,想当年做得时候那叫一个痛苦啊.怎么养都养不好,总是一片片的细胞消化时.不过还是谢谢楼主的分享哦,敢问楼主养这个细胞是做什么呢,轮状病毒?

作者: 四福晋 时间: 2011-12-1 15:44 标题: 回复 #2 园丁## 的帖子

不是，我是做转运体的。呵呵。。现在基本摸清门道了，觉得还好了，不好养是不好养，现在养到门路了，觉得还是蛮好养的呢。。。

作者: dotaaa 时间: 2011-12-1 15:46

谢谢楼主的好经验分享，我们正好也在培养Caco-2细胞，具体是建立一个模拟肠壁渗透的模型，在体外对药物的吸收做一个大致的评估（In vitro permeability study).
关于Caco-2的培养基，我来补充点儿实在的：
-DMEM with 10%FBS, 10mM HEPES, 1% Non-essential amino acids and 2mM L-glutamine.
*DMEM Medium(powder):
GIBCO,Cat No.:12100-046
*HEPES(powder):
SIGMA,Cat No.:H-4034
*Non-essential amino acids:
GIBCO,Cat No.:1140-050
希望对准备养Caco-2的战友有帮助，而且耐心真的很重要．

作者: windy+++ 时间: 2011-12-1 15:46

不错，对很多肿瘤细胞的培养都管用。

作者: 白白的 时间: 2011-12-1 15:47

关键是血清的问题，若用进口的，进行培养还是挺简单的，我门主要使用进行酶的提取，传代时，在显微镜的帮助下，多消化几次，即可。

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-1 15:47

能否上传一张照片看看啊！？我的细胞铺到transwell里头，21day， TEER只有500多！再继续培养也涨不了多少。。。郁闷啊！是不是细胞不行！？

作者: 园丁## 时间: 2011-12-1 15:52 标题: 回复 #7 @STAR@ 的帖子

因为不知道你们具体的做法，如果２１天ＴＥＥＲ只有５００多，那细胞出问题的机会比较大．可能是细胞长的太慢，没有铺满（seed cell的数量？）；或者细胞长的不够好，根本形成不了一块儿地毡．
以下是我们用的Procedure，希望有帮助．
Seeding of 24-well culture insert(day1)
*Pre-incubation of the BD transwell culture system:add 200ul of complete DMEM in each insert and 1ml in each well of 24-well plate.Incubate for 2hours at 37℃.
*Measure TEER in blank inserts before seeding.
*Seed 6x10^4 cells/cm^2 (2x10^4 cells/well) to each insert(in triplicate).
*Incubate the transwell culture system in the 37℃ CO2 incubator.
*Change medium for the transwell culture system every other day contiunously for 21-25days.

Remark:
(1)BD BioCoat (Cat No.354803)
Fibrillar collagen TypeI Insert System 24-Multiwell Insert Plate 1.0 Micron.
(2)MILLPORE
MILLICELL-ERS (Cat No.MERS00001)

补充：我查了实验记录，day1空白的TEER是１００多，day21时大部分的TEER已经达到２０００左右了．

给你做个参考，有问题大家在一起讨论．

作者: 盼盼 时间: 2011-12-1 15:53

请大家帮忙：如果transwell没有铺基质胶，可否用多聚赖氨酸（爬片时为细胞更好的粘附到片子时用的）代替Matrigel？

作者: caihong 时间: 2011-12-1 15:54

MXFT supplement 为淋巴细胞无血清培养基的添加剂，厂商 AEC 价格：39339.2 货号：FB00899

作者: 克隆鱼 时间: 2011-12-1 15:55

caco-2细胞染菌是什么现象呀？急！！！

我养的细胞出现了黑色的物体~~~~~~

请各位大侠急救呀~~~

作者: 四福晋 时间: 2011-12-1 15:56 标题: 回复 #11 克隆鱼的帖子

你得具体描述你黑色物体是什么，这个CACO-2细胞是很会分泌一些物质的，看起来脏脏的在培养瓶里，很不爽。这就需要你在传代的时候多洗几次。污染的话一般会变浑浊的，你的知识有可能是分泌物之类的。

作者: utt0989 时间: 2011-12-1 15:56

你好，我刚开始养人原代的T淋巴细胞，想请教一下具体过程，谢谢指导

作者: 小螺号 时间: 2011-12-1 16:09

对于Caco-2模型来说，可以用纤维胶原蛋白铺板，多聚赖安也可以，有利于生长；同时培养基也有讲究，需要配一些培养添加剂。

作者: 西子 时间: 2011-12-1 16:09

因为不知道你们具体的做法，如果２１天ＴＥＥＲ只有５００多，那细胞出问题的机会比较大．可能是细胞长的太慢，没有铺满（seed cell的数量？）；或者细胞长的不够好，根本形成不了一块儿地毡．
以下是我们用的Procedure，希望有帮助．
Seeding of 24-well culture insert(day1)
*Pre-incubation of the BD transwell culture system:add 200ul of complete DMEM in each insert and 1ml in each well of 24-well plate.Incubate for 2hours at 37℃.
*Measure TEER in blank inserts before seeding.
*Seed 6x10^4 cells/cm^2 (2x10^4 cells/well) to each insert(in triplicate).
*Incubate the transwell culture system in the 37℃ CO2 incubator.
*Change medium for the transwell culture system every other day contiunously for 21-25days.

Remark:
(1)BD BioCoat (Cat No.354803)
Fibrillar collagen TypeI Insert System 24-Multiwell Insert Plate 1.0 Micron.
(2)MILLPORE
MILLICELL-ERS (Cat No.MERS00001)

补充：我查了实验记录，day1空白的TEER是１００多，day21时大部分的TEER已经达到２０００左右了．

给你做个参考，有问题大家在一起讨论．

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请问这个转运的时候这个胶是必须铺的吗？我们用的是康宁的小室。我们还是第一次做，没什么经验，我一个人在摸索，很多地方都很疑惑。请问可否指教一下

作者: 西子 时间: 2011-12-1 16:10

对了，各位坛友，我打听一下这个电阻仪是必须的吗？我知道TEER这个指标很重要，但是整个实验室就我一个人做这个，以后也不一定会有人做这个，有必要单独买一个吗？还是可以和别人共享一下？

作者: BOSS2011 时间: 2011-12-1 16:11

用caco-2细胞单层上做通透性或者转运实验，不需要铺胶的。这个细胞粘附的很好。我们用的是millipore的millicell。

电阻仪可以不买，能用别人的测几次，找找感觉就行了。caco-2的致密性可以用lucifer yellow或者荧光素等可以被酶标仪检测的染料的跨细胞单层的通透性来评价。比如，在donor侧的待测化合物溶液中加入lucifer yellow或者荧光素，转运实验结束后，检测对侧的lucifer yellow或者荧光素的量。如果有的孔染料的量太高了，这个孔的细胞单层可能是不完整的。

caco-2的致密性还可以用一些低通透性的化合物来衡量。比如阿替洛尔。我们实验室，阿替洛尔的Papp一般小于0.5*10-6 cm/s。如果大于这个值，可能这批细胞的致密性不够好。阿替洛尔在你们实验室的Papp很可能不是这个值，这很正常。只要批次间差别不大就可以了。

个人的一点经验，仅供参考！

作者: 白白的 时间: 2011-12-1 16:13

因为不知道你们具体的做法，如果２１天ＴＥＥＲ只有５００多，那细胞出问题的机会比较大．可能是细胞长的太慢，没有铺满（seed cell的数量？）；或者细胞长的不够好，根本形成不了一块儿地毡．
以下是我们用的Procedure，希望有帮助．
Seeding of 24-well culture insert(day1)
*Pre-incubation of the BD transwell culture system:add 200ul of complete DMEM in each insert and 1ml in each well of 24-well plate.Incubate for 2hours at 37℃.
*Measure TEER in blank inserts before seeding.
*Seed 6x10^4 cells/cm^2 (2x10^4 cells/well) to each insert(in triplicate).
*Incubate the transwell culture system in the 37℃ CO2 incubator.
*Change medium for the transwell culture system every other day contiunously for 21-25days.

Remark:
(1)BD BioCoat (Cat No.354803)
Fibrillar collagen TypeI Insert System 24-Multiwell Insert Plate 1.0 Micron.
(2)MILLPORE
MILLICELL-ERS (Cat No.MERS00001)

补充：我查了实验记录，day1空白的TEER是１００多，day21时大部分的TEER已经达到２０００左右了．

给你做个参考，有问题大家在一起讨论．

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我用的是12well plate。seed 8×10e4 cell/well。肉眼观察，可见颗粒状物质，镜下观察细胞比较密集，但是TEER value 始终上不去，一直是600-700（2k ohmm），单个insert面积为1.12cm^2,所以TEER value应该约是1200k ohmm/cm^2 不知您的2000是什么单位呢！？

作者: 阿敏 时间: 2011-12-1 16:13

这细胞好养，但无法去除空泡，随着细胞融合，空泡会明显增多，请老师发个图片给大家吧。

作者: 969 时间: 2011-12-1 16:14

对于Caco-2模型来说，可以用纤维胶原蛋白铺板，多聚赖安也可以，有利于生长；同时培养基也有讲究，需要配一些培养添加剂。

请您说的再详细点好吗？

新手上路，多多指教

作者: 笑弯了腰 时间: 2011-12-1 16:15

文献中说TEER大于200-500不就可以用了吗？我现在的TEER在500多，用苯酚红考察通透性小于
1*10-6，不就证明可以用作转运实验了吗？请问，您那2000多是怎么回事？

作者: fqswdzd 时间: 2011-12-1 16:16

请问在做药物转运实验时所用的PBS是什么成份呢？文献中多数选用HBSS，但是都没说明是否含钙，镁,而且，钙离子对细胞的紧密连接是有影响的，那么大家做实验时是用的哪种HBSS呢？请指教！

作者: zhezhe 时间: 2011-12-1 16:16

caco-2做转运时间一般用的TRANSWELL的规格是多少的啊

作者: 四福晋 时间: 2011-12-1 16:17

这细胞好养，但无法去除空泡，随着细胞融合，空泡会明显增多，请老师发个图片给大家吧。

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空泡是经常出现，一旦出现空泡的时候基本上细胞已经差不多不行了。我这里没有拍很清晰的图片，实验室没有专门照相的转换装置。待买中呵呵。

作者: 月牙牙 时间: 2011-12-1 16:18

请问在接种millicell插入式细胞培养皿有什么操作要点要注意的吗？感觉这一步和后面细胞能否分化良好很相关。谢谢！

作者: HP007 时间: 2011-12-1 16:20

请问在接种millicell插入式细胞培养皿有什么操作要点要注意的吗？感觉这一步和后面细胞能否分化良好很相关。谢谢！

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这个我觉得就是接种均匀就好。另外就是接种前细胞尽量吹散成单个单个。。。

作者: tianmei001 时间: 2011-12-1 16:21

11月6日开始养了，可惜亚运戒严不能进去单位的实验室，只好放了3天没去测电阻，10号扣去空白暂时有70到80的测定值。

作者: windy+++ 时间: 2011-12-1 16:22

你好！我最近开始养Caco-2细胞，遇到了一些问题，相向高手咨询下，我目前养的是上个学姐冻存留下的，她养的时候状态就不好，我现在养的细胞在同一个瓶子里状态也不一样，有的部分就有大大小小的圆空泡，泡周围长的乱乱的，不规则，这是营养不良还是什么原因导致的？有的部分就长的还可以，铺路石的样子，而且细胞落层长，瓶底有时还未铺到80%-90%，直接用肉眼就能看到瓶底白白的一片，我想知道，这个时候是不是就长过了，应该提早消化吧？对了，细胞里会有很多黑色的小点点~~~~是正常的分泌物吗？
我要做吸收透过模型，将细胞接种到Millicell膜上，接了3个浓度的，测电阻观察，可用电阻仪测出来的电阻特别没谱，同一孔的电阻重复测量时就呈升高趋势~~而且低中高三个浓度的电阻趋势有时会倒过来，不太正常呀！
期待回复！多谢呀！

作者: 四福晋 时间: 2011-12-1 16:22 标题: 回复 #28 windy+++ 的帖子

这个细胞长的就是那样，空泡装有可能是你消化没有消化好。
我不做电阻的。这个我也不清楚啊。

作者: windy+++ 时间: 2011-12-1 16:23

哦，谢谢！感觉Caco-2很容易从瓶底吹下来，若吹成单细胞的话，需要的时间较长，你有同感吗？

作者: 四福晋 时间: 2011-12-1 16:23 标题: 回复 #30 windy+++ 的帖子

很有同感，不过成单个不在吹，在于消化，一定要用好的胰酶消化，消化前PBS洗细胞。

作者: 了了 时间: 2011-12-1 16:24

有人用Caco2接种病毒的吗
病毒感染Caco2后出现大量的空泡算是CPE吗

作者: abc816 时间: 2011-12-1 16:30

请问用CACO-2做转运试验最多可以用到多少代的细胞做SEEDING呢？谢谢

作者: ffooll 时间: 2011-12-1 16:31

我有几个问题想请教一下：
1.测电阻时，用Hank’s洗完的电阻值是不是比培养基养的时候测的电阻小？为什么？
2.细胞养到21d以后，要测电阻值时是用不含钙镁的Hank's吗？含有钙镁会对细胞有什么影响？
3.这个细胞接种到transwell里面以后，如果每隔一天测下电阻的话，是不是特别容易污染?我如果用聚碳酸酯膜，看不到细胞形态，那怎么判断我的细胞污染没污染呢？污染后细胞电阻长不上去去吗？
4.做完实验后，版主还会测下电阻吗？会不会降很多呢？
期待回复，谢谢！呵呵~~

作者: 中国特色 时间: 2011-12-1 16:32

谢谢楼主的好经验分享，我们正好也在培养Caco-2细胞，具体是建立一个模拟肠壁渗透的模型，在体外对药物的吸收做一个大致的评估（In vitro permeability study).
关于Caco-2的培养基，我来补充点儿实在的：
-DMEM with 10%FBS, 10mM HEPES, 1% Non-essential amino acids and 2mM L-glutamine.
*DMEM Medium(powder):
GIBCO,Cat No.:12100-046
*HEPES(powder):
SIGMA,Cat No.:H-4034
*Non-essential amino acids:
GIBCO,Cat No.:1140-050
希望对准备养Caco-2的战友有帮助，而且耐心真的很重要．

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我最近也要开始养Caco-2细胞，从上海细胞库买的细胞，问他们培养基的时候都回答得含糊不清，从说明书中看到买的细胞培养基都是粉末状的，是这样么？希望高手指点迷津啊，不然细胞刚到手就要毁了

作者: 二丫头466 时间: 2011-12-1 16:33

我最近也要开始养Caco-2细胞，从上海细胞库买的细胞，问他们培养基的时候都回答得含糊不清，从说明书中看到买的细胞培养基都是粉末状的，是这样么？希望高手指点迷津啊，不然细胞刚到手就要毁了。。。。。先谢了

作者: yychen 时间: 2011-12-1 16:34

细胞长的好慢呀

作者: 园丁## 时间: 2011-12-1 16:34

Caco-2细胞，最大的特点:

1、挑培养基，一定要有胎牛血清的DMEM才成，不然死给你看。

2、消化要完全，胰酶量要给足，时间要充分，同时要多吹打，尽量散成单细胞。

作者: tieshazhang 时间: 2011-12-1 16:35

同感，有哪位大虾用CaCo-2做过hoechst啊，发张照片上来观摩下，不胜感激。。。。。。正用这种细胞做毕业论文，忒痛苦的。

作者: 彼岸花opp 时间: 2011-12-1 16:36

我有几个问题想请教一下：
1.测电阻时，用Hank’s洗完的电阻值是不是比培养基养的时候测的电阻小？为什么？
2.细胞养到21d以后，要测电阻值时是用不含钙镁的Hank's吗？含有钙镁会对细胞有什么影响？
3.这个细胞接种到transwell里面以后，如果每隔一天测下电阻的话，是不是特别容易污染?我如果用聚碳酸酯膜，看不到细胞形态，那怎么判断我的细胞污染没污染呢？污染后细胞电阻长不上去去吗？
4.做完实验后，版主还会测下电阻吗？会不会降很多呢？
期待回复，谢谢！呵呵~~

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我做过一段时间，尝试回复一下，供参考

1 用Hanks洗完后因溶液的介质不一样，电阻会有变化，正常。

2 我用的是含钙镁离子的平衡液，是否有影响就没详细追查咯，反正结果还是比较理想。

3 隔天测电阻对细胞的确有一定影响，污染倒不一定的，只要操作得当。用聚炭酯膜看不到细胞，但拿细胞板对光看可以看见细胞层的，不完整或剥落很容易就看到，另外可以根据培养的颜色变化来判断。

4 我做完实验后，都会测电阻，操作得好的话应该变化在50欧姆左右。

作者: flower-201 时间: 2011-12-1 16:36

我刚开始准备养Caco-2细胞做转运实验，请教一下DMEM培养基怎么选择呢？葡萄糖含量对细胞生长影响如何？另外看到前边有战友说transwell不需要铺胶，那这样的话transwell可以重复使用吗？

新手上路，请多多指教

作者: 中国特色 时间: 2011-12-1 16:37

楼主有没有遇过细胞不贴壁啊，昨天下午解冻了一管细胞，当时看的时候贴壁的挺多的，今天过来换液细胞很少贴壁，都一个个的飘着那。高手，有没有遇过这种情况啊，给个建议啊

作者: DNA 时间: 2011-12-1 16:38

我用常规方法复苏caco-2细胞，加入高糖的DMEM培养液（含1%非必需氨基酸、20%胎牛血清、双抗），用一次性培养瓶培养，初始镜下见细胞密集,
24h后细胞仍不贴壁,已排除污染,为什么会出现这种情况？和没用进口血清有关吗？现在该如何处理？请高手指教，万分感激！

作者: fsdd817 时间: 2011-12-1 16:39

我前两天刚从中科院细胞库买的这株细胞，买回来的时候就在200倍镜下看了一下状态，没有看高倍镜，当时觉得长得太满了就直接进行了传代，今天是第三天，根据中科院老师的说法，今天再换液，但是当我换液的时候，我突然想起来在高倍镜下看了一下，结果被吓了一跳，400倍下细胞周围好多黑黒的东西，还有黑色的细胞样圆状物体，但是没有发现运动迹象，300倍下又不是黑色的了有点发亮，我不知道是染菌还是楼上同学们说的细胞的分泌物，求高手指点！非常感谢！

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作者: 笑弯了腰 时间: 2011-12-1 16:39

我也养这个细胞，真的痛苦，养了快一年了，总是有问题。买回来的时候挺好的，但是冻存后复苏总是长的特别的慢，要将近一周才能长一起来。在养的时候还会出现有梭形的细胞，开始以为是杂细胞，还打电话问了中科院的老师，他们说不是杂细胞，说这个细胞就是这个特点，有时候会有梭形的，还会有大量空泡。

作者: 笑弯了腰 时间: 2011-12-1 16:40

我也看到你这样的情况，而且低倍镜下平皿底面也总是有很多不干净的东西，还有会一小团一小团的黑色物质出来，每天换液每天都会有，看着很不爽，但是细胞还在长，应该没有污染，就是长的慢死了。

作者: lixi559 时间: 2011-12-1 16:41

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[ 本帖最后由 lixi559 于 2011-12-1 16:48 编辑 ]

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作者: lixi559 时间: 2011-12-1 16:48

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作者: 四福晋 时间: 2011-12-1 16:49

我养的时候倒是从没有过梭形细胞。。。其它地方的细胞倒是很像。这个细胞就是这样，看上去脏脏的，一定要用PBS洗，然后用胰酶消化传达，细胞必须消化成一个一个的，才会长得好。

作者: zhezhe 时间: 2011-12-1 16:50

哎~~这细胞真不好养，那些黑黒的东西用PBS洗都洗不干净，只是洗几次会少点，但是第二天又有的。

作者: 笑弯了腰 时间: 2011-12-1 16:50

你的细胞成片浮起来说明长得太多了点，应该尽早传代的。

作者: yychen 时间: 2011-12-1 16:51

我想咨询一下你们养这个细胞传代时，一般消化多长时间能消化成单个细胞？

作者: 四福晋 时间: 2011-12-1 16:52 标题: 回复 #53 yychen 的帖子

看你的胰酶质量和你消化的操作了。我的基本在1-2分左右。

作者: bohe221 时间: 2011-12-1 16:52

这个细胞对生长环境的要求非常之高。除了大家熟知的培养液条件的苛刻外（此不详述，又不懂的可留言问），对生长的空间问题要求比较高。

在每一次传代消化的时候，要消化足够长的时间，要不停地在镜下观察细胞的消化状态。因为这个细胞长的比较厚，所以消化比较困难。需要耐心。而消化的结果应该是保证足够多的细胞都是成单个状态而不是抱团或者成片。对于这一点，常规消化是比较难做到的。所以需要采取点特殊措施，我一般是这样做的：

首先吸干净原培养基，加入PBS洗，至少洗两遍，第二遍可以时间长一点，起到一定浸润作用，然后吸走，加入少量含EDTA的胰酶（以下简称YE）润洗，快速润洗完细胞生长面后吸走，然后加入适量的YE（我个人一般较常用量多加0.5-1ml），进行充分的消化，保持在镜下适时观察。待较多细胞被消化下来悬浮于消化液中，大部分细胞边缘皱缩变清晰后，用吸管吸出消化液入离心管中加入适量培养基，常规离心5分钟左右，离心完毕倾倒上清，加入新鲜培养基吹打均匀，然后置于新的小培养瓶中培养。原培养瓶中加入培养基吹打，细胞吹下来之后，适当多吹打几次细胞悬液以使细胞单个分离均匀。然后分瓶传代，原瓶加入新培养基继续培养。

很关键的一点就是将YE的消化细胞悬液加培养基离心后培养，因为这里面的细胞基本上都是被消化下来的单个单个细胞，Caco-2细胞单个单个的生长会比抱团的生长的好很多。传入新的培养瓶中之后你可以与原瓶进行比较。当然若细胞消化的好的话，这点可以舍弃掉。

提醒;一定要用好的胰酶！这点钱一定得花！

希望对大家有用。

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请问离心转速是多少？我曾试过离心，完了之后肉眼看到白色絮状，细胞黏粘在一起。再请教一下这细胞不怕消化过头吗？如果消化过了头是什么状态？我没养过细胞，一来就养Caco-2。。。郁闷

我从其他实验室拿回来的细胞，一开始状态很好，透明均匀长得飞快。养了2周传代了四五次后越来越差。瓶壁没长满但不均匀，有的地方成片掉落而且越来越脏。我再复苏刚拿回来时冻存的细胞，24小时后都没几个贴壁的。。。很是担心，实验室就我一个人养还没人指导。

作者: caihong 时间: 2011-12-1 16:53

马上要养这个了~~还真是怕怕啊~~他们死了那该多伤心啊~~
“这个细胞对生长环境的要求非常之高。除了大家熟知的培养液条件的苛刻外（此不详述，又不懂的可留言问），对生长的空间问题要求比较高。"
完全的新手，能稍微详细的说一下么？

作者: TAT 时间: 2011-12-1 16:53

我养caco-2细胞快一年了也出现过这个问题就是有黑的一团一团的在显微镜下看很小像一串葡萄似的用pbs洗了后会减少但是下次换液前又出现了只要换得勤不影响细胞生长但是肯定是污染了因为只要用这个借到transwell里面过几天就便浑浊了不知道你解决这个问题了吗、？我现在也还是头疼着呢不知道是什么东西？

作者: TAT 时间: 2011-12-1 16:54

这个细胞对生长环境的要求非常之高。除了大家熟知的培养液条件的苛刻外（此不详述，又不懂的可留言问），对生长的空间问题要求比较高。

在每一次传代消化的时候，要消化足够长的时间，要不停地在镜下观察细胞的消化状态。因为这个细胞长的比较厚，所以消化比较困难。需要耐心。而消化的结果应该是保证足够多的细胞都是成单个状态而不是抱团或者成片。对于这一点，常规消化是比较难做到的。所以需要采取点特殊措施，我一般是这样做的：

首先吸干净原培养基，加入PBS洗，至少洗两遍，第二遍可以时间长一点，起到一定浸润作用，然后吸走，加入少量含EDTA的胰酶（以下简称YE）润洗，快速润洗完细胞生长面后吸走，然后加入适量的YE（我个人一般较常用量多加0.5-1ml），进行充分的消化，保持在镜下适时观察。待较多细胞被消化下来悬浮于消化液中，大部分细胞边缘皱缩变清晰后，用吸管吸出消化液入离心管中加入适量培养基，常规离心5分钟左右，离心完毕倾倒上清，加入新鲜培养基吹打均匀，然后置于新的小培养瓶中培养。原培养瓶中加入培养基吹打，细胞吹下来之后，适当多吹打几次细胞悬液以使细胞单个分离均匀。然后分瓶传代，原瓶加入新培养基继续培养。

很关键的一点就是将YE的消化细胞悬液加培养基离心后培养，因为这里面的细胞基本上都是被消化下来的单个单个细胞，Caco-2细胞单个单个的生长会比抱团的生长的好很多。传入新的培养瓶中之后你可以与原瓶进行比较。当然若细胞消化的好的话，这点可以舍弃掉。

提醒;一定要用好的胰酶！这点钱一定得花！

希望对大家有用。

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我养的caco-2细胞快一年了，有个很头疼的问题就是里面会有很小的像葡萄这样一串串的聚在一起要么漂浮在液体中要么就和caco-2细胞一起贴在平底在显微镜下可以看出要比caco-2小很多形状也很规则圆形也很注意操作了还是有，这个东西不影响细胞生长，用pbs多洗几次能够洗掉但是过几天又长出来了后来问别人要了好的caco-2细胞养了一段时间传了几代后又出现了这个东西已经试过培养基没有问题了（将培养基放在一个干净的flask里一起放在培养箱，过了几天都没有发现这个东西）不知道这个是什么东西？求指点啊~~~~ 头疼得不行了有报道说这个是黑胶虫但是看了也不像啊

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作者: duoduo 时间: 2011-12-1 16:54

可能是白色念珠菌或酵母菌。能否跟你们要点Caco-2细胞。

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