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标题: [讨论贴]单细胞凝胶电泳技术及应用讨论 [打印本页]
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 09:16     标题: [讨论贴]单细胞凝胶电泳技术及应用讨论

[讨论贴]单细胞凝胶电泳技术及应用讨论   



做了一年的单细胞凝胶电泳工作，也查阅了不少相关资料，随着经验的积累，总结了一些经验和教训，想和大家讨论，希望大家积极参与。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 09:16


此方法在许多领域已经得到广泛应用，从放射医学的角度讲，此法还是有很大应用前景的，如：辐射生物剂量学，辐射的旁观效应，低剂量照射的适应性反映，凋亡细胞的观察等等。
本人的一些观点，很不成熟，敬请批评指正：
辐射生物剂量：此法适于照后短期内的剂量评价，中性条件优于碱性条件；
旁观效应：查阅了许多国外文献，尚无此方法观察旁观效应的研究报道，所以我采用此方法观察了1Gy照后的旁观效应，试验今天上午刚刚结束，结果待分析，粗略看，此法对于旁观效应还是很敏感的，此法的优势在于成本低，操作比较简单。
低剂量照射的适应性反映：本实验室的一个相关课题刚刚结提，论文在法医学与特种医学版的军事医学子版已有上传，感兴趣的可以去看。
凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。
注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。
朋友们如果有异议，请不吝赐教，也对我有所帮助。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 09:16

单细胞凝胶电泳技术应用非常广泛，本单位正在进行荷瘤小鼠放疗后的淋巴细胞DNA损伤研究，初步结果：大剂量放化疗前给予小剂量照射（分不同时间），动物的淋巴细胞彗星尾长、尾矩等指标试验组均小于对照组，证明该方法在放射医学的实用性。
作者: BUK    时间: 2011-12-2 09:17

一叶 你好，本人也正要做这个实验，预实验做了两次，但什么都没看到，也不知道是什么问题，望指教。
铺3层胶，第一层100ul1％regular胶，50度烤干，第二层50000个细胞100ul0.5％低熔点胶，第三层100ul 0.5％低熔点胶。
裂解液：EDTA 100mM Nacl 2.5M Tris(10mM)pH10 1%TritonX-100 裂解 1小时
解旋液：EDTA1mM NaoH 300mM Ph>13 孵育20分钟。电泳40分钟。
染色： PI 50ug/ml染色15分钟。
结果是什么都看不到，好像一点都没染色。

另外，用软件分析能不能区分是单链损伤还是双链损伤？
敬请指教！
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 09:17     标题: 回复 #4 BUK 的帖子

战友您好！非常欢迎您参加讨论！
首先，此试验的生物学原理目前还不是很清楚，Sighn和Olive这两个单细胞凝胶电泳的鼻祖首先提出的中性和碱性条件，中性条件检测双链断裂，而碱性条件检测单链断裂，有人曾提出这是为什么，我查阅了大量文献，国外文献没有具体的说明，国内文献更是人云亦云，所以，目前只能按照大家比较默认的：中性－－双链，碱性－－单链，这不是用软件来区分的，而是你的试验条件决定的，我看了您的裂解液ph10，所以检测结果应是单链断裂。
其次，您用的是三层三明治铺胶法，目前多数彗星试验已经少用此法，而是双层法甚至单层灌胶，有人担心双层或单层铺胶的脱胶问题，只要在凝胶的承载载体上做点文章，就解决了！我用的是双层铺胶法，我不知道您的第一层正常熔点胶为什么要烤干，是为了防治脱胶吗？我建议您采用双层法（卖瓜人不说自己的瓜苦，呵呵），这样在实验操作上可以节省时间，不必担心脱胶问题，我做了一年多了，自认为很成熟了，从来没有出现脱胶问题，（我不知道您用的凝胶承载体是什么？）。
第三，解旋20分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道您的电泳条件（电压、电流、），我认为20分钟足够了，时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析。
第四，因为我用的EB染色，2ug/ml，效果很好，您用PI染色，我可能没有发言权，因为我不知道PI 的荧光激发光波长是多少，是否您的荧光条件不对？可以查查文献，这一点您对PI应该比我更了解吧。
第五，您的裂解时间有点短了，文献报道，最好不要少于1.5小时。
第六，我不知道您用的什么细胞，50000个细胞加入100ul0.5％低熔点胶，是不是细胞太多了，含细胞层的凝胶如果细胞密度过大，即使做出结果，彗星图像过于密集，头尾连接互相影响，无法分析。一般100ul0.5％低熔点胶中含400个细胞就足够了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 09:18     标题: 回复 #4 BUK 的帖子

还有一点，差点忘了，我刚刚做的时候，不会用荧光显微镜，大开了自然光源，其实荧光激发根本不用开自然光源，画蛇添足。
只要荧光光路通畅了，物镜会出现特殊的荧光，只要波片上有荧光染色的细胞，它肯定跑不了！
另外，我不知道您用什么软件分析彗星图像，我用CASP，很好用，如果需要，我可以提供连接，网上可以下载的。
本版【图片仓库】子版有我做的彗星图像，感兴趣可以看看
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2729243&sty=1&tpg=1&age=0')
如有什么问题或我的回答有不妥之处，敬请指正。
作者: BUK    时间: 2011-12-2 09:19     标题: 回复 #6 一叶 的帖子

非常感谢 一叶 老师，您的建议很有用。
1.我用的是HepG2细胞，我是看了一篇文献，上面说最大可以达到50000个细胞，因为第一次做的时候一个细胞都没见到，我以为是细胞数过少，所以我就加大细胞：（ 根据您的指导，应该肯定可以排除这个可能性了。
2.关于电泳时间，我也是参考文献的，同时该篇文献上建议的电泳条件为 15V 400mA,但我们实验室的电泳仪电流上不去，只能到100mA，不过参照您的成功经验，这样的条件已经是可以了的 吧？
3.我烤胶也是按照同一篇文献的：（ 主要也是为了防止脱胶的问题。因为我开始也试过不烤胶，裂解后捞起来时确实出现了脱胶的问题，所以还得向您请教一下，每层胶铺上以后时怎么处理的？另外，我用的载体是普通的显微镜观察用的载玻片，不知道行不行？
4.关于染色的问题，由于我们实验室这个实验做的不多，所以不敢用EB，怕污染了荧光显微镜，根据文献建议的几种燃料，我选择了PI，不过我现在想可能是浓度小了，昨天我上流式用PI单染时，用到了1mg/ml出来结果很漂亮，下面我也会考虑加到PI浓度试一下。不过也可能正如您的提示，我的裂解时间过短，我会首先拉长裂解时间看看的。另外，我配的各种溶液成分是对的吧？
5.关于单链，双链断裂的问题，因为我正是想通过这个实验看看我的样品对DNA的损伤情况，或者是说究竟有无损伤？（不知道我这要设计合不合理？敬请指正）如果这样可以的话，是不是我要分别做中性和碱性的实验，再进行判断？
6.我观察细胞的时候是把自然光关掉的，所以应该不是这个问题。关于数据分析的问题，是不是我用数码相机拍下了照片就可用CASP了？如果是就太好了，因为我正想去外边联系成像系统和分析软件呢。所以还麻烦您提供下载的链接。
再次感谢 一叶 老师，希望您能继续指导我的实验。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 09:19     标题: 回复 #7 BUK 的帖子

SCGE的实验条件尚缺乏标准化，去年曾在美国召开专门会议讨论SCGE的标准化，这都是有文献可查的。
您的列解液应该不是问题，只要能够把细胞膜和核膜列解就可以了，1%TritonX-100 应该是临用时加的吧，另外我还加了DMSO，也是临用时加的。
我觉得您完全可以作中性和碱性两种，这样您的结果就更完美了。
三层铺胶法在铺胶后都要加盖片的，目的是使胶平整，凝胶固化后移去盖片，再铺另一层，普通波片表面比较光滑，容易脱胶，文献多用毛玻璃片，应该好一点，但也不能完全避免脱胶，我是将普通波片稍加改良，在波片上人为作出两个小电泳槽，是用很窄的玻璃条封上的，这就看你的功夫了，不过这可是一劳永逸的事，不会脱胶。
作出的彗星图像用数码相机拍摄后转入计算机，然后就可以用CASP了，我想你的数码相机已经准备好了吧，我用的是NIKON 4500，可以和荧光显微镜配套的。注意，CASP只读.tif扩展名的图像，如果你的相机拍摄的图像可以有.tif格式，就更好了，如果是.jpg格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简单。目前国外有很多SCGE的自动成像分析系统，不过，价格也不菲，还是自己用相机拍的好。
另外，我还是为你担心一个问题，100ul胶含50000个细胞，出来的彗星图像可能密度太大，每个图像都互相影响，将来无法用CASP分析，除非您的胶铺的很薄，不过，就我 的经验，不会很薄吧。
下面就是CASP的链接，可以免费下载，使用也很简单，看看说明就可以了，祝你成功！

cuturl('http://sourceforge.net/project/showfiles.php?group_id=91972')
作者: BUK    时间: 2011-12-2 09:20     标题: 回复 #8 一叶 的帖子

感谢 一叶 老师的指点，我会把细胞数降下来的，我先做一下，有问题再向您请教。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 09:21

我现在想问的是
1.彗星试验的重复性好吗？
2.不太明白彗星和流式的组合可以检测到什么？
3.我做的是碱性，是不是一定加肌氨酸钠，因为不是很好溶解？
4.裂解液，电泳液，中和液有没有必要新鲜配置，因为我的裂解液在冰箱中放置3天后会有结晶，但是加热后会溶解
5.我也是按照三层胶铺的，不过每次总是会有脱胶的现象，搞得挺难受的。6.验证试验的阳性对照应该选什么啊？
7.不同的细胞的裂解时间应该不同吧，想问的是假如想评价药物，（兽药）应该选什么细胞比较合适啊？我现在做的是vero，不过是看了别人的文献决定的，想听听大家的意见
很多问题，3Q
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 09:21     标题: 回复 #10 乌贼老弟 的帖子

乌贼老弟 战友，就我的经验，SCGE的重复性还是不错的，但要做到所有的试剂要同批配制，存放时间不要过长，如我的试验，宁愿累几天，也不要把战线拉的太长，前期准备工作可以按部就班，如（肿瘤接种、给药等），一旦用SCGE的时候，一定在较短时间完成，记得我最累的一天从8点上班，到晚上11点半才回家，中间利用一点时间吃饭。因为裂解液时间长了会结晶，（浓度太高了），正如您所说的。加热磁力搅拌器搅拌后，还可以溶解，但是，还是不宜久存的。电泳液和PBS相对好一点。呵呵，SCGE是一个比较年轻的方法，潜力还没有完全发掘出来，与其它技术结合是必然趋势，就拿血液病来说吧，CD分子已经发现了很多了吧，给药后，用某种药物处理，然后用流式把细胞提取出来，再做SCGE，结果可以看到哪种细胞对该药物敏感，有助于发现该药对哪类白血病敏感，
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 09:22

裂解液药新鲜配制，SCGE中最难配的是裂解液，每次做的时候都要最先配制，而且用加热磁力搅拌器不停搅拌，同时就可以干别的，完全溶解后再放入冰箱预冷。您的脱胶问题和biomed96 战友一样，可以该一下凝胶载体，磨砂玻璃或自制微电泳槽，我用的自制微电泳槽，其实很简单，从不脱胶，另外SCGE最好在避光条件下操作，避免额外DNA损伤。
阴性对照不必说了，阳性对照可以旋已知的对所研究药物（或同类药物）极度敏感的细胞，如国外文献报道，用共济失调－毛细血管扩张症患者的淋巴细胞做阳性对照观察辐射或UV对正常人淋巴细胞DNA的损伤作用。
不同细胞到底裂解多长时间我还没有看见相关文献，但有文献报道，一般裂解1.5～2小时即可。
您用的vero我不知道是什么药物？所以我不便发表意见，不过我觉得先用淋巴细胞比较合适。当然还要看药物的靶细胞是什么。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 09:23     标题: 回复 #12 一叶 的帖子

谢谢回答，你那是不是有comet－FISH的资料啊，你能大概给我解释一下不？比如说方向，检测的目标，还有啊我做的是一个兽药的毒性评价，不象你们做的是人医的，不象你们那么复杂，呵呵不过对我的水平也就比较麻烦了。
我现在做的vero是一种动物的细胞，对了，你说的磨砂的玻片是自己整的吧，我买了砂纸，不过自己搞了半天觉得效果不是很好，你说的那种自制的微电泳槽能再详细一点介绍吗？我也学学，3Q

PS：和您交流一下，觉得收获挺多的，因为在我们这里只有我一个人在做，没有交流的人
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 09:23     标题: 回复 #13 乌贼老弟 的帖子

因为作FISH的成本比较高，所以我没有作，我这有这方面的文献，用不同染色体探针标记后，作SCGE，可以筛选出某种损伤因子（物理因子或化学因子等）的靶染色体是几号染色体。国内可能也有人作过，您可以查一下文献，如果需要，我可以帮你查一些国内此方面的文献。CNKI就可以。
毒性评价我觉得您用VERO细胞和淋巴细胞分别作一下，如果单纯发表文章还可以，如果作课题，最好再加一点SCGE以外的指标，结果更全面，更合理，更完美，呵呵。
磨砂玻璃片应该可以买到，自己作恐怕太麻烦了，而且作的也不好，和您一样，我当初也是自己作，自己摸索，出来后更有成就感，呵呵，我们实验室以前有人作过，也是脱胶的问题，就半途而废了，后来一个师兄又作SCGE，他走后我又把技术改良了一下，现在觉得比较成熟了。
微电泳槽其实也不难作，用普通载玻片，用玻璃刀割出几条2毫米的细条，用这些细小的玻璃条在普通载玻片上粘两个1.5厘米见方的槽，呵呵，微电泳槽就作好了，关键怎么割出那么细的玻璃条，我刚开始怎么也割不出，都要放弃了，后来发现工具不好，如果您要作的华建议您买一把好的玻璃刀，100多元，不算太贵，用比较薄的载玻片，太厚了不好割，您就可以“庖丁解牛”了，不管作什么，好的工具是成功的开始，磨刀不误砍柴功，还有就是胶水的选择，首先要不溶于水，还要牢固，我专门作过比较，买了好几种胶，粘完后泡在蒸馏水里至少24小时，筛选出最好的胶水，看广告没用，得靠实践，我作的微电泳槽可以长期重复使用，所有的实验作下来，还是用那几个槽，很爽，所以叫一劳永逸。我作了n次SCGE，从来没有脱胶，您不妨试试，如果还有什么问题，尽管提，我会尽力而为。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 09:24     标题: 回复 #13 乌贼老弟 的帖子

还有，设计实验时要考虑中性还是碱性，都做的话工作量大，但我觉得结果更可靠，因为您的实验是药物毒性评价
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 09:24     标题: 回复 #15 一叶 的帖子

嗯，看到了，也知道了，我自己试试吧
我也觉得FISH的成本高，不太了解到底是哪条染色体受损伤，因为我作的这个药的毒性作用没有涉及过染色体损伤，假如做的话是不是要全试一下，或者选几个感兴趣的基因，看看它们在哪条上，然后作探针。您是不是还有什么其他的思路？
还有就是彗星试验检测细胞凋亡时的给药剂量会不会是细胞的死亡数目超出90%啊，因为我需要自己涉及试验思路，看了文献后觉得思路很乱，不知道做完SCGE后应该再往什么方向做
再问一个问题，是不是应该做一下体内细胞的SCGE啊，这样试验会不会才比较完整啊，3Q
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 09:25     标题: 回复 #15 一叶 的帖子

还有一个问题，我的凝胶都是事先配好的，分装成5ml。每次用微波炉加热，这样会不会导致水分蒸发，因为我发现每次用到大概剩1ml的时候，在铺第三层的时候，点到上面很快就凝了，是不是因为它的浓度变大的原因啊？
PS:我的正常熔点的胶就是用普通的跑DNA电泳的那种，是不是纯度不够啊
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 09:25     标题: 回复 #17 乌贼老弟 的帖子

检测凋亡细胞的给药剂量我觉得没必要那么大，你的药物半数致死剂量有吧？可以以这个剂量作为坐标，向两边分出不同剂量，然后做SCGE，计算凋亡细胞率，是个不错的指标。
有多条染色体探针，可以一次用，方便看您的药物的靶染色体，如果是全新的实验设计，那就靠摸索了。
我所说的淋巴细胞不就是体内细胞吗？动物体内给药，根据药物的药代动力学特征，选择不同时间采血，分离淋巴细胞，SCGE，我觉得这种毒性实验当然最好做体内，我上面提到过建议您做淋巴细胞的。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 09:26     标题: 回复 #17 乌贼老弟 的帖子

建议您的凝胶不要提前配置，我查过的文献都是新鲜配置的，可以提前称量好，分装，用前加PBS至5ml，煮沸，铺胶，很好用，我也曾试过反复用，效果不好，不易铺平，如果您的第三层胶失败了，那前面不就前功尽弃了吗。凝胶的纯度不是问题，您的胶肯定可以用，不必担心。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 09:26     标题: 回复 #19 一叶 的帖子

谢谢回答，呵呵还有问题请教
1.第三层胶的目的是什么啊。还有啊这个试验为什么会选择低熔点的胶来混合细胞啊，低熔点和正常熔点的胶在电泳过程中有什么不同，我觉得是不是第三层胶可以不用铺啊？
2.我现在做的是H2O2嘛。它的剂量我是从9.1，18.2，27.3，45.4，91，182，273，454，910，1820uM的浓度，我发现前几个剂量的脱尾区别不是很大，是不是可以把这几个剂量去掉啊，我现在不是很会设计试验剂量
3Q!
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 09:27     标题: 回复 #20 乌贼老弟 的帖子

您的问题很好，说明您善于思考，呵呵。细胞肯定要用低熔点胶混合，铺胶前低熔点胶PBS溶解、煮沸，要温于37度水浴箱，再和细胞混合，不会破坏细胞，而正常熔点凝胶就做不到了，正常熔点胶要煮沸后立即铺胶，否则温度降低，就凝固了。
我也赞成您的想法，因为我就是用的双层铺胶法，根本不用铺第三层，有文献报道只铺一层胶，呵呵，那就更简单了。
我没做过H2O2，不敢妄加评论，但是，试验结果要通过科学的统计学分析后得出结论的，我不知道您说的“区别不大”是否经过了统计学分析呢？如果预实验时您发现了前几个剂量的效应无差别的话，可以在正式试验中保留其中的一个剂量，当然最主要的还要看它和阴性对照组之间有无差别。我觉得初次用这个方法做毒性试验的话，一定要找到和阴性对照组之间有差别的最小剂量，然后剂量逐步提高，如知道半数致死剂量就更好了，有了两个坐标，在这两个剂量之间选择剂量，当然，在大于半数致死剂量还要选择一定剂量，随着剂量的增加，必然会出现从某一个剂量以后，大于此剂量的若干组之间都没有了差别，那就以此剂量造成的损伤作为100％（如尾长、尾矩、OLIVE尾矩等等好多指标可测），首、尾都有了，中间就好办了！可以根据这个剂量范围，继续做凋亡细胞率的观察，看看这个指标怎么样。
个人看法，不一定合理，仅供参考，见笑了。
作者: 园丁##    时间: 2011-12-2 10:00

谈一些我的经验，希望有所帮助。

我们用有机玻璃板自制了一套架子，按照电泳槽的大小制作一个托架，可直接放进电泳槽(托架上打孔使电泳液自然流动,否则胶会被冲跑)。托架可以放置8个载玻片托架。载玻片托架与载玻片同宽，略长，按载玻片大小粘上4个有机玻璃小块，载玻片可以嵌入托架。

关于铺胶，我们只铺一层，说是铺胶不如说是“滴”胶。载玻片倾斜，用较大口的玻璃滴管滴在靠上部分，胶会自然流动形成。非常薄的胶使得彗星图象更清晰。每个玻片可以找到20-60个有效细胞。

图像系统直接用摄像头接在显微镜上。摄像头的线性要好。我使用中性滤片校准灰度值。穷人只能因陋就简。几万的摄像头可买不起。因为一个图像一个细胞，分析可以批量处理。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 10:01

很感激两位高手的指点，真的是帮助很大啊，呵呵。
我现在胶的问题基本上解决了，看来一个试验应该注意的细小的地方真的是很多，我还得踏下心来一点一点的解决问题，说实话问了这么多的问题真怕大家烦了，昨天还有点担心大家不会再给我解答问题了呢，呵呵。看来担心是多余的了，一叶 老师辛苦你了，感谢万分！同样的谢意也送给园丁##！

PS：希望还能继续讨论！
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 10:01

对了，你们用的分析软件是CASP吗？我怎么下载不下来啊，听说还有KOMET5.5,不过我下载了之后装不上去，现在手头上有image pro plus，是不是应该用专业的用于分析彗星试验的软件要好一点啊，3Q
作者: dotaaa    时间: 2011-12-2 10:09

我没用过CASP 或 KOMET， Image Pro用过但不适合分析彗星试验的图像，我的软件是自己写的，没有UI 。输入一系列采集的图像，自动分析每个图像，结果保存在CSV文件中，验证结果可以浏览输出的图像(叠加头、尾的边界)。

我已经很久没做过彗星试验了。看到人家KOMET都在卖，而我的程序早已不知去向，在我以前研究所的某张软盘上

CASP 是OpenSource的，可以自己按照你的需要更改，可以试试。如果每张图片都要人工介入去分析，太累了。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 10:16


问啊，EB的致癌性那么强，那么用过的玻片应该怎样处理啊，呵呵，现在觉得整天接触EB很危险
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:17

玻片我也不知道怎么特殊处理，我只是每天做完试验后把胶板用镊子刮掉，玻片用水反复冲洗后，把玻片泡在一个专用的盆里，第二天再用蒸馏水洗，我也不知道这样行不行。再有，试验过程中要严格隔离，我当时做试验的时候，开始实验就带上医用乳胶手套，中间还要换新的，直至结束，一天下来，手就像水泡馒头一样，呵呵，是有点辛苦。
还有，建议您把用于拍照的数码相机保护好，因为带手套的手要按快门的，所以最好把相机外面套一层塑料罩。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:26

SCGE是想补充一下资料，或是使您的实验更完美和有说服力。如果您选择SCGE的话，会有短期的一段时间比较累，但是实验进展很快，时间不会长，估计不会耽误您的毕业。关键是SCGE的摸索过程，因为您从未做过这个实验。 按您所说，做药物的毒性实验，可查的文献比较多，可以参考，想必您也通过文献了解了不少了吧？SCGE的方法学各个实验室都不太一样，但是实验主线不会变。先设计好您的实验，预实验时摸索一下方法，比如药物浓度、剂量、时间等等。预实验中只要能出来结果，您就成功了一半，然后按设计好的实验进行，会很顺利，所以，实验设计是比较关键的一个好的导师会帮助你设计一个比较好的实验，如果在实验过程中再去改设计，那就太被动了！
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:28

取血－淋巴细胞分离－铺胶－裂解－解旋－电泳－染色－荧光显微镜观察－拍摄
这是全过程，其实不难，有什么问题尽管提，我尽量帮您。
作者: dotaaa    时间: 2011-12-2 10:29     标题: 回复 #29 一叶 的帖子

我其实一点实验都还没做，我还有8个月的时间，前一阵子一直在变方向，老是确定不下来做什么。我很惨的，导师是搞行政的，没有人能帮我，我全都是自己设计。看了很多文献，但是光看不做什么效果也不会有。
我不清楚你研究的方向是什么，如果是毒理或相近的话请帮帮我，我出些钱过来做实验好吗？
我一个人实在无法撑下去了。而且我们实验室那边都不是做毒理的，根本没实验条件。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:38     标题: 回复 #30 dotaaa 的帖子

您好，看来您的情况比较特殊，不过，别气馁，我会尽我的最大努力帮助你，你看了不少文献说明你关于SCGE的知识储备应该不错。我搞的是放射医学毒理，我当时做的课题是 γ 射线对小鼠、人外周血淋巴细胞DNA损伤的观察，并拟合人淋巴细胞照射后的剂量效应曲线，后来有总医院的两个硕士生来我们这SCGE，是他们硕士课题的一部分，做的是低剂量辐射对放、化疗效果的影响。虽然我没有做过有关药物毒理方面的研究，但是我们的研究方向还是有相通之处的，可以互相借鉴，而且如果你能来的话，我也可以帮您找我们这里搞药理的老师帮忙，虽说我们这里的条件也不是很好，但做SCGE还是绰绰有余的，呵呵。还要看您的导师能否同意您出来做试验，如果您能来，我会尽量帮你在这边联系的。
祝您成功
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 10:39


最近一直在做试验，想请教一下 一叶 老师和 园丁## 老师，我安装CASP的时候，先是全部下载之后但是安装上的程序，总是显示不成功，很是奇怪，想问一下大家到底怎样才能装上这个程序。3Q
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 10:40


对了，我的一张片子的结果觉得有点奇怪，为什么尾部的DNA会和头部连在一起啊，不象文献上的那种很是规则的拖尾，我的结果也不是每个剂量都是这个样子，大部分还是挺好的。

图片附件: 91385623.jpg (2011-12-2 10:40, 32.61 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9437

作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:41     标题: 回复 #33 乌贼老弟 的帖子

战友您好：
先说您的CASP软件，干脆我放到我的网络U盘，晚上您去下载吧。
图像的问题你可以去看看我做的彗星图像，仅供参考。我不认为你的彗星图像不好，我觉得完全可以出现这样的彗星，不过有一点，您的EB浓度没有掌握好，背景太乱了。太多多余EB结晶和杂质。这种图片质量发文章很困难。

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2729243&sty=1&tpg=1&age=0')
作者: utt0989    时间: 2011-12-2 10:43

我用的农药是溴虫腈，市场上卖的是质量浓度为10％的悬浮剂（微米或厘米级）。我们实验室一位博士合成了质量浓度为5％的纳米级（20-30nm）溴虫腈悬浮剂（粒径变小的话可以提高药效），而且他制备了TiO2修饰纳米级溴虫腈的功能化制剂。（利用氧化钛的光降解作用加快溴虫腈农药的降解，从而达到低残留的目的）。
我实验的目的就是评价他制备合成的两种农药的毒性（毒理研究）。
所以受试物是：
纳米溴虫腈，
经TiO2修饰的纳米溴虫腈
TiO2
市场上售的溴虫腈。
我做微核的话要用小鼠先做一下急性毒性试验，求出LD50。
做SCGE,是取了小鼠淋巴细胞培养后喂毒，当然如果体内喂毒的话也可以，看哪个方便效果好为主。
麻烦老师替我想想了。

感激不尽啊！！！
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 10:43


唉，别提了，我们实验室没有条件照相，这几个片子是我放了好多天后才去照的，所以胶已经很干了效果当然不是很好。不过最有收获的还是看见您提到的EB的浓度问题，我用的是1ug/ml的浓度，每次用40ul，染色2分钟，用水冲掉，这是同学帮我照的嘛，背景是她调的，当时我们觉得不好，但是同学说可以用photoshop处理，所以就这样了，老师啊，是不是不能处理啊？哪÷那是不是就不能用了
还有您用过cometscore软件吗？怎么它要求的格式是bmp啊，我得文件根本就打不开。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:45


首先，荧光染色的东西最好马上看，否则影响结果。
其次，您的染色液量我觉得多了点，我用2ug/ml，1ml注射器1滴就可以。
第三，要忠于实验结果，图象内容不能更改，可以用ACDSEE或PHOTOSHOP转换图象格式或大小，所以，作出来的实验图象质量要好。
您说的cometscore软件我没有用过，不过JPG格式可以用上面的两个软件转换成BMP格式。
作者: utt0989    时间: 2011-12-2 10:45

一叶老师，我导师说我花2万块太贵了，微核就自己实验室做。
我把受试物改为3个，
纳米溴虫腈
TiO2修饰的溴虫腈
TiO2
设3个剂量组4.9mg/Kg, 9.8mg/Kg,19.6mg/Kg,（参照人家做市售溴虫腈DNA损伤的剂量）
每个剂量组4只老鼠（杂交鼠即可，雌雄对半）
阴性对照组4只，总共老鼠40只。
腹腔染毒24h后采血。
这样工作量就少了很多，估计很短的时间就能做完吧？
您帮我算一下器材费，试剂费，老鼠费，人员费，还有两个人的住宿费，来回车费等等大概需要多少钱，我得再向我导师审批。
真是不好意思啊，麻烦您了，谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:46     标题: 回复 #36 乌贼老弟 的帖子

注意了，请您到我的网络U盘下载CASP软件，左键点击那个CASP，弹出对话框，然后点击“直接下载”就OK了，双击安装，没问题的，我已经试验过了。下面附上这个软件的使用说明。

cuturl('http://lq6688.vdisk.cn')
这是网络U盘的链接，直接点击即可。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:46


这是CASP的工作界面，我选的是我做的3Gy照射的彗星图像，分析后的界面。

图片附件: 36151209.snap.jpg (2011-12-2 10:46, 36.72 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9438

作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 10:47     标题: 回复 #40 一叶 的帖子

收到，不过结果和我以前安装得一个样子，就是点击它，安装在c盘，然后，桌面上形成一个不能识别的图标，点击它会提示：快捷方式casp.link指向的驱动器或网络连接不可用，请确认磁盘插入正确或网络资源是否存在，老师您知道是什么问题吗？机器是XP系统，一直安装不上就是因为这个原因。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:47     标题: 回复 #41 乌贼老弟 的帖子

奇怪，我还从来没有遇到这种事！可能是软件的问题。（我在单位和家里的电脑上都有安装，均未出现任何问题）
你在D盘建一个文件夹，如命名为CASP，把软件安装到这个新建的文件夹中，如果桌面上出现快捷方式，干脆把它删除！然后到D盘，打开刚建立 的CASP文件夹，找到其中的CASP.EXE，左键双击它，看能不能出现CASP的工作界面，如果工作正常，那就再右键选中CASP.EXE，选择发送到桌面快捷方式，桌面会出现一个新的快捷方式，这个快捷方式可能是一个不可识别的图标，但是双击它时可以正常出现CASP的工作界面，那就OK 了。另外，请注意，成功安装后，在新建的CASP文件夹中，会有一个CASP.ICO文件，那是一个图标文件，你可以把桌面上的不可识别图标换成它，这个图标就好看多了。
试试看，应该没有问题！我刚才在我的机器上又试验了一次，绝对不会有问题，安装后，好好阅读我发的CASP使用说明，几分钟你就会用了！（其实安装成功后，它自带使用说明的）。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:48


记住，CASP软件只读.tif格式的图像，如果你的相机拍的照片没有这个格式，可以存如计算机后，用ACDSEE（现在是7.0版本）转换一下，很方便的。还有，用CASP分析时一定要让彗星的尾巴方向向右！其实这在使用说明中都有的。你在做试验时，电泳仪的阳极端在你的左侧，DNA片断会向阳极迁移，彗星尾巴当然向左，但在显微镜下尾巴就会向右，原因不用我解释吧？那拍下来就是尾巴向右了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:48

呵呵，今天中午我突然想到你可能遇到你提到的问题，果然出来了。背景的选择问题，如果图片质量好的话，背景大小不同，对结果影响不是很大，如果图片背景乱七八糟，那背景框的选择肯定对结果产生很大影响。我的建议：背景框不要太大，参考我贴的那个图。注意，背景框可以在细胞的上面或下面，如果背景框在上面时，分析后的图像（分析后出现一个头、尾分明的图像，是基本重合在细胞上的）质量很差，很不规则，那再把背景框调到下面试试，如果还是不好，那只能说你的结果质量不好了。背景框的选择关键在于分析同一批细胞，背景框要相同，才能保持资料的可比性。
结果的保存，记得好像使用说明里提到了，如果没有提到，那就是我原创的！！！呵呵，先卖个关子。FILE菜单下有一个EXPORT RESULTS（输出结果）的按钮，点击以后，默认是.TXT文本文件，好了，给你的输出文件起个名字，选择保存位置，点击确定就OK了，回到你保存的输出结果文件，发现它是一个不可识别的文件，那就直接把它的扩展名改成.TXT，打开它，看看你的结果，包括13个指标，很好，这个.TXT的结果文件可以被SPSS统计软件直接识别，不是很方便吗？？（如果你愿意把数据一个一个地输入统计软件，我也没意见，呵呵）。这里还有一个小窍门，在用SPSS读取之前，最好把你的结果文件调整一下，这也是我发现的。把所有的指标都排列到第一行，下面的结果要和指标一一对应，每个数据之间留空格（默认的），行与行之间不要用回车，就是不要有空行，其实调整起来很简单，主要是调节.TXT文本文件阅读框的宽度。调好后，SPSS软件直接识别，很方便，为你节省很大工作量，不信就试试。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:49


关于你的下一步工作，如果还想做SCGE，体内试验当然是最好了。那就结合FISH 或流式，如果你的药物不知道它的靶染色体，那就慢慢摸索，FISH的成本高，看你老板的经济能力了，如果你第一个发现了你研究药物的靶染色体，呵呵，不是很惬意？？和流式结合的试验我也没做过，我们的流式刚刚到位，正在调试。流式可以把具有不同表面特异性分子的细胞提出来，然后做SCGE，如果有新的发现，你的论文不是更好吗？当然，探索就要有风险的。如果不做SCGE，药物试验（尤其是生物效应方面）还可以做染色体畸变、SCE（姐妹染色单体互换）、微核，其中以SCE对药物的特异性最好。这方面我没经验，我们这一个老教授很有经验。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 10:51

对了，您说照相的时候的放大倍数对结果有没有影响啊，是不是选择的倍数不一样，图片的质量也会不同啊，应该是清晰度不同吧。我一般选择20倍的，因为觉得照下来的彗星多
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:51     标题: 回复 #46 乌贼老弟 的帖子

我觉得用高倍镜比较好，40倍物镜，如果您用20倍物镜拍的图像用CASP分析时效果好的话，也不妨用20倍，还是那句话，每一批试验所有条件相同就可以，否则没有可比性。你说呢？
作者: fqswdzd    时间: 2011-12-2 10:52

一叶 老师：您好
您说您用的是两层胶，我想知道您这两层都用的是多大浓度的胶？多大量？怎么铺的？
作者: fqswdzd    时间: 2011-12-2 10:52

都怕EB有毒，而吖啶橙效果又不好，所以想换一种，但是SYBR Green Ⅰ是结合双链的内嵌染色剂，而碱性电泳是把DNA双螺旋解开成单链的，所以甚觉不妥，望不吝赐教！

前面 一叶 老师已经做了解释，在此再提出来向各位高手请教，先谢谢了！
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 10:53     标题: 回复 #49 fqswdzd 的帖子

SYBR Green Ⅰ用于检测双链，所以你还是用EB，DAPI的敏感性比EB要好一点，你也可以用，不过还是强致癌物。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:54     标题: 回复 #48 fqswdzd 的帖子

您好，前面我已经介绍过，我用双层铺胶法，自制微电泳槽，第一层:0.75％正常熔点胶，100μl，第二层：0.75％低熔点胶，75μl+25μl淋巴细胞悬液，用枪直接把凝胶吹到自制的微电泳槽中，铺平即可。第二层以相同的方法铺到第一层上面，不必担心脱胶的问题。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:54     标题: 回复 #50 乌贼老弟 的帖子

您好，前面我已经介绍过，我用双层铺胶法，自制微电泳槽，第一层:0.75％正常熔点胶，100μl，第二层：0.75％低熔点胶，75μl+25μl淋巴细胞悬液，用枪直接把凝胶吹到自制的微电泳槽中，铺平即可。第二层以相同的方法铺到第一层上面，不必担心脱胶的问题。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:54     标题: 回复 #35 utt0989 的帖子

战友您好，在凝胶中即使有细胞的话，不通过任何染色措施，不易看到细胞，在凝胶中不同于细胞悬液，有时看悬液中有无细胞，可以直接滴片，自然光镜检，可以看到细胞，儿在凝胶包裹中就不容易看见了。首先您要确定悬液中有无细胞，如果您用的细胞系的话，应该有细胞，如果没把握，您可以在裂解完成后，先不电泳，直接染色看一下，如果有细胞，在荧光下是很漂亮的一个个细胞，圆形，周围有晕环，（这我曾试过，所以我敢说），如果看不到细胞，那就是凝胶中根本没有细胞，我建议您换EB试试，注意防护就可以了。其实做试验多是在对药品毒性了解的情况下进行的，而现实生活中有多少我们不能察觉而根本没有防护的损害因素呢？所以我觉得不要因噎废食，做好防护就可以了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:56


还有一个可能原因就是您的激发光波长不合适，
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 10:57


大家有没有朱志良发现苯代谢物的靶染色体的那边文章吗？我自己怎么都找不到啊，希望大家帮个忙，谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 10:57


我查了万方和CHKD都没找到，只是在文献上看到过他发现靶染色体的叙述，也没找到原文，不知道怎么回事。国外文献？可是一般国内也该有的。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 10:59     标题: 回复 #56 一叶 的帖子

我想知道假如我做一个基因的探针，因为这个基因可能会很长，我可能只做含有几个外显子的探针，如果FISH结果阳性那就好说了，但是如果是阴性，您说是不是想叫大家大家相信就要做更多的工作啊，因为大家怀疑是你试验过程或者设计有问题啊
因为我现在想证明一下这个药物可能的致癌性，能不能选个癌基因做一下FISH啊，如果有损伤，能不能说明一些问题啊
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:00

如果你研究的基因在染毒后出现断裂，不管断裂点在这个基因的哪个部位，你的探针标记肯定会在电泳后跑出来，如果通过多次重复试验，还是阴性的话，说明药物的DNA靶点不在这个基因上。
我有一点不明白您的意思，（药物的致癌性和DNA 断裂的关系）。药物导致DNA断裂，不完全等同于它的致癌性吧？两者是有关系，但不能说药物可以使DNA断裂，就有多强的致癌性吧？（呵呵，也许我没有看明白您的意思）。我觉得说“基因组不稳定性”更好。您说呢？
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 11:01     标题: 回复 #58 一叶 的帖子

对，您的意思很对，我也是这么想的认为它可能的致癌性，呵呵，没有表达清楚。
作者: loli    时间: 2011-12-2 11:02

一叶 老师：
你好，最近打算做一下彗星实验，以前没有做过，身边也没有做过的人，请教一下几个问题：
1.实验中所使用的载玻片是不是一定要那种frosted slide，用普通显微镜使用的那种透明的载玻片可不可以？
2.实验中使用的盖玻片是不是就用那种小个的正方形的普通盖玻片就可以？
3.在染色后观察时是不是不用在用清水冲洗了，从染色液里拿出直接盖盖玻片观察？
4.电泳时的电压文献里说法不一，这个电压的选择有什么标准？需要电泳多长时间
5.我不是学生物的，对显微镜不太熟，就用过那种最简单的，彗星实验里需要用什么样的显微镜，好像如果用visual scoring，就是肉眼定等级那种就用普通的显微镜照相就行了是吧，是不是得用专门的能往上装相机的显微镜啊？如果要用软件分析的话，好像还得有滤光片之类的，是不是还得有激发波长之类的需要调的参数，谁给介绍一下，另外这种分析软件是不是都是显微镜自带的分析软件，还是把图像弄下来有第三方的分析软件？
6.如果用EB染色的话，需要泡在EB里吗？还是往上滴染色液就行了？观察时用什么光谱条件？
希望能够得到您的帮助，非常感谢！
作者: loli    时间: 2011-12-2 11:02


又想到几个问题：
1.看前面的帖子，您用的中性条件，裂解液的成分都是什么，ph在多少？
2.您为什么要专门做一个小电泳槽？把玻片直接放在水品电泳槽里不可以吗？如果没人碰它，应该不会随便移动吧？可不可以把自制的小电泳槽照张照片放在上面，让我们看一下是什么样的
谢谢！
作者: abc816    时间: 2011-12-2 11:08


我想问 一叶 老师：我也是用CASP分析彗星的，但是相机拍出来的是JPEG各式的，想要把它转成TIF格式，我通常是在photoshop上转的，但是必须一张一张的转，这样很费时的。可不可以同时把所有的照片转呀？
还有，CASP上的ADJUST可以调尾部或头部的大小，但是程序的默认值是最佳的，说明上好像说了与灵敏度有关，最终我还不懂是怎么回事，虽然这个与分析没有什么关系，但是我觉得知道他的原理更好一些。
读了您上面的帖子，我重新又把软件用了一遍，感觉进步了很多，谢谢你哦。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 11:08


载波片一定不能用普通的,否则胶很容易掉下来.
作者: abc816    时间: 2011-12-2 11:09


2。盖玻片用普通的就可以了，但是可以自做的，普通的盖玻片其实有点小了，如果胶很多的话，第二层胶非常厚，这样不利于观察细胞，而且不利于电泳。
3。染色后要用双蒸水冲洗，据我的经验，冲要冲的非常干净，否则背景太亮了，拍照后不容易分析。但是又不能使劲的冲，否则胶很容易掉下来。
4。电泳的时间一般是20分钟，电压各个细胞是不同的，你可以查查有关资料，自己做做预试验。一般情况下，对照组的细胞的tail DNA%应为10%左右，不超过20%，如果尾巴太短了，也不好。
5。分析要用荧光显微镜的，具体的染液，有不同的激发波长。casp软件在前面的帖子中就有。很好用的，在推荐一次哦。最好用显微镜自带的相机，如果你的技术好的话，可以在目镜照相，洗出来扫描后可以分析的。
6.把EB滴加在胶上就可以了。观察时要在暗室里。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 11:09


1。裂解液的配方也是不同的，这个可以在网上找找。
2。玻片可以直接放在水平电泳槽里，但是一定要放直，和边缘靠齐，否则跑出来的尾巴向上翘。倒电泳液的时候，也要注意，防止水把玻片冲歪了。
祝你试验成功哦！
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 11:10

请教，彗星的分级是根据尾长分吗？它说的15um是指除以放大倍数后得到的数值吧
它的分级标准是不是有很多个 啊，还有根据损伤率分的，到底哪个准确一些啊，或者通用一些
作者: loli    时间: 2011-12-2 11:10     标题: 回复 #62 abc816 的帖子

谢谢abc816，再问一下，盖玻片太小的话，可以用那种普通透明的载玻片代替吗？
会不会太厚了影响观察？还有，有那种能直接买来用的小片的毛玻璃吗？
还是得买大片的自己分割？
作者: abc816    时间: 2011-12-2 11:11     标题: 回复 #67 loli 的帖子

每分析完一个数据要点“保存”按钮，最后你保存用“文件名.txt”，打开这个文件后，你全选，复制，然后复制到word文档上，然后全选，点表格中的将文件转化成表格。然后你就可以看到数据了。
你看不到数据，因为你分析得数据有点少了，不过这个没关系的。
如果你再找不到，告诉我，我给你介绍的详细点。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 11:11     标题: 回复 #66 乌贼老弟 的帖子

现在根本不分级了，那个有点过时了，而且主观性很大。
用casp软件直接就可以知道13个指标，你只要选一个单项指标和一个复合指标就可以了，一般是选tail DNA%和tail moment.
ihuan，不能用普通的载波片，太厚了，而且很重，作出来的胶不好，不平，这样不利于电泳。你观察细胞的时候当然要把盖波片揭掉了。
毛波片可以在一些公司订购的，千万不要用普通的载波片。也可以自己磨，不过比较费时，而且做成的几率也非常小。
作者: loli    时间: 2011-12-2 11:11

用哪种染色剂比较好？
丫叮橙和EB哪种效果好些？
作者: abc816    时间: 2011-12-2 11:12     标题: 回复 #70 loli 的帖子

吖锭橙就可以了,一般是20微克每升,效果很好的.
EB有毒呀!
吖念"a"不是"ya",呵呵.
作者: 白白的    时间: 2011-12-2 11:13


我想问一叶老师：我也是用CASP分析彗星的，但结果按您指点的方法存后，在打开只有分析的指标而没有数据，麻烦您将具体一点好吗？
作者: 中国特色    时间: 2011-12-2 11:14

1.实验中所使用的载玻片是不是一定要那种frosted slide，用普通显微镜使用的那种透明的载玻片可不可以？
2.实验中使用的盖玻片是不是就用那种小个的正方形的普通盖玻片就可以？
3.在染色后观察时是不是不用在用清水冲洗了，从染色液里拿出直接盖盖玻片观察？
4.电泳时的电压文献里说法不一，这个电压的选择有什么标准？需要电泳多长时间
5.我不是学生物的，对显微镜不太熟，就用过那种最简单的，彗星实验里需要用什么样的显微镜，好像如果用visual scoring，就是肉眼定等级那种就用普通的显微镜照相就行了是吧，是不是得用专门的能往上装相机的显微镜啊？如果要用软件分析的话，好像还得有滤光片之类的，是不是还得有激发波长之类的需要调的参数，谁给介绍一下，另外这种分析软件是不是都是显微镜自带的分析软件，还是把图像弄下来有第三方的分析软件？
6.如果用EB染色的话，需要泡在EB里吗？还是往上滴染色液就行了？观察时用什么光谱条件？

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1.普通的那种光滑的载波片不大好用，主要是容易脱片。所以很多人都用磨片的玻璃。如果你不想用磨片的玻璃，也可以自己设计，象楼主那样。我在晶美买过一种做彗星实验的试剂盒，玻片上不知涂过什么冬冬，很好用，只需要铺一层低熔点胶，不掉胶。缺点是太贵，只能一次性使用。
2.盖玻片还是用大一点的，22mm×22mm的那种规格，可以把胶铺得更匀更薄一些，还容易取下来。
3.这个问题帖子里已有讨论。
4.具体得电压电流真的还需要自己摸索的，各种细胞各个仪器应该有所不同吧。电流100mA-300mA，电压0.5－1V/cm，电泳时间10－40min，我有见过做60min的。
5.如果想用荧光染的话，就用荧光显微镜来观察。要用普通显微镜来看，就得银染。摄像装置的目的是要把结果保存下来做分析用。有好几款软件可以用来分析。除了楼主推荐的这一款外，丁香园FTP上有一款comet5.0的，也不错。
6用EB染，不用泡，滴上去就行，泡的污染太大。弄的到处都是。用荧光显微镜的绿光来看。
作者: windy+++    时间: 2011-12-2 11:14


请战友指教comet assay，是测定凋亡的。

图片附件: 60525937.jpg (2011-12-2 11:14, 6.38 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9439

作者: windy+++    时间: 2011-12-2 11:15


还有一张结果，可能不太好。

图片附件: 79494621.jpg (2011-12-2 11:15, 6.78 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9440

作者: windy+++    时间: 2011-12-2 11:15


我用CASP软件分析了一下，但不知道分析出来的值是否有意义？

图片附件: 39363948.snap.jpg (2011-12-2 11:15, 29.9 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9441

作者: 园丁##    时间: 2011-12-2 11:15

关于comet-fish。其实fish 技术就用于检测染色体上具体的基因。这个基因对损伤的敏感性一般要比其他的强。现在最热门的就是检测tp53基因。而且通过这种检测。可以确定更多对人体有害的环境因素。有兴趣的话可以看看下面的摘要：In addition to exogenous risk factors, the development of head and neck cancer is based on genetic alterations and individual
sensitivity to mutagens. The DNA-damaging effect of xenobiotics and the location of chromosomal changes warrant further
investigation. The aim of this study was to evaluate variance in structural genetic changes in human epithelia as target cells for
head and neck carcinogenesis. The combination of the single-cell gel electrophoresis (Comet) assay with the fluorescence in situ
hybridization (FISH) technique is presented to examine differences in sensitivity to DNA-damage induction and in alterations
of chromosomes 1, 3, 5 and 8 in patients with and without squamous cell carcinoma of the oropharynx.
Macroscopically healthy biopsies from the mucosa, taken at a distance from the tumor of 10 patients with oropharyngeal
carcinoma and from 10 patients without tumor were harvested during surgery. Cells were isolated by enzymatic digestion and
incubated with benzo[a]pyrene-diolepoxide (BPDE), causing DNA-adduct formation by covalent binding of BPDE with DNA
bases. The cells were subsequently analyzed by means of the Comet assay to separate DNA fragments and to visualize the DNAdamage.
A hybridization mixture with whole-chromosome paints for Chr1, Chr3, Chr5 and Chr8 was added. After fluorescent
staining, the entire DNA and the DNA of chromosomes 1, 3, 5 and 8 were evaluated by digital analysis.
BPDE caused significant DNA damage in oropharyngeal mucosa cells of patients with and patients without carcinoma.
No differences in the amount of DNA damage could be observed between patients suffering from sqamous cell carcinoma
and patients without malignancy. Evaluation of chromosomal alterations, however, revealed significantly higher damage levels
in chromosomes 3, 5 and 8 compared with chromosome 1 in tumor patients. In contrast, for patients without oropharyngeal
carcinoma no differences in chromosomal alterations could be observed.
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:16

loli 战友，您好！
1、如果不自制电泳槽的话，最好用毛玻璃，我前面讲过自制微电泳槽的方法，我会尽快按照您的要求拍一张我自制的电泳槽照片，仅供参考，不过我觉得很实用。
2、我铺胶时不用盖片，所以我不清楚用什么盖片，估计就是普通盖片。“老王卖瓜，自卖自夸”，我还是向您推荐我讲过的自制微电泳槽的方法，会省去很多时间的，不信就试试，呵呵。
3、我不清楚您用什么染液，我是用EB的，电泳后，直接在胶板上滴上一滴，然后用水冲洗，用滤纸吸去多余水分，荧光显微镜观察。
4、电泳的电压问题，我在前面的帖子已经谈到过，虽然文献说法不一，但是相差也不是很大，有一篇文献专门讲了SCGE的最适条件，可以参考一下，如果您手头没有，我可以提供。
5、显微镜要用荧光显微镜，如果没有专门的彗星分析系统硬件（价格比较昂贵），最好用数码相机拍下来，然后存入计算机，用CASP软件分析。这个软件可以在网上直接下载，我在前面的帖子已经提供了。
6、如果染色时把标本泡在EB里，我觉得那是很不明智的，那样很容易污染操作中所用到的硬件，甚至自己的双手，不易防护，只要用1ml注射器在胶片上滴上1－2滴就可以了，然后用水冲洗一下，滤纸吸干（前面已经讲了）。
7、我做小电泳槽的目的主要是防止脱胶，而且不用盖片，从来没有遇到过脱胶的问题。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:17

列解液的配制和光谱条件稍候我会给您提供详细的资料。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:29

abc816战友，您好
文件格式的转换非常简单，用ACDsee就可以了，可以批量转换，现在的版本好像到了7.0，它的工具栏有“转换文件格式”，很方便的。把要转换的图像文件选中，然后找到“转换文件格式”，OK! 一次可以转换很多图像文件，很方便，而且还有批量改变文件名，改变文件大小等等。（如果一个一个转换，那岂不是很惨！我好像分析过了上万张彗星图像，一张一张转换的话，我早累死了，呵呵）。
我用CASP前详细阅读过它的说明，我觉得最好还是用它默认的条件为好。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:29

您的问题是您没有仔细看CASP的使用说明，您的分析界面还是我之前提供的那个“预分析界面”，（上面lwk2003战友也提供了一个这样的界面），预分析的界面是不能输出结果的，要在该界面的第二行的工具栏有一个像“齿轮”样的标志点击一下，齿轮上出现一个红色的斜杠，才可以正式分析，分析后的结果可以通过我以前的帖子所讲进行输出，很方便的。您可以预览分析结果，点击“view”下拉菜单，选择“view result",再把图像分析界面最小化，（可不是整个分析界面，而是左侧的图像分析界面），然后把这个最小化 的小窗口用左键向下拉一点，您就可以看到一个result的结果窗口，也是最小化的，把它最大化，您可以看到您的分析结果，结果窗口和图像分析窗口可以随意转换。如果还是不够具体，您尽管提出来，我会解答。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:30     标题: 回复 #74 windy+++ 的帖子

您的图像质量不是很好，如果您的目的可能是测定凋亡细胞率，您选的这张图片不是凋亡细胞，您仔细看一下CASP分析界面偏右侧的曲线，如果是很明显的双峰（M型），那肯定是凋亡细胞，而且凋亡细胞在显微镜下很容易鉴别的，典型的小头大尾，而非凋亡细胞是大头小尾，我稍候会把一张比较典型的凋亡细胞彗星图像贴上来，另外您在分析的时候最好把界面右侧的"head 和tail"选中（打上对勾），左侧的图像分析界面会出现鲜明的头和尾。
作者: windy+++    时间: 2011-12-2 11:30

重贴一次

图片附件: 82205047.jpg (2011-12-2 11:30, 14.82 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9442

作者: windy+++    时间: 2011-12-2 11:31

分析结果

图片附件: 29025082.snap.jpg (2011-12-2 11:31, 36.32 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9443

作者: windy+++    时间: 2011-12-2 11:31


还有一张

图片附件: 90280895.jpg (2011-12-2 11:31, 5.24 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9444

作者: windy+++    时间: 2011-12-2 11:31


分析结果

图片附件: 88795960.snap.jpg (2011-12-2 11:31, 29.47 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9445

作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:32

您的4.tif图像质量还不错，是凋亡细胞，但是好像有点头尾没有充分分离，是电压的问题？
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:32     标题: 回复 #83 windy+++ 的帖子

我觉得您的第一张图像没有分析的价值，背景太乱了，
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:33


这是我做的凋亡细胞图像，仅供参考：

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作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:35


将此图像转换为.tif格式后，用CASP分析的界面，请注意箭头所指部位的变化，在这种界面下，才能输出保存结果。

图片附件: 99808429.jpg (2011-12-2 11:36, 59.02 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9447

作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:36


请大家仔细看一下这个彗星分析的图像特点，头小而尾大，和以前我提供的截图不同，右侧的曲线呈双峰（M型）。这就是典型的凋亡细胞彗星图像。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:36


回答loli战友曾提出的问题：
裂解液的成分：NaCl, Na2EDTA, 肌氨酸钠, Tris-HCl, 用前加 TritonX-100 , 二甲基亚砜, PH值8.2-8.4,使用前4 ºC在预冷。
光谱条件：（EB）：激发波长515-560nm，绿光。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:37


有时间我做一个详细的CASP软件使用图解，今天恐怕不行了。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 11:37

奇怪啊，刚才是不能输出结果，现在是突然可以了但是呢，每次输出的结果都是第一次的结果，很是奇怪啊
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 11:38


Q1好像结果的那一栏总是显示第一个文件的名字，显示result 1，后来的文件的名字就没有了
Q2我的照片很大，不满足分析的条件，每个文件的大小是14M，我想把它改小一点，怎么改啊，谢谢大家
Q3就是我的一张片子的不同地方的结果差异很大，有的地方很小的拖尾，有的就要大一点，我应该怎么做啊
Q4我用EB的背景有点高，就像上一个战友的那种，应该注意什么地方啊
Q5同一批的样品只是浓度不一样，有的片子的结果很好，有的就很差劲，想不出来是什么原因
希望能和大家讨论一下啊，谢谢
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:39     标题: 回复 #95 乌贼老弟 的帖子

您好，您的个别问题不够明确，请明示，我暂按我的理解回答：
Q1：注意我上面有一个帖子的截图，在您把“小齿轮”点击后，出现红色的斜杠，同时，它左侧第三个按钮由灰色变亮，每分析一个彗星后，都要点击它，才能保存结果，然后分析第二个彗星图像，同样也点击那个按钮，最后把所有的图像都分析完成后，按我以前所说，输出结果，OK！（我会做一个详细的CASP使用图解）。
Q2：照片大的问题很简单，ACDsee这个软件就可以，我在4月25日的帖子里提到了用这个软件转换文件格式和大小，很简单，但是有一点我不太明白，您的图像为什那么大？数码相机拍出来的不会那么大吧?什么格式的？如果是BMP格式，那就比较大，赶快把它转换呈TIF格式，用于CASP分析。
Q3：这一点很正常，有战友在该版的“图片仓库”子版的单细胞凝胶电泳图像后面的跟帖中提到这个问题，可以去看看，说明不同细胞受损程度不同，这种现象在药物毒性试验中可能小一些，在射线损伤中尤其突出，我深有体会。
Q4：我在本专题前面的帖子早就提到过EB的浓度和量的掌握，EB过多肯定影响图片质量，像上面战友提供的一张图，背景很乱，没有分析价值，一点点染液就足以让DNA显色，另外，千万注意电泳后用水冲洗，最好立即染色观察，胶板不要干，否则前功尽弃，质量很差。
Q5：“同一批的样品浓度”，指的是什么浓度？细胞浓度？OR药物浓度？
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:40


Q5：我理解可能是药物浓度不同，出现您说的结果是否试验过程中有失误？试验用的器械尽量干净，不要混入其它杂质，另外，跟兔子学习学习，"狡兔三窟“，我 就是这么做的 ，每一个样品最少铺两张胶板，同时裂解，如果其中一张失误了，还有另一张候补，呵呵，我觉得这方法不错！
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 11:40

对了，老师能不能给解释一下，图像分析结果的横纵坐标代表什么意思吗
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:41


CASP软件应用图解：时间仓促，不妥之处，敬请指正：
一、这是该软件的工作界面，注意箭头所指的几个按钮，主要用这几个按钮工作。

图片附件: 36898094.jpg (2011-12-2 11:41, 43.92 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9448

作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:44

二、单击红色箭头所指按钮，即打开文件，注意图像文件应是TIF格式，（蓝色圈定所指），按住SHIFT键，可以同时选定多个文件，点击OK，（绿色圈定），CASP软件就读入了您所选的图像文件。

图片附件: 36898094.jpg (2011-12-2 11:44, 43.92 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9449

作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:44


三、点击view下拉菜单，选红色箭头所指的”result window",在分析后您就可以看到您的结果窗口，绿色箭头所指是我做的彗星图像

图片附件: 39373291.jpg (2011-12-2 11:44, 50.96 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9450

作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:44


四、下面就可以开始分析了，分析之前最好把右侧的head 和tail选中，（绿色箭头所指，这样可以出现头、尾分明的视觉效果，如图），在图像分析框内按住左键下拉，出现黄色箭头所指的框，这个框一定要圈住整个要分析的一个彗星图像，然后就是用到红色圈定区域的 按钮了，我分别做了标号，逐一解释：1和2：可以选前或后面的图像进行分析，即上一个和下一个的功能，分析完第一个，当然要选下一个分析，很简单！！！
3：这是分析的功能键，黄色箭头所指的框圈住彗星后，点击此按钮就可以分析了。
4：每分析完一个彗星后，都要点击一下它，它会把结果数据保存到结果窗口，点击后，它会变灰。（这很关键）。
5：背景选择按钮，点击它，框的背景会上下变化，（注意黄色箭头所指的框，较小的框是背景框，较大的是工作框，这两个框在分析之前是可以调整的，一般工作框要大于背景框。
6：正式分析前一定要点击它，否则没有结果，如果不点击它，只是预分析状态，在这种状态下，可以把分析条件调好，然后进入正式分析，点击它后，此钮上会出现一斜杠。（如图）。
蓝色箭头所指区域是分析后的曲线，主曲线是单峰，如果是双峰，就是凋亡细胞。曲线图下面列举了几个数据，不全，全部结果在结果窗口。（下图）

图片附件: 40748119.jpg (2011-12-2 11:44, 59.74 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9451

作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:45

五、分析过程中或分析完成后，都可以看您的 result窗口，如图，将图像分析窗口最小化（红色箭头），就显示出结果窗口（绿色箭头），从左到右依次是文件名（name)和分析的各个指标。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9452

作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:45


六、分析完成后，别忘了输出结果，点file下拉菜单，选红色箭头所指区域的“输出结果”，将会出现第七步的图像。

图片附件: 60969276.jpg (2011-12-2 11:45, 56.34 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9453

作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:45

第七步、选输出结果后，出现如下的结果输出窗口，（黄色区域），先建立一个文件夹用于保存您的结果文件，也就是给您的结果安个窝，呵呵，好了，给您的文件取个名字吧，别忘了它的扩展名是.txt，点击OK！

图片附件: 91591258.snap.jpg (2011-12-2 11:45, 42.78 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9454

作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:46


第八步：找到您保存的结果文件，我刚才保存的是1.txt，打开看看，结果好像有点乱，怎么办？且看下回分解。

图片附件: 63947964.snap.jpg (2011-12-2 11:46, 64.08 KB) / 该附件被下载次数 5
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作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:46


第九步：没关系，把结果稍微调整一下就好看了，（要把结果直接转入SPSS统计软件分析，必须做调整！！！）。调整文本框的宽度（绿色箭头处），把分析的指标都放到第一行，可是各个指标的英文单词比较长，简化一下，如：taillength 变成tl，cometlength变成cl，红色圈定区，我不再一一赘述。调整后，左侧就是图像的name，向右依次是各个指标的数据，注意！！！各个指标名和数据之间一定要有空格相隔！！！否则无法转入SPSS统计软件！

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作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:47

后面的工作就是如何使用SPSS统计分析了，DXY好像有专门板块介绍，我就不说了，如有疑问再做解释。
作者: windy+++    时间: 2011-12-2 11:48

我又做了一次，把电泳时间由原来的10V，25min延长到35min的结果

图片附件: 75889937.jpg (2011-12-2 11:48, 9.59 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9457

作者: windy+++    时间: 2011-12-2 11:48


用的是PI染色，中性法

图片附件: 60969779.jpg (2011-12-2 11:48, 24.03 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9458

作者: windy+++    时间: 2011-12-2 11:49


第三张

图片附件: 45727309.jpg (2011-12-2 11:49, 7.84 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9459

作者: windy+++    时间: 2011-12-2 11:49

第四张

图片附件: 21800678.jpg (2011-12-2 11:49, 6.3 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9460

作者: windy+++    时间: 2011-12-2 11:49


第五张

图片附件: 54491725.jpg (2011-12-2 11:49, 10.38 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9461

作者: windy+++    时间: 2011-12-2 11:50


第六张

图片附件: 18099370.snap.jpg (2011-12-2 11:50, 29.47 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9462

作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 11:51

老师谢谢您了，讲的很好很详细，真的谢谢了
呵呵，老师您说它的分析曲线的横纵坐标代表什么啊，还是不明白
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:51


我也曾考虑过这个问题，到现在也不是很清楚，大家可以讨论，横坐标是象素值，相当于长度，纵坐标是强度值，好像是一个百分含量的值，（DNA含量），使用说明里没提，编这个软件的人在MUT RES 上发表的文章也没有介绍，呵呵，让大家猜？我觉得***不离十，请谈谈您的高见。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:52     标题: 回复 #114 windy+++ 的帖子

我不知道您的试验条件和所用的细胞，可能和这些有关吧，物镜倍数？总之，您的彗星肯定是凋亡细胞，曲线有点M峰的意思，但不是很清楚，头、尾应该分开一点，细胞凋亡的原理您应该很清楚，按道理，凋亡的DNA片断应该相对集中而且跑的比较远，是否裂解和解旋的时间问题？还是那句话，不知道您的实验条件，没权力妄加评论，呵呵。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 11:52     标题: 回复 #116 一叶 的帖子

由于我们实验室的条件，每次不能马上观察，只能到第二天才可以，想问一下大家有没有好的保存方法能支持到第二天，3Q
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 11:53     标题: 回复 #118 乌贼老弟 的帖子

这个不太容易，关键是保持胶板的湿度，可以在胶上滴加蒸馏水，然后放到培养皿里，4度冰箱保存，可能行，我没试过，我最多用此法保存1H ，如果到第二天，即使胶不干，您的彗星图像肯定受影响，最好立即观察。让你老板买个数码相机不就行了吗 ？
作者: utt0989    时间: 2011-12-2 14:21

我采用的是一个文献上的方法，中性法。1％的低熔点胶，4度10min凝固。然后在裂解液中（2.5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM Tris, 1% Triton X-100 at pH 10）4度裂解1h，蒸馏水洗3×5min。再在电泳液 (300mM NaOH, 1mM EDTA, pH 13)中4度解旋40min，最后10v（电泳槽阴阳极30cm，电泳仪最低只能是10v）电泳25min，10ug/ml 的PI 4度染色30min，荧光显微镜观察结果。最后把电泳时间延长到60min，才有以上的结果，请看看我的步骤中有什么问题？谢谢！！
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 14:22

第一，我看过的文献中性法裂解液的PH都在8－8.5之间，很少到10的，PH＝10那岂不成碱性了？这一点我觉得值得商榷；
第二，您的裂解时间太短了，最少要1.5H，一般1.5－2H，裂解时间短可能是您的彗星头尾没有分离的原因；
第三，解旋时间应该足够了，一般20分钟就可以了，如果电泳时间到60分钟，那您的实验也太浪费时间了（一般20分钟），还有一个因素就是不同细胞它的电泳条件也不同，我主要做淋巴细胞，上述条件就可以了，如果其它细胞，还要根据经验摸索一下。
我建议您先把裂解时间延长至1.5或2H ,看看结果，如果还是不行，干脆加大电压到15V试试。
作者: 中国特色    时间: 2011-12-2 14:22


是的，裂解这一步是非常关键的，虽然其他步骤也很关键。
如果裂解不彻底，最后电泳的时候DNA还被核膜包裹着，断裂的片断就分不开了。所以裂解时间应该在2H吧，1H太少了，而且裂解液的配方也非常重要。在配置裂解液的时候一定要药品充分溶解，从冰箱里拿出裂解液的时候，也许会有一些结晶的东西。一定要加热到透明才可以。把玻片放入裂解液后，要在4度下裂解。
我以前做过很多次，也失败过很多次，总结经验，还是觉得裂解这一步出的问题最大，虽然感觉很简单，就是把玻片丢进去2小时，自己就去玩了。
作者: 中国特色    时间: 2011-12-2 14:28

楼上筒子说的这个问题，可以保存好几天，千万不要泡在中和液中很长时间，否则胶很容易脱掉。
你可以按照我在pm上告诉你的方法，或者按照lq6688师兄说的，最后在盒子上裹一层保鲜膜，放入冰箱就行了，冰箱有一定的湿度，而且，被保鲜膜盖着，水分也不容易挥发掉，这样就达到了保湿的效果。
在保存的中途，你可以看看，如果感觉干，就在往上洒点蒸馏水，胶上有点水是没有关系的。
作者: guagua    时间: 2011-12-2 14:29

一叶你好，我请教一个问题。我的导师让我做彗星实验。可我从来没做过。我的实验是关于金属铍对小鼠脾脏损伤的研究。主要看看对脾淋巴细胞DNA是否有损伤？请问做彗星实验需要哪些仪器和试剂，怎么配置这些溶液，条件如何控制？请您百忙中回答一下，谢谢？（时间比较紧）
作者: 园丁##    时间: 2011-12-2 14:29

保持胶板的湿度，可以放在特制的玻片盒里（即饭盒里面用金属焊的类似于片架的形状），玻片盒底铺一些纱布然再稍加点水，4度冰箱保存，到第二天，肯定行，我每次试验都这样做，效果很好。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 14:38     标题: 回复 #124 guagua 的帖子

您好！彗星实验的材料与方法在国内外文献上会找到很多。
所需试剂：溴化乙啶（EB）染液，也可用其它的）、正常和低熔点琼脂糖凝胶，乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、 肌氨酸钠、氯化钠、Tris 、硼酸、二甲基亚砜、TritonX-100 、磷酸二氢钠
磷酸氢二钠。

裂解液的成分：NaCl, Na2EDTA, 肌氨酸钠, Tris-HCl, 用前加 TritonX-100 , 二甲基亚砜, PH值8.2-8.4,使用前4 ºC在预冷。
电泳液：0.5％TBE电泳液：EDTA、硼酸、Tris
主要仪器：
电子天平、离心机、恒温水浴锅、水平电泳仪、荧光显微镜、显微照相设备
电泳条件：20V，200MA,20MIN.
光谱条件：（EB）：激发波长515-560nm，绿光。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 14:39


我给您的试剂配制方法是中性SCGE的，看您的需要，如果需要做碱性SCGE，还有参考一下相关文献，我没有做过碱性。
您要首先把脾脏制成单细胞匀浆吧。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 14:41


中性单细胞凝胶电泳步骤：（以淋巴细胞为例）
1) 淋巴细胞的提取
①  取各组荷瘤鼠外周血0.2ml,肝素抗凝,加入到等体积淋巴细胞分离液上,3500r/min离心4min。
②  取中间层淋巴细胞并加入PBS至5 ml, 1500r/min离心8min。
③  重复洗涤细胞两次。
2) 琼脂糖玻片的制备
①  制好微型电泳槽。
②  使用两层凝胶法,第一层为100μl 0.75%正常熔点琼脂糖凝胶, 第二层为75μl 0.75%低熔点琼脂糖凝胶和25μl淋巴细胞的混合液。
3) 细胞裂解、电泳
①   好的玻片浸入新配的预冷的(4ºC)中性裂解液中裂解1.5h。
②   取出玻片,用双蒸水浸没漂洗。
③   将玻片置于0.5%电泳液中先解旋20分钟，然后电泳20min,电压20V，电流200毫安。

4) 染色
  用溴化乙啶(2μg/ml) 染色。
  用双蒸水冲去多余染液，滤纸洗去多余水分。
5)读片和分析
①   用荧光显微镜(激发波长515-560nm)观察玻片,每张胶随机抓
取100个慧星图像并用数码相机拍照后输入计算机储存。
②   用CASP软件分析系统分析慧星图像。
作者: zhezhe    时间: 2011-12-2 14:41

软件安装上了，我也把图片的格式转换成tif了为什么打开所选的图片，这个图片不会出现呢？急死我了。
作者: 中国特色    时间: 2011-12-2 14:42


是不是软件没有装好呀？
你试着一张一张的打开，不用全部选定，看看怎么样。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 14:43     标题: 回复 #129 zhezhe 的帖子

如果按照我在这个专题讲过的方法安装了CASP，应该没问题。有一点，图像都是1024*768的，转换成TIF后，再把它调整大小为400*300，（一定要先转换格式再调整大小，步骤反过来的话，影响图片质量）。
如果还不行，把你的CASP工作界面（有问题的界面），做一个截图，帖到这儿，看看到底怎么回事。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 14:44

有没有细胞的半数致死量这个概念，我看一篇文献的方法是：染毒后（用DMEM原液）培养24h后，细胞计数，和空白的比较，找到细胞存活率50％的浓度。不知道这样准确吗？
我知道测定细胞活力的方法是MTT法，想请大家给我一个建议，3Q
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 14:44


我觉得MTT方法还是比较经典的吧。
作者: ffooll    时间: 2011-12-2 14:45


今天有人来推销彗星分析系统，整个一套25万元，包括显微镜、计算机、打印机、数码相机和分析软件。
在显微镜上装了CCD（Charged Coupled Device，相当于数码相机的作用）,对动态图像进行实时拍摄，估计也是要一张张拍的。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 14:46


如果是在读片的时候可以在电脑屏幕上直接看到细胞就好了，然后直接抓图，图像又可以直接由软件读取，那就很惬意了，呵呵。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 14:46

25万有点贵了，进口的荧光显微镜十几万，其他的加起来也不到二十万吧。
作者: caihong    时间: 2011-12-2 14:47


我最近想查关于“彗星”分析法，终于在这里看到啦，我想用这个方法做关于药物放射增敏实验，不知道可以不可以，以及它的原理，希望一叶老师不吝赐教！
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 14:47     标题: 回复 #137 caihong 的帖子

站友您好，我认为您完全可以用DNA损伤作为生物终点，通过SCGE技术做您的药物辐射增敏的实验。

单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel electrophoresis, SCGE），又称彗星试验（Comet assay），是在核酸沉淀法（Nucleoid sedimentation）和晕圈分析（Holo assay）等检测技术基础上逐步发展起来的一种在单细胞水平检测有核细胞DNA断裂的新技术。它主要包括Olive等建立的测定DNA双链断裂的中性单细胞凝胶电泳技术和Singh等建立的测定DNA单链断裂的碱性单细胞凝胶电泳技术。此技术已经被广泛应用于放射生物学、DNA断裂与修复、毒理学、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。

SCGE技术的原理：
细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，盘旋而形成核小体。一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA残留而形成类核。如果类核中的DNA有断裂，断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析。

随着SCGE技术的发展，可测量的指标也越来越多，而且更准确。目前，用于SCGE分析的指标主要分为四类，包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。其中形状指标有彗星细胞率；距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、尾部半径；强度指标包括头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等；矩类指标包括尾矩、Olive尾矩等。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 14:48

依靠目镜测微尺人工测量彗星距离指标，主观性较强，人为误差较大，而且矩类指标更需要人工通过公式计算得出，使研究人员的工作量加大。因此，研究人员渴望开发出一种专用的彗星图像分析软件。近年来，各国研究机构纷纷推出各自的图像分析软件，这些分析软件可以快速提供一系列评价参数，如彗星总长、尾长、尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩等，更好地客观定量DNA损伤。目前，用于彗星分析的软件包括英国Kinetic Imaging公司的Komet5.5、Perceptive Instruments公司的Comet Assay Ⅲ、LAI公司的LACAAS、美国NIH的ImagJ、TriTek公司的CometScoreTM、印度原子能研究所的SCGE-Pro、奥地利癌症研究所开发的自动分析软件等。其中的部分软件可以到其相应网站下载，但最好与相应的彗星分析系统硬件设备配套使用，价格昂贵，提高了研究成本。新近研发的彗星分析软件（Comet Assay Software Project, CASP）很好地解决了这一问题，该软件可以在普通微机上运行，界面友好，使用方便，分析速度快，可以一次同时给出最多达13个指标，分析结果避免了人为误差，更加客观和准确，结果可以以.txt文件直接输出，SPSS等统计软件可以直接读取其输出结果，便于统计学分析，节省大量人力物力。
作者: caihong    时间: 2011-12-2 14:49     标题: 回复 #139 一叶 的帖子

十分感谢您,能这么快得到您的解答我很荣幸，但是十分惭愧，我是临床的研究生，基础这方面知识比较贫乏，我们的实验条件也比较艰苦，我想具体了解一下做“彗星”分析法都需要什么仪器，以及低熔点凝胶的成分和配制，裂解液的成分，实验成本大概能有多少，希望给我一些关于这方面的详细材料
作者: abc816    时间: 2011-12-2 14:50

今天有空重新看了上面的帖子，有一些方面还不是很懂：
1．为什么凋亡细胞中的DNA片段跑得快？它们是大片段，应该跑得比较慢才对，为什么要调低电压，电流和时间呢？而且，在相同的电泳液下，你怎么把电压和电流同时调低一半呢？
2．我还是比较推荐用三层胶的，单层的话，细胞在毛玻片上电泳，非常不平，在相同条件下，跑得肯定是比较慢了。第三层胶能保护细胞（当细胞和外界接触时，环境的一些因素也能影响细胞的尾长等各项指标），而且能补充第二层胶中铺的不平，有气泡等缺陷。最终的目的还是让细胞在同一条件下点泳。
还有一些是我自己的看法：
3．H2O2是作为阳性对照的吧？它是标准的断裂剂。但是不同的细胞对它的敏感程度是不同的，我觉得前几个数据有必要删掉，30微摩尔以下的浓度应该是会造成断裂的。
4．PI染色我见过，染出来的效果也是很不错，是蓝色的。不一定用EB染色呀，毒性又大。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 14:50

凋亡细胞的彗星尾部DNA应该是相对比较集中。
电泳条件是我做培养的人淋巴细胞时摸索出来的，试了几个条件，感觉这个条件最好，不过可能对于不同细胞，条件还要调整。
我觉得铺胶是见仁见智的问题，文献上从一层到三层都有报道。
染色的选择余地更大了，我当时开始实验就用EB，后来就一直用，也怕它的毒性，用低毒或无毒的染液同样能够达到目的，当然还是后者好了。
作者: fsdd817    时间: 2011-12-2 14:51

现在正在做单细胞凝胶电泳，但是铺胶的时候总是出现气泡，不知道怎么才可以避免出现气泡啊，都快郁闷死了，还有一叶可否制作一些SCGE的微电泳槽卖给我呀，现在急需，老板催的紧，非常感谢啊
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 14:51

可能还是用枪不熟的问题，我的经验：出胶时枪头对准玻片，但要稍微抬高一点，如果帖在玻片上的话容易出气泡，不过有气泡时拿枪头轻轻点一下它，一般就破了，（在胶固化之前）。ambmcm站友，其实微电泳槽挺好做的，我在前面的帖子已经讲过了，关键是工具的选择要好。如果方便的话，我可以做几个送给你，至于钱嘛，就不提了，大家互相帮助嘛。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2904130&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=4#2904130')
作者: 911    时间: 2011-12-2 14:53

一叶老师你好,我是初次做scge,可惜尝试N次，都以失败告终，非常郁闷，不知道问题出在哪，所以向您求助。
1，我用的裂解液是Na2EDTA 100mM Nacl 2.5M Tris(10mM)pH10 1%TritonX-100,10%DMSO,我是全部混合后，加热搅拌，冷却4度 裂解 2小时。这样配制溶液会有问题吗？
2，碱性溶液解旋40分钟，碱性电泳液100MA 20V 30分钟。
3，染色使用的是Hoest33342 250倍下看片。
结果是看不到彗星状。
另外问一下在明视场是否可以看到裂解后的细胞。我好像能看到，这是否说明我裂解有问题？
作者: abc816    时间: 2011-12-2 14:54

铺胶的时候千万不能出现气泡，否则各个细胞的电泳条件不同，结果差异就大了。我觉得枪是一个问题，不要用大的枪头，要用那种20-200微升的枪头，比较细一些。盖玻片也很重要，盖的方法也重要，盖的时候，轻轻的从左到右把盖玻片放下去。
裂解液没有什么问题，时间2小时也可以了。
建议你下次做的时候不要裂解，铺完胶后，直接染色，看能不能看到细胞，如果看不到，说明你铺的时候就没有细胞，就不是后来的裂解，解旋，电泳和染色等的问题了。
如果能看到，可能是你在后面的操作中脱胶了，你可以仔细看看玻片上有没有胶。
作者: yychen    时间: 2011-12-2 14:54

为什么我的CASP中选定框不能拉大？

图片附件: 54805903.snap.jpg (2011-12-2 14:54, 25.37 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9463

作者: yychen    时间: 2011-12-2 14:54


一个样品一般要计数多少细胞？25个够吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 14:55

SCGE所需的基本仪器：离心机，荧光显微镜，配套的数码相机，电泳仪，恒温水浴箱。
实验的成本不算高。（如果荧光显微镜和数码相机需要购买，那就另说了）。
裂解液的成分好像我在前面的帖子已经说了。正常和低熔点的凝胶可以买到，不贵，提前称好，用前用PBS溶解，煮沸，就可以用了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:21     标题: 回复 #145 911 的帖子

abc816站友的回答已经很详尽了，如果尝试N次都失败的话，您就要多个心眼儿了，在您收获细胞后看看悬液里有没有细胞，估计一下细胞密度，以及您混合到凝胶中的细胞数，确定胶板中有细胞，在进行下一步，否则您不就前功尽弃了吗？
SCGE脱胶是个大问题，前面我也介绍过我的对策，我在实验中没有遇到过脱胶的问题，而且铺胶也比较简便。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:22     标题: 回复 #147 yychen 的帖子

从您的截图上看，您在一开始就没有把选定框拉开，只看到四个点。CASP读取您的 TIF图片后，在分析框中点中左键下拉，让您的鼠标移动范围大一点试试，估计没问题的。在预分析状态，可以根据您的 需要随意调节框的大小。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:22


每个样品观察的细胞数：25个我觉得太少了，还要考虑您的分组样本的大小，如果是动物实验，每组6-10只动物，每个样品数50-100个细胞应该够了。国内外文献报道从20到100都有。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 15:23


补充一点哦：
如果每个动物观察细胞数为50-100个的话，首先计算出每一只动物各个指标的平均数，然后再拿这5只动物平均数的平均数进行分析，而不是100（细胞数乘以5（动物数）=500各细胞的平均数。
这样可以分辨出同一剂量组之间的个体差异，还可以分析不同剂量之间的显著差异性。
作者: yychen    时间: 2011-12-2 15:23

一叶老师，我们这个平均数是怎么计算的啊？
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:24

abc816讲的没错，我就这个问题专门请教了医大搞卫生统计的同学，可以综合到一起做均数，也可以像littlesheep04战友所讲的那样做，目前国内很多实验数据都是按前者做的。从统计学上讲，后者好于前者。可以看出同组个体间的差异，同时可以证明方法的可重复性。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 15:24

我们讨论了这么多，都是讨论的多细胞动物的彗星怎么做。
有没有人做过植物，单细胞生物，昆虫等的细胞的彗星呢？
比如做植物彗星时，存在破壁，制备原生质体等步骤，这些也会影响试验的成败。
讨论一下哦。
作者: 月牙牙    时间: 2011-12-2 15:29


请问一下肥大细胞的概念是什么？
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:29


肥大细胞来源于髓系造血干细胞，它的发育过程：髓系造血干细胞－嗜碱粒祖细胞－原始粒细胞－早、中、晚幼稚嗜碱粒细胞－成熟嗜碱粒细胞（释放入外周血）（包括杆状核和分叶核）－在特定条件下，体内的细胞因子（IL-3、IL-4）刺激成熟嗜碱粒细胞移形成为肥大细胞，又称组织嗜碱粒细胞。
肥大细胞镜下形态不规则，表面多突起，胞浆内含有较多嗜碱性颗粒，颗粒粗大，颗粒中含有组织胺、5－羟色胺等血管活性物质，机体发生超敏反应的时候，肥大细胞释放颗粒中的血管活性物质，参与超敏反应。
作者: 阿敏    时间: 2011-12-2 15:30

一叶老师:感谢你的无私和热忱，根据你的讲解，我也学做单细胞凝胶电泳，实验很成功。但每次EB的背景都偏高，我用的EB染液浓度是2ug/ml，染色2分钟后用自来水冲掉多余的EB，但最后看片时仍有红色的背景。请问有什么更好的办法让背景降到最低。
作者: 阿敏    时间: 2011-12-2 15:30

能不能把你做的中性单细胞凝胶电泳技术的protocol给我们详尽的介绍介绍，谢谢！！
作者: 阿敏    时间: 2011-12-2 15:31

我愿意在这里与大家分享胶板制作的体会

我只铺单层胶，即0.5%的低熔点胶。先在普通载玻片上用玻璃胶粘上塑料小胶条，起到围栏的作用。这是我的一个师弟受lq6688战友微电泳槽制作理念启发后发明的，具体讲他是把做基因芯片用的围栏粘在普通载玻片上即可，非常好用，也可用自制小胶条代替。铺胶时（1）先把100-150ul的0.5%低熔点胶分装在EP管中，也可以应根据你制作的 围栏大小调整胶量，把EP管放入37度恒温水浴锅中，这样胶就保持在熔化状态；（2）用血球记数板记数，调整好细胞悬液浓度，一般加5-10ul（含500-1000个待检细胞）细胞悬液入装有低熔点胶的EP管中，体积太大会影响胶的浓度，用加样枪仔细混匀细胞；（3）用加样枪把细胞凝胶的混合液加到粘有围栏的玻片上，加样时应沿着围栏加样，只要胶和围栏之间不留间歇，一般就不会脱胶，由于表面张力的作用，胶会向中间收缩，所以上样时用的细胞凝胶混合液不能太少，原则就是不让胶和围栏之间留有间歇。（4）把灌好的胶板置室温或4度冰箱凝固后就可用了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:31     标题: 回复 #161 阿敏 的帖子

不知您的EB染液的量用多少？量多了同样会产生副作用。不妨把您的图像帖上来，看看是什么原因。
我做SCGE的具体操作：请多多指教。
①用细玻璃条在普通载玻片上自制约1.5×1.5cm2的微电泳槽；
②铺胶：0.5％正常熔点琼脂糖凝胶煮沸后取100µl均匀铺于微电泳槽内，置于4℃固化1min，取淋巴细胞悬液25µl与75µl0.5％低熔点琼脂糖凝胶混匀后均匀铺于第一层凝胶上面，置于4℃冰箱固化1min；
③裂解：将微电泳槽置于新鲜配制的中性裂解液中，4℃冰箱中裂解1.5h；
④解旋：取出微电泳槽，用双蒸水漂洗去掉多余的盐分，置于提前加入0.5％TBE电泳液的水平电泳仪中解旋20min，使原来致密的DNA双螺旋结构充分松解；
⑤电泳：在20V，200mA电泳条件下电泳20min；
⑥染色和观察：2µg/ml溴化乙锭（EB）染色，双蒸水漂洗，去掉多余染液，在荧光显微镜下观察，并用Nikon数码相机随机抓取彗星图像。

国内单层铺胶的研究者还有用96孔培养板盖的，利用它圆形的槽做承载体，我觉得也不错，那更方便。
您的铺胶我有点不同意见，胶板应尽量薄，如果样品太多的话，胶板太厚，许多细胞不在一个水平面上，易重叠，而且影响背景质量。从您的铺胶过程看，估计胶板不会很薄，因为您是从外向里加，胶从四周向中间聚集需要的量更大。我恰恰相反，尽量把胶加在槽的中央，迅速调节槽的水平方向，使呈流动状态的胶尽快扩散到四周，这一步比较关键，动作慢了胶的流动性就没那么好了，我觉得这样铺的胶比较薄。个人看法，仅供参考。
作者: 中国特色    时间: 2011-12-2 15:32

彗星试验常用的阳性对照：ethyl methanesulfonate(EMS)，ethyl nitrosourea (ENU)，methyl methanesulfonate (MMS)，N-nitrosodimethylamine (N-DMA)和1-nitrosopiperidine。
都是硝基类的东西。
作者: 泡泡    时间: 2011-12-2 15:33


能不能帮忙分析一下我的实验结果

图片附件: 87087887.snap.jpg (2011-12-2 15:33, 9.4 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9473

作者: 泡泡    时间: 2011-12-2 15:33

还有下面几张
由于电泳的时候没注意载玻片的方向，图象有点斜

图片附件: 78729516.snap.jpg (2011-12-2 15:33, 5.91 KB) / 该附件被下载次数 15
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9474

作者: 盼盼    时间: 2011-12-2 15:34


彗星实验到底能不能作为研究生论文？我做三种农药对小鼠骨髓体内和体外试验，请lq6688老师和littlesheep04老师指点，够研究生论文吗？我现在挺迷茫的，实验做完了，但导师数据不够，谢谢了！
作者: abc816    时间: 2011-12-2 15:34


上面的那张背景太亮，再casp上不能分析，建议将背景冲干净。
下面的那张图我转了个方向，可以分析，看看右边的框，是双峰，有凋亡细胞的嫌疑，不过总感觉细胞有点机械化，象画出来的似的。

图片附件: 18228065.snap.jpg (2011-12-2 15:34, 27.47 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9475

作者: abc816    时间: 2011-12-2 15:34     标题: 回复 #166 盼盼 的帖子

看你们学校对硕士论文的要求高低。
我觉得你做了三种农药，是不是每种农药都有不同的剂量？如果计量多的话，就可以做出效应关系。而且你做的是体内和体外，我觉得差不多吧。
你要是觉得单调的话，加点微核的数据也可以，不过现在好像已经过时了，呵呵。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:35     标题: 回复 #164 泡泡 的帖子

您好，图像的质量和您的实验条件有关，您的列解时间多少？这个挺关键的。图像确实如abc816所说，不够柔和，不好看，而且您的第二张图没有层次感，好的彗星图像应该有层次的。您最好把实验条件帖出来，大家帮你分析一下原因。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:36     标题: 回复 #166 盼盼 的帖子

您好，我觉得做您的课题设计首先考虑您的目的，根据实验需要选择方法，不是说某某方法能否作为研究生论文毕业，我个人认为，用SCGE大有文章可做，论文工作量的大小要看您的设计了，所以，我认为做实验之前最关键的是把它设计好，不急于开试验，实验设计时尽量考虑周全，如果设计不好就盲目实验，一旦中途出现问题就很被动了，就像建楼房一样，首先设计一个好的图纸，如果盲目上马，就成了“没头脑”和“不高兴”了，呵呵。
同意小绵羊MM的说法，如果您的剂量设计比较细，又有体内和体外，我觉得应该没问题。如果您的设计比较粗，导师觉得数据不够丰满，可以加点微核或SCE或流式。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:36

有一点请教一下：AO染的绿色蛮漂亮的，但是好像头部荧光不够强，是图片质量的问题？拍照时调微调的问题？染液的问题？还是什么问题？
作者: abc816    时间: 2011-12-2 15:37     标题: 回复 #171 一叶 的帖子

师兄每次提的问题都很好，我以前都没想过。
头部荧光强需要大量的DNA,我觉得这与细胞的种类有关，在做的过程当中，也发现有一些头部非常亮的彗星，但是没有拍下来，就选了那些比较小的细胞，不过发现了一个问题：核大的细胞尾巴非常短，核小的细胞脱尾比较长，所以都集中在尾部了，头部就不亮了。也可能与我设定的电压大有关系吧。
在显微镜下看的时候，细胞就是那个样子，与相机没有关系。
作者: 盼盼    时间: 2011-12-2 15:38

谢谢两位老师了，题目是导师定的，彗星实验在农药检测中的应用，剂量我设的的确粗点，每个农药三个剂量，我加了微核和AMES的试验数据，但导师还说少，她让我加睾丸细胞体内体外试验，再加两个农药，太多了，我再和导师商量
作者: abc816    时间: 2011-12-2 15:38


是的，要筛选农药的话，光作彗星是不够的，添点其他的实验数据让你的证据更充分。
为什么你导师让你做睾丸细胞的体内试验呢？是检测生殖毒性？
睾丸的彗星不好做，各级生精细胞都有，而且大小差异非常大，更有很多变态细胞，里面有好几个，甚至十个以上的细胞核，彗星的时候都把它们当成一个细胞了，而且还有很多都是双核的。
所以你这样一做的话，变异非常大，尤其是尾长，可能会出现给药组和对照组没有差异的情况。
如果你现在不毕业，就先做做也可以，多点数据对答辩有好处的。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:39


对，我觉得做SCGE选择细胞还是选异型性比较低的细胞比较好。除非能把细胞分选出来。
作者: 盼盼    时间: 2011-12-2 15:39


我还想问两位老师，彗星实验和什么试验连用能用在农药检测上，我学校要求硕士论文要有创新点，可是我个人认为彗星实验再加上农药真的创新点太少了，请两位老师明鉴。
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-2 15:40


单细胞琼脂糖凝胶电泳（comet assay）
Single Cell Agarose Gel Electrophoresis (SCGE)

步骤：
一、 细胞悬液的制备：
1. 吸弃旧培养基，D-Hanks冲洗2遍
2. 0.25%胰酶消化，待细胞变圆，间隙增大，立即终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞，使成细胞悬液，加入离心管，1000rpm，离心10min，弃上清，以1mlD-Hanks悬浮细胞，以上应在暗室及较低温度下进行。各组收集细胞2~3×106个，必须分散成单个。悬浮于1mlPh7.4PBS中，此步在暗室及较低温度下进行。
二、玻片制备：
1. 玻片磨砂。
2. 制备0.5%正常熔点琼脂糖(NMPA)和0.5%低熔点琼脂糖(LMPA)各20ml。用pH7.4 PBS配制。称0.1g溶于20mlPBS，如NMA与玻片附着不紧，可升高其浓度至0.65%。
铺第一层胶：0.5%NMPA 100μl于磨砂玻片面，迅速盖上盖玻片，室温>5min使其固化，即为第一层胶；
第二层胶：37℃ 0.5%LMPA 100μl+30-50μl（1-2x106）细胞悬液(10:1)混匀，迅速铺于第一层胶上，盖新盖玻片，移入冰箱>5min，使其固化。
* 余下的细胞1000g×10min离心，于0.1-0.2ml悬浮缓冲液中混匀，做Western-blot。
三、细胞溶解：
1. 玻片缓缓浸入新鲜配制的冰凉细胞溶解液中，4℃>1小时或过夜。玻片在细胞消化液中可至少存放4周。
细胞溶解液配制
NaCl 146.1 g
Na2EDTA 37.2 g
Tris base 1.2 g
用约12克NaOH调节pH至10。
用去离子水定容至890ml。过滤除菌，为贮备液。室温保存。
应用液
加入 Triton X-100 至 1%
DMSO 至 10%（消除血液或动物组织中血红蛋白释放的铁产生的自由基）
应用前冷藏30~60分钟。
4、碱化处理及电泳：取出玻片，放入水平电泳槽中(正极端)，并列放置，不留空隙。倒入新鲜配制的冰冷电泳缓冲应用液，高于胶2mm，无气泡。放置10~30分钟，本室一般采用15min，使DNA解链。25V, 300mA电泳20分钟。通过调节液面来调电压。(电压先调到最大，电流300mA然后通过液面来调节电压)
电泳缓冲应用液：
10N NaOH 30.0 ml（12克）
200mM EDTA 5.0 ml （二钠为0.372g）
(附言：电泳缓冲液储备液：
10N NaOH 200g/500ml水，两周内用。
200mM EDTA 14.89g/200ml水，pH=10,室温保存。）
定容至1000ml，混匀，电泳前新鲜配制。
可通过改变液面高度来调节电压。
5、中和：
切断电源，取出玻片，置染缸，中和缓冲液浸洗，3次×5min。
中和缓冲液：
Tris base 48.5 g
去离子水 定容至1000ml
用>10 N HCl调节pH至7.5。室温保存。
6、染色
呈中性后，凉干玻片，50μl EB应用液染色，盖上新盖玻片。
EB染色液(10×贮备液)
EB 1 mg
去离子水 20 ml
室温避光保存。
临用时将贮备液稀释10倍。使终浓度为5μg/ml
以上除中和及染色外，各步均应在暗处进行，以避免额外的DNA损伤。
7、镜检及结果评价
EB染色后的DNA样品应尽快在荧光显微镜下观察。未受损细胞表现为以圆形荧光核心，即彗星头部，没有尾巴。受损细胞则有彗尾伸向阳极，形成一个亮的头部和尾部。
用目镜测微尺或拍摄×400倍照片再作判断。每个样品中至少随机挑选25个细胞测定。
彗星尾长度 <35μm为未损伤
35-70μm为中度损伤
>70μm为重度损伤
作者: @STAR@    时间: 2011-12-2 15:40


计数100个细胞后，统计的时候，尾长、尾矩的平均值是用全部细胞（包括彗星和正常细胞）还是仅用其中的彗星细胞的数据计算？
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:41

盼盼您好。SCGE和FISH已经有报道了，可以看看，做的不多，但成本可能比较高。还可以和流式结合，我目前想到的就是用流式分选，然后SCGE，我本来想用这个方法，可单位的流式不给分选，他们太忙了！临床上的活都干不完，没时间分选。没办法，只好放弃了。我觉得这两个结合还是挺有潜力的。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:42     标题: 回复 #178 @STAR@ 的帖子

您好。
您这个问题在SCGE中是一个比较敏感的问题。
1、用老方法，目测，费时，费力，主观因素影响较大；
2、用新方法，软件分析，简单，客观。但是：
（1）如果遵循随机的原则，采集到的彗星应该是包括部分正常细胞的，这样，对统计学分析可能会有影响；
（2）如果采集彗星时，人为挑选有尾巴的细胞拍摄，又违反了随机的原则，掺入了人为因素，同样，对统计学分析有影响；
3、彗星细胞率的应用问题，分析软件多不能直接得出彗星细胞率，仍然靠人工判断，还是有人为因素。
我在开题的时候，请的一位老教授就提出了这个问题，他建议我用软件分析的基础上，再加上人工计数彗星细胞率。
我个人观点：还是遵循随机的原则，随机抓取图像，然后再计数彗星细胞率。
我还考虑过用软件分析后，根据实验组和对照组的对比，从实验组中剔除被“冤枉”的正常细胞，后来我也请教了医大搞统计的同学，建议我用统计学的方法去掉“可疑数据”，尽量保证数据的客观性。
作者: tianmei001    时间: 2011-12-2 15:42

请教一下：
用casp分析出来的彗星尾长的单位是px，是什么含义？能否转换为um？
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:42


建议您仔细看看软件附带的使用说明，软件生成的所有长度单位都是PIX ，象素，可以转换为微米，但是我不赞成转换，用原始的比较好，有文献也是直接用pix发表的。
作者: tianmei001    时间: 2011-12-2 15:43

一叶老师，我和 @STAR@ 有同样的疑问，看了您的解释，又查阅了一些文献，有文献说先数彗星率，然后随机用软件分析30个－50个彗星细胞的尾矩。我觉得这个方法比较可行。但，我如果计数500个细胞，彗星率在5％，那么彗星细胞尚不足30个，分析的时候应在500个细胞外再寻找彗星细胞呢，还是就用这25个彗星细胞平均？谢谢啦！
作者: @STAR@    时间: 2011-12-2 15:44

请教：有没有战友用SCGE做过损伤修复阿？
一起来讨论一下阿！
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:44     标题: 回复 #181 tianmei001 的帖子

你的问题，我觉得还是重新找比较好，不是在这500个以外找，而是随机找，可能包括在500个以内，也可能在那500个以外。
作者: 笑弯了腰    时间: 2011-12-2 15:45

单细胞琼脂糖凝胶电泳（comet assay）
Single Cell Agarose Gel Electrophoresis (SCGE)

步骤：
一、 细胞悬液的制备：
1. 吸弃旧培养基，D-Hanks冲洗2遍
2. 0.25%胰酶消化，待细胞变圆，间隙增大，立即终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞，使成细胞悬液，加入离心管，1000rpm，离心10min，弃上清，以1mlD-Hanks悬浮细胞，以上应在暗室及较低温度下进行。各组收集细胞2~3×106个，必须分散成单个。悬浮于1mlPh7.4PBS中，此步在暗室及较低温度下进行。
二、玻片制备：
1. 玻片磨砂。
2. 制备0.5%正常熔点琼脂糖(NMPA)和0.5%低熔点琼脂糖(LMPA)各20ml。用pH7.4 PBS配制。称0.1g溶于20mlPBS，如NMA与玻片附着不紧，可升高其浓度至0.65%。
铺第一层胶：0.5%NMPA 100μl于磨砂玻片面，迅速盖上盖玻片，室温>5min使其固化，即为第一层胶；
第二层胶：37℃ 0.5%LMPA 100μl+30-50μl（1-2x106）细胞悬液(10:1)混匀，迅速铺于第一层胶上，盖新盖玻片，移入冰箱>5min，使其固化。
* 余下的细胞1000g×10min离心，于0.1-0.2ml悬浮缓冲液中混匀，做Western-blot。
三、细胞溶解：
1. 玻片缓缓浸入新鲜配制的冰凉细胞溶解液中，4℃>1小时或过夜。玻片在细胞消化液中可至少存放4周。
细胞溶解液配制
NaCl 146.1 g
Na2EDTA 37.2 g
Tris base 1.2 g
用约12克NaOH调节pH至10。
用去离子水定容至890ml。过滤除菌，为贮备液。室温保存。
应用液
加入 Triton X-100 至 1%
DMSO 至 10%（消除血液或动物组织中血红蛋白释放的铁产生的自由基）
应用前冷藏30~60分钟。
4、碱化处理及电泳：取出玻片，放入水平电泳槽中(正极端)，并列放置，不留空隙。倒入新鲜配制的冰冷电泳缓冲应用液，高于胶2mm，无气泡。放置10~30分钟，本室一般采用15min，使DNA解链。25V, 300mA电泳20分钟。通过调节液面来调电压。(电压先调到最大，电流300mA然后通过液面来调节电压)
电泳缓冲应用液：
10N NaOH 30.0 ml（12克）
200mM EDTA 5.0 ml （二钠为0.372g）
(附言：电泳缓冲液储备液：
10N NaOH 200g/500ml水，两周内用。
200mM EDTA 14.89g/200ml水，pH=10,室温保存。）
定容至1000ml，混匀，电泳前新鲜配制。
可通过改变液面高度来调节电压。
5、中和：
切断电源，取出玻片，置染缸，中和缓冲液浸洗，3次×5min。
中和缓冲液：
Tris base 48.5 g
去离子水 定容至1000ml
用>10 N HCl调节pH至7.5。室温保存。
6、染色
呈中性后，凉干玻片，50μl EB应用液染色，盖上新盖玻片。
EB染色液(10×贮备液)
EB 1 mg
去离子水 20 ml
室温避光保存。
临用时将贮备液稀释10倍。使终浓度为5μg/ml
以上除中和及染色外，各步均应在暗处进行，以避免额外的DNA损伤。
7、镜检及结果评价
EB染色后的DNA样品应尽快在荧光显微镜下观察。未受损细胞表现为以圆形荧光核心，即彗星头部，没有尾巴。受损细胞则有彗尾伸向阳极，形成一个亮的头部和尾部。
用目镜测微尺或拍摄×400倍照片再作判断。每个样品中至少随机挑选25个细胞测定。
彗星尾长度 <35μm为未损伤
35-70μm为中度损伤
>70μm为重度损伤
作者: @STAR@    时间: 2011-12-2 15:46

个人建议：
配细胞溶解液时，加NaOH 8g左右就可以了（一个protocol上看到的，自己也实验过）。试过加12g，pH就值过碱了。NaOH最好少量分次加，要充分搅拌，Na2EDTA溶解完全时，pH值也就差不多了。
作者: @STAR@    时间: 2011-12-2 15:47

一叶老师，想跟您讨教方法了^_^。您是怎么处理细胞的？好像这几张片子是同一个细胞啊？是贴壁细胞吗？疑问多多～～
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:48     标题: 回复 #188 @STAR@ 的帖子

楼上的站友您好，我用的细胞是小鼠淋巴细胞，体内照射，照后淋巴细胞分离，中性SCGE；
您怎么会认为几张片子是同一个细胞呢？我没明白您的意思。
实验过程和注意事项我在前面的帖子已经提到了，您不妨把您的图片帖到【图片仓库】，大家看看，好的地方供大家借鉴，问题大家可以帮助解决，互相学习嘛。
另外，经常来这里的abc816在SCGE方面也是很有经验的，她的一些方法也很值得借鉴，我下一步做肿瘤细胞的SCGE就想借鉴她的经验，使实验技术和过程更加完美，没有最好，只有更好，呵呵。如果把大家的优势都集于一身，我们的实验岂不是很完美？（期待共 产 主 义！）
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:49

@STAR@个人建议：
配细胞溶解液时，加NaOH 8g左右就可以了（一个protocol上看到的，自己也实验过）。试过加12g，pH就值过碱了。NaOH最好少量分次加，要充分搅拌，Na2EDTA溶解完全时，pH值也就差不多了。

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您的建议很好，但好像有一个小问题哟，这个量的概念首先要明确所配的裂解液的总体积吧？如果配1000ML或500或200，所用的NaOH量肯定不同，对吧？
作者: abc816    时间: 2011-12-2 15:50

那几个细胞不可能是同一个细胞，跑过一次电泳了，还能在跑吗？
一叶师兄做的是淋巴细胞，细胞核大小都差不多，所以你可能认为是同一个细胞。
通过和师兄的交流，感觉都进步了好多，好快。只有付出的多，才能收获更多。
另外，关于像素转化成微米，正在研究中，快出来了，与像片的分辨率有关，分辨率等于像素/厘米，不同的相机分辨率不同，所以根据自己相机来转化，还有放大倍数等等。
我觉得把像素转化成微米是很重要的，虽然在文章中说了相片大小，显微镜的放大倍数，但是各个实验室的相机等等都不同，还是有个统一的单位比较好。
等我研究出来，就传上来哦。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 15:51

一叶下一步做的肿瘤细胞彗星，我觉得不光是对细胞DNA损伤，引起肿瘤细胞的坏死。如果能做出来凋亡是最好的了，坏死可能会引起炎症等一系列的负面影响。
当然了，放射疗法究竟会不会引起凋亡还是个未知数，做做这方面的研究也是很有意义的。
个人意见哦。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:52

abc816的观点总是画龙点睛之笔，放疗后应该存在两种结果，肿瘤细胞坏死和凋亡（应该还有抗性细胞存活），肿瘤的放疗方法进一步研究确实是很有意义的，我下一步想做的只是用SCGE在临床上辅助设计个体化的放疗方案，虽然目前多种肿瘤及其病理类型的辐射敏感性都基本清楚了，但是，同种肿瘤的不同患者之间的辐射敏感性存在或多或少的差异，如果针对同种肿瘤的患者仍然千篇一律地采用相同剂量照射，这与临床上治疗方案的最优化原则是相违背的，SCGE用于临床尚需时日，但前期工作是必不可少的。随着SCGE技术标准化程度的提高，它在临床上也将大有作为。
abc816的象素与微米转换观点很有道理，期待你的结果，如果能进一步做成软件，输出结果直接以微米为单位，那就更好了！所有做SCGE的站友会爱死你的，呵呵。
作者: HP007    时间: 2011-12-2 15:53


感谢一叶坚持主持这项讨论，感谢其他几位无私奉献的战友

这几天多少学习了各位的帖子受益匪浅，获益良多。
有几个问题请教各位老师：

1、有一些细胞，电泳后的确呈头小尾大的典型彗星形状。但是分析的时候因为尾巴的亮度过高，用CASP分析他会误把细胞尾部亮的地方默认为头部。那么就过显然是不正确了。对这些细胞这么分析？丢弃？

2、同一批实验肯定会有不同的实验组，同一实验组不同的“复本“（比如同一组的细胞我做了三个电泳）。那么这些不同的组别或样本之间即使染色条件，漂洗条件等严格控制，总还是会有染色强度的差别。我这里显微镜不好，也会造成拍出来的照片染色的强度不一。那么这种情况回不会影响到各个组别之间的分析？是不是可以忽略？这可能涉及到不同组别之间到底采用那些指标进行比较的问题，也是我第三个问题

3、用casp分析会得到13个指标，那么我是不是需要将各组这十三个指标分别进行比较，统计？还是取几个有代表性的指标比如头尾的面积，长度等进行统计？有没有一个相对公认的选取指标的标准？

周围有人想做，我也问问，没查过相关的国内外文献，问得不妥的地方请多多包涵

如果有比较经典的文献，也希望能赠送几篇（pm联系）
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:54     标题: 回复 #194 HP007 的帖子

关于楼上主任 的提问，有一点不成熟的想法，请多指点：
1、像您说的那种细胞应属凋亡细胞，因为凋亡细胞的DNA片段大小相对集中，所以在尾部比较聚集，荧光强度较强，超过了头部，这也暴露出CASP的弱点， 在应用中发现它主要是以荧光的强度来自动判断头部和尾部的。在我的实验中，像您说的这种情况还没遇到过，但是从理论上完全可以出现，凋亡晚期的细胞，SCGE后应该是这样，对于此类细胞，CometScore这个软件应该比较有优势，它是靠人为判断头部的，有一点点主观因素在里面，但可以解决您提到的问题，它一次可以得到10个指标，这两个软件各有千秋吧。
2、这个问题很现实，除了您提到的以外，还有：为保证实验条件的一致，实验中可能同批完成不少片子，实践中不可能同时镜下观察，不同时间观察也可能影响结果，所以出现了文献中报到的电泳后甲醇固定的方法。您提出的问题我觉得最好的办法还是严格掌握实验条件，我在实验中一般同一组铺两张胶板，每张板计数100个彗星，合在一起，此组彗星数为200个。好在CASP的设计者考虑到了此类问题，它的分析框有一个背景框，可以剔除背景的影响，最大程度上解决了染色强度不同的问题。染出一张好片子也是很关键的。
3、指标的选择文献上多用长度指标和矩类指标，如尾长、尾矩和Olive尾矩。其中矩类指标是比较公认的较准确的指标。我的实验中采用了其中的6个指标，头部DNA含量、尾部DNA含量、尾长、全长、尾矩和Olive尾矩，两个强度指标，两个长度指标，两个矩类指标。而且对三类指标进行了对比，发现两个矩类指标的准确性最好，我觉得原因是它们是复合指标，综合考虑了彗星图像的特征，比较全面。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:54

SCGE在各个领域的应用非常广泛，可目前的现状是各个实验室各自为政，几乎没有哪两个实验室的方法是一样的。我觉得为了保证这个技术的健康发展，建议国内搞SCGE的人们坐在一起讨论一下方法的统一和标准化问题，每个实验室好比一棵树，大家逐渐统一起来，才可能成为林子，甚至森林，“保护环境”的力量岂不是更大？
另外，我觉得把SCGE和其它技术结合应用或在SCGE中融入其它技术的原理应该是一个发展方向。
呵呵，不学无术性乖张，净整些异想天开的事儿，惭愧，请多多指点。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 15:55

我也有做成软件的想法，或者把CASP在优化一些更好，呵呵，如果能让它分析JPEG格式的图片就更好了。
等把这些问题都搞定，可以找同学帮忙写程序。
但愿一切都可以实现。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-2 15:55

对于CASP输出的结果，是检测到的像素，那么应该怎样转换成微米呢？
脱胶的问题我是这样解决的，大家可以去玻璃厂去打磨一批玻片，用起来效果很好，基本上没有脱胶的现象发生，很简单大家可以试试！
作者: HP007    时间: 2011-12-2 15:56

在您给我的标号为17的文献中有这么一句：

As a result of the loss of DNA supercoiling at low concentrations of genotoxins or DNA fragmentation at high concentrations, more fluorescence was observed in the tail relative to the head in damaged cells. DNA fragments migrate more freely in the gel than the loops and cause the formation of more elongated tails

1、红色单词的准确中文翻译是什么
2、按这句话理解，尾巴的荧光强度很有可能超过头部的，(可能它是指总的荧光强度) 那么出现的我上述第一个可能性就更大了哦。

我说的这种情况，借用园子里的一幅图，可以看看。

图片附件: 83168672.jpg (2011-12-2 15:57, 9.33 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9476

作者: duoduo    时间: 2011-12-2 15:57

SCGE在各个领域的应用非常广泛，可目前的现状是各个实验室各自为政，几乎没有哪两个实验室的方法是一样的。我觉得为了保证这个技术的健康发展，建议国内搞SCGE的人们坐在一起讨论一下方法的统一和标准化问题，每个实验室好比一棵树，大家逐渐统一起来，才可能成为林子，甚至森林，“保护环境”的力量岂不是更大？
另外，我觉得把SCGE和其它技术结合应用或在SCGE中融入其它技术的原理应该是一个发展方向。
呵呵，不学无术性乖张，净整些异想天开的事儿，惭愧，请多多指点。

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很好的主意，很有远见。
关于彗星实验的资料收集了不少，包括国内的深圳庄志雄那里做过自己的软件和讲座培训（资料我也拿到一份，但里面的彗星图不显示了，是那里的工作人员惠赠的）。而同济有位教授说她是从奥地利学会的正宗技术。想必还有许多的版本，统一的会议需要做，应该做。但谁来做？
前两天google的时候发现一个comet assay forum:
cuturl('http://www.comet.itrcindia.org/')
我想大家应该知道，有很多有用的资料和文献。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:58

genotoxins我觉得应该把它分成两部分：geno-toxins把geno-看作一个前缀更好，基因的－，toxin是毒素，直译为基因毒素，我觉得译成遗传毒素更好，个人看法，仅供参考。
您说的那种情况完全可以出现，CASP识别头部的标准是单位面积的荧光强度，而不是总强度，我有过体会，如果在一个彗星旁边有一个很强的杂质点，CASP会把它误以为是彗星。出现您说的第一种情况我觉得可以尽量避免，上面那张图好像是物镜20×的，我个人认为还是40×比较好，两者各有优缺点，20×的每个视野细胞数多，每个图可以分析多个彗星，但同一张图中各个彗星的清晰度容易不一致；40×的每个视野1～2个，每张图也就只能分析1～2个，速度会比20×的慢，但可以保证每个彗星都很清晰，上面那张图如果把您分析的那个彗星用40×拍一下，可能会使头部更清晰，头部虽然是一个很小的亮点，但它单位面积的强度大，CASP还是可以识别的。我下面这张图是20×的，清晰度还可以，CASP也可以分析。

图片附件: 93387816.snap.jpg (2011-12-2 15:58, 7.72 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9477

作者: 一叶    时间: 2011-12-2 15:59

而这张图是我以前发过的，40×的，我觉得这样更好，头部虽然相对尾部很小，但其强度大，所以不会出现您的第一种情况。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=3196285&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#3196285')
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:00

楼上提出的象素与微米的转换问题确实很棘手，我也想过这个问题，和abc816站友也讨论过，目镜中看到的大小虽然知道是放大了多少倍的，但是，拍下来后的大小到底和看到的大小有多少差别不得而知，哎，还是SCGE 的标准化问题，目前有人用微米，有人用象素，不统一，如果大家都能统一，就没有这个问题了。
abc816关于这个问题很有自己的想法，我觉得也很合理，但我觉得我还是不便发表，还是先挖个坑，让abc816本人来说吧。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:00

你提供的网站非常好！从里面见到了以前只在文献中看到的许多SCGE鼎鼎大名的人物，littlesheep04站友之前也给过我一个彗星的网站，也很不错，有高手的支持，相信这个专题会红红火火！！
作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:01

是同济的石年教授吧？他对彗星试验的研究很有一套，很多关于毒理实验技术书的单细胞凝胶点泳章节都是他编的。其实我学的技术也是间接的从他那里来的。
深圳疾控中心的庄志雄教授在国内办过生物标志物的讲座，也宣传过彗星软件。
但是我觉得彗星试验作为一个毒理的常用技术，会逐渐被一些高级的技术替代，毕竟它的检测水平只是到细胞水平，随后的技术可能会在分子水平，或者分子特定的位点。
可能过几年之后，彗星试验像现在的微核一样，虽然很简单，但是不可替代。
一叶师兄的图片调亡细胞非常明显，很漂亮的，不过我有个问题：上面的细胞都是淋巴细胞吗？细胞核的大小差别有点大哦。还是放大40倍好看一些。
上面提到的关于把像素转化成微米，我和一叶也讨论过，得出如下的结果：有点不现实。我们拍照片的时候，只是把相机接到显微镜上，我们并不知道相机镜头离细胞的距离，而且各个实验室的也许都不同，拍出来的照片不能代表实际细胞大小，正如我们拍的照片中人的大小并不能代表人真实的大小。所以即使可以把相片上彗星长度算出来，也不知道细胞实际的大小。
有个方法可以解决这个问题：用一个1微米的标尺，这可以买到的，采用拍细胞相同的条件把这个标尺拍下来，因为在同一条件下，所以就可以拿标尺和细胞对比，就可以知道它的长度了。
战友 指的那个细胞，如果出现那种情况的话，就不用分析了，其实casp并不是所有的彗星都能分析的，有时看相片的时候，看的彗星很漂亮，但是就是没法分析，这也是软件的一个弊端吧。不过一叶对这个软件是情有独钟的（呵呵，当然应该感谢它了，更要感谢波兰的三位博士发明了它），我记得在上面的贴子中，当讨论到显微镜自带的软件时候，其实计算机扫描后直接把数据输出来了，而你还是希望计算机代替相机输出图片后，仍然用CASP分析。
楼上同志我觉得应该是遗传毒物吧，这里把它翻译成毒素有点不妥，毒素是应该是一些细菌分泌的有毒的物质，包括外毒素和内毒素，概念是不同的。可以查查。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:02

你提到的细胞大小的问题，我觉得主要有两个原因：1、淋巴细胞本身的大小差异；2、20×下同一视野细胞比较多，有的细胞不在同一焦距上，不清晰的细胞看起来比较大，所以我比较赞同用40×，保证每一个细胞都很清晰。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:03

嗯，是的，所以铺胶的时候应该尽量铺薄。关系到细胞电泳的时候在同一条件下，拍照的时候在同一焦距上。
一叶发明的微电泳槽上其实加50微升就可以了。一张玻片上共100微升，这样细胞数也足够了。
作者: hold住    时间: 2011-12-2 16:04

我现在用彗星试验做 人外周血淋巴细胞的DNA损伤，试验过程严格按照方法所要求的（如温度，暗室等），但还是出现了以下问题，殷切希望指点：
1、图片中出现的彗星较多，基本上看不到正常细胞
2、我一张载玻片做了两个平行，结果一个平行的正常细胞较多，但是另外一个平行却以彗星为主
3、裂解液不加肌氨酸钠有无影响？裂解液是不是每次必须加热使其完全融解？电泳缓冲液可以不可以在冰箱放置2－3天！！
请一叶老师指点！！

下面是我做的一幅图像！


图片附件: 65045811.jpg (2011-12-2 16:04, 28.05 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9478

作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:08

不知道您用的什么损伤因素？
1、彗星细胞率的大小和损伤因素的作用方式有关，化学因素造成的彗星细胞率可能会比较高，而物理因素，如电离辐射，在高传能线密度（LET）时，造成的彗星细胞率会比较高，低LET造成的彗星细胞率会低一些。
2、第二个问题可能就出在您的实验过程中了吧？关键在裂解和电泳的时候是否有两个平行样条件不一致的情况？
3、裂解液的每一个成分都不能少，用前是否加热要看它有没有完全溶解，如果溶液中出现结晶，那就要采取措施促进其溶解，然后再放入冰箱预冷，注意，裂解前裂解液要保证是清澈透明的，如果溶质没有完全溶解，肯定影响裂解的效果，这我是有教训的。
电泳液可以保存2~3天，我用的时候保存的时间有的还要长一些，不会有什么影响。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:09     标题: 回复 #208 hold住 的帖子

又仔细看了看您上面那张图，感觉有点问题，尾巴的形态不是很好，可能的原因：
1、荧光显微镜的荧光条件没掌握好，调调滤光片，试试看；
2、您是电泳后立即拍照的吗？从彗星形态上看，像是电泳后放置了一段时间后拍的。
作者: tieshazhang    时间: 2011-12-2 16:09

因为作FISH的成本比较高，所以我没有作，我这有这方面的文献，用不同染色体探针标记后，作SCGE，可以筛选出某种损伤因子（物理因子或化学因子等）的靶染色体是几号染色体。国内可能也有人作过，您可以查一下文献，如果需要，我可以帮你查一些国内此方面的文献。CNKI就可以。
毒性评价我觉得您用VERO细胞和淋巴细胞分别作一下，如果单纯发表文章还可以，如果作课题，最好再加一点SCGE以外的指标，结果更全面，更合理，更完美，呵呵。
磨砂玻璃片应该可以买到，自己作恐怕太麻烦了，而且作的也不好，和您一样，我当初也是自己作，自己摸索，出来后更有成就感，呵呵，我们实验室以前有人作过，也是脱胶的问题，就半途而废了，后来一个师兄又作SCGE，他走后我又把技术改良了一下，现在觉得比较成熟了。
微电泳槽其实也不难作，用普通载玻片，用玻璃刀割出几条2毫米的细条，用这些细小的玻璃条在普通载玻片上粘两个1.5厘米见方的槽，呵呵，微电泳槽就作好了，关键怎么割出那么细的玻璃条，我刚开始怎么也割不出，都要放弃了，后来发现工具不好，如果您要作的华建议您买一把好的玻璃刀，100多元，不算太贵，用比较薄的载玻片，太厚了不好割，您就可以“庖丁解牛”了，不管作什么，好的工具是成功的开始，磨刀不误砍柴功，还有就是胶水的选择，首先要不溶于水，还要牢固，我专门作过比较，买了好几种胶，粘完后泡在蒸馏水里至少24小时，筛选出最好的胶水，看广告没用，得靠实践，我作的微电泳槽可以长期重复使用，所有的实验作下来，还是用那几个槽，很爽，所以叫一劳永逸。我作了n次SCGE，从来没有脱胶，您不妨试试，如果还有什么问题，尽管提，我会尽力而为。

=================

一定要用为电泳槽吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:12     标题: 回复 #211 tieshazhang 的帖子

我因为一直用自己做的微电泳槽，觉得还可以，但是也不是一定要用的。abc816战友就用毛玻璃片，也没有遇到脱胶的问题，她很有经验的，而且胶铺的很薄，便于观察。两种方法各有利弊。
作者: 西子    时间: 2011-12-2 16:14

一叶老师好！
我做的细胞是直接从新发的糖尿病人，采集静脉血后，用淋巴细胞分离液提取细胞，用PBS清洗细胞两次后，然后直接进行彗星试验！
我配的裂解液呈乳白色，是不是没有完全溶解啊？没有完全融解的话，到底会对实验产生什么影响啊？
作者: 西子    时间: 2011-12-2 16:14

你真是一针见血，我基本上是每天都做彗星实验，两天看一次荧光。不知道为什么，我采的都是糖尿病病人的外周血，但是呢，结果差别很大，上一张彗星很多，我昨天照得相就基本上没有彗星，但是毛边现象教严重（见下面），不知道是不是正常？还有一个问题，彗星分析结果所用的OTM代表什么意思啊？

图片附件: 74249448.jpg (2011-12-2 16:14, 23.2 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9479

作者: 西子    时间: 2011-12-2 16:14


我还有一个电泳的问题：
好多文献都写道，电泳条件是300 mA，25 V，可是我在用北京六一的DYY－6电泳仪的时候，电压不能固定，老师在23——28之间晃动。后来，我用做PCR的biometra的电泳仪电泳，电压是可以固定在25 V，可是电流随着电泳时间不停的上升，上升幅度保持在1mA/min。电泳条件太难控制了，不知道一叶老师是使用的什么电泳仪啊？
谢谢！！
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:15     标题: 回复 #215 西子 的帖子

SCGE的可重复性还是不错的，安您的结果，正好相反，答案可以在您发的帖子里找到，您的裂解液不应该是乳白色的，那是没有完全溶解，一定要让它溶解后，才可以裂解，试想，您的试验过程中出现问题，结果肯定不可靠。
我看糖尿病相关文献很少，您是不是较早把SCGE用于糖尿病的？如果得到好的结果，那岂不是很爽？
彗星的毛边现象是正常的，因为细胞膜和核膜都破坏了，得到的彗星边界不可能清晰。
0TM：Olive尾矩，是Olive这个人首先提出的，彗星尾部DNA百分含量与彗星头部重心和尾部重心间的距离的乘积，是目前最灵敏准确的指标（我个人认为是，有我的试验证明）。
您提的电泳的问题可能许多战友都遇到了，确实很难控制，我以前做的这种情况比较少，最近也有此类问题，我也正在找原因，也请广大战友们多献计献策，共同解决！
作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:15     标题: 回复 #213 西子 的帖子

你用的电泳议是国产的，可能质量不是很好，电压不稳定，解决的方法就是买个新的：）还有一个问题：就是你做的片子挺好，有个缺憾就是细胞密度有点大，可以将调低。
在电泳的过程当中，我也遇到过电流上升的现象，但是没有你的上升那么快。但是有人做过电流和彗星尾长之间的关系，得出的结论就是关系不是很大，主要还是电压要稳定。
做彗星还是要用国外的电泳仪。国产的太差了。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:17     标题: 回复 #215 西子 的帖子

你的第一次彗星很多，在相同的条件下第二次就没有彗星，而且有所谓的毛边现象，我分析是因为没有列解完全，细胞是完整的，所以有这种情况，正常的列解后，只剩下核团，细胞边缘就是非常模糊的。
我试过铺胶完后，直接染色后看片子，和没有损伤的细胞形状是不同的，和你的差不多。
所以就像lq6688师兄所说的那样，裂解液一定要是透明清亮的，即使从冰箱中那出来后有结晶，也应该在37度水浴中放置一段时间使其完全溶解后，才能裂解，否则，细胞膜没破，DNA断片是跑不出细胞核的，当然也没有尾巴了。
作者: 西子    时间: 2011-12-2 16:18

说实话，每天做彗星实验，对于我这样一个新手，遇到的困难实在是太多了，而彗星实验又是那么繁琐，所以有时遇到不是很理想的结果时，心里很烦！！有的时候，甚至产生退缩的念头！！但是，有了这里各位老师朋友的支持，我决心要把此实验继续下去，以报各位的关心支持！！
作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:19     标题: 回复 #219 西子 的帖子

刚才去铺胶和裂解了，以前配裂解液的时候没有注意，今天特地留心了一下，裂解液从冰箱拿出来的时候是透明的，但是当加入DMSO的时候，溶液变成乳白色的了，所以在37度水浴中放一会变成透明的了，这样可以裂解了。
其实西子做的挺好的，建议把细胞密度调低一倍，彗星试验也不复杂，如果能作出来，就是很好得数据了。你想想，最后细胞在荧光显微镜下是一个个的彗星，很漂亮的，到时候你会觉的很有成就感。以前我也是做了十几次才做成功的，每一次的失败都是收获，得到了不少经验和教训，但是当时我没有退缩的念头，呵呵（建议你坚持下去），每天都做，直到把所有的问题全部解决了。在和一叶的讨论中也学会了不少东西，肯定比以前进步很多，以前做多了，感觉不想做了：），当时想着就是每天就是重复，再重复，很无聊，但是越做越发现有很多的问题，包括自己实验方面的缺陷，还有忽然想到的一些问题，等等，都是值得讨论和学习的。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:19


这是分析的结果，尾巴就是我以前碰到的“公鸡尾巴”，而不是彗尾。
原因就是一叶老大说的滤光片的问题。普通的荧光显微镜有三个滤光片，上面分别写ND4,8,16,其中，16挡光最多，4最少，如果用两个同时挡光时候，结果就是两者的乘积，如把4和8同时挡，结果就是32，挡光就非常多了。建议你用4挡光。如果你在拍照的时候没有挡光，那就是显微镜荧光的问题了，你可以把荧光调大，如果荧光已经调到最大，那就是显微镜荧光灯管的问题了，解决的办法就是换一个灯管，因为灯管有一定的寿命。
公鸡尾巴并不是做实验的过程中做出来的，而是最后拍照时候因为挡光太多，本来哪个地方有荧光，但是很弱，你把它挡住了，就在照片上看不到了，而软件分析的是你的照片，这和显微镜下看到的细胞没有关系，所以就出现那种情况。荧光显微镜有很多按钮，没事的时候随便调调，坏不了的：）仪器还是自己调出来比较好，看说明书不是很管用。
还有，你的片子背景没有冲干净，细胞旁边还有很多EB，这样除了不好看，还会影响分析结果的。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9480

作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:20

这是一叶做出来的彗星分析后的结果，可以看到非常漂亮的彗尾。
一叶师兄做出来的彗星是我见到的最好看的，从调细胞密度到染色，拍照，每一步都很完美。佩服佩服。

图片附件: 95274879.jpg (2011-12-2 16:20, 41.97 KB) / 该附件被下载次数 0
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9481

作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:20

abc816的分析很好，图像背景的问题一个就是要冲干净，还有就是染液量的掌握，不要太多，我在前面已经介绍过了，(EB，2微克/毫升），1毫升注射器1～2滴足够 了，多了反倒弄巧成拙，也不好冲。
作者: 西子    时间: 2011-12-2 16:21     标题: 回复 #222 abc816 的帖子

您好，你上边的图像是用Casp软件分析的吗？不知道，我用的
casp不能显示你所显示的背景（粉红色的尾巴部分），请问是什么原因啊？
作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:22

这是用CASP分析出来的，我怀疑是你没有在右边的分析状态框中的tail和head前面没有打勾，CASP打开后，tail和head前面没有打勾。
作者: 西子    时间: 2011-12-2 16:22


找到原因了，真的是分析状态框中的tail和head没有打勾！！
谢谢 abc816指点！！
作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:23


不客气了，前面几页有一叶师兄对软件的详细介绍和说明书的下载,并有图,很直观的,你可以仔细阅读.
作者: 蒲公英    时间: 2011-12-2 16:24


各位高手:
我是新手,今天刚刚做了彗星实验,第一次做,我们实验室以前也一直没有人做过,看了各位高手的高见,让我收益非浅!感谢各位!我想问第二层胶：37℃ 0.5%LMPA 100μl+30-50μl（1-2x106）细胞悬液(10:1)混匀,我用的的正常的MPA,我们这里没有LMPA,这个是要另外买吗?对实验影响会很大吗?还有我用的玻片是大概1cm*1cm的毛玻片,压片是用盖波片的,这些对实验影响大,各位高手指教!问题很菜!见笑了!
作者: 蒲公英    时间: 2011-12-2 16:24

裂解液的成分中我没有加入肌氨酸钠,请问对实验又什么影响?肌氨酸钠必须要吗?
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:25     标题: 回复 #229 蒲公英 的帖子

楼上的站友您好！
1、首先，第二层一定要用LMPA，买一小瓶可以用很长时间，因为正常熔点的胶在37℃的流动性不好，应该是凝固了吧？用低熔点胶，提前煮沸后放入恒温水浴锅（37℃），然后和细胞悬液混合铺胶。
我用的是0.75％的LMPA，25微升细胞悬液+75微升LMPA。
2、您用的是毛玻片铺胶，只有1厘米见方？是不是普通玻片用来写标记的部分？凝胶固化后除去盖玻片的时候会不会破坏凝胶？如果不会的话，对实验的结果不会有什么影响。
3、裂解液的成分中SKL应是不可少的，它的作用是帮助破坏细胞的膜结构，这个作用应该是挺重要的。如果细胞的膜结构破坏不充分，裂解的效果就不好，下面的步骤肯定受影响。
作者: 蒲公英    时间: 2011-12-2 16:26

非常感谢一叶的热情的解答！我赏试的做该实验，用来分析家蚕细胞的凋亡，呵呵， 以后还需要各位高手的帮助！我看了各位的帖子，让我收益非浅！真诚谢谢各位哈！
作者: 蒲公英    时间: 2011-12-2 16:26


请问各位的低熔点胶是在哪家公司购买的啊?好象听说还有做彗星实验的试剂盒,不止到各位用过没有,效果怎么样啊,大概多少钱可以搞定啊?谢谢!
作者: DNA    时间: 2011-12-2 16:27


EB是强致癌剂，用时确实让人不放心，我采用吖啶橙取代，效果挺好，只是荧光保持的时间较短些，不过马上用数码相机拍照下来，再慢慢分析，可以解决这个问题。
作者: DNA    时间: 2011-12-2 16:27


那位高手教我一下，如何防止单层胶或二层胶在电泳时漂浮起来。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:28

同意楼上的观点，吖啶橙毒性确实小，安全第一。
如果用毛玻片出现上述现象的话，可以尝试我以前说过的方法，自制电泳槽，（我又卖瓜了）。
低熔点的凝胶还是很好买的，一般的试剂公司都可以买到，SCGE 实验相对比较简单，我认为没必要买试剂盒。
作者: one    时间: 2011-12-2 16:29

老师，我做了两次彗星电泳，结果都差不多。
我用的是人肺癌A549细胞。空白和喜树碱（300um/L）的结果几乎一样。也就是说喜树碱没有令细胞凋亡。但是与报道以及我的流式结果，和实验前普通显微镜下的观察结果不一致。我不知道我为什么做不出凋亡。以下是我的实验过程。
步骤：
一、 细胞悬液的制备：
1. 吸弃旧培养基，PBS冲洗2遍.
2. 0.25%胰酶消化，待细胞变圆，间隙增大，立即终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞，使成细胞悬液，加入离心管，1000rpm，离心10min，弃上清，以PBS悬浮细胞。暗室下进行。
二、铺胶
1. 我用的是单面单头载玻片以及普通盖玻片。
2. 第一层胶：0.5%NMPA 100μl于磨砂玻片面，盖上盖玻片，-20度5min使其固化；
第二层胶：37℃ 0.5%LMPA 100μl+30-50μl（1-2x106）细胞悬液混匀，铺于第一层胶上，盖新盖玻片，-20度5min，使其固化。
三、细胞溶解：
1. 玻片浸入新鲜配制的冰凉细胞溶解液中，4℃ 放置2小时。
细胞溶解液配制
NaCl 146.1 g
Na2EDTA 37.2 g
Tris base 1.2 g
用NaOH调节pH至10。
肌氨酸钠1%。
Triton X-100 至 1%
DMSO 至 10%。
用去离子水定容至890ml。过滤除菌，为贮备液。室温保存。
4、碱化处理及电泳：取出玻片，放入水平电泳槽中(正极端)，并列放置，不留空隙。倒入新鲜配制的冰冷电泳缓冲应用液，高于胶2mm，无气泡。放置10分钟，25V, 100mA电泳20分钟（我室的电泳仪电流升不上去）。
电泳缓冲应用液：
10N NaOH 30.0 ml（12克）
200mM EDTA 5.0 ml （二钠为0.372g）
5、中和：
切断电源，取出玻片，置染缸，中和缓冲液浸洗，3次×5min。
中和缓冲液：
Tris base 48.5 g
去离子水 定容至1000ml
用>10 N HCl调节pH至7.5。
6、PI染色
7、镜检
作者: one    时间: 2011-12-2 16:30

今天我看到Biochemical Pharmacology 69 (2005) 113–121 上发表的一篇文献，其中也提到彗星电泳的方法。我摘录了其中的一段。
2.5. Single cell gel electrophoresis (Comet assay)
Nuclei were isolated from A2780wt cells by incubating whole cells in a buffer containing 5 mM MgCl2, 1mM EGTA, 1 mM KH2PO4, 150 mM NaCl for 20 min on ice with gentle rocking. Plasma membrane disruption and nuclei integrity were checked under the microscope. Isolated nuclei were exposed to the drugs at 10 mMfor 30 min at 37 8C or to H2O2 for 5 min. DNA breaks were detected as previously described [8]. Briefly, nuclei were embedded in agarose gel and then spread on a polylysinated microscope slide. Nuclei were lysed in 2.5 MNaCl, 10 mMTris–HCl, 100 mM Na2EDTA, 1% Triton, 10% DMSO, pH 10,for 1 h at 4 8C. After lysis, nuclei were preincubated for 20 min at 4 8C in the electrophoresis buffer (0.3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA, pH 13.5) and then subjected to alkaline gel electrophoresis (300 mA, 4 8C, 20 min). Nuclear DNA was stained using SYBR-gold (Molecular Probes). Slides were analysed by automatic image analysis (Casys system, Synoptics Ltd.) to quantitate DNA damage. The tail moment, calculated by multiplying the total intensity of the comet tail by the migration distance from the centr ofthe comet head, was used to measure DNA damage. Fifty nuclei for each experimental point were scored blind from two slides.
作者先把细胞破膜提出细胞核，然后加药处理一段时间，再裂解，跑电泳，染色镜检。
我不明白作者为何要提出细胞核再加药呢？作者用的阳性药是顺铂，喜树碱和H2O2.理论上顺铂和喜树碱都可以使细胞凋亡。
大家是否可以说说自己的看法？
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:31     标题: 回复 #237 one 的帖子

楼上的站友，您好，看了您的实验过程，提出如下疑问：
1、铺胶：第二层胶铺好后，您没有提到把盖玻片拿下来，我估计您肯定应该拿掉了吧？如果没拿掉的话，会影响结果；
2、解旋：您用的解旋时间是10分钟，应该调整到20分钟，10分钟有点短了；
3、电泳：我在前面的帖子中已经提到过，检测凋亡的电泳条件和其它SCGE是不同的，您的电压应该调低一点，可以自己再摸索一下条件，我用来测凋亡的条件是：淋巴细胞，10V，100mA，10min。我在图片仓库子版已经发过典型凋亡的图像，仅供参考，多提宝贵意见。
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=3656387&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=7#3656387')

您提到的文献，方法的选择是为他的实验目的服务的，不知文献中提到实验目的是什么。我用SCGE作为一种辐射生物剂量计，如果采用上述方法的话，肯定不行，作者肯定有他的目的，但是我个人认为大多数还是不用提前破坏细胞膜的，如果是用SCGE观察抗肿瘤药物的致凋亡作用，我觉得上述方法不可靠，结果没有实用参考价值。
作者: one    时间: 2011-12-2 16:32     标题: 回复 #238 一叶 的帖子

谢谢老师的解答。
1、铺好第二层胶后，我把盖玻片拿下来了；可是我是放在-20度，对试验结果影响大吗？
2、解旋，我第一次做的时候是用的20min，可是也是一样的结果。
3、电压的设置我有看过文献，比较原始的中文文献用的是25v，300mA，我不知道电流对电泳的影响大不大，因我实验室的电泳仪电流始终上不去。所以想在这里一并请教老师。

至于我上面提到的那篇文献，我咨询了一下其他的老师，作者是想在技术水平上考察纯粹的药物对DNA的作用机理，所以需要这样的处理。

我的实验要用的细胞必须是肿瘤细胞，我室以前从未做过彗星电泳，所以没有什么经验可谈。我做了两次都没有做出来，连阳性对照都没有看到慧尾。我想请问这里有没有做过肿瘤细胞的彗星电泳，用的阳性药是什么？细胞怎样前处理？
谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:32     标题: 回复 #239 one 的帖子

楼上站友的问题关键在裂解不充分，裂解液一定要充分溶解，还有，裂解液最好要新鲜配制，临用前才加Triton X-100 和DMSO 。
另外，建议您还是把细胞密度调低一些；
其实凝胶铺好后很快就凝了，我觉得没必要放到－20度，还要5分钟？4度1分钟就很好了。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:32

我觉得放再－20度没事，放5分钟，温度不会降下去很多的。说不定连0度都没达到。
既然是做调亡，为什么还用碱性电泳呢？
电流的影响不会很大，你可以通过加电泳液的方法来加大电流，这样只能提高液面的高度。
我觉得试验失败的原因还是因为裂解的问题，还有电压，应该象lq6688说的那样，调到10v。
作者: 二丫头466    时间: 2011-12-2 16:33


我一直不大明白 碱性电泳和中性电泳的本质区别是什么？见笑了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:33

中性SCGE和碱性SCGE最主要的区别就是：
中性检测DNA双链断裂，碱性检测DNA单链断裂。
根据实验设计的需要，可以选择不同的实验条件，也可以同时选择两种条件，结果进行对比。
拿电离辐射来说，中性和碱性检测的敏感范围不同，碱性SCGE的敏感范围值偏低，如可以小到0.05Gy，而中性SCGE的敏感范围值偏高，它可能检测不到0.05Gy的DNA损伤，但可以检测大到100Gy的损伤，而相对中性SCGE来说，碱性SCGE在大剂量照射时的各项指标容易形成平台。
从修复方面来说，双链断裂的修复较单链断裂的修复慢，损伤重，后果更严重，双链断裂是后来形成染色体畸变和微核的主要物质基础。
从文献上来看，药物引起的DNA损伤多采用碱性SCGE 检测单链断裂，我觉得如果中性和碱性两种条件都做一下，进行对照分析，可能更容易发现一些有用的东西。
下次把碱性和中性SCGE的图像帖上来，大家对照看一下。
同时也欢迎做SCGE的站友把自己做的碱性和中性SCGE的图像拿出来，大家分享一下。
作者: 缘yuan    时间: 2011-12-2 16:36


上面说有人用96孔板盖子上的孔铺单层胶，是不是太小了，用24孔板的盖子大小比较合适，不知道有没有人做过，如果铺双层胶的话盖子也不能用吧，边缘太浅了
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:37


24孔板盖的话，两层胶，共铺200微升应该没问题的。我做的槽边缘也是比较浅的，目的只是防止脱胶。
作者: ffooll    时间: 2011-12-2 16:37

一叶老师。你的给的casp已收到,安装了以后,运行正常.但在我点击"start"按钮后,再选"view"工具栏的"results window".结果是"result"中不显示结果内容。我试了好几次都不成，请你指点一下。谢谢。
作者: ffooll    时间: 2011-12-2 16:38

另外，casp软件测定彗尾的长度，有没有单位呢？（nm ,um mm......)
作者: 白白的    时间: 2011-12-2 16:38

这段时间做了几次，下面把我的方法和结果介绍一下：
第一次用的玻璃载波片，发现很容易脱胶，于是改用24孔板的盖子，剪成小块后，正好一个孔铺一块胶，第一层胶开始用的是0.75％，但是浓度太低，感觉胶比较稀，不好凝固，后来用1％的胶，每孔加70ul，第二层胶是60ul0.75％的胶加上10ul细胞悬液，固化后，在裂解液中泡2h，晾干后放入电泳buffer放置20min，20v，200mA电泳10min，中性Tris液洗后用EB染色，第一次做的结果还好，看见胶上有很多小亮点，不过当时的扫胶系统分辨率不够，放大了就模糊了，第二次胶上什么都没有，不知道是取的细胞太少，还是细胞在电泳的过程中都跑掉了？

裂解液：
NaCl 2.5M
EDTA 100mM
Tris 10mM
十二烷基肌氨酸钠 1％
用NaOH调pH至8.2（中性）或10（碱性）
用前加10％DMSO，1％Triton X－100，4度预冷

电泳buffer：
EDTA 1mM
NaOH 300mM

感觉用24孔板的盖子还是不行，老是脱胶，泡在裂解液中都会脱，电泳的时候也到处跑，还是lq6688的方法好，不知你做的槽子高度是多少，24孔板的盖子边缘太低了。

各位多提宝贵意见，为什么我第二次什么都看不到呢？
作者: ffooll    时间: 2011-12-2 16:39


做的图片，这些小亮点应该就是吧

图片附件: 17511211.jpg (2011-12-2 16:39, 22.29 KB) / 该附件被下载次数 0
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9482

作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:41

1。24孔板的盖子边缘就是有点低了，一叶用的微电泳槽边缘就是用普通的载波片割成小细条粘上去的，绝对比盖子的边缘高，建议你也坐坐微电泳槽。要不然，买毛波片吧，去普通做玻璃的地方也可以让别人打磨。
2。第二次没有细胞，可能的原因就是细胞太少了，原则上，第二层胶的浓度是0.5%，可是你加入10微升后，胶的浓度还不是0.5%，这会影响最终的电泳。建议你把第二层胶配成1％，然后把细胞和胶按照1：1的比例配，这样细胞多了，终浓度也是0.5%了，也可以按照一叶老大的75微升0。75％胶加上25微升的细胞悬液，这样终浓度就是0.5%了。我和一叶都不赞成细胞悬液的体积加少了，有时候可能就没有把细胞加进去。
3。试剂的配方是没问题的。小亮点就是细胞，不过，实验室没有荧光显微镜吗？用凝胶成像系统只能看看，不好分析，到时候要在单个细胞水平分析的。细胞没有打散，中间都挤成一堆了，在显微镜下都不好分析。
4。电泳的时间有点短了，应该20分钟。都看不到彗星。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:42


没有经过一叶的同意，把微电泳槽发上来了。
就着一块小小的载波片，可以做3个样，非常方便的。


图片附件: 93296500.snap.jpg (2011-12-2 16:42, 9.36 KB) / 该附件被下载次数 0
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作者: ffooll    时间: 2011-12-2 16:42


多谢abc816的解答，老大的槽子做的真是精致，我也准备自己动手，丰衣足食了，老是脱胶真是烦透了，上次电泳完了一看胶都没了，然后在电泳槽里捞了半天，拍照的时候也不方便。

用荧光显微镜看的话，一般放大倍数要到多少才够，每个细胞都要照一张吗？那要是照100个不是累死了。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:43

一般用20倍或者40倍放大就可以了。40倍效果更好一些，细胞比较好看。
你要在单个细胞水平上分析，当然应该每个细胞都照了，但是不一定一个细胞照一张，可以好几个细胞照一张，这样工作量就小了，当然也取决于你的细胞密度。前面一叶说过，放大40倍的时候，一个视野下有4－10个细胞就行了。你可以先不裂解，铺胶后直接染色看看细胞密度。
作者: bohe221    时间: 2011-12-2 16:44


各位大侠的裂解液一般多少时间才会完全溶解呀，我加了DMSO和Triton－100后磁力搅拌了4个小时还没完全溶解，溶液呈乳白色，这个现象是否正常。谢谢！！
作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:44

DMSO和Triton-100是临用前加的，不能在配裂解的时候就加进去。
裂解液中，最难溶解的是SLS,它在中性的时候不易溶于水，所以你把其他的药品加进去后，先不要加SLS，这里需要磁力搅拌器搅拌，但是时间不会很长。溶解后，用NaoH把PH调到10，这里调PH值要用NaoH固体，然后把SLS加进去，在用磁力搅拌器搅拌，一般需要加热，50度左右就可以了。大约搅拌1个小时就可以溶解。这时，溶液应该是透明的，不是乳白色的。加热溶解的过程中，可能会损失一定的水分，等搅拌完了后，你要把溶液的量补充到你最后需要的体积。
当你从冰箱中取出裂解液后，裂解液如果有沉淀，你就把它放在37度水浴中让它充分溶解，然后把DMSO和Triton-100加进去，这时，还是乳白色的，你把他放在37度中放一会就可以了。注意，溶液的颜色是透明清亮的，浑浊的话，不能起到裂解的效果，最后跑不出彗星来。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:45

一叶师兄，对于您说的“中性检测DNA双链断裂，碱性检测DNA单链断裂”，我有不同的看法：碱性电泳是在1988年建立的，而最开始彗星方法都是在中性条件下做的（1984），所以我认为，这是方法逐步改进的过程。碱性条件下，DNA解旋，检测出来的应该是双链和单链断裂的综合损伤，这样可以提高试验的灵敏度，也就是您说的可以检测到0.05Gy,而中性电泳做不到这一点。这是我自己的一点看法哦：）
另外，我不懂为什么“碱性SCGE在大剂量照射时的各项指标容易形成平台”。对这一点感到非常的困惑，想了半天也没想清楚。
听了您的观点，我觉得耳目一新，又学到了一些知识，谢谢。
作者: qqq111    时间: 2011-12-2 16:46

谢谢abc816大大的热情解答，我用的也是24孔板，铺的一层胶，感觉还是会有脱胶的现象，有文献说把板预热效果会好点，准备试试，如果不行的话我也准备自己做玻片了，不知道一叶大大会不会说我们侵权
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:46     标题: 回复 #257 qqq111 的帖子

呵呵，我曾经做过每个样拍200个细胞，拍100个您应该感到庆幸了吧？细胞的数量要根据您的实验需要，太少了没有意义，太多了只是盲目增加了工作量。工作量还和你做的片子质量有关！质量好的话拍100个细胞很简单。
建议您下次再脱胶的话就不要再捞了，试想，脱落的胶板在电泳液中自由“游泳”，而电流的方向是一定的，跑出来的尾巴岂不是都拐弯了？那还有什么分析的意义呢？
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:47     标题: 回复 #257 qqq111 的帖子

这个连接有关于COMETSCORE的介绍：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=3383162&tpg=1&ppg=1&sty=3&age=0#3383162')
这个软件和CASP软件使用起来各有利弊，大家实际用用就知道了，至于最终选择哪一个就是见仁见智的问题了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:48     标题: 回复 #256 abc816 的帖子

abc816提出的问题很好，中性条件跑出来的是DNA的双链，单链断裂不会出来，而强碱性条件下，破坏了断裂部位连接碱基的氢键，这样，双链断裂也就成了单链形式，可以说碱性检测的是“双链和单链断裂的综合损伤”，两种电泳条件的最大区别是适用于不同的实验需求。碱性条件的SCGE的建立也是为了满足不同实验需要。实践中要根据DNA致伤因素选择实验条件，如：电离辐射对DNA的损伤以双链断裂为主，应该选择中性SCGE，而且可以排除环境因素对DNA损伤的影响（因为DNA很容易受到环境因素的影响而断裂－－单链为主），如果用碱性的话，就不能区分哪些是实验因素引起的断裂，哪些是其它影响因素引起的断裂。如果实验致伤因素是以DNA单链为主，那就应该选择碱性SCGE了。
有一点需要说明一下，碱性SCGE确实增加了检测的敏感性（中性SCGE达不到），但牺牲了特异性，DNA很容易受许多因素的影响而产生断裂，如吸烟、饮酒等不良生活习惯、环境污染等因素。所以碱性条件很难从实验结果中剔除哪些是非实验致伤因素造成的，对实验结果会或多或少有点影响。所以说SCGE条件的选择主要还要根据实验的需要来定。
我在下面这个帖子里说的“碱性SCGE在大剂量照射时的各项指标容易形成平台”这句话是相对中性SCGE而言的，因为碱性SCGE的检测敏感范围要比中性SCGE的敏感范围低，即碱性在小剂量范围敏感（灵敏到0.05Gy），中性SCGE在较大剂量范围敏感。（我已经在这个帖子里做了相应的强调修改），科研工作者非常需要littlesheep04这样一丝不苟的精神（钦佩！），在科研中甚至要作到“斤斤计较”，这样才容易发现问题，许多没有结果的实验找不到问题那岂不是很悲哀？
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=3866482&sty=3&keywords=%BC%EE%D0%D4SCGE%D4%DA%B4%F3%BC%C1%C1%BF%D5%D5%C9%E4%CA%B1%B5%C4%B8%F7%CF%EE%D6%B8%B1%EA%C8%DD%D2%D7%D0%CE%B3%C9%C6%BD%CC%A8')
呵呵，看来对某一句话的理解还要考虑语境啊，“碱性SCGE在大剂量照射时的各项指标容易形成平台”这句话如果单拿出来的话，它本身的描述不够准确，应该是某些指标（如长度指标TL、CL）容易形成平台，中性SCGE也有这个问题，而矩类指标不会出现平台（当然，哪个指标都会有它的敏感检测范围），这样，这句话的目的就是说明矩类指标优于长度指标的。呵呵，脱离了语境，某句话的目的也就大不相同了。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:48     标题: 回复 #260 一叶 的帖子

终于明白了。
两种方法各有优势，关键就是试验为了达到什么目的。
作者: flower-201    时间: 2011-12-2 16:49

我做彗星的几点体会：
1 正常熔点琼脂糖我用的0.6%，低熔点我用的0.7%。
2 把普通载玻片拿去玻璃厂磨成磨砂玻片，也不贵。磨几百张肯定够用了。
3 我通常在烧杯里配100ml左右的正常熔点琼脂糖，煮沸之后把磨砂玻片放进去，让胶液浸过磨砂面之后，捞出玻片，用布或者别的什么把光滑面擦干，然后把玻片水平放置，晾干。这样第一层胶就铺好了，玻片放多长时间都行。做彗星的时候直接往上铺第二层胶和细胞的混合液就行了。可以一次处理很多玻片放着慢慢用，特别节约时间。
4 裂解很重要。裂解液最好每次新鲜配置，pH值要调得比较准确才行。我用人外周血淋巴细胞时，裂解1h就行了。有些细胞可能需要比较长的时间，我们实验室也有裂解过夜的。
5 不同的细胞用于彗星试验时，需要的电压可能不同，口腔颊黏膜细胞用18V电压比较合适，有很多细胞株需要20V或者25V。要做预试验摸一下条件。
6 用EB染色效果挺好，也便宜。只要注意防护就行了。
7 如果要保存，可以用乙醇进行脱水，观察前再染色。
作者: abc816    时间: 2011-12-2 16:49     标题: 回复 #262 flower-201 的帖子

这种铺胶的方法也太浪费了。
作者: flower-201    时间: 2011-12-2 16:50     标题: 回复 #263 abc816 的帖子

其实不浪费。胶用不完留着下次煮沸了再用。这样不会脱胶，技术再差也不会。对于现场取样做彗星，这个样子很节约时间。
作者: flower-201    时间: 2011-12-2 16:51


用过的片子可以把胶刮去（戴手套），用自来水冲洗，晾干后用洗液浸泡过夜，捞出来用自来水冲干净就行了。
作者: ffooll    时间: 2011-12-2 16:51

3 我通常在烧杯里配100ml左右的正常熔点琼脂糖，煮沸之后把磨砂玻片放进去，让胶液浸过磨砂面之后，捞出玻片，用布或者别的什么把光滑面擦干，然后把玻片水平放置，晾干。这样第一层胶就铺好了，玻片放多长时间都行。做彗星的时候直接往上铺第二层胶和细胞的混合液就行了。可以一次处理很多玻片放着慢慢用，特别节约时间。

=========================================================

真是好方法，大批量处理啊，不过我还没用过磨砂玻片，真的不容易脱胶么？
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:52

就你的描述来看，说明你的凝胶板中根本就没有细胞，问题可能出在淋巴细胞分离中，SCGE的一个优势在于所需标本量少，我用全血0.2毫升就足够了，我在前面的帖子里提到过，如果怀疑自己的细胞悬液中没有细胞，可以先在镜下看看。其实淋巴细胞分离是一个很简单的技术，用0.5毫升的小离心管，加入4度保存的淋巴细胞分离液0.2毫升，在其液面上轻轻加上0.2毫升血，注意不要混，如果加的好，中间接触部分是一个很清晰的分界面，我是个急性子，用4000转，2分钟足够了，如果1000转，最少要10分钟，这没有一定之规。离心后，可以看到中间一层薄薄的灰白色的淋巴细胞，其上面是血清，下面是淋巴细胞分离液，用移液管轻轻将淋巴细胞吸出来，转移到2毫升离心管中，洗涤（加PBS至2毫升，混匀，1000rpm离心），离心后可见管底部灰白色的细胞团，以此重复洗涤一次，细胞悬于PBS，调整细胞浓度到2×104/ml，备用。有经验后不必在镜下调整，根据离心效果可以粗略估计加PBS的量。
你的低熔点凝胶我觉得最好提高一点浓度，我用0.75％的，因为你还要加细胞悬液的，有稀释作用嘛。你的低熔点凝胶凝固不好可能与此有关。
EB的浓度我用2ug/ml染色效果不错。你给我的是2ug/l,是不是笔误？
还有，你的电泳时间太长了，20min足够了。
裂解也是很关键的，裂解液要新鲜配制的，时间1.5～2h,注意裂解液中的溶质是否完全溶解。
裂解或电泳后还要多个心眼儿，看看胶板是否还在玻片上，有可能脱胶，如果给光秃秃的玻片染色了，那岂不是什么也看不见？呵呵。
作者: zhezhe    时间: 2011-12-2 16:53

我估计问题也是主要出在细胞分离过程，接下来我会按照您的方法去做。您提到的0.2ml的全血分离就可以看到明显的淋巴细胞层吗？对离心机有什么特殊的要求吗？比如说对它的制动系统等有要注意的问题吗？另外象您调整细胞浓度2×104是一般加几毫升的PBS呢？因为以前没有做过这些，所以我得问题比较多一些。^_^
多谢！
作者: yychen    时间: 2011-12-2 16:54


请问老师，我用的是SYBR GOLD 染料，用495nm激发，可拍到的图片是绿色的，请问是为什么？还有，您能否提供用SYBR GOLD 染料做的SCGE图片？万分感谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:54     标题: 回复 #268 zhezhe 的帖子

0.2ml全血离心后可以明显看到淋巴细胞层。
离心机的选择，就我的经验，微量高速离心机效果比较好，达到理想速度的时间短。
调整细胞浓度时加PBS的多少是根据离心管底部的细胞的多少而定的，开始少加，根据镜下细胞计数板观察的细胞密度估计加PBS 的量。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:55     标题: 回复 #269 yychen 的帖子

至今没见过用SYBR GOLD 染色的彗星，这个染料好像挺不错的，灵敏度比EB高。
作者: yychen    时间: 2011-12-2 16:56     标题: 回复 #271 一叶 的帖子

灵敏度是比EB高，但相反会把杂质也凸显出来，我们是为了避免使用EB才选定它的，但图象却没有EB的漂亮。我想和其他人做的比较一下。可否提供用SYBR GOLD 染料做的SCGE图片？可能我们的显微镜的滤光片有问题了，本来是金色的荧光，可我们拍到的是绿色的彗星图象。现在使用的是140多万的蔡司镜，有这方面的专家请指教。谢谢！
作者: yychen    时间: 2011-12-2 16:57


还有，请教一下一幅照片里有几个彗星图象比较合适？
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 16:57     标题: 回复 #273 yychen 的帖子

此类问题在前面的帖子里都提到过了，如果同一个视野中各个彗星图像在分析过程中不互相影响就可以，如40倍下，1～2个，再多了容易出现图像重叠，就不能分析了。
作者: yychen    时间: 2011-12-2 16:58     标题: 回复 #272 yychen 的帖子

请问你用的SYBR GOLD染料是那个公司的产品？效果怎么样？可否传图片来分享一下？我见到有同行做的图片也是红色的彗星图像，拖尾现象也很明显，就是背景有点杂乱，不过不太清楚他们用的多少的激发光。
作者: ffooll    时间: 2011-12-2 16:59

谢谢老师的解答。这种染料做出的图片是金色的，很漂亮，我曾经做出来过，用的是Nikon TE300。不过CCD的快门得打到12倍，背景就差了。我现在用的是蔡司激光镊的荧光镜，但出来的是绿色图象，仅有一点金色了，文献中其emission峰为黄色与绿色之间的波段，但现在只能用10倍镜拍了。请问专家能否解答40倍镜下非常模糊？几乎和周围的背景色一样了。谢谢。看来SYBR GOLD 并不适合SCGE。
作者: ffooll    时间: 2011-12-2 16:59


SYBR GOLD不可能发出红光，它只有唯一一个发射峰537nm.你看到的应该是EB的图片。EB是SCGE的首选，尽管有剧毒。
作者: ffooll    时间: 2011-12-2 16:59

还有，请老师帮我解答一个问题，我查了国外的文献，碱性SCGE(PH10)可以同时检测DNA的单链和双链损伤，和您前面的解答相抵触，是不是有什么不一致？谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:00     标题: 回复 #278 ffooll 的帖子

就SCGE的原理来讲，碱性条件可以检测单链断裂，在强碱性条件下，较小的双链DNA片段中碱基之间的氢键被破坏，也形成单链的形式，所以，彗星尾部的片段也是单链的，实质上碱性条件检测的是单链和双链断裂的总和，灵敏度提高了，但也牺牲了特异性。这在前面的帖子里也提到过了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:01

EB的激发光波长在515-560nm，在镜头上是绿色光，实验结果好的话，低倍镜下会看到彗星象正在游泳的鱼群一样，很漂亮。下面这个链接有不少彗星的图片：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2729243&sty=1&tpg=1&age=0')
作者: ffooll    时间: 2011-12-2 17:01


老师您好，我现在用的彗星分析软件是本研究所一位博士编的，分析时需要自己在界面上拖动确定其头和尾，人为因素很大，而且每次只能分析一个彗星，实在太慢。您说您做过一个sample 800个彗星，是怎么分析出来的啊？若也是一个一个地做，工作量实在太大了。
作者: 克隆鱼    时间: 2011-12-2 17:02

看了各位老师的经验，我真是受益斐浅。已经做了两次彗星了，但还是脱片的老问题。有人说载玻片要用酸处理，你们处理么？染色后要加盖玻片么？要不怎么能均匀呢？我的裂解液是：
氯化钠：14.61克
氢氧化钠：0.8克
EDTA-Na2:3.7224g
定容至89毫升，用前TritonX-100(1ml),10mlDMSO
作者: TAT    时间: 2011-12-2 17:02

SYBR GOLD不可能发出红光，它只有唯一一个发射峰537nm.你看到的应该是EB的图片。EB是SCGE的首选，尽管有剧毒。

==============================================================================================================

请看这张图片，是用什么染色的？据说是SYBR GOLD染的，我没用过这种染料，所以搞不清楚，我目前正期待找到一种毒性小，效果好的染色剂。

图片附件: 16638139.jpg (2011-12-2 17:02, 1.55 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9484

作者: 克隆鱼    时间: 2011-12-2 17:03


我也很想试试wtp53的方法。我以前用的是刮血片的方法，感觉不到胶的存在。而且低熔点的胶放到四度十五分钟似乎不能凝固。
我现在做的是睾丸支持细胞，用的是18-20天的SD大鼠，为社么睾丸做彗星不好做？
作者: ffooll    时间: 2011-12-2 17:03


我可以保证这张图片不是SYBR GOLD做的。it has two irrigation peaks,one centered at 300nm and one at 495 nm,a single emission peak at 537 nm,请你自己看附上的图谱。

图片附件: 77102731.jpg (2011-12-2 17:03, 8.52 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9485

作者: 克隆鱼    时间: 2011-12-2 17:04


标准的彗星实验的受试物是双氧水么？浓度多少啊
作者: 克隆鱼    时间: 2011-12-2 17:04


有人说加完低浓度的胶可在四度冰箱放久些有助于凝固
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:06     标题: 回复 #281 ffooll 的帖子

前面的帖子提到的CASP也是一个一个的分析，cometscore也是同样，我分析过的彗星有上万张了，并没觉得工作量有多大，只要你的图像质量好，分析起来就好多 了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:06     标题: 回复 #284 克隆鱼 的帖子

那么多做彗星的，铺胶方法也很多，其实主要目的就是一个－－防止脱胶，解决了脱胶的问题就是好方法。
如果低熔点胶不凝固，就要考虑是不是胶的浓度的问题 了。
不同细胞的裂解条件会不同，可以参考文献的报道，睾丸做彗星的一个问题就是它的细胞的异质性，细胞种类较多，不好判断彗星到底是哪类细胞。如果能把不同细胞分出来，再做彗星，那结果就好了。
作者: pengke1983    时间: 2011-12-2 17:07


大家好，我们实验室想买照相设备，镜子是leica的，工程师给我推荐了很多种相机，我不是很懂术语，冷CCD的什么，想问一下大家实验室的相机都是什么牌子什么型号的啊，像彗星实验需要什么要求的相机啊，大家能不能把型号给我说一下啊，现在工程师推荐的leica的一种相机需要7000美金，好贵啊觉得，我现在就想花最少的钱能办事情就可以了，是不是用nikon4500照的相片不能发表啊，急等指点，谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:07     标题: 回复 #290 pengke1983 的帖子

呵呵，怪事，为什么用nikon4500照的照片不能发表？不少人在用它吧（我也是），我觉得nikon4500出来的照片挺好的，比7000刀了儿便宜多了。
作者: pengke1983    时间: 2011-12-2 17:08     标题: 回复 #291 一叶 的帖子

呵呵，谢谢一叶，因为我不懂这方面的知识，工程师来了介绍了好多，我们的实验老师也没有这方面的经验，她担心的是用我们普通的数码相机照出来的照片不能满足发表文章的要求，怕质量不够好吧，所以我才来问问大家的经验和意见了，问的问题有点幼稚吧见笑了啊，那我就放心的和老师说了，再次谢过了
作者: tieshazhang    时间: 2011-12-2 17:09


请问一叶：用单细胞凝胶电泳技术能否区分凋亡细胞和坏死的细胞？如果可以怎么区别？谢谢！！
作者: 铜雀    时间: 2011-12-2 17:09

请教：你说彗星的毛边现象是正常的，因为细胞膜和核膜都破坏了，得到的彗星边界不可能清晰。我第一次做的时候裂解1h，显微镜下看到的是未处理的样本得到的是完整的亮团，而且形状也不是很规则，边缘很清楚，这是否说明裂解不完全？我改用裂解4h后，即使是未处理的也有些微的彗星。裂解时间对不同细胞真的影响这么大吗？
还有一个问题，LMP和细胞混合铺胶以后盖上盖玻片，等到显微镜下看时发现细胞全部都集中到盖玻片的边缘，你们有碰到这样的问题吗？
另一个问题，我有的片子上会出现比较奇怪的现象：同一张片子，有彗星的在一块，另外没有彗星的也在一块，是裂解不均匀吗？
谢谢各位前辈指教。
作者: zhezhe    时间: 2011-12-2 17:10


普通显微镜可以看彗星,只是需要银染,银染怎么染呢?效果好么?
我们实验室荧光显微镜是新的,我怕EB污染.
作了几次彗星都以失败高终,才发现盖玻片也很重要.我的盖玻片太脏,而且质量可能不好,胶都沾在盖玻片上.
细胞裂解液一定要予冷么?我今天的裂解液预冷后乳白色,放水浴锅里温了一下,也每怎么冷就倒在染缸了,这很影响么?
我已经做了几遍了,都没看到彗星.真是失败啊
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:11     标题: 回复 #294 铜雀 的帖子

1.裂解1小时肯定不够，2小时最佳（不同细胞可能不同），你第一次的结果说明裂解不充分。
2.裂解4小时肯定是太太太长了，所以，即使没有收到损伤的细胞也出现彗星尾，裂解当然是很关键的步骤，在SCGE的最佳条件中，有人专门做过研究的。
3.因为我从来不用盖玻片，所以没有遇到过此问题。试想，用盖玻片可能出现此问题，怎么解决呢？如果你用的盖玻片稍大于载玻片会不会好点呢？
4.这个问题有几个可能：首先，可能是铺胶不均匀，造成裂解程度不同；其次，电泳的问题，如果玻片在电泳液中不是水平的话，可能会出现不同区域的电压不同吧，第三，可能就是盖片的问题，人为造成胶板内的细胞浓度不同。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:12     标题: 回复 #295 zhezhe 的帖子

银染我没做过，可以参考一下文献，摸索一下方法。见过银染的图片（文献中的），质量不是很好，呵呵，至少不如我做的EB染的那样。
裂解液当然要预冷，如果把凝胶放到温的裂解液中裂解，低熔点的胶容易融化，凝胶里就没有细胞了。
如果冷的裂解液出现混浊，可以在磁力搅拌器上搅拌一下，也可以稍加热，然后放到冰箱里，预冷，温度降下来的时候，不至于出现混浊了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:12     标题: 回复 #293 tieshazhang 的帖子

前面好像提到过此问题，我认为SCGE很难区别凋亡和坏死，凋亡彗星可以很容易识别，但是，到底哪个是坏死，就不容易判断了，坏死的DNA断裂片断大小不一，而凋亡相对比较均一，所以出现特征性的彗星。
我曾经做出过这样的结果，（处理后培养的淋巴细胞），同一个视野可以见到凋亡、正常损伤的细胞，还有一种图形的描述如下：彗星呈梭形，左右尖，中间大，我怀疑这可能是坏死细胞，DNA断片 分布还是有点规律的，相近大小的片断在中间，而较大和较小的片断比较少，已经没有类核的轮廓了，所以呈梭形。也不知道我的判断对不对。
这里有SCGE和凋亡的专题，以及彗星图像，有凋亡的：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=3291884&sty=1&tpg=6&age=0')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2729243&sty=1&tpg=2&age=0')
作者: ladyhuahua    时间: 2011-12-2 17:12

彗星试验用什么作阳性对照比较好？浓度是多少？（体外染毒）
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:13

铺胶成功是实验成功的第一步，铺胶不好的话后面的就更不用提了。
作者: 笑弯了腰    时间: 2011-12-2 17:14

您好!
最近我因为打算做SCGE，但是有几个问题不能解决，希望能得到您的帮助！
1.我养的细胞是传代细胞，正常人肝细胞，做一种有机溶剂对该细胞的毒性作用。我要做的染毒时间最多是24小时，但我不知道用什么器皿染毒好，用培养瓶染毒，还是培养皿好？我有一种很小的培养瓶，底面积12.5cm2。培养皿我没用过，若用培养皿，直径多少的为好？培养过程中，胰酶多少消化为宜？是不是得用滴管消化？
2.细胞裂解液中得DMSO10％一定要加吗？我的细胞不是从血液中分离的。
3.裂解的过程能放在4度冰箱中进行吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:15

您好！
1、您的这个问题我还没有权力回答，细胞培养方面的知识我掌握的很少，没有发言权，抱歉。
2、DMSO当然要加。
3、裂解过程最好在冰箱中，而且电泳也要用预冷的电泳液。
作者: 西子    时间: 2011-12-2 17:15


我看了蛮多文章中细胞裂解液中都有肌氨酸钠的成分，请教各位老师，这有社么作用？我同学是用氯化钠：14.61克，氢氧化钠：0.8克，EDTA-Na：3.722g，用前加TritonX-100和DMSO。做这个实验一定要有阳性对照和阴性对照么？
作者: pengke1983    时间: 2011-12-2 17:16


裂解液里是不是一定要加肌氨酸钠啊，浓度1% 是怎么算的，是质量百分比吗？要是配100ML裂解液要加多少克肌氨酸钠？
作者: glass    时间: 2011-12-2 17:17


应该是重量体积比,100ml中1g肌氨酸钠
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:17

肌氨酸钠的作用主要是破坏细胞膜的磷脂双分子层。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:17

我现在已经做预实验了，也是存在脱胶问题，我没有像abc816一样好的技术。所以像学您的以逸待劳的方法。工具我都找来了，我又一个问题想问您：您自制的电泳槽应该是一个“槽”吧，四周都用玻璃条为起来的吧？（希望您还没申请专利^_^）
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:18     标题: 回复 #307 一叶 的帖子

我做的电泳槽照片曾经发给小绵羊站友，她已经把图片帖上来了，请看下面的链接：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/4022263')
一张载玻片可以做3个槽，同时跑3张胶板。粘合剂的选择很重要，要不溶于水，最好用的是一种用前混合的胶，两瓶胶各滴一滴，混匀后使用，玻璃条不会掉，很好用。
铺胶的方法我在前面也提到过，第一层NMP，100ul,第二层LMP与细胞悬液的混合液也是100ul，铺的时候也讲究技巧的，与其说铺胶不如说是“滴胶”，把胶滴在小槽的中央，然后迅速向四个角倾斜移动玻片，使胶布满整个槽，保证胶板平整，（过程要迅速，否则胶就凝固了），第二层就好铺了。胶的浓度我在前面也提到了。
作者: caihong    时间: 2011-12-2 17:19

文献大多采用25V或0.78V/cm
这里cm是不是电泳槽两极之间的距离？
那么，电泳槽的长度是不是25/0.78=32cm？
如果长度不同，是不是根据0.78来调节电压？
作者: TAT    时间: 2011-12-2 17:20

你做的微电泳槽玻璃条的高度大概多少？铺第一层胶时要不要盖玻片？如果不要的话怎样保证第一层胶是平的？

前两天做了一次，我是参考lq6688老大的方法，用直径0.5mm的毛细管做成围栏，用502胶粘在载玻片上，还比较牢固，就是铺第一层胶时比较费劲，担心铺不平。

裂解后发现毛细管松动了，看来还要多用几种胶水试试，不过不太影响实验。我用20ug/ml的EB染色，浓度有点高了，染色后用水冲洗几次，拍照时发现背景还是比较高，有什么方法可以把背景洗掉呢？另外聚焦时发现比较困难，是否和胶的厚度有关系，胶太厚就不容易聚焦呢？
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:21     标题: 回复 #310 TAT 的帖子

我做的微电泳槽玻璃条厚度和普通载玻片的厚度一样，因为玻璃条就是用玻璃刀从载玻片上切割下来的，用毛细管的想法也很好！只是接触面小，可能不牢固，如果胶选的好，估计也没问题的，我好像前面提到了，胶是用两种混合的（俗称哥俩好），两种混合后才能用，粘好后，第二天就可以用了，可以反复使用。
这种方法铺胶其实是滴胶，不敢保证胶板的四周是平的，但是，除了四周，靠近中心的部位肯定是平的，况且拍细胞的时候中央附件的区域足够满足需要了。铺第一层胶是很关键的，动作慢了很容易导致胶板凹凸不平，这样的胶板肯定不行。
我前面也提到了EB的浓度，比你的小了十倍，2ug/ml，染色后用双蒸水漂一下就可以了，背景很干净。
聚焦困难原因有：胶不平；胶太厚。
如果第一层胶铺不好，第二层肯定受影响，干脆重新铺吧，多试试就行了。胶厚是不是因为你的槽做小了？或胶多了？我做的槽铺100ul绝对不厚，我最多每张胶板数200个细胞的。
作者: 西子    时间: 2011-12-2 17:21

您说的普通载玻片是光滑面的吗？还是磨砂面的？按照您的说法，加上我的理解，我用了光滑的载玻片，可是没法铺胶，而磨砂载波片却很容易铺好，而且很薄很薄。想知道，您是怎么在光滑面的载波片铺的胶？谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:22     标题: 回复 #312 西子 的帖子

我用的就是普通光滑面的载玻片，做好槽后就可以直接在上面铺胶了，前面说过了，其实是“滴胶”，把胶直接用枪滴在槽内，稍微动一下槽，胶就布满了整个槽，而且能保证槽中部是平的，这一步挺关键的。
作者: 西子    时间: 2011-12-2 17:22     标题: 回复 #313 一叶 的帖子

我也是那么做的，可是胶聚集一团，怎么弄也散不开！或许与我的胶有关系？因为是练习，所以我用的是两三年前买的胶，我再用新买的胶试试
作者: 白白的    时间: 2011-12-2 17:23


你们用EB染色时加盖玻片么？加多少EB才行呢？我做出来的背景很深，不过是用1ml注射器加的，而且没用蒸馏水漂洗。加完EB还要等么？
作者: 月牙牙    时间: 2011-12-2 17:24     标题: 回复 #315 白白的 的帖子

今天做了一次，用毛细管做的围栏，槽子没有一叶的大，所以第一层胶只铺了70ul，看起来还是挺薄的，第二层胶铺了50ul，中间很平。
裂解2h后用电泳buffer解链20min，因为是预实验所以没跑电泳，直接拿中性Tris液洗了一下，然后用2ug/ml的EB染色5min，用自来水冲洗了几下，晾干后上镜观察，细胞还是挺多的，背景也不是太亮，不过感觉比较模糊，聚焦还是有点困难，估计可能胶还是有点厚。
下次准备再把胶铺薄一点，跑个电泳试试。

用EB染色不用加盖玻片了，EB浓度不能太大，染完后最好洗一下。
作者: 月牙牙    时间: 2011-12-2 17:24

请一叶看看，这样的照片怎么样？能不能用casp分析？

图片附件: 42268245.jpg (2011-12-2 17:24, 7.94 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9486

作者: one    时间: 2011-12-2 17:25

这是我做的肝原代细胞的图片,大家帮我看看我的图片怎么这样子.
都是没受损伤的图片,但是后面的没有拖尾,前面的却有大的拖尾,而且方向也是斜向下的.

图片附件: 34271692.jpg (2011-12-2 17:25, 40.57 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9487

作者: one    时间: 2011-12-2 17:25


接上面

图片附件: 89922028.snap.jpg (2011-12-2 17:25, 10.24 KB) / 该附件被下载次数 0
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9488

作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:26     标题: 回复 #314 西子 的帖子

你的胶浓度是否合适？还有，煮沸后要立即铺胶，否则胶凉了就铺不开了。如果新买的胶还有问题的话，就要好好找找原因了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:26     标题: 回复 #315 白白的 的帖子

用我在帖子里的方法是不用盖片的，染色：电泳后经中和、漂洗，2ug/mlEB，用1ml注射器加2滴就可以，染色30秒就够了，然后双蒸水漂洗一下，上镜观察，加完EB当然不用等，呵呵，等荧光衰减后再拍吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:27     标题: 回复 #316 月牙牙 的帖子

染色后漂洗，用滤纸吸去槽周边的多余水分，吸的时候胶板上的水会自然吸进滤纸里的，但滤纸不要接触胶板，不必晾干，荧光不等人啊！
我不太理解你的聚焦困难的问题，彗星图像不可能象病理切片的细胞那样有清晰的边缘，聚焦的时候主要看头部。如果上移载物台时镜头碰到胶板还是没有清晰的彗星的话，那可能是胶厚的原因。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:27     标题: 回复 #317 月牙牙 的帖子

细胞好像有点暗，是否我的电脑显示器不好的原因？（回家再看看），密度是不是还是有点大？
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:27     标题: 回复 #318 one 的帖子

电泳后的彗星不应该出现斜的尾巴，是不是电泳过程中脱胶了？为处理的细胞 出现拖尾，问题肯定出在实验过程中，是否裂解时间没掌握好？这要结合具体实验条件。
你的第二张图没有分析的价值，细胞都堆在一起了。
作者: tianmei001    时间: 2011-12-2 17:28

请教一叶老师：
一般EB加多少微升，我的片子背景很红，而且有很多亮的红点点，像是核酸的碎片，是我的细胞被破坏了么？照片好像复制不上来
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:28     标题: 回复 #325 tianmei001 的帖子

哎.................................................
请大家在实验过程中不要太教条，也许是我们从小到大接受的教育造成的，把我们的思维“凝固”了，生活在条条框框里时间久了，就逃不出去了。
象染色过程，不必照搬文献和某某人所说的必须加多少，要根据预实验的结果而定，有文献说加100ul，可是我用1ml注射器加2滴就够了，染色也不必那么长时间，EB加多了当然出现染液的结晶，会出现很多很亮的红点，既浪费资源又影响实验结果，也许你的照片比较大，超过了300K，可以转换格式和调整一下大小，贴上来看看。
作者: loli    时间: 2011-12-2 17:29

是不是裂解时间过长，也会使细胞受到损伤，而出现没处理的细胞出现拖尾得现象？是不是不同的细胞，电泳条件条件和裂解事件是不是有很大的差别？
有没有人也在做大鼠肝原代细胞的电泳的，希望能得到指点，做了几次老是出现一些问题，很是郁闷。
作者: 盼盼    时间: 2011-12-2 17:29


我们这里好象还有裂解过夜的，裂解时间估计一个半小时就够了，时间长了会脱胶的，当然若会lq6688老师的槽子估计也不会脱
作者: 盼盼    时间: 2011-12-2 17:29


我挑了一最好的张彗星照片，请老师帮我看看，还不知能不能发的上去

图片附件: 61171110.jpg (2011-12-2 17:29, 14.77 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9489

作者: 盼盼    时间: 2011-12-2 17:30


请高手再看看这一张

图片附件: 46014350.jpg (2011-12-2 17:30, 56.51 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9490

作者: dotaaa    时间: 2011-12-2 17:30

一叶老师：
我是现在也准备尝试一下这种方法，现在正在买电泳仪，请问一下您用的是什么型号的电泳仪与电泳槽，我准备买biorad，请您给一点建议，谢谢。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:31     标题: 回复 #331 dotaaa 的帖子

我们用的也是biorad的电泳仪，水平电泳槽我觉得不要太大，如果一次跑完的胶板比较多的话，没时间看，会影响质量，可以流水作业，基本可以保证跑完马上看，最好有一个人帮忙做。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:31

呵呵，不好意思，可能要打击你了，因为你说这是你最好的照片。
（单位的电脑显示器不好，只看到几个小红点，所以回家上网看看）
在家里看的很清楚，细胞密度已经调的很好了，背景也可以，如果背景再清一点会更好，关键是你 的彗星形态不好，“彗星实验”，顾名思义，要跑出彗星的形态来，在软件中可能没办法分析。
可能有如下原因：
1、电泳后是否放置过久才拍的？
2、荧光显微镜的条件没掌握好？
下一贴请把你的一些实验介绍讲一下。
可以和下面的图片对照一下，希望有所帮助：
【原创】单细胞凝胶电泳的彗星图像[精华]
作者: 盼盼    时间: 2011-12-2 17:32

没有放置过久啊！可能有两天吧，不过没有经过无水乙醇处理。我做的是一种农药对睾丸支持细胞的损伤。裂解时间有三小时，没做预实验，电泳是按25V，300mA，电泳半小时。荧光显微镜我根本不会用，请做过彗星的同学帮忙调好。有社么要注意的么？我的照片好象没有过那么标准的彗星图案。要么是头部不标准，要不是尾部不明显。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:32     标题: 回复 #334 盼盼 的帖子

呵呵，放置两天已经不短了，电泳后的胶板最好当时上镜观察，否则会影响质量的。
使用荧光显微镜时注意看：
1、激发等的位置是否正确；
2、根据你镜下看的细胞形态调整荧光强度，有时彗星形态的好坏和荧光量有关的，你可以在镜下摸索一下。
作者: 蒲公英    时间: 2011-12-2 17:33


一叶老师：

最近我也想买台电泳仪，想问您买的biorad电泳仪是什么型号的，价格多少？你用的离心机是什么牌子的，我也想买一台。我在网上也查了一些资料。但是没有用过，所以不知道性能如何，想让您给点建议，谢谢！
我们实验室也有一台biorad电泳仪，但是用来跑蛋白用的，我想知道跑蛋白的biorad电泳仪与跑彗星的biorad电泳仪应该不是一样的吧？希望您能尽快给我一个答复，thank you！
作者: 盼盼    时间: 2011-12-2 17:34


又做了一次,染色后很快就照相,感觉比以前好了不少,贴上来请一叶看看,这个照片合不合格?

图片附件: 91206664.jpg (2011-12-2 17:34, 3.74 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9491

作者: 盼盼    时间: 2011-12-2 17:34


但是处理组的图像和对照组差不多,不知道是不是彗星没跑出来,我用的电泳条件是:16V,100mA,10min

没有彗星的原因一般有哪些?请指教
作者: 园丁##    时间: 2011-12-2 17:34     标题: 回复 #338 盼盼 的帖子

焦距没有调好啊。
还有电泳的时间短了，至少20MIN吧。电压和电流也有点低了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:35     标题: 回复 #338 盼盼 的帖子

如园丁##所讲，电泳条件好像没掌握好，还有，裂解是否充分？
作者: guagua    时间: 2011-12-2 17:35

我碰到的情况是 我安装后 首先桌面上出来一个不能识别的图标 然后点击 出现说什么文件被破坏 链接不上 然后我就安装到d盘 也是这样的结果 我就直接到安装的文件夹里 点击 这次这个软件的运行桌面能出来 我试的测试这个软件自己带的几张图片 但是测试的时候 那个小筐根本就不随着细胞的大小变化 出来的数字都是一样的 真不知道是什么原因
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:36     标题: 回复 #336 蒲公英 的帖子

我用的电泳仪型号：
made in USA的
BIO-RAD PowerPAC 200
220－240V, 50-60Hz,
max power: 500VA
离心机：
北京医用离心机厂生产的 LG16-W型微量高速离心机，最大转速16000rpm。
用着挺顺手的。
作者: 一叶    时间: 2011-12-2 17:36     标题: 回复 #341 guagua 的帖子

呵呵，您的问题出在没有仔细看本专题以前的帖子，象你提到的这个问题早就回答过了
CASP读取您的 TIF图片后，在分析框中点中左键下拉，让您的鼠标移动范围大一点试试，估计没问题的。在预分析状态，可以根据您的 需要随意调节框的大小。
看看下面的链接吧：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/2727570')
作者: DNA    时间: 2011-12-3 08:54

请问一叶老师：
你能确保你做微型槽子用的胶对细胞无毒么？
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 08:56     标题: 回复 #344 DNA 的帖子

提的好,
只能通过空白对照组的彗星表现来解释了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 08:56

因为你的问题也许对其它人有帮助，所以我在论坛里来回答你（其它内容见PM）：
1、实验用的细胞：我的观点在论坛里提到过，咱们的学生有时学知识比较教条，实验材料的选择需要根据你的实验需要，如你的染毒因素，首先要了解它的染毒机理，它的最主要的靶细胞是什么，最好选择敏感细胞。我对你的有机物光化学产物的致毒机理不懂，所以我没有发言权，我只能谈谈我自己的想法。我们用γ射线损伤细胞，淋巴细胞对射线非常敏感，而且取材也很方便，所以我们用淋巴细胞，还有就是根据实验目的，如果观察某种因素对肿瘤细胞的作用，那当然要选肿瘤细胞了（简直是废话），如果你的实验目的是观察某种因素的毒理反应，我建议你选淋巴细胞吧。如果是观察化学产物对呼吸系统的毒理作用，那就用肺泡上皮，如果观察生殖毒性，就用生殖细胞。总之，以上我感觉说的都是废话，呵呵。
2、实验仪器清单：
只能根据我所用的仪器提供，与你的实际操作也许有出入，但大体应该是这些：
高速微量离心机、分析天平、托盘天平、加样枪、移液管、离心管、载玻片、恒温水浴箱、酒精灯、镊子、立式或卧式染缸，电泳仪、荧光显微镜、配套的数码相机、电脑（最好17‘液晶，P4，512M内存，80G硬盘，XP系统呵呵）、注射器等等。可能有疏漏，发现后再补充。
3、如果有培养细胞，那要注意无菌操作了，有个超净台可以了，CO2或普通培养箱（看你的培养条件而定）。
4、软件的问题，可以从我以前提供的链接下载，也可以PM你的邮箱。
5、数据的处理，当然最好用软件处理，SPSS,SAS,STAT三大王牌统计软件，我用“盗版”的，严厉打击盗版！但正版的我买不起，呵呵（我们已经告别了钻木取火的时代，有好的工具为什么不用呢？）
祝实验顺利！
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-3 08:58

想来大家很多都是用EB染色吧,那么我们再观察片子的时候怎么放在显微镜的台子上啊,是不是铺一层膜防止污染显微镜啊,大家有什么方法啊
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 08:59     标题: 回复 #347 小鱼鱼 的帖子

可以，保鲜膜就行。
作者: 白白的    时间: 2011-12-3 09:00


我也想做这方面实验，但是我不是很了解实验过程能不能说详细些，还有配液方面的内容？谢谢！！
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-3 09:00

想请教一下老师，显微镜十倍的照片能分析么？别人都说要20或40倍的。一张片子上400个细胞肯定蛮少，不保证一定细胞密度，要照很多照片，只要保证不粘在一起就行。我的片子上几千个细胞好象都不是
还有DMSO用普通分析纯的行么？
附照片

图片附件: 52261331.jpg (2011-12-3 09:01, 20.69 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9493

作者: 一叶    时间: 2011-12-3 09:02     标题: 回复 #350 小鱼鱼 的帖子

单从您的片子上看，质量还不错嘛，背景再干净点就完美了！看来您是用10倍拍的，为什么不用20×、40×的都试试？然后用软件分析后看看哪个更好？
我建议用40×的。
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-3 09:24     标题: 回复 #351 一叶 的帖子

多谢老师的夸奖，听别人说十倍就可以的，二十四十是用来看的不做分析，可我感觉十倍是不是太小了。但四十倍的照片里面细胞太少了，不行我再用二十倍的试试。
还有背景能怎么再干净哪？我用EB 染色后都不用水洗的，直接盖盖玻片
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-3 09:24


咱们真正关心的是数据是Tail DNA%还是社么别的，好象CASP软件只能识别TIF格式的。
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-3 09:25

转换成tif格式呢？在数码相机里可以转么？电脑上好象只能一张张换。
多谢一叶老师的指导，你的经验使我受益斐浅
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 09:26

咱们真正关心的是数据是Tail DNA%还是社么别的，好象CASP软件只能识别TIF格式的。

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怎么转换成tif格式呢？在数码相机里可以转么？电脑上好象只能一张张换。
多谢一叶老师的指导，你的经验使我受益斐浅

===============================================================================================================

CASP软件给出的13个变量中，比较有代表性的：尾部DNA百分含量、头部DNA百分含量（根据实验需要，或两者都选，或两者选其一），尾长、全长、尾矩、Olive尾矩。后者较好。
好像一般的数码相机没有TIF格式的，多是JPG格式，其实格式的转换非常简单，用ACDsee这个软件，可以批量处理，不用一张张转换，否则不把人累死？
哎，还是做个具体操作过程的截图吧。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 09:27

下面把ACDSee软件转换图像格式和大小的详细步骤帖上来：
第一步：打开ACDsee软件，找到你要转换的文件，并选中它们，我这里只选中4张图，举例说明。怎么选中？借助shift和鼠标就行了。

图片附件: 73531546.snap.jpg (2011-12-3 09:27, 51.19 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9494

作者: 一叶    时间: 2011-12-3 09:27

第二步：点击“工具”按钮，看到“转换文件格式”了吗？点一下！会出现第三步的对话框：

图片附件: 82593645.snap.jpg (2011-12-3 09:27, 63.84 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9495

作者: 一叶    时间: 2011-12-3 09:27

第三步：在“格式”栏选“TIF图像文件格式”然后点“下一步”........

图片附件: 77548859.snap.jpg (2011-12-3 09:27, 60.92 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9496

作者: 一叶    时间: 2011-12-3 09:28


第四步：又一个对话框，可以自己选择目标文件的保存位置，蓝色箭头所示，然后还是“下一步”

图片附件: 14723710.snap.jpg (2011-12-3 09:28, 56.19 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9497

作者: 一叶    时间: 2011-12-3 09:28

第五步：哈，又一个对话框，选择输入和输出文件方式，选红色圈定的按钮即可（默认就是），然后“开始转换”.......

图片附件: 35290419.snap.jpg (2011-12-3 09:28, 59.12 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9498

作者: 一叶    时间: 2011-12-3 09:29


第六步：我这里只选了四张图片，很快就转换完成了，实际操作可以根据需要每次选多个图片。

图片附件: 45939867.snap.jpg (2011-12-3 09:29, 53.14 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9499

作者: 一叶    时间: 2011-12-3 09:29


第七步：已经转换完成了，可以在右侧原始图片文件夹中多了四张新的图片，是TIF格式的。

图片附件: 87263868.snap.jpg (2011-12-3 09:29, 53.77 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9500

作者: 一叶    时间: 2011-12-3 09:30

第八步：还可以接着调整图像大小，在右侧文件夹同时选中多张要调整的图像，在“工具”下拉菜单，有“调整图像大小”

图片附件: 31284792.snap.jpg (2011-12-3 09:30, 64.75 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9501

作者: 一叶    时间: 2011-12-3 09:30


第九步：出现一个新的对话框，如以象素尺寸表示图像大小，为适合CASP软件分析，可以调整为400×300的（我以显微镜40×拍摄为例），如果10×或20×拍摄，也许不必调整，根据实际情况而定吧。然后就是“开始调整”了，以后的就没必要再说了。

图片附件: 20483910.snap.jpg (2011-12-3 09:30, 54.46 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9502

作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-3 14:22

请教一叶老师：
EB是不是透不过细胞膜？可能我细胞裂解液出了点问题。结果今天一个细胞也没有。郁闷！！！
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-3 14:22

就算胰酶消化时间长了也应该有细胞的呀
作者: 铜雀    时间: 2011-12-3 14:23

请教一叶老师:
想请你帮我分析分析：
我连续做了三次预实验，都在摸索实验条件，第一次是电压20v，电流300mA ，裂解1.5h，解旋15min ，电泳20min：只有很少部分（大概不到10％）细胞呈彗星样，有的甚至散了。第二次电压25v，电流200mA ，裂解1.5h，解旋20min ，电泳20min：结果依旧。第三次电压25v，电流200mA ，裂解1.5h，解旋20min ，电泳20min：结果仍然依旧！我做的是培养细胞，个人认为培养细胞膜应该比从血液中分离出的细胞好裂解；可总是没办法把细胞膜裂解。我现只有怀疑自己的裂解液有问题了，但是每次操作都是很严格地按照园子里的方法做的，自认为没有问题。染毒浓度梯度是有实验依据的，不应该有问题。困扰中……
您做彗星配制的裂解液中加不加肌氨酸钠的？您用的裂解液是实验当天配制的吗（好像帖子里有介绍）？我的裂解液是两个星期就能用完的，且一直保存于4度中。
作者: 铜雀    时间: 2011-12-3 14:23     标题: 回复 #366 小鱼鱼 的帖子

你好！我也遇到过这种情况，我觉得有可能是你的细胞数目没有控制好，另外在与低熔点琼脂糖混悬时，没有混好。我的处理方法是，离心后控制好细胞的数量，在与低熔点琼脂糖混悬前用枪头仔细的再把细胞混悬，因为细胞由于重力作用，都已经下沉了；吸取适量低熔点琼脂糖于1.5ml离心管中，把细胞悬液加入低熔点琼脂糖中，在黄色灯光下你可以看到细胞被加入琼脂糖中。我认为琼脂糖是有粘滞性的，细胞不会被混的非常均匀，绝大部分呆在你加入细胞时的位置，所以铺胶时在加入细胞的位置吸取琼脂糖细胞混悬液就好了。如果现把细胞悬液放入1.5ml离心管中，琼脂糖再加入混悬，就要小心跑出来的电泳没细胞。只要稍微留点心就不用怕了，^_^祝你实验成功！
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-3 14:24     标题: 回复 #368 铜雀 的帖子

你好，我是好好控制细胞数目以后才做的。十的六次方细胞沉淀加200ULD-HANKS，混匀后取十微升悬液，加100微升的 胶，每板50微升。以前都满好，找不出原因才更郁闷。现在觉得细胞裂解液也没问题了 。
作者: qqq111    时间: 2011-12-3 14:25


有两个问题请教大家：
1.scge操作时要求避光，原因是怕光引起DNA损伤，我不是很明白难道我们平时的日光灯照射这么容易引起DNA损伤吗？
2.做了几次试验，总是控制不好细胞的分布，就是细胞会很集中在载波片的四周中间很少，这样的电泳结果应该是不准确的吧，那么大家都是怎么解决这个问题的呢，谢谢大家！
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-3 14:26


我的细胞裂解液是不加肌氨酸钠的，而且我没模电泳的 条件，就按25伏，300毫安跑的，以前也满好。建议你的染毒加几个梯度，可以浓度再高些。我们细胞裂解液4度放十天都没问题。我们这还有人配890毫升，用前取89毫升，加TRITONX-100,DMSO.
作者: 911    时间: 2011-12-3 14:27

我很想做单细胞电泳这方面的实验，但是没有什么经验！软件也没有，能不能给我一个相关软件下载的网址？谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 14:28     标题: 回复 #367 铜雀 的帖子

看来你的问题不在电泳，“有的甚至散了”这是什么意思？细胞核完全散开了？还是？...............你要确认一下是没有把细胞裂解，还是裂解过头了？如果是核散开了，可能是裂解有点过了，再有，你用的是淋巴细胞？每一个浓度梯度都是同样的结果吗？考虑一下有没有染毒后细胞坏死或凋亡的因素？
裂解液是要新鲜配的，裂解液中的其它成分可以提前配好，但DMSO和TRITON是要临用前才加的。
（希望我没有曲解你的意思）
可以把你的问题图片发上来，更直观。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 14:28     标题: 回复 #372 911 的帖子

有的站友实验结果细胞分布不均匀的主要原因就是细胞和凝胶混合的过程没处理好，一定要混匀。另外，SCGE避光是必要的，尤其对做单链的站友，DNA对各种因素非常敏感，整个实验过程如果让DNA暴露在光照下，容易造成额外损伤。
作者: 了了    时间: 2011-12-3 14:30

中性COMET asaay的时候，我用到电压20V，电流也就达到15mA，为什么您的条件可以达到100mA呢，您是用什么电泳buffer的？谢谢，以前在文献上也看到过comet的电流达到100mA，师兄说是碱性的才可以，糊涂了
作者: zhezhe    时间: 2011-12-3 14:31

我们实验室的水平电泳槽平时都是用来跑DNA的，所以都被EB污染了。我们平时操作都带着手套。
这次导师要我做comet assay，以前没人做过。如果我用这些电泳槽的话，很可能把玻片污染，继而又污染显微镜。你有什么好办法吗？为了这个实验买一个新的电泳槽吗（我导师很节俭的，说动她不太容易）？
能不能把这些电泳槽泡一泡，把EB泡掉再用？
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 14:31     标题: 回复 #376 zhezhe 的帖子

呵呵，一个小电泳槽又不贵。
也许用保鲜膜把玻片盖一下会好点吧。
洗一下电泳槽应该也可以的。
作者: zhezhe    时间: 2011-12-3 14:34


为什么我的裂解液不溶？？？
配100ml的，加了0.25mol（14.61g）氯化钠，10mmol（3.7224g）NA2EDTA.2H2O，1mmol的Tris（0.12114g），1g肌氨酸钠，大概加到了60ml（因为还要加DMSO，Triton100，再加上移液时要涮洗烧杯，就先加这么多ddH2O）
搅拌并加热了三小时，还是没有完全溶，怎么办？再加水吗？可是最多最多只能加到70ml，有用吗？
作者: 阿敏    时间: 2011-12-3 14:34

这是我刚做的图，有点奇怪，请大家帮忙分析

图片附件: 88826200.jpg (2011-12-3 14:34, 2.06 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9503

作者: 阿敏    时间: 2011-12-3 14:35


为什么会呈弥散状态？

图片附件: 74606060.jpg (2011-12-3 14:35, 34.44 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9504

作者: zhezhe    时间: 2011-12-3 14:35

哦，看了前面一位高人的留言，受了启发，用固体NaOH调了一下PH值，竟然溶了！！
谢谢楼主！
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 14:36     标题: 回复 #378 zhezhe 的帖子

我还想说两句，看来您用的是碱性SCGE，配100ml的要加10mlDMSO和1mlTriton100，所以您完全可以加到85ml，就好溶了，当然用abc816的方法更好。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 14:37     标题: 回复 #380 阿敏 的帖子

看您的彗星形态，好像细胞类型比较杂，（像是用骨髓做的彗星），如果您用的细胞不是单一类型的话，我个人认为结果不好分析，甚至不很可靠。
您的细胞密度稍微有点大了，而且杂质也挺多，电泳时玻片放斜了？怎么慧尾是歪的？分析的时候还要用软件调过来。
作者: 阿敏    时间: 2011-12-3 14:37

哦，这是人肝癌细胞BEL-7402.不过我的实验不是为了看凋亡。我收集细胞后，用膜裂解液（5 mM MgCl2, 1mM EGTA, 1 mM KH2PO4, 150 mM NaCl．）破膜取细胞核，加入药物（如喜树碱）37度孵育30min。之后的步骤和各位一样了。以下是我的参考文献：

2.5. Single cell gel electrophoresis (Comet assay)
Nuclei were isolated from A2780wt cells by incubating
whole cells in a buffer containing 5 mM MgCl2, 1mM
EGTA, 1 mM KH2PO4, 150 mM NaCl for 20 min on ice
with gentle rocking. Plasma membrane disruption and
nuclei integrity were checked under the microscope. Isolated
nuclei were exposed to the drugs at 10 uM for 30 min
at 37 oC or to H2O2 for 5 min. DNA breaks were detected
as previously described [8]. Briefly, nuclei were embedded
in agarose gel and then spread on a polylysinated microscope
slide. Nuclei were lysed in 2.5 MNaCl, 10 mMTris–
HCl, 100 mM Na2EDTA, 1% Triton, 10% DMSO, pH 10,
for 1 h at 4 8C. After lysis, nuclei were preincubated for
20 min at 4 8C in the electrophoresis buffer (0.3 M NaOH,
1 mM Na2EDTA, pH 13.5) and then subjected to alkaline
gel electrophoresis (300 mA, 4 8C, 20 min). Nuclear DNA
was stained using SYBR-gold (Molecular Probes). Slides
were analysed by automatic image analysis (Casys system,
Synoptics Ltd.) to quantitate DNA damage. The tail
moment, calculated by multiplying the total intensity of
the comet tail by the migration distance from the center of
the comet head, was used to measure DNA damage. Fifty
nuclei for each experimental point were scored blind from
two slides.
摘自：Thiocolchicine dimers: a novel class of topoisomerase-I inhibitors，Biochemical Pharmacology 69 (2005) 113–121

这是探讨药物作用于细胞核的一种新方法。
谢谢一叶。
另外，我只铺了一层胶，有什么影响吗？
作者: tianmei001    时间: 2011-12-3 14:38


CASP具体怎么用，能详细说明吗，说明在哪呀
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 14:38     标题: 回复 #384 阿敏 的帖子

您的单层铺胶应该不是问题，您只要解决了细胞密度和杂质问题（其实这只是小问题），彗星图片就不错了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 14:38     标题: 回复 #385 tianmei001 的帖子

请您看看本专题以前的帖子，我做了详细的使用方法贴图
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/thread/2727570')
作者: qqq111    时间: 2011-12-3 14:39

我还有两个问题
（1)在用EB染色时，应该染色后多长时间洗掉EB呢？我在做DNA电泳时，EB后染色都是30min后再用蒸馏水洗10min，太早洗掉会不会染 不上色？
（2）我用CASP这个软件时，同时打开多个图片，可是好象总是不能分析第一个图片以后的图片，在其它图片的界面上选好工作框后点击开始的图标就又回到第一个图片，不知道为什么？还有在分析结果中，有tailmoment 和VE tailmoment ，这两者有什么区别吗？－－－哦，已经是三个问题了：）
谢谢老师！
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 14:40     标题: 回复 #388 qqq111 的帖子

回答：
1、彗星的EB染色不同于您以前做的DNA电泳染色，把染液滴到胶板上最多保持1分钟就可以漂洗了，否则背景会很亮，不用担心不着色的问题。
2、CASP这个软件的使用非常简单，您的问题也很好解决，在预分析状态，不管分析到哪个图像，您的结果都不会保存的，如果点击那个小齿轮后进入正式分析状态，分析图像会自动跳转到第一个彗星图像，从第一个彗星开始分析，这就是您所说的好像总是不能分析第一个图片以后的图片的原因，如果您不想分析前面的图片，可以按next按钮到您要的那个彗星，注意，界面上会同时显示彗星图片的名称，很容易找到您要分析的那个彗星。应该是从第一个彗星就开始分析的，因为拍摄彗星是随机拍的，分析时当然要每个彗星都分析的，如果主观选择分析的话，就失去了随机的意义了，主观因素影响岂不是很大？另外，正式分析后，工作框就不可以随意调整大小了，但可以移动位置，因为彗星图片不是只在某一个位置的。
3、TAILMOMENET是尾矩，没有VE tailmoment这个指标，是您没看清，应该是Olive tailmoment，即Olive尾矩，是Olive教授首先提出的，所以以她的名字来命名两者有区别，尾矩是尾长和尾部DNA百分含量的乘积，而OTM是彗星头部重心和尾部重心之间的距离与尾部DNA百分含量的乘积。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 14:41


我在前面提到的CASP软件结果的输出，保存为纯文本文件，然后调整文本窗口大小，（有图示），SPSS可以读取。
还有一个方法，保存为文本文件后，可以不必调整文本窗口大小，直接全选所有数据和变量，粘贴的WORD下，然后再全选，点表格－－转换－－文字转换为表格－－确定，生成一个新表格，如果用SPSS统计分析的话，可以选定表格，可以直接把所有数据粘贴到SPSS中，此方法也很方便。
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-3 14:42

你好，经过两个多月的彗星实验，很郁闷的发现连高剂量组的彗星都很少，有没有药物对细胞损伤不能通过彗星表现出来？这个药物剂量的设定是经过MTT试验的。
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-3 14:42


另附一张照片

图片附件: 74110127.jpg (2011-12-3 14:42, 48.18 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9505

作者: hold住    时间: 2011-12-3 14:44

您好，前面您分析到细胞坏死或者细胞凋亡是不是对这个实验结果也有影响，看不到有彗星现象的出现？
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 14:44     标题: 回复 #391 小鱼鱼 的帖子

SCGE比较灵敏，尤其是碱性测的单链断裂，没有阳性结果就要好好找找实验的原因了，您用的还是睾丸细胞吗？是否裂解不充分？解旋时间？电泳条件？
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 14:49     标题: 回复 #393 hold住 的帖子

凋亡细胞可以计算一个凋亡细胞率，作为一个指标也不错的。
因为可能存在坏死细胞的问题，所以，做彗星之前是要看细胞存活率的，尤其是在培养细胞中。
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-3 14:49

我做的还是支持细胞，由于老板搞行政，也没有师兄姐带，一个人在实验室瞎做，从丁香园里学到了很多书上没有的知识，也感谢lq6688版主，你的无私和耐心真的让我受益匪浅。
还想请教一下老师，中性和碱性电泳除了测单链和双链以外还有社么别的区别么？我用的是碱性的电泳条件。电泳两小时应该够了吧？解悬二十分钟。电泳没有摸条件，25V,300毫安，25分钟。我看了别的文献，别人做的是生精细胞，用的是中性电泳条件，12V，130毫安，难道电压高了，尾巴都跑没了？我甚至用了比较高的药物浓度都不行。彗星能测出所有的损伤么？只能DNA断裂吧？
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-3 14:50


而且我发觉我做出来的细胞不圆，周边很毛糙，是***作的问题么？望老师不吝赐教。

图片附件: 86879251.jpg (2011-12-3 14:50, 20.95 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9506

作者: 一叶    时间: 2011-12-3 14:50


中性和碱性SCGE因检测DNA断裂类型的不同，因而适用范围也有所不同，灵敏度也不同，一般药物染毒是做单链的，我的观点是某种致毒因素最好碱性和中性都做，因为碱性中包括了双链断裂，但它的影响因素比较多，不好排除，而中性的特异性要好。还要根据你的药物致毒机理来选择实验条件。我没有做过你说的细胞，所以不能确定电泳条件是否合适，可以再摸一下条件，不同电泳条件多做几个平行，看结果如何，（不同细胞类型电泳条件一定要摸的！）。
裂解液的成分请告诉我，看看是否裂解有问题。
作者: 蒲公英    时间: 2011-12-3 14:51


我是遗传学研二的学生，单细胞凝胶电泳这一技术在我们实验室属于常规方法，最近在写关于单细胞凝胶电泳技术影响因素的文章。提到如何去避免掉胶等问题，希望对各位学长有所帮助。
作者: 蒲公英    时间: 2011-12-3 14:52

你的图象尾巴歪了可能是胶片摆放的问题。
作者: 蒲公英    时间: 2011-12-3 14:52

我们实验室的EB胶片都是先在沸水中煮半小时以上，用刷子洗掉残留的凝胶，然后用水反复冲洗，在放入酒精中浸泡。EB的致癌性很高，一定要从各个方面注意保护自己。
作者: 西子    时间: 2011-12-3 14:52

做彗星已经两周了，可是没有任何进展。
步骤：
1.取小鼠胸腺细胞，1640＋10％血清体外培养6－10小时，细胞凋亡。
2.6－10小时后取细胞PBS洗，计数。以0.5％正常溶点的琼脂糖凝胶铺第一层胶，4°C 使之凝。后将10ul细胞悬液加 入0.5％低溶点的琼脂糖凝胶铺第二层胶，4°C 使之凝。
3.置入新鲜配置的裂解液（NaCl 146.1 g，Na2EDTA 37.2 g，Tris base 1.2 g，用约12克NaOH调节pH至10，临用前加入1% Triton X-100 ，10%DMSO），4°C 2h
4. 取出玻片，电泳液（NaOH 12克，二钠EDTA 0.372g）中解旋20min，后25V，150mA（电流上不去） 20min。
5。中和，染色，镜检。
可是我看到的都是一些小圆点，看不不到彗尾。
是因为我的裂解液有问题吗？里面没有加肌氨酸钠。
另外，中和有什么意义？就是电泳后为什么要用中性溶液中和，对结果有什么影响吗？
谢谢！
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-3 14:53


我还是不太明白碱性和中性电泳的区别，难道碱性电泳只能测双链DNA断裂就不能测单链？电泳条件会影响彗星的有无么？上次看到的文章中生精细胞有很多碱性敏感位点，故用碱性电泳会促进损伤致使DNA断裂。我用的细胞裂解液成分如下：
NaCl:14.61g
NaOH:0.8g
EDTA-Na:3.7224g
TRIS-BASE:0.12g
双蒸水定容致89毫升，4度保存，用前加1毫升TRITONX-100和10毫升DMSO
还想问一下老师我的彗星照片有没问题？
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-3 14:56


如果用中性电泳的话，条件还是要重新摸的么？
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 14:57     标题: 回复 #402 西子 的帖子

肌氨酸钠是应该加的，它的作用是破坏细胞的磷脂双分子层。
中和是为染色做准备的，中和后容易着色。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 14:58     标题: 回复 #403 小鱼鱼 的帖子

同样的细胞，用中性和碱性得到的结果肯定不同的，中性只能测双链，而碱性测的是单链和双链的总和。
你的裂解液为什么不加肌氨酸钠？
再有，裂解液一定要全溶解，混浊的裂解液裂解效果不好。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 14:58     标题: 回复 #401 蒲公英 的帖子

EB的防护问题在SCGE中应该引起足够重视，目前大多数实验室好像只是戴手套、清水浸泡玻片、冲洗等方法。请冰凝子站友详细谈谈SCGE中EB的防护方法，同时加上自己的观点，有没有比较标准化的防护方法呢？
身体是革命的本钱。
作者: qqq111    时间: 2011-12-3 14:59

我做彗星实验，第一次就出图像了。虽然彗星尾巴没有你的那么漂亮。但是老板很满意，逢人就夸。我没有人带，这个实验我们系也没人做过，我的步骤都是看你们的帖子摸索出来的。真是谢谢你们了！
制作电泳槽后，果然没有遇到脱胶的问题。而且我是用中性树胶做的。中性树胶是我们实验室用来封片的，用在这里特别适合，向你推荐一下吧。
好笑的是，我学你铺两层胶，但是顺序弄错了，把有细胞的胶铺在下面（直接滴在玻片上），上面再滴琼脂糖胶，居然也跑出来了。但是尾巴都特别小，最好的用casp分析后，OTM在20左右。不知道是因为我的药物作用微弱还是我铺胶的问题。你能发表一下看法吗？
还要谢谢abc816，在她的帮助下我才成功的配出来裂解液，使实验能够顺利进行。
但是我还是有疑惑想请教楼主：
我听你的，用2ug/ml的EB,但是我滴上就照，没有用水洗，觉得画面还可以。看了你的图片决定下次洗试试，那你是染之后多久才洗的呢？一洗就把EB弄得到处都是，你是如何防护的呢？
我这里的拍照软件不知道怎么回事，拍出的图片特别大，一张tif格式有30多m，而且10倍物镜下照出来的图像里细胞就像你的截图里一样大，20倍物镜下的细胞更是大的不得了，casp里，圈细胞的框就有四分之一个显示屏那么大，很不方便。我都不敢拍40倍的。怎么回事呢？
还有，结果你是怎么分析的呢？是不是用spss里面的单因素方差分析比较加药组同对照组的尾矩是不是有显著性差异？我以前没搞过科研，很多细节上的东西都能难住我，请您不吝赐教好吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 15:00


首先恭喜你的实验成功，看到有人从本专题受益，很欣慰。
不知道你做的中性还是碱性SCGE，OTM20已经够高的了，相当于我做中性SCGE的3Gy照射的损伤程度。估计您做的彗星尾部DNA含量应该达到40～50％了，还嫌尾巴小吗？
染色后冲洗出来的片子背景比较好。漂洗的时候应该是在一个固定的容器中进行的，如染缸中倒双蒸水，在缸里洗就可以了，不会污染很大。
你是用CCD拍的吧？能不能调一下图像大小？1024×768就可以了。没必要那么大。上CASP前要把图像调整大小，最好用400×300，就很好用了。
统计分析要根据你 实验设计，但第一步要看资料是否服从正态分布，再决定采取什么统计方法，如果象你说的，比较加药组同对照组的尾矩是不是有显著性差异，T检验，方差分析都可以的。
作者: 铜雀    时间: 2011-12-3 15:00


请问一叶，如果论文中采用了CASP软件计算尾部DNA含量的结果，是否需要在参考文献中引用CASP软件的出处？有相关的文献吗？如果有的话发给我一份，多谢！
作者: 盼盼    时间: 2011-12-3 15:01

请问老师：
您用的载玻片是只有一部分是磨砂面的还是整个一面都是磨砂的？还有肌氨酸钠一般哪里有卖的？我问了好几个人都说没有卖！！
作者: 盼盼    时间: 2011-12-3 15:01

老师您好！我想作一下药物对红细胞的伤害试验，看一下是否有断裂DNA的作用，我用的药物是蜂毒素，用的是鸡红细胞（有细胞核），不知道该用中性裂解还是碱性裂解的方法？？请指教，谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 15:02


肌胺酸钠应该算是普通试剂了吧，怎么会不好买？我是从中国医学科学院血液学研究所科技公司买的，他们也是分装的。
一般药物染毒首选碱性裂解的，如果不放心，可以在预实验时两种实验条件都试试，看看哪个好。
作者: 盼盼    时间: 2011-12-3 15:02


老师您好！还想问一下关于染料的问题，我们实验室用goldview，不知道这个能不能作为染色剂？这个可能污染会小一些。
作者: 盼盼    时间: 2011-12-3 15:02

不好意思，还要再麻烦一下！我这几天一直在看这个帖子，想自己也做一次。还有一点不是很清楚，想 明确一下。是不是用中性的裂解液对DNA没有伤害，如果出现了尾巴就应该是药物的作用？而用碱性裂解液即使没有药物的作用也会有尾巴，在药物作用后尾巴就会更明显呢？
可能我提的问题有点蠢，不过还是希望老师能不吝赐教，我是新手，从来没有做过这方面，见笑了！
作者: 盼盼    时间: 2011-12-3 15:03


今天查了一下肌氨酸钠，我看到sigma有十二烷基肌氨酸钠，应该就是您用的这个吧？如果是一样的我就定了！盼老师回复！
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 15:04     标题: 回复 #414 盼盼 的帖子

彗星首选EB，但是污染比较大，用什么染料关键在于你的染料需要的激发光波长，还有这个染料和单链或双链DNA结合的能力，不管什么染料，只要得到清晰客观的图像就好，然后考虑它的毒性。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 15:04     标题: 回复 #415 盼盼 的帖子

您理解错了，在适合的实验条件范围内，没有损伤的细胞在中性或碱性条件都不可能做出尾巴，多阅读文献，多了解一下SCGE的原理。不管在什么条件下，实验技术本身都不会额外增加DNA损伤，尽量保证致毒因素的客观作用，并在结果中显示出来。
前面已经讲过了，碱性条件比较灵敏，但影响因素比较多，不会对DNA产生额外损伤。
另外，裂解液中用的就是十二烷基肌氨酸钠，它的作用就不用说了。
作者: 盼盼    时间: 2011-12-3 15:04


我想问一下：从血液中提取淋巴细胞来做单细胞凝胶电泳，是不是必须是新鲜的细胞，可不可以把血液或者提取的淋巴细胞保存一段时间做呢？
作者: BUK    时间: 2011-12-3 15:05

我还有一点疑惑，老师您用的自制电泳槽周围粘的玻璃，会不会影响电流的通过？是不是第二层胶要稍微高于玻璃才行？
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 15:06     标题: 回复 #419 盼盼 的帖子

最好是新鲜血液，保存的我也试过，实验结果凋亡细胞明显增多，可能保存过程不好，细胞营养不良。
作者: 克隆鱼    时间: 2011-12-3 15:07

呵呵,看了你们的介绍也查了些文献,我对SCGE也很感兴趣,呵呵,我是做抗肿瘤药物的,我想SCGE 可以用来观察我的药物引起的肿瘤细胞的调亡吧,我养的是hela细胞,不知道细胞浓度应该选多少?还想问下SCGE对电泳仪的要求,呵呵,谢谢!还有可不可以把你自制的那个玻片拍张照片上来啊,直观的看下是什么样的
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 15:08     标题: 回复 #422 克隆鱼 的帖子

细胞浓度在2×104即可；
SCGE对电泳仪要求不高，一个小电泳仪就好了；
自制电泳槽照片已经发过了，这里不能重复发帖，请您在这里好好找找吧；
作者: lixi559    时间: 2011-12-3 15:57


我正在做的淋巴细胞的电泳，跑出来的结果也有像前面一位同仁的情况，周边是毛边，不是很圆 ，不知道是什么原因，是因为有细微的损伤还是别的什么原因？急盼回答。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 16:02

你肯定是用低倍镜拍的，而且你用SONY DSC-P200相机无法与荧光显微镜配套？只能从目镜拍，对图像质量不好掌握，为什么不买一个和你的荧光显微镜配套的相机呢？那样拍的图像质量好控制。
谈谈你用的什么损伤因素？什么细胞？图片还是蛮漂亮的，细胞密度掌握的也很好，但焦距还要调一下，对着镜头拍有难度。
这图是我分析后的，明显用低倍镜拍的图像不如高倍镜。

图片附件: 87242310.snap.jpg (2011-12-3 16:02, 34.56 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9507

作者: 一叶    时间: 2011-12-3 16:11


我把你的图片放大到800×600，分析同一个细胞，曲线明显好转，建议以后用高倍镜拍，仔细调一下焦距，得到的图像质量会更好！

图片附件: 54368783.snap.jpg (2011-12-3 16:11, 37.27 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9508

作者: 一叶    时间: 2011-12-3 16:11

建议你老板给荧光显微镜配一个合适的相机，好马配好鞍。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 16:12


还有，你用的曝光时间是1/8秒，光圈：3.5，下次高倍镜拍可以试试1/4秒曝光时间，光圈2.6，图像质量可能更好。
作者: TAT    时间: 2011-12-3 16:22

请问一下老师：为什么那么多人都选择用数码相机拍照呢？直接用电脑上的照片不是很方便吗？应该是每台荧光显微镜都配有电脑的啊。另外我预试验做的一些照片好像不是想要的结果，看起来怪怪的。难道都是细胞碎片或是染料颗粒？这些应该不会结合染料 的啊。因为怕污染，我加EB后只是把胶面上多余的染液吸走，然后加一点清水再吸一下。差点忘了交代我想做的是白色念珠菌被二氧化氯作用后是否有DNA链的断裂。
作者: TAT    时间: 2011-12-3 16:23


另外，有人有过goldview染料吗？它的发射波长和激发波长是多少呢？我总是觉得用EB太恐怖了。每次取看显微镜，那个管显微镜的老师都用那种眼光看我，让我很不舒服。
作者: TAT    时间: 2011-12-3 16:23


有人中和后还要用76％和96％的乙醇处理，这一步的作用是什么呢
作者: glass    时间: 2011-12-3 16:27

谢谢一叶老师的鼓励，看照片便知何种型号的相机，佩服！我们这里的配套相机出了点故障，只好采用笨法。这是食物中的化学预防剂作用人胃癌SGC7901细胞24小时的结果 ，在园子学习好长时间，才试着做，受益非浅，谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 16:28     标题: 回复 #429 TAT 的帖子

荧光显微镜配有电脑当然更好啦！我用的还是老荧光，没有，所以只能买配套的相机。
看了你的图片，不知道那是什么，念珠菌？不像！而且即使有念珠菌在里面，你的背景没有处理好，背景太亮了，图像质量很差，根本没法用。建议下次预实验首先明确裂解后胶板中有没有菌？染色后直接把片子放到专用的小染缸中洗涤，然后滤纸吸去多余水分，这样背景会处理的很干净。
如果怕污染的话，可以试试AO。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 16:29     标题: 回复 #431 TAT 的帖子

有文献报道的，作用应该是固定，固定后胶放置一段时间后也可以看，但我觉得不是电泳后立即看的片子，图像质量不好，所以我都是中和后染色即看，不用乙醇处理
作者: TAT    时间: 2011-12-3 16:30

谢谢一叶老师。EB的浓度达到2mg/ml是不是太高了？有人做酿酒酵母的SCGE时就用这么高浓度的EB。
作者: TAT    时间: 2011-12-3 16:30

转贴：EB（溴化乙锭）的处理方法，与大家共享
今天在Google Group上看到一个帖子在讨论处理EB（Ethidium bromide，溴化乙锭）废液的问题，这确实是个问题，正好把相关资料翻译一下，供大家参考：

由于EB是一种诱变剂，直接倒入水槽或扔进拉圾箱可能会带来危害。所以应该根据情况处理：

1. 电泳胶

胶里面痕量的EB没有问题，如果小于0.1％可以直接扔掉。而如果发红，即大于等于0.1％时应该放在生物危害柜中焚烧掉。

2. EB溶液

<10ug/ml 时可以直接倒入水槽

>10ug/ml 时应该用木炭过滤或化学方法使其失活（推荐用木炭过滤的方法）

溶液中还有重金属、氢化物、硫化物时应该按照危险垃圾处理

化学中和方法：

方法一：加等体积的漂白粉，搅拌4小时，静置4天，用NaOH调至pH4-9, 倒入排水沟的同时用大量水冲。

方法二：每100ml加5％磷酸，加12ml0.5M的NaNO3，搅拌并静置20小时，同上调pH, 倾倒。

3. 手套、设备等物品

放在医用垃圾中焚烧，如污染严重则用漂白剂处理。
作者: TAT    时间: 2011-12-3 16:31

转另一个贴，也是关于废弃EB的处理的。
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废弃溴化乙锭EB净化和处理方法



作者：佚名 来源：本站原创 2005-8-26


实验室中经常有EB被打翻或EB废弃物的处理问题，如何做到标准处理？

1 严禁随便丢弃。因为EB是强致癌性，而且易挥发，挥发至空气中，危害很大。

2 废 EB溶液的处理方法
(1) 对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理：

a. 将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml；
b. 加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4 ，混匀，再加入等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时；
c. 加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。

(2) EB含量小于0.5mg/ml的溶液可如下处理：

a. 按1mg/ml的量加入活性炭，不时轻摇混匀，室温放置1小时；
b. 用滤纸过滤并将活性碳与滤纸密封后丢弃。

3 废EB接触物，如抹布，枪头。

一般回收至黑色的玻璃瓶中，定期进行焚烧处理。
作者: TAT    时间: 2011-12-3 16:32

电泳时电泳液是不是一定要循环呢？另外我的电泳仪不是双恒电泳仪，电压和电流只能固定其一。电压设为0.5V/cm时电流只有2～4mA！这样会不会影响彗星效果？
作者: TAT    时间: 2011-12-3 16:33

还有，大家是不是一个载玻片只做一个样呢？我都是一个片点三个样，这样做行不行？因为我还没有得到有价值的结果，只在预试验。没有发言权
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 16:34     标题: 回复 #435 TAT 的帖子

SCGE染色用EB浓度2ug/ml足够了，你说的2mg/ml大了1000倍！没必要那么高的浓度。
非常感谢您提供的关于EB的处理方法，看来我们用的2ug/ml浓度比较好处理。
我做的是每个载玻片做两个样。
电泳时的电压和电流一直是个让许多站友挠头的问题，调整一下电泳液的量，看有没有变化。不同电泳仪差别挺大的，有的电泳仪电泳液超过胶面后，可能因电流过大烧坏了。
作者: loli    时间: 2011-12-3 16:35


我在我们实验室的电脑里找到一个CASP软件，我安装后对照一叶老师前面的帖子操作过，其它都挺正常，但是结果那个对话框里没有数值，而且扩展名是.res，而不是.txt。也没法批量处理，不知是不是软件版本的问题还是其它原因，请各位指教！谢谢！
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-3 16:35


b. 加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4 ，混匀，再加入等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时；

我感觉这个方法不是很合理，第一没有２５mlo/L这么大浓度的ＨＣＬ．第二在酸性的条件下KMnO4和HCl会起反应的放出ＣＬ２．这是我个人的看法．不知道有没有人试过
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 16:36     标题: 回复 #441 loli 的帖子

首先，要确定是否是在正式分析状态做的，而不是在预分析状态；
其次，要明确是否在点击了“分析”按钮后，又点击了它右侧的“输出”按钮，因为如果不点击“输出”的话，你做的分析工作就都白忙活了，在结果窗口什么都没有；
再次，CASP保存的结果默认就是.res文件，顺便说一句，CASP很人性化的一点，它会在安装文件夹中对你分析的结果保存一个.res文件，可供以后导入结果文件，防止导出的结果误删除，有备无患啊；
最后，你对你分析的结果肯定是没有导出，导出命令在文件下拉菜单中找，然后把导出文件的扩展名定为.txt，其实默认就是的，这样你所有分析的结果就OK了。
哎........................，以上我都在以前的帖子里提到了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 16:37

1、解旋是在电泳液中进行的，中性SCGE用0.5%TBE,而碱性SCGE用EDTA+NAOH，不是真假的问题。
2、您的方法只要不脱胶就可以。
3、SCGE的详细步骤和试剂配方在文献中已经有很多详细介绍了，我觉得这里没必要重复介绍，抱歉。
作者: abc816    时间: 2011-12-3 16:37

我的玻璃片是普通光滑型,加0.75%的普通凝胶倾斜玻璃片,凝胶液如同水样流下,在斜玻璃片上不粘凝胶液,是否此玻璃片不可用吗?有否高招?您所用的玻璃片是何种?谢谢!
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 16:39     标题: 回复 #445 abc816 的帖子

我用的就是普通光滑载玻片，只是做一下处理。
作者: abc816    时间: 2011-12-3 16:41     标题: 回复 #446 一叶 的帖子

您的处理是如何操作的?能否说说,方便吗?
作者: ladyhuahua    时间: 2011-12-3 16:41

有几个问题，想请教一下：
1. 在铺第二层胶，也就是含有样本的胶的时候，和第三层胶的时候，有的介绍说在冰盒上操作，这个温度会不会影响细胞？
2. 细胞裂解液可不可以重复使用？如果重复使用会有什么影响?
3. 在解旋的时候，也就是用电泳缓冲液的时候，还有中和液的时候，这两种液体是在4度冰箱保存呢？还是室温？还是37度比较好？较低温度保存会不会影响细胞？
4. 在电泳和中和的时候，室温对结果的影响大吗？我们这边实验室的人说，比较暖和的时候，结果比较好，冬天冷的时候做的结果不好，是不是啊
5.最后，一个最重要的问题：我在年前年后作了好几次预实验了，可是细胞老师出现毛边现象，基本上每个细胞都有，有的时候比较严重。有的时候毛边现象还好，但是还是有，用肉眼还是能判断结果的，但是如果用软件就不行了。各位老师，能否告诉我为什么吗？我先说不是细胞种类或者病例模型的问题？因为我在预实验中，也出现过很漂亮的没有毛边现象的情况？
期盼您的解答！！谢谢！！
作者: caihong    时间: 2011-12-3 16:42

今天我又重做了。以前我的结果全是毛边现象，有的人说是可能裂解时间太长了，于是我改为一批裂解一个小时，另外一批裂解两个小时，发现：第一批，还是有毛边现象，但是比裂解两个小时的毛边现象稍微好一点。第二批，居然全是彗星细胞，但是居然还出现没有毛边的，边缘很光滑的正常细胞，不过个数很少，一张片子也就十几个。这是怎么回事啊？
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 16:52     标题: 回复 #449 caihong 的帖子

1、文献报道确有不一致，本人觉得常温即可；
2、已经明确，裂解液要新鲜配制的，否则影响裂解效果；
3、应该是4℃保存，裂解后就没有细胞结构了，只是存在类核；
4、影响不大，但我在实践中发现室温对裂解液的配制好像稍有影响，室温低时DMSO很容易冷凝；
5、请您把您的图像帖上来，您说的“毛边”到底是什么样的？一看就知道了；
裂解应该掌握在1.5～2h之间，1h 肯定是不够。
SCGE实践中发现，除了软件中可以直接给出的几个指标外，彗星细胞率这个需要主观判断的指标还是不容忽视的！
作者: baidukk    时间: 2011-12-3 16:53


请教各位老师，我下载的casp软件，选取框不能调整大小（不能拉伸），这是怎么回事呢？
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 16:53     标题: 回复 #451 baidukk 的帖子

请仔细阅读本专题以前的帖子，对于软件的使用都有详细介绍。
在预分析状态是可以调整大小的，但在正式分析状态不能随意调整大小，所以最好在预分析状态把框大小调整好。
如果确实需要调整的话，需回到预分析状态，但你会发现彗星图像自动回到你选择的所有彗星中的第一个细胞，点NEXT，找到你要分析的彗星，继续。
作者: 白白的    时间: 2011-12-3 16:54

做了这么久的彗星实验，终于有了结果。首先要感谢一叶老师，还有abc816。以前老是觉得电泳出来的有毛边现象，现在看来有毛边现象是正常的，因为细胞已经裂解了嘛，如果是圆圆的，边缘非常清楚光滑的细胞，那才是非实验结果的细胞。看来这段时间做彗星走了一些冤路，但是只要得到实验结果了，就满意了。
下面把我做的一些经验和大家分享一下，有些是我自己的实验经验所得，可能和一叶老师的不一样，只是在这里讨论，没有反驳的意思，敬请谅解。
1.  在溶解琼脂糖的时候，我认为可以将琼脂糖装在一个具塞的试管里，一次性配好溶解，以后每次加热溶解使用就行了。因为，很多资料上都说，轻微的琼脂糖浓度变化对实验结果影响甚微。而我们实验室的经验，也认为这样就行了。没有必要每次都要新配，这样浪费实验材料。
2.  细胞裂解液，当然用前新鲜配置是最好的。但是我做过实验对照，在一两天内，可以使用同一批裂解液两次，使用前加二甲亚砜和曲拉通，四度冰箱放置30-60分钟，好像对实验结果也没有影响。哈哈！当然，这是我偷懒的做法，不过，在某些急救的时候，可以派上用场。希望一叶老师不要骂我。
3.  我不清楚一叶老师的微电泳槽效果怎样？我听说是很好。但是我在想这样一个问题。我用的是毛玻璃片，每次我铺第二层胶的时候，都用盖玻片压，有的时候压不好的话，导致实验结果的细胞不在一个层面上，这样观察起来，拍照的时候，都有困难。我在想一叶老师的不用盖玻片，直接让第二层较在第一层较上铺匀，这样能行吗?这样，观察的时候在一个层面上吗？
4.  我发现现在市面上卖的好多磨砂玻片都说是毛玻璃片，可是我发现他们的粗糙程度都不够，都容易脱胶。因为现在的磨砂玻片都使用化学试剂腐蚀玻璃制造的，粗糙程度不够。而原来的毛玻璃片是用机器打磨的，粗糙程度比较好。但是就算这样的毛玻璃片，在用过一两次之后，他的粗糙程度也会降低，也会导致脱胶现象。我就倒过这样的霉，二次使用的毛玻璃片居然在我最后电泳完中和的时候，脱胶了，害得我四个小时的实验白做了，可都来不及。而新的毛玻璃片就挺好的，我还没有用起来脱过胶。所以，要是一叶老师的微电泳槽可以解决细胞是否在一个层面上的话，我觉得还是挺好的？
5.  我觉得细胞裂解时间不能一概二论，1.5—2小时。要根据自己细胞的不同，还有自己实验室的条件来看。就像我的实验，每次裂解两个小时，细胞全裂解了，电泳出来全是彗星细胞，正常细胞倒是在少数，而且“毛边”现象非常严重，和背景比较，边缘比较模糊。我们说毛边现象是正常的，但是也有个程度，这样的结果肯定是不对的。就我的实验来说，裂解80-100分钟就够了。这一点，我认为是和一叶老师最不相同的。
6.  还有电泳液，我也有个偷懒的方法，呵呵。在一两天内，电泳也可以重复使用三到四次，只不过用前一定要在4度冰箱放置。
7.  染色，不知道是不是因为我们用的EB质量不好的原因，我用EB固体配成20ug/ml，用前稀释10倍，变成2 ug/ml。可是发现2 ug/ml染色效果就是不好，我干脆不稀释直接用20ug/ml，发现效果很好。所以我觉得这一点是不是也根据实验条件的不同，各有差异，这也是和一叶老师不同的。
大约就这些，下面就是关于几个问题，请教一下一叶老师、abc816、还有各位彗星强手：
1.  就是一叶老师的微电泳槽能否解决“细胞在同一个层面” 的问题？怎样解决的？
2.  小绵羊姐姐是毛玻片使用的高手，怎样压片，才能让“细胞在同一个层面”，每次我压片不是轻了就是重了，要不就是样本压倒边上去了，显微镜下丑得要命。
3.  这就是关于观察和统计的问题了。我是学公共卫生的，所以对统计方面比较在乎一点。前面也讨论过这样的问题，我觉得不是很明显。我们在显微镜下看的时候，不是要数100个细胞出现的彗星率吗，是不是最好是这样：假如每个视野有平均10个细胞，我们就随机选取10个视野，拍照；然后，直接在电脑上分析10张照片。还是第二种做法，在显微镜下用肉眼观察，主观选出10个视野（带有彗星细胞的）拍照，分析10张照片？我个人认为第一种做法比较好，但是第一种做法有可能在随机选出来的10个视野中，一个彗星细胞也没有。
4.  在分析细胞的时候，是随机分析这10张照片上的100个细胞的各项指标呢？还是第二种做法：肉眼观察照片，主观判断，着重分析类似彗星和彗星细胞的各项指标? 我个人认为第一种方法比较好，虽然比较麻烦。但是， 我在想，彗星细胞率是100个细胞中出现的彗星细胞的个数。这个定义对不对？如果是这个定义的话，那彗星细胞率就用的二种方法比较好一点？因为第一种方法，用软件如何来区分正常细胞和彗星细胞？我发现好多正常细胞，因为有一点点扩散，也被软件分析出来是“有头有尾”的彗星细胞。
敬请讨论，解答！！

[ 本帖最后由 白白的 于 2011-12-3 16:57 编辑 ]
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 16:55     标题: 回复 #453 白白的 的帖子

的帖子很有见解，这也说明一个问题就是SCGE的标准化。
1、同意您的意见，我也在用此办法，但发现一个问题，正常熔点凝胶冷凝后再次煮沸时很容易爆沸，注意安全，最多重复3次。
3、我的做法解决了脱胶的问题，但确有细胞不在一个层面上
5、裂解时间当然不是固定的，视不同细胞而定。
6、电泳液的重复使用问题，用前最好看看PH值有无变化。
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1、观察的时候根据镜下条件主要拍在同一层面上的细胞即可；
2、abc816用毛玻片很有经验，我们聊过这个问题，abc816是不用玻璃盖片的，这样容易出现你说的问题，用平整的塑料薄片，要稍大于载玻片，滴胶后盖上去，待冷凝后拉出来，没有点经验估计是做不好的；
3、我的意见是镜下观察100个细胞，看彗星细胞率，然后随机拍照，50～100个细胞，上软件分析各项指标，软件不好定彗星细胞率。
低倍镜下可以满足每视野10个细胞，但采集到的彗星形态不好，就像镜下看骨髓片，高倍镜看到的细胞更清楚，建议最好用高倍镜；
4、同3。
作者: HP007    时间: 2011-12-3 16:58

最近需要做单细胞凝胶电泳，看了一叶还有各位战友的讨论，受益匪浅，非常感谢！
由于实验室没有荧光显微镜，不知道实验结果可不可以用一般的凝胶成像仪进行拍照，由于这台仪器本实验室就有，相对比较方便。希望各位各位指教，谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 16:59

不知道实验结果可不可以用一般的凝胶成像仪进行拍照，

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用来拍跑DNA的一般凝胶成像仪不能用在SCGE上，因为彗星图像是要通过显微镜高倍放大的，就像看血片或骨髓片，一般的凝胶成像仪是做不到的。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 17:00


最近发现的一个问题，就是CASP分析凋亡细胞，有时镜下看某个细胞是凋亡细胞，但上CASP后分析效果不是很理想，后来看了看CS,可以解决此问题，而且输出的结果和CASP的类似，感觉不错，看来这两个软件结合应用就更完美了。但是，用CS的时候引入的主观因素很多，分析框的选择很关键，一定要准确！
作者: guagua    时间: 2011-12-3 17:00


一叶老师，虽然做了比较久的彗星实验，但是还是有一点不太确定。裂解时间，解旋时间，电泳时间越长，是不是彗星细胞越多，彗尾也就愈长？
还有是不是电流或者电压越大，彗星细胞越多，彗尾也就愈长？
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 17:01


对，所以实验条件一定严格掌握，有人专门做过这方面的研究，不同实验条件下对实验结果的影响，得出比较合适的SCGE实验条件。
作者: guagua    时间: 2011-12-3 17:01

说了这么久的标准化问题，我还是没有弄懂。就是随机拍摄100个细胞吧，这100个细胞中肯定有彗星细胞，还有部分正常细胞。那我分析各项指标的时候，是100个细胞都分析呢？（也就是说包括正常细胞了）；还是只分析彗星细胞？有的用软件分析起来有一点点尾巴的，是属于正常的细胞，还是彗星细胞？
作者: @STAR@    时间: 2011-12-3 17:02

你好，我们实验室近两年一直在做SCGE，但都是检测DNA损伤的，我们也看到SCGE能测凋亡 ，但就是没查到具体做法的文献报道，而且用此法测凋亡也鲜有人用。我急用测凋亡的方法，但是用别的又不太可行。看了你的报道眼前一亮，你是否在用SCGE 测凋亡，请详细赐教。非常感谢！
作者: BOSS2011    时间: 2011-12-3 17:04


以前看文献的时候觉得单细胞凝胶电泳挺好做的，可是自己试验了几次，不知道问题出在哪，就是染不上色，由于毕业前还有实验用到SCGE，很是着急，望各位老师给予指导。
刚开始实验的时候由于没有买到十二烷基肌氨酸钠，裂解液里没有这一物质，今天刚试验了加入这种物质后进行电泳，可是结果还是一样，用EB染色之后没看到一个红色荧光。
电泳的时候我把几个载玻片并列一块电泳的，电泳后以用中和液进行了中和。采用了银染和EB染色（2μg/ml），可就是都不显色。
我现在是一头雾水，不知道问题出在哪。请各位老师帮忙分析一下。
谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 17:08     标题: 回复 #461 @STAR@ 的帖子

我做了淋巴细胞凋亡的实验，当时不是刻意去做的，是看了文献后，在我的实验中自己加的内容（和实验关系不大，仅为兴趣使然），淋巴细胞受到电离辐射，诱导凋亡，实验操作与测DNA损伤基本相同，只是在电泳条件的掌握上有所差别，我用的电压是10V，100MA，10MIN，同时也做了其它条件对照，如20V，200MA，20MIN，出来的彗星图像在前者很好！不知道你用什么细胞，不妨可以改变一下电泳条件试试，本专题以前的帖子有凋亡细胞的彗星图像。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 17:08     标题: 回复 #462 BOSS2011 的帖子

有部分文献报道中确没提到裂解液中加SLS的，但我觉得最好还是加的，它有助于对细胞膜的破坏，只是配裂解液时不好溶。
您的问题
1、首先一定要明确胶中是否有细胞！裂解后不妨先用EB染一下看看，或铺胶后就在普通光镜下看看有没有细胞，如果胶中根本没细胞，以后的工作都是做无用功。
2、既然采用了银染和EB染色，应该不是染液的浓度问题了；
3、如果胶中的确有细胞，看裂解是否充分？
4、还有，是否对荧光显微镜的 操作有误？冤枉了染好的细胞？
目前只想到了这几点，再试试看？可以具体介绍一下你的操作步骤........
作者: HP007    时间: 2011-12-3 17:10

我每次把细胞浓度调整到10的4次方个细胞左右，然后和0.5％的低熔点琼脂糖按1：3的体积混合，铺胶。不过还真没在普通光镜下确证过胶里有没有细胞，看来应该确证一下。
操作步骤：
1.铺0.6％的琼脂糖胶，再铺含细胞的0.5％的低熔点琼脂糖胶。刚开始在每层胶铺完后都用了盖玻片，发现揭下来的时候容易使胶不平，后来就没再盖盖玻片。
2.在pH10的裂解液裂解2h
3.在电泳缓冲液中先解旋20min，然后20V，80mA电泳25min
4.电泳完在pH7.5的Tris-HCl缓冲液中中和15min
5.进行银染或EB染色 EB用2μg/ml在每个胶面上滴上1-3滴，染色1min后用蒸馏水冲洗。
6.显微镜观察 由于用的不是本实验室的荧光显微镜，都是他们那边的老师专门操作，应该没有操作上的问题。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 17:11

不过还真没在普通光镜下确证过胶里有没有细胞，看来应该确证一下。

1.后来就没再盖盖玻片。
6.显微镜观察 由于用的不是本实验室的荧光显微镜，都是他们那边的老师专门操作，应该没有操作上的问题。

==================================================================================

1、没盖盖片，你是怎么让胶尽量展开的呢？
6、“尽信书不如无书”，把这句话引用到这来，我可吃过这类的亏呀。如果其它原因都排除了，就应该去怀疑。
作者: HP007    时间: 2011-12-3 17:13     标题: 回复 #466 一叶 的帖子

1. 我是靠转动载玻片把胶摊平的。
还是一叶老师有经验啊，给我的提醒很对，这次铺完胶之后我在显微镜下先确证了一下胶里有细胞，最后染的还可以。可见以前是铺胶之前没把细胞在胶里面混匀。

我还想问一下： 消化下来的细胞在4℃一般能放置多长时间，再做SCGE可以没有问题？
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 17:14     标题: 回复 #467 HP007 的帖子

1、照射1－2Gy足够了，没必要那么大，除非你的实验确需要大剂量照射；
2、如果用一瓶细胞，你的整个实验可能都足够了，是一种“简便”的做法，但我觉得还是每个时相点用一瓶细胞比较好，我以前都是这么做的，没比较过两种做法的区别，所以说话没有足够的依据。
作者: windy+++    时间: 2011-12-3 17:14

请问，彗星试验分析参数彗星总长、尾长、尾DNA含量、尾矩和Olive尾矩等，它们的关系？为什么用它们？做彗星试验评价用哪几个较好？哪个准确？为什么？国内外有没有关于不同指标的论述及相关论文？请各位老师指点。万分感谢！谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 17:15     标题: 回复 #469 windy+++ 的帖子

彗星总长、尾长、尾DNA含量都是可测的。
尾矩：尾长×尾部DNA含量
Olive尾矩：（彗星头部重心与尾部重心间距离）×尾部DNA含量
上述指标均可通过彗星分析软件获得。
哪个好：应该是复合指标（如尾矩和O尾矩）比较好，更准确。因为单一指标在损伤因素强度达到一定阈值后可能会出现平台，超出其描述范围。
尾长、尾矩、Olive尾矩、尾部DNA百分含量在对彗星的描述中应该是很必要的，另外，彗星细胞率也不容忽视。
介绍几篇综述：
Journal of Chromatography B, 1999, 722: 225–254
Single cell gel electrophoresis assay: methodology and applications
E. Rojas, M.C. Lopez, M. Valverde

Mutagenesis. 2003 , 18(1):45-51.
Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop.
Hartmann A, Agurell E, Beevers C, Brendler-Schwaab S, Burlinson B, Clay P, Collins A, Smith A, Speit G, Thybaud V, Tice RR; 4th International Comet Assay Workshop.

Environ Mol Mutagen. 2000;35(3):206-21.
Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.
R. R. Tice, E. Agurell, D. Anderson, B. Burlinson, A. Hartmann, H. Kobayashi, Y. Miyamae, E. Rojas, JC. Ryu, and Y. F. Sasaki

另外，关注一下PL Olive的文章，她们实验室做的很多，有相关指标介绍的。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 17:17


昨天特意做了对照实验，一组裂解液中加SLS，一组不加，电泳后的彗星图像没有什么区别，分析后的数据也没有显著差异，用的是人骨髓细胞，当时没有阳性样品，准备下周用阳性样品再做一下对照实验，看看加不加SLS对实验结果到底有没有影响。
文献报道中，在加不加SLS上没有严格掌握，humana press V291中的protocols提到的SCGE是不加SLS的。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 17:17


第四届彗星分析研讨会讨论了SCGE的方法问题，【the 4th International Comet Assay Workshop (Ulm, Germany,22–25 July 2001) 】
专家组认为加肌氨酸钠是多余的。
（The addition of 1% N-lauroylsarcosine is now considered redundant. ）
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 17:18


今天做一个患者的淋巴细胞SCGE，再对照一下，下午看结果怎么样。
昨天下午没来得及填。
分析后的结果仍然是：彗星图像形态二者无区别，各项指标也无差别！看来以后SLS不必加了，呵呵，又可以省了。
作者: duoduo    时间: 2011-12-3 17:19


一叶老师及各位高手： 年前做了一下预实验，没有观察到细胞DNA（我的试验材料是白色念珠菌，细胞很小 ，很难做！）的荧光点，更别说 彗星细胞了。无细胞的对照片也是繁星点点，和有细胞的片一样，而且点也不是很大，不像各位那种很容易观察的那种典型的荧光亮斑。染色后我也 用清水冲洗了一会（水龙头下流水轻轻冲洗），但还是没有办法把这些背景冲洗掉，我的EB也只是2微克每毫升啊！我感觉很绝望！放置了几个月之后，回过头来想重新做，但不知道如何过这染色关。是否EB溶液用之前需要离心一下呢（把不溶颗粒离下来）？然后到底是在缸里染好呢还是流水冲洗好呢 ？
另外，一叶老师的电泳槽是四面都围起来的，这样电泳时会不会对电流的通过造成障碍呢？
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 17:20     标题: 回复 #474 duoduo 的帖子

1、建议查阅文献看看裂解条件和哺乳动物细胞的区别，这是首先要明确的，否则后面的工作谈不上；
2、背景不干净肯定不是染液的问题，除非你配的染液也有问题。实验流程一定严格掌握，任何可能在你的胶里混入杂质的因素都可能影响染色效果，你的情况可能是杂志着色，但没有细胞；
3、2微克每毫升的EB还能有不溶颗粒吗？
4、应该说染色后的漂洗不会因流水或非流水而影响观察，在染缸里漂洗和用蒸馏水壶轻轻冲洗应该都没有问题的。
5、电泳时电泳液是要刚刚浸没胶板的，根据物理学原理，有没有电流通过，取决于两端是否存在电压降。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 17:20

1、这个问题应该很简单，NMP胶浓度不是问题，问题在于你的胶是用什么溶的？溶解后是否加热到沸腾？明确这两个问题后如果还不行，就是胶的质量问题。
2、去除盖片是技术活儿，但有小窍门的，盖的时候要在边缘给自己留一点可操作余地，凝后轻轻把它拉出来；还有，可以不用盖片，参考血涂片的办法，但不是推，而是拉片，否则容易把底胶推掉，这样铺的胶应该比较均匀；
3、我要赶紧申请专利，想用就掏钱吧，；
4、你提到的裂解、电泳、中和（中和一般在15min）看来没问题，可以把你的图片发过来看看到底是什么原因。
作者: duoduo    时间: 2011-12-3 17:21

一叶老师：再问一个“傻傻”的问题：EB的激发波长是在515～560之间，发射波长是590～615之间吧，也就是在绿光范围（你在前面的回帖里也有说过）。但是为什么战友们发上来的图片都是红色荧光？我自己观察到的确是一些蓝色荧光的非细胞亮斑。这是怎么回事呢？就是没有观察到绿光。
作者: 一叶    时间: 2011-12-3 17:21     标题: 回复 #477 duoduo 的帖子

您所说的“绿光范围”指的是在物镜中发射出来的荧光颜色，而不是激发荧光燃料后细胞所显的颜色。
作者: duoduo    时间: 2011-12-3 17:22

一叶老师:那么肉眼观察到的细胞的颜色（EB染）应该是红色的罗？
作者: duoduo    时间: 2011-12-3 17:23


你看我这样理解对不对:细胞染色后，用激发光激发EB染料。然后染料发射出绿色光，绿色光进入物镜（应该还有其它波长的光），滤光片过滤掉其它杂光，最后从目镜出来的是绿光。（而lq6688老师说：您所说的“绿光范围”指的是在物镜中发射出来的荧光颜色，而不是激发荧光燃料后细胞所显的颜色。）我弄不明白的是，难道激发荧光染料后细胞所显的颜色不是染料的发射光吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 14:26

您没明白我的意思，从目镜看到的当然是染料的发射光，EB的发射光在590nm，属红橙区，所以在目镜应该看到红色荧光的细胞。
作者: abc816    时间: 2011-12-4 14:27

普通的荧光显微镜有三档光，按照波长分为450～490nm,510~560nm和330～380nm,通常，450～490nm波长下的光为蓝色，吖锭橙染色后就再此档下看，细胞为绿色，其他两档光线为绿色，EB染色后，在510～560nm下看，细胞为红色。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 14:28

谈谈铺胶的问题，看看文献，一、二、三层铺胶法都有，毛玻片，光玻片都有，烤胶和不烤胶都有，目的都是不脱胶，只要解决问题，都是可取的，不必拘泥，大家比较常用的现在是两层法，载玻片（毛、光）铺第一层，烤干后可以室温保存，然后铺第二层。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 14:31

请看此帖：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=6148689&sty=1&tpg=1&age=0')
作者: whitesheep    时间: 2011-12-4 14:36

请问,我们用淋巴细胞做单细胞凝胶电泳时,是直接将细胞取出体外加药观察呢?还是得经过一个活化的过程?淋巴细胞一般在体外能存活多长时间?我们加药的浓度和作用时间究竟应该按什么标准做?不要等我们对细胞加药处理12-24小时后,细胞本身都已经死了,而并非是药物的作用
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 14:36     标题: 回复 #485 whitesheep 的帖子

用人淋巴细胞做体外？为什么不做动物体内实验？
我做过人淋巴细胞的体外实验，全血加到RPMI1640培养液中，37度培养，72小时以前还是可以的，以后就不敢保证了。12－24h更没问题。加药浓度和时间如果没有文献借鉴，只能自己摸索了。
作者: whitesheep    时间: 2011-12-4 14:37


我查到一份报告（繁体字）说：我那种药（农药里的一个成分）限制使用浓度是１００００ppm,那么我设置的浓度梯度：5000ppm　7500ppm　10000ppm　12500ppm　15000ppm，跨度会不会过大啊？
谢谢版主老师！！！
我现在大三，院里要求我们马上做ＤＮＡ　ＬＡＤＤＥＲ实验并且自己找药物做彗星电泳检测！！所以很多东西不是那么明白，请原谅！！！
作者: whitesheep    时间: 2011-12-4 14:38


我不清楚为什么不用动物的淋巴细胞做．
是老师要求我们做人体的外周血淋巴细胞的．
作者: 生物迷    时间: 2011-12-4 14:39

您好，我是做植物单细胞凝胶电泳检测的，遵照您提供的方法，我现在能得到较好的图片，不过有个问题是，我的对照中，损伤的细胞太多，约有70－80％，太离谱，具体见以下图片。另外我实验中裂解时间为1.5h, 解链20分钟，电泳20分钟，请帮忙分析一下。

裂解太长了即使没有受到损伤的细胞也出现彗星吗？

图片附件: 41352639.snap.jpg (2011-12-4 14:39, 8.51 KB) / 该附件被下载次数 0
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9523

作者: 一叶    时间: 2011-12-4 14:48     标题: 回复 #489 生物迷 的帖子

实验条件因所用细胞类型不同而不同。
植物细胞的没做过。
预实验摸一下条件吧，空白对照不应该出现那么多损伤率的。
作者: abc816    时间: 2011-12-4 14:49


植物细胞需要破壁，可能是再破壁过程中出现的损伤情况吧，或者电流有点偏大了，建议你将电流调小做下对比。
作者: 生物迷    时间: 2011-12-4 14:49

昨天我重复了一下实验，我在获取植物单细胞悬液时采用的是传统的切片的方法，使植物组织中的细胞在切片时分离收集到PBS缓冲液中，上次实验时我以3000rmp的转速离心后取上清液收集细胞，这次没有离心，而是静置了10分钟
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 14:50     标题: 回复 #487 whitesheep 的帖子

这是预实验要解决的问题。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 14:51     标题: 回复 #492 生物迷 的帖子

离心造成的额外损伤？
还是参考一下abc816的建议吧。
作者: abc816    时间: 2011-12-4 14:53

是啊，离心不可能造成损伤的，可能两次实验其它地方有什么不同吧，重复性不可能这么不好。
作者: 克隆鱼    时间: 2011-12-4 14:54

请问有人知道怎样用银染吗？我们这里没有荧光显微镜，借普通的显微镜可能还方便一些。帮帮忙！
作者: lixi559    时间: 2011-12-4 14:54

您好！我的实验中也准备用到SCGE技术。由于我们实验室没有其他人做过这个实验，刚开始我都不知道该从哪里着手。您的帖子和各位站友的无私奉献让我受益匪浅，真的万分感激！
但是我还是有一点不是很明白，希望能得到lq6688老师和其他站友的指教：在操作中很多步骤要求避光操作，以避免额外的DNA损伤。请问具体是怎么做到避光的呢?我看有文献上用红色或黄色光源，那不是只有晚上做实验了啊？大家有没有更好的方法介绍？谢谢各位了！
作者: 月牙牙    时间: 2011-12-4 14:56


楼上的,我一般就是把片子放到4度冰箱里,这样就可以做到低温避光,
作者: lixi559    时间: 2011-12-4 14:58

您的这个办法用于电泳时很好哟！谢谢！但进行其他操作的时候呢？比如在制备细胞悬液（在无菌间）、与低溶点琼脂混合、铺胶等时候。
作者: 月牙牙    时间: 2011-12-4 14:58     标题: 回复 #499 lixi559 的帖子

我觉得你说的这几种操作不可避免在室温操作,我觉得只要只要细胞培养的时候无菌就可以了,
作者: lixi559    时间: 2011-12-4 14:59     标题: 回复 #500 月牙牙 的帖子

您的这个办法用于电泳时很好哟！谢谢！但进行其他操作的时候呢？比如在制备细胞悬液（在无菌间）、与低溶点琼脂混合、铺胶等时候。
作者: 月牙牙    时间: 2011-12-4 15:00     标题: 回复 #501 lixi559 的帖子

我在用CASP软件分析的时候,经常分析两三个就自己关了,我还没来得及输出数据呢,是不是我的软件不全呢,大家给说说看
作者: qqq111    时间: 2011-12-4 15:01


我今天是第一次配裂解液，发现最后加入肌氨酸钠（我买到的是十二烷肌氨酸钠，不知大家用的什么？）
后溶液（有加热）变为乳白色，不够透明，于是我将溶液过滤，可是溶液粘稠，过滤速度超慢。那位好心的战友能告诉我，你们的溶液有这种情况吗？我认为配方应该没有什么问题啊！
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 15:02     标题: 回复 #502 月牙牙 的帖子

不是软件的问题，可能是软件之间的冲突？
重启一下就好了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 15:02     标题: 回复 #503 qqq111 的帖子

裂解液本身就是高盐和去污剂的溶液。之前小绵羊战友已经提到了，加SLS前最好先把PH值调好，PH值上来后SLS就好溶了，否则很难溶的。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 15:03     标题: 回复 #501 lixi559 的帖子

避光主要是避免来自光源中的紫外线造成的额外损伤，实验室拉窗帘，在红或黄光源下操作应该可以。
作者: duoduo    时间: 2011-12-4 15:04

版主你好！老板要我用脂肪间充质干细胞做一种材料生物相容性方面的体外检测实验，想用单细胞凝胶电泳做遗传毒性检测，能把你的CASP发给我吗？你用的肌氨酸钠效果好吗？我看了几篇文献阳性对照物为MMS（甲磺酸甲酯），网上没搜到，你用什么做阳性对照，我在别人实验室作实验，仅这一实验大约要花多少钱？有便宜的阳性对照试剂吗？回答这么多的帖子，天气这么热，又要做实验，辛苦您了，先谢谢您了！
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 15:21


1、需要CASP，请PM我你的EMAIL；
2、SLS不是必要的；
3、阳性对照可以选环磷酰胺 、丝裂霉素（MMC）、双氧水等，都不贵；
4、实验费用要根据所在实验室而定，看你的工作量了；
作者: 西子    时间: 2011-12-4 15:23


我在用CASP分析图像时发现有不少细胞虽托尾不明显，但尾部DNA百分含量也会有5％－10％，不知你们在统计彗星细胞数是有没有将这些略微受损的也算在内。看到许多文献报道中彗星细胞数都比较多，可我多次实验后发现如果只算明显托尾的彗星数就很难达到报道的高数值，除非毒物剂量比较大。能说说你们的经验吗？
作者: dotaaa    时间: 2011-12-4 15:25

请教各位仁兄，我今天作了小鼠血红细胞单细胞凝胶电泳，但是为什么最后用碱性电泳液电泳后，到染色时发现凝胶都被溶解了，我们用的是0.6％的琼脂糖。请问是什么原因？ 谢谢
作者: dotaaa    时间: 2011-12-4 15:25

看了好多资料，感觉好像是第一层胶的浓度太低了！！
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 15:26


红细胞？
应该不是浓度的问题，电泳液要4度冷的，你电泳后电泳液是否温度太高了？
作者: dotaaa    时间: 2011-12-4 15:26


我是常温电泳，是不是电泳液的PH值太高了，我的电泳液的PH值是13的。
作者: dotaaa    时间: 2011-12-4 15:26

真郁闷，做完了，怎么没有东西。
作者: 铜雀    时间: 2011-12-4 15:27

您好 我做的是一个保健品中药的， SCGE的结果阳性对照结果的彗星很漂亮 但是染了此类保健中药的结果不见彗星只见到大量的凋亡细胞。可以认为此类保健品不引起DNA损伤么 ，大量的凋亡细胞是什么原因造成的？
作者: 园丁##    时间: 2011-12-4 15:30     标题: 回复 #515 铜雀 的帖子

看了你的帖就感觉有问题，用外周血红细胞吗？它是没核的，怎么作呢？呵呵。裂解后还有啥？肯定没东西。
作者: 园丁##    时间: 2011-12-4 15:30     标题: 回复 #515 铜雀 的帖子

肯定不能下此结论！
凋亡也是DNA损伤的一种形式啊。
要看你的凋亡是怎么造成的：染毒多长时间？用什么营养液悬细胞？做没做染毒的阴性对照？
作者: 园丁##    时间: 2011-12-4 15:34     标题: 回复 #513 dotaaa 的帖子

电泳液一定要预冷的；PH值不是问题。
你电泳后有没有电泳液比较热的现象出现？
作者: 铜雀    时间: 2011-12-4 15:35

谢谢园丁##老师的回复 染毒24小时左右（不是精确的24小时）营养液是DMEM
做了阴性对照 但是阴性对照也有不少彗星 ，也就是说我的阳性和阴性对照里面都有见到彗星，惟独染了次类保健品的细胞呈现凋亡和少量的正常细胞。不知道导致凋亡的原因是什么 。原来我的裂解时间是24小时，后来有看到相关文献说裂解时间过长会导致细胞凋亡，裂解最佳时间为3-4个小时，于是我就把时间调整为4个小时，可是结果还是这样：（ 下面是我阳性结果的彗星
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 15:36

如果多次重复实验都是同样的结果，那就有意思了，这保健品也够厉害的了。
为什么阴性对照也出现了那么多彗星？值得考虑，实验过程有什么不妥吗？裂解1.5-2小时够了吧。
作者: lixi559    时间: 2011-12-4 15:38

我现在是作预实验，主要练习实验操作过程，我用的是全血，红细胞无核，但是别的细胞应该有核啊， 我昨天做的用EB染色后在荧光显微镜下看起来怎么是橙色的，而且还很模糊，不知道是显微镜的缘故还是染色剂的残留，感觉好像不是的，染色后用双蒸水清洗两次。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 15:41     标题: 回复 #521 lixi559 的帖子

看看楼上丫丫的照片，很漂亮，应该是EB染的，你的激发光不对吧？
你的背景有可能没有控制好。
作者: hold住    时间: 2011-12-4 15:41

您好!我有两个问题请教，望给予解答，谢谢。
第一，请问你EB染色后的微电泳槽，如何清洗处理后才再次重复利用？
第二，我是第一次做彗星电泳，我用的电泳仪电压条件600V，电流100mA,
电压调到20V时，电流只能达到2-4mA，电泳20分钟，最后竟然也出现了彗星，不知这样或其他（如600V，100mA）的电泳条件下跑出的彗星电泳结果 是否能用？另外不知彗星电泳最初创立时有否高电压、低电流（如600V，100mA，或20V，2-4mA）的实验情况？
作者: lixi559    时间: 2011-12-4 15:41

谢谢老师的回复 我做了三次 三次都是这样的结果 电泳时电压是25V 电流是300mA 不知道哪里有问题。。
作者: lixi559    时间: 2011-12-4 15:43


我以后就裂解1.5-2个小时再看看结果
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-4 15:43

我正在作彗星实验预试，准备用H202做阳性对照组，因为比较经典、易得，我们实验条件也不是很好。查了一些资料，染毒时间各有不同，有5min、20min、30min、1h、2h、4h等等；染毒方式和温度也五花八门；有资料说H202在染毒早期即可造成DNA损伤，有些细胞断裂在1h内达90%修复，3h达97%，还有说某些细胞15min就可修复H202造成的损伤，这样的话我制片的时间就会对实验结果造成影响；不知各位高手如果用H202做阳性对照的话在浓度、时间、温度方面有些什么经验？还有哪些比较明确易得的阳性染毒物？

另外，不同细胞对同一种染毒条件的敏感性也不同，我用现有的人胚肾细胞株感觉效果很不理想，结果不稳定，H202我用到8000umol/L与阴性对照组比也没有明显区别，同样电压下要么都拖尾，要么都不拖尾，比较绝望。有人做小鼠肝、脾、肾细胞原代培养，认为肾细胞的自然拖尾率很高容易影响观察结果。大家能否对细胞的选用方面提些建议，讨论一下？
作者: 铜雀    时间: 2011-12-4 15:44

您好!首先感谢你上次对我的问题的解答，我又有几个问题请教，望给予解答，再次深表感谢。
第一，我咨询过他人EB也可使蛋白质等物质染色，所以我们电泳出来的的彗星如何能确定就是DNA损伤片断形成的，彗星的大小又如何能代表DNA的损伤程度？
第二，为何裂解、解旋及电泳要在4度？
第三，裂解、解旋及电泳要闭光，说是为了避免紫外线对细胞的损伤，那是不是说不一定非在很暗的环境中，只要避开有紫外线的太阳光就可以了？
第四，我看到一个帖子的上说裂解的时间为1.5h或过夜，而你推荐的时间是1.5h，所以我想问一下裂解时间长了对结果有否大的影响？
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 15:44     标题: 回复 #527 铜雀 的帖子

1、先好好看看经典的文献，许多都有SCGE的原理，说的很详细，那时你的第一个问题就解决了。裂解液中是高盐和高去污剂，蛋白质在裂解时会扩散到裂解液中。彗星有许多指标反映DNA损伤程度，最常用的就是尾长和尾矩。损伤越重，彗星尾部的DNA就越多，尾长越长，尾矩也越大。这是SCGE最简单的原理。
2、应该说这个条件的掌握并不是很严格，它的主要目的是在冷的条件下，凝胶固化较好，不容易脱胶。
3、你说的有道理。避光的主要目的就是避免紫外线的损伤。
4、裂解时间长了是会对结果有影响的。部分中性裂解是过夜的，但绝大多数还是1.5-2H之间。为什么过夜我也没搞清楚，抱歉。
作者: 中国特色    时间: 2011-12-4 15:45

看见各位大虾的建议，给你们看看我以前做的单细胞凝胶电泳后照的照片
是小鼠肝细胞的。用甲醛染毒处理后的。

图片附件: 21063874.jpg (2011-12-4 15:45, 19.23 KB) / 该附件被下载次数 4
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作者: BUK    时间: 2011-12-4 15:46

您好!首先万分感谢你上两次对我的问题的解答，我又有几个问题请教，望给予解答，再次深表感谢。
第一，我一直想看到SCGE的原理的经典文献，但未找到，麻烦老师给予具体的指点哪儿有SCGE原理经典的文献或E-MAIL给我一些资料。
第二，我的电泳液用的是中性的，电压20-30V时，电流只能达到2-6MA，换成碱性的电泳液后电压20-30V时，电流可达到180-200MA，不知中性电泳液电压20-30V时，电流能否达到100MA以上的大电流？是否与电泳仪有关？是不是SCGE需要专门的低电压、高电流的电泳仪？还是只要电压电流的标示范围分别达到SCGE要求就可以了？
第三，我在25V、4MA、中性条件下跑出了明显的彗星，不知能用否？因为我的条件与大家的都不一样。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 15:46     标题: 回复 #529 中国特色 的帖子

AO染的？绿色荧光很漂亮。背景也很好
作者: 小螺号    时间: 2011-12-4 15:47

这是我在25V、4MA、中性条件下跑出了明显的彗星，不知能用否？因为我的条件与大家的都不一样。

图片附件: 25546426.snap.jpg (2011-12-4 15:47, 12.28 KB) / 该附件被下载次数 3
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作者: 小螺号    时间: 2011-12-4 15:47

2~~~~~~~~~~~~~~

图片附件: 96277002.snap.jpg (2011-12-4 15:47, 11.33 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9526

作者: 小螺号    时间: 2011-12-4 15:48

这是我在25V、4MA、中性条件下跑出了明显的彗星，不知能用否？因为我的条件与大家的都不一样,电流上不去,才4MA,是不是中性条件下电流就是这样低,还是和电泳仪有关?不知abc816老师做过中性条件下的电泳否?望给予解答,另外麻烦老师给予指点一下哪儿有SCGE原理经典的文献,传上一些或E-MAIL给我,非常感谢!

图片附件: 13575172.jpg (2011-12-4 15:48, 17.02 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9527

作者: 一叶    时间: 2011-12-4 15:48     标题: 回复 #534 小螺号 的帖子

你的pic不错呀，应该可以用的，我当时做中性的时候电流也很小的，结果也不错。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 15:49

你的pic是40×拍的？密度再调低点会更好吧？重叠比较多。另外背景有点亮了。
作者: 小螺号    时间: 2011-12-4 15:49

您好!我的pic是40×拍的,细胞密度是有点高了,不知老师1.5cm见方的微电泳槽大约加多少细胞?另外我用的EB的浓度是3微克/毫升,1个槽用滴管加2-3滴,是浓度高了还是加的量多了?望赐教。
作者: abc816    时间: 2011-12-4 15:50

照片挺好的，就是染料加多了，加一小滴就ok了，而且要冲干净。
电流上不去没事的，影响不大。
相关的文献可以在彗星网站去找，网址在前面的帖子中，都是比较经典的。
作者: 蒲公英    时间: 2011-12-4 15:51

我也作彗星试验，我有几个问题请教：1，我做碱性电泳，裂解液中没有肌氨酸钠，因为我看有些老外的文章中没有提到这个试剂，现在很犹豫！2，我做的是肝细胞彗星试验。脱胶问题一直难以解决，我看你发言中自制得微电泳槽，能不能贴张图，大家分享一下，谢谢。还有就是我也请教过其他搞这方面的专家，他们说胶浓度大一点[1%],可以贴牢，我试过了，效果还可以，但是部分还是容易脱胶，不知道胶浓度大了会不会影响彗星试验的结果。3，我用的染料是sybr green 1,昨天刚做了一次，结果在荧光显微镜下什么都没看到，[三个滤光片都用过了]. 问一下师兄有没有用过这个染料。看还有没有效果还行低毒的染料，因为我们在别人的实验室测，人家有意见！：]
4，问一下师兄，在荧光显微镜下，可见光条件下能否看到裂解细胞得轮廓阿，昨天，在片子里什么都没找到。。晕！期待您的回复！谢谢！！
作者: tianmei001    时间: 2011-12-4 15:52

我想请教您一个问题，我做的裂解液是pH10的不含肌氨酸钠的溶液。我看资料上有的裂解液加肌氨酸钠，有的没加，像我的这种PH10的裂解液应该加这个试剂吗，若加的话，应加多少阿?能不能具体的配方法发一份。谢谢阿。还有我看您前边说到；中性电泳是针对双链DNA损伤的。能不能具体介绍一下这个咚咚阿，以前没有考虑过这个。他跟碱性电泳的具体不同之处能不能介绍一下啊，期待您的回复！
作者: tianmei001    时间: 2011-12-4 15:52

首先纠正我的pic是20×拍的；其次非常感谢你百忙之中发来得文献！
作者: @STAR@    时间: 2011-12-4 15:52

您好，您的图片我看到了，的确漂亮，什么染的阿，能不能留个联系方式交流一下，小弟现在因为这个实验的染料正郁闷呢，想让你指导指导，期待您的回复！谢谢
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 15:53

1，我做碱性电泳，裂解液中没有肌氨酸钠，
2，肝细胞彗星试验。脱胶问题一直难以解决，我看你发言中自制得微电泳槽，能不能贴张图，大家分享一下，谢谢。还有就是我也请教过其他搞这方面的专家，他们说胶浓度大一点[1%],可以贴牢
3，染料是sybr green 1,在荧光显微镜下什么都没看到，[三个滤光片都用过了].
4，问一下师兄，在荧光显微镜下，可见光条件下能否看到裂解细胞得轮廓阿，昨天，在片子里什么都没找到。。晕！期待您的回复！谢谢！！

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1、肌氨酸钠不是必要的；
2、稍晚些时候我会帖上来，其实abc816已经帖过的；
3、试试AO，或EB，注意防护是没问题的；
4、这个我没试过，裂解后、电泳前倒是可以染色先看看有没有，这我试过，能看见裂解后细胞。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 15:54

裂解液加肌氨酸钠，有的没加，
中性电泳是针对双链DNA损伤的。他跟碱性电泳的具体不同之处

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1、肌氨酸钠没必要加的，可有可无，对结果没有影响；
2、碱性SCGE检测到的既包括单链断裂也包括双链断裂，今天时间有限，只能说这么点了，有时间你可以看看这方面的文献。
作者: caihong    时间: 2011-12-4 15:54

那位大哥指导被丫啶橙污染后的仪器该怎么去毒阿，急需，谢谢。。。。
作者: 白白的    时间: 2011-12-4 15:55

我做的彗星图象很怪,能帮我分析一下原因吗?以下两张图是我用淋巴细胞做的图:解旋后直接染色,没电泳,为什么核周围有这么大范围的光晕呢?我仿照l一叶老师的槽子做的,但盖了三层胶，胶是问题吗?最早时我用毛玻片盖三层胶法,光晕也很大.

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作者: 白白的    时间: 2011-12-4 15:56


下面这张用成像系统拍摄时消了一下背景.焦距可能调的有点问题,不太清楚

图片附件: 64278276.jpg (2011-12-4 15:56, 10.05 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9529

作者: 白白的    时间: 2011-12-4 15:56

这是未染毒淋巴细胞在18V、30min跑出的电泳图，有几个问题：1、为什么会拖尾呢？2、这种形状和经典彗星图象不一样 3、光晕影响很大、用彗星软件似乎不能分析。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9530

作者: 白白的    时间: 2011-12-4 15:57

以下三张图是25V、40min未染毒淋巴细胞的电泳图：尾拖的更长，这三张我用电脑成像系统依次减少曝光时间,结果最后一张看上去竟像凋亡

图片附件: 67901876.jpg (2011-12-4 15:57, 13.53 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9531

作者: 白白的    时间: 2011-12-4 15:57

第二张

图片附件: 94142866.jpg (2011-12-4 15:57, 10.62 KB) / 该附件被下载次数 2
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作者: 白白的    时间: 2011-12-4 15:58


第三张,本来我减少曝光时间的目的是减少光晕影响,想用彗星软件分析,但测定下来这三张的各指标肯定是不同的

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作者: 白白的    时间: 2011-12-4 15:58

光晕怎样才能减掉呢?是怎样形成的呢?起初我用T293、3T3都做过，不染毒也拖尾，甚至在15V以下，以为是细胞的问题，可换了淋巴细胞还是这样，做不出一叶老师的图象，做了几个月了，不知道原因在哪里？
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 15:58     标题: 回复 #552 白白的 的帖子

我认为出现晕圈应是正常现象。但正常细胞出现那么大的尾部，很难理解。你的彗星图像就是典型的凋亡。实验过程出现问题了吧？新鲜血？解旋时间？电泳20Min够了。
作者: 白白的    时间: 2011-12-4 15:59

晕圈是怎样形成的呢?这很影响软件分析的。我用新鲜血,20min解旋，电泳20min一样拖尾，短点而已。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 15:59     标题: 回复 #554 白白的 的帖子

裂解液什么成分？？？？？
作者: 白白的    时间: 2011-12-4 16:00     标题: 回复 #555 一叶 的帖子

是碱性凝胶电泳,和咱们论坛中的一样,NaCl 2.5M,EDTA-Na2 100mM,Tris 10mM,NaOH溶解,调PH=10,没有肌酐酸钠,用前加10%DMSO 和1%Ttriton-100.lq6688老师,我昨天试了一下中性电泳,和您的彗星图象一样,尾是尖的,同时用同一批也做了碱性电泳,还是我上面贴图的老样子，一叶老师,您说自己没做过碱性,不如您试试,看能否跑出我这种大尾巴图.
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:00     标题: 回复 #556 白白的 的帖子

我最近一直在做碱性的，空白对照从没有出现您这样的结果。
谈谈您的实验过程吧。
作者: 白白的    时间: 2011-12-4 16:01     标题: 回复 #557 一叶 的帖子

3T3、T293细胞我是自己培养的，淋巴细胞是急性分离的。消化后离心1000r/min,5min，PBS重悬放在冰浴中，在37度水浴箱中和1%的低熔点琼脂糖1：4混匀，铺胶采用您推荐的方法，但盖了第三层胶，凝固后裂解1.5h，解旋20min。用中性电泳显示我的细胞拖尾。我还尝试了用中性裂解液裂解，用碱性电泳液解旋电泳，跑出来还是大尾巴。因为我的细胞全是这个样子，我觉得不是凋亡，否则不可能传代。在中性电泳中，在大片拖尾细胞的背景下，只有个别细胞呈现凋亡图象，但到了硷性电泳中，这些拖小尖尾巴的细胞就全变成上面的样子了。
作者: 白白的    时间: 2011-12-4 16:01     标题: 回复 #557 一叶 的帖子

我是不是应该把所有的试剂换一批？
作者: 阿敏    时间: 2011-12-4 16:02

我也是近段时间要开始做彗星电泳了，目的是检测农药的遗传毒性，刚开始觉得彗星电泳已经作了这么多年了，没什么创新性了，可关于遗传毒性的实验方法却一直没有很好的，我查了查资料，初步选择碱性电泳（可检测单双链断裂和碱不稳定位点），中性电泳（可检测双链断裂），pH12.1电泳（可检测单双链断裂），用这几种方法，然后对实验结果进行简单加和，同时用彗星电泳检测损伤的修复，不知道行不行的通阿，请各位大侠指教，谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:02     标题: 回复 #559 白白的 的帖子

是啊，有时是很郁闷。
看过程没什么问题，实在不行就换试剂。从0 开始。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:03     标题: 回复 #560 阿敏 的帖子

是啊！我们在做什么？我们在想什么？我们怎么了？呵呵。
SCGE还有一个很大的问题就是标准化。

当然可以呀。
作者: 969    时间: 2011-12-4 16:03

老师您好:我马上要开始彗星试验的预试验了,看到您的帖子让我受益匪浅,写得相当棒!在丁香园确实能感觉到一种相互学习\提高的氛围.
但 学生仍有几个问题想请教一下:
1.我看到您自己做的微型电泳漕,确实相当有创意,我有个问题就是,需要做多少个这样的载玻片才能够用（假设做200份人血清淋巴细胞的试验）您用的是什么牌子的胶粘得?
2.学生刚接触这个实验方法,能否问一下,一天能做多少份血?在不熟练操作的情况下. 另一个就是,要做200份血清需要做一段时间,这其中的淋巴细胞怎么保存为好?我看到帖子里有用4c保存，也有用液氮保存。您能否给个建议？
3.实验中设阳性对照和阴性对照，以什么试剂为好？双氧水可以吗？-阳性
4.在凝胶中的细胞密度控制方法用哪一种？需要牛鲍计数板吗？是不是太麻烦了，版主是怎么控制细胞密度的？
作者: yychen    时间: 2011-12-4 16:04

好长时间没做了，今天做了怎么出来这样的结果，全是长长的尾巴，我用的是小鼠的新鲜肝脏做的，是糖尿病小鼠，碱性电泳， 时间20min，电压25 V

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作者: yychen    时间: 2011-12-4 16:05

今天做的全是长尾，而且也不怎么清楚，不知是什么原因？

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作者: 泡泡    时间: 2011-12-4 16:05

您好!有个问题请教,望回答。
我用荧光显微镜自带的成像系统拍的彗星照片TIF格式,大小是21MB,输入CASP分析软件后,分析框中不能显示图象,也不能分析,不知为何?将其通过ACDsee软件转换为JPG格式（400K），然后再将JPG格式（400K）转回TIF格式，其大小变为8.07MB，输入CASP分析软件后,分析框中能显示图象,也能分析,只是图象面积很大，一个窗口只能显示一个彗星的一部分，分析起来非常不方便，望老师帮助分析一下原因。谢谢！
作者: tieshazhang    时间: 2011-12-4 16:06

实验中碰到好多问题也有经验想和大家分享。今天看到有有人在讨论可真高兴，赶快问几个问题，希望大家帮助分析！
1、试验中是否应该控制一彗星率？
2、在拍照时应该挑彗星来照后分析，还是每个视野所有细胞都纳入？
3、荧光显微镜是别的实验室的，可我做完实验总是在下午，我把片子放在 无水已醇中过夜，第2天观察彗星还可以，不知这有没有问题？
4、为什么镜下很清楚但是用图像采集系统照下来就不清楚了？尾巴都看不清了！该怎么办呀？图像不好就没发分析了！我看有用数码相机照的是不是比那清楚？怎么照就是对在目镜上吗？
5、SLS不是必须的，我加和不加结果基本一样～！
6、实验一定需要阳性对照吗？我看文献为什么都没提呢？
7、对了我用GENE FINDER染的片子，效果也很好，而这种染料是无毒的，我们学校都用这种替代EB了！
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:07     标题: 回复 #566 泡泡 的帖子

呵呵，把您的图像大小改一下就可以了21M的TIF太大了，不是不能显示图像，而是图形过大，你没找到有彗星的部分，直接把TIF 格式的图像改成400×300就可以，就用你的ACDsee软件。不过要保证所有的实验都用这个大小，保持一致。
作者: DNA    时间: 2011-12-4 16:07

您好，我想请您帮我分析一下我的图片是不是核酸的电泳图片，我担心是不是毛玻璃的反光亮点阿。谢谢。这是一张大的图片，好像是十倍的。
作者: DNA    时间: 2011-12-4 16:08

40倍的。望解答！谢谢

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作者: DNA    时间: 2011-12-4 16:08


四十倍的

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作者: 园丁##    时间: 2011-12-4 16:08

谈一点我所知道的经验:
1.分析方法是随机选视野拍照,计数200个细胞,算其彗星率,然后选有彗星的细胞20个分析、比较。前面的帖子好象有更详细、确切的说法。
2.若当天照不完片子，我的经验是跑完电泳后，滴上1-2滴甲醇固定上，可慢慢拍，1-2天内没影响。
3.镜下很清楚但是用图像采集系统照下来就不清楚，你可以调一下拍照软件的调节背景、颜色等功能试试，应该效果很明显的。用数码相机照相机的话，你的照相机的机身接口需与显微镜连图像采集系统的接口能吻合上才行，有图像采集系统我觉得没必要用数码相机照相机。
4.我的观点：实验阳性对照不一定必须，但阴性对照是一定要的，若阴性对照出现了明显的彗星（超过自然发生率），则说明你的实验过程中对细胞增加了额外的损伤。当然有了阳性对照，若阳性对照都跑不出彗星则说明你的实验出了问题。我的观点不一定正确，大家共同讨论。
作者: loli    时间: 2011-12-4 16:09     标题: 回复 #572 园丁## 的帖子

我还想问（1）我们计算彗星率在最终统计中有什么作用？也是一项比较指标吗？（2）甲醇和乙醇都是挥发的只是滴上会不会干了？你是说染完色滴甲醇吗？我都是跑完放在乙醇里泡着，照时现染色，提前染荧光会不会衰退？（3）我是做肿瘤细胞照射，如果先消化制成单细胞悬液后再照可以吗？我看文献还有铺完胶再给片子中细胞染毒再跑电泳的，这种方法很省细胞但不知道行不行的通？
作者: 园丁##    时间: 2011-12-4 16:10     标题: 回复 #573 loli 的帖子

1.彗星率也是一项比较指标。
2.我是跑完后就滴甲醇固定，甲醇挥发不影响，若怕太干可在饭盒里铺上纱布倒上蒸馏水浸湿，玻片放在纱布上，拍片前染色，提前染荧光可能会会衰退。
3.你是做肿瘤细胞照射，不知是照射X线、电子线、紫外线？若照射后几小时就跑电泳，我认为消化制成单细胞悬液后再照可以，但若照射后还要培养几天，则不宜消化制成单细胞悬液后再照，因为照射可能影响细胞贴壁、继续生长。铺完胶再给片子中细胞染毒再跑电泳的，这种方法可行，我有各同学现在就在这样做。
作者: loli    时间: 2011-12-4 16:11     标题: 回复 #574 园丁## 的帖子

感谢您的慷慨解答，由于我们这边没有做彗星实验的，我是从零开始，所以遇到很多问题，不过还好，有这里的战友！我先把这几天的收获实践一番，如果有问题再来请教！
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:11     标题: 回复 #574 园丁## 的帖子

补充一点点：
4、既然有图像采集系统，应该在屏幕下调好它的清晰度才拍吧，镜下清楚不一定在你的屏幕下就一定清楚！数码相机也是一样。
5、是啊。
7、是个好消息，我也试试，是无毒的？
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:12     标题: 回复 #571 DNA 的帖子

第一张40倍的象是细胞，第二张不大象。
作者: DNA    时间: 2011-12-4 16:12     标题: 回复 #577 一叶 的帖子

我写错了，第二张不是四十倍的，我记不得是多少倍的了。用激光共聚焦显微镜照的。是鸡的血细胞和肝细胞在一块混着做的。鸡的血细胞有DNA.所以就没细分开。那张十倍的图片是不是阿？三张图片的细胞没有进行损伤处理。直接用正常鸡的细胞做的。望再解答一下，谢谢！
作者: loli    时间: 2011-12-4 16:12


GENE FINDER是无毒的就是比EB贵点，50微升180元，不过是1：1000稀释，也能用很长时间了，激发出来是绿色的荧光。还是不错的！最重要是无毒呀！

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作者: abc816    时间: 2011-12-4 16:13


照片的焦距没有对好。
注意：是用相机和你的图片对焦，并不是眼睛和显微下的图片。
作者: loli    时间: 2011-12-4 16:14

文献上说裂解液中曲拉通和二甲基亚砜要用前现加，电泳液要新鲜配制使得我每次实验时上午就只能配液，下午跑完电泳就太晚了，不能看结果（显微镜是别人实验室的）。我想问，裂解液中的这两种东西和电泳液我可以提前一天晚上配出来放在冰箱里保存，第二天直接用吗？如果可以最长我可以存放多长时间？请各位战友帮忙解答！谢谢！
作者: abc816    时间: 2011-12-4 16:14     标题: 回复 #581 loli 的帖子

可以提前配好，但是曲拉通和二甲基亚砜用前在加，并且必须保证你的裂解液完全融解。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:15

我每次实验时上午就只能配液......

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不至于吧！？
作者: loli    时间: 2011-12-4 16:15

不至于吧！？

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是真的，我在自己科里养细胞，治疗室照射，在医院实验室电泳，再到另一个实验室看结果。这一天腿都溜细了。实在不容易呀！
作者: @STAR@    时间: 2011-12-4 16:16


看了群里的介绍确实受益非浅，少走了很多冤枉路，今天我又作了彗星实验，显微镜看下来，觉得要把一个视野下的细胞全部调清楚好像比较难，有些清楚，有些糊，再调一下，清楚的又变糊了，总觉得细胞不是在一个层面上的，这样拍下来的照片很影响分析，不知道是什么原因，请大家帮我分析分析吧！
作者: abc816    时间: 2011-12-4 16:16


有细胞的那层胶铺的太厚了。
作者: HP007    时间: 2011-12-4 16:17

我现在也在做单细胞凝胶电泳，在这个网站上获取了不少宝贵的知识，帮了不少忙，先谢谢了，但是现在有个问题，每次结果都是在胶的边缘可以看到很多的彗星细胞，但是在胶的比较中间的位置，却几乎看不到细胞，我想问这是为什么啊，是不是铺第二层胶的时候，胶的浓度太大了阿，我用的是50%的低熔点叫75微升和10位升细胞悬浮液混合的，还有请问大家用的电泳槽是什么样的啊，普通的水平电泳槽就可以了吗，我的在25v电压的时候，很难达到300mA的电流啊。请老师多多指教。
作者: loli    时间: 2011-12-4 16:17

还有请问大家用的电泳槽是什么样的啊，普通的水平电泳槽就可以了吗，我的在25v电压的时候，很难达到300mA的电流啊。请老师多多指教。

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电泳就是用普通电泳仪，你的问题我也碰到过，可是把我难坏了！问题出在电泳液上！不能用0.5％TBE，那样电流肯定上不去，你可以用12克NAOH，0.375克EDTA加1000ml去离子水配，把电流调好，不用管电压，然后用调整液面来调整电压。就OK了！
作者: HP007    时间: 2011-12-4 16:18

我用的是50%的低熔点叫75微升和10位升细胞悬浮液混合

这个低熔点胶的浓度太大了吧！
作者: flower-201    时间: 2011-12-4 16:18

实验室打算专门买一个电泳仪用来做单细胞凝胶电泳，请问各位用的都是什么电泳仪啊，是那个公司的啊，型号呢？
谢谢啦
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:22

电泳就是用普通电泳仪，你的问题我也碰到过，可是把我难坏了！问题出在电泳液上！不能用0.5％TBE，那样电流肯定上不去，你可以用12克NAOH，0.375克EDTA加1000ml去离子水配，把电流调好，不用管电压，然后用调整液面来调整电压。就OK了！

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那要看做什么条件，中性电泳是不能用碱性裂解液的。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:22

实验室打算专门买一个电泳仪用来做单细胞凝胶电泳，请问各位用的都是什么电泳仪啊，是那个公司的啊，型号呢？
谢谢啦

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BIO-RAD很好了，比国产的贵点。
作者: loli    时间: 2011-12-4 16:23

中性电泳除了之前铺胶步骤和碱性电泳一样外，裂解液一样吗？电泳液怎么配制？电压电流又是多少？能否详细解答？谢谢！
作者: HP007    时间: 2011-12-4 16:23

请问电泳槽有专门用来做彗星试验的吗，还是普通的就行啊，我试了一下铺胶的时候，第二层胶用50%的LMA和50%的细胞混悬液混合后铺胶，是碱性电泳，但是300mA的电流条件下，电泳一小时后，在显微镜下不能看见细胞，怀疑是第二层胶掉了，请问，老师在做的时候一般第二层胶的浓度是多少阿，和细胞混匀的比例是多少啊，谢谢啦。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:24

中性电泳除了之前铺胶步骤和碱性电泳一样外，裂解液一样吗？电泳液怎么配制？电压电流又是多少？能否详细解答？谢谢！

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裂解液当然不同，PH值也不同，主要有两种配法：
1、Na2EDTA.2H2O(30mM), 0.5%SDS, 蛋白酶K(10mg/ml,可选)， 用前加1% TritonX-100, 10% DMSO， PH=7－8.0
2、2.5M NaCl, 1% N-sodium lauroyl sarcosinate可选, 30mM Na2EDTA.2H2O, 10mMTris, 用前加1% TritonX-100, 10% DMSO，PH=7－8.0

电泳液：TBE电泳液
Tris Base or Tris HCl(90mM), H2BO3(90mM), Na2EDTA.2H2O(2mM), PH=8.5

电压电流在本专题前面的帖子提到过了。

其实这些东西都可以在文献中找到答案！
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:24     标题: 回复 #594 HP007 的帖子

SCGE用普通电泳槽就可以了。
LMA浓度太高了吧，应该是0.5％，比例一般是0.5％的LMA：细胞悬液＝3：1，细胞悬液浓度在1×105/ml左右。
作者: one    时间: 2011-12-4 16:25


为什么我的CASP软件不能选择分析的范围?

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作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:26     标题: 回复 #597 one 的帖子

打开软件后按住左键拉开便有分析框，你肯定是没按住，框太小。
您这样的图片质量没法分析。
作者: one    时间: 2011-12-4 16:27


一叶老师：
细胞悬液浓度在1×105/ml左右这个如何算出来的，我是用细胞计数板数的，大概10ul充池，计数四个大方格的细胞数，大概每个方格多少细胞是1×105/ml呢？
另外我的细胞作出来都不大亮，而且有些毛边，我没有用肌氨酸钠，是不是这个原因？

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作者: abc816    时间: 2011-12-4 16:28


那个大东西不是细胞，是染料颗粒，小点点才是细胞。
作者: ffooll    时间: 2011-12-4 16:28

细胞计数板每个大方格的面积为:1 mm2 ，深度为0.1 mm,容积为1 mm2 x 0.1 mm=0.1mm3=1.0 x 10-4 ml。则每ml 悬液细胞数目=(4个大方格的细胞数之和/4) x 104。
注意事项:1.取样计数前,应充分混匀细胞悬液,在连续取样计数时 ,尤其注意这一点；
2.镜下遇到2个以上细胞组成的细胞团,应按单个细胞计算.若细胞团占10%以上,说明消化不充分,应考虑重新消化吹打制悬液；
3.细胞压中线的,只记左侧和上方者,不记右侧和下放者;
4.每个大方格的细胞数少于20个或多于50个时,说明稀释不当,需重新制备稀释悬液、计数。
作者: one    时间: 2011-12-4 16:29     标题: 回复 #601 ffooll 的帖子

那大的那种是染料颗粒的话，是染液有问题吗？麻烦指教
作者: 二丫头466    时间: 2011-12-4 16:29

打开图片窗口载入单凝图片后，你的鼠标在图片上的第一次点击就会自动生成一个分析框的，所以需要按住鼠标左键拉出分析框，此框可调节大小。如果只是随意的点下鼠标，出现的就是你那种图片框，这种框是不能调节大小的，换别的图片此框也不会改变。只有重新打开casp，重新载入图片。
初涉单凝，在这里收获很多，谢谢大家。
作者: ffooll    时间: 2011-12-4 16:30     标题: 回复 #602 one 的帖子

我也出现过这种情况,考虑可能的原因是：
1.收集的标本细胞碎片等杂质太多,其中部分碎片含有DNA成分,如果是这种情况,则较大的碎片也会出现慧尾；
2.低熔点及正常熔点琼脂糖熔解不充分,残留有琼脂颗粒(但也别熔解过头,否则琼脂变糊或浓度变高影响DNA的泳动),但看你的照片背景并不红,所以这种可能性不大；
3.染液的问题:浓度太高或溶解不充分；
4.其他原因；
5.以上多个原因的综合作用。
以上仅是我个人的看法，有道理否请各位站友讨论指正。
作者: TAT    时间: 2011-12-4 16:30     标题: 回复 #603 二丫头466 的帖子

我发的照片确实是个大染色颗粒,不是细胞,旁边的小点是,不要见笑呀
作者: 缘yuan    时间: 2011-12-4 16:31

一叶老师您好: 这些天做了一些彗星实验,但有部分不成功想请教您!
我用彗星实验检测铝致小鼠睾丸细胞的损伤与凋亡。损伤彗星结果算成功，但凋亡一直也没有检测出来。两个实验步骤都相同，只是电泳条件不同而已。按各位老师所说的，我把电压和时间均调低跑的凋亡，但细胞几乎没有尾巴，更看不到凋亡形状的慧尾。
想请教老师是那里可能有问题
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:32     标题: 回复 #606 缘yuan 的帖子

如果多次重复实验总是此问题的话，是否考虑调整实验方法。
如：检测损伤采用一种染毒条件，而凋亡采用另一种染毒条件（剂量、时间、浓度等等）
作者: zhezhe    时间: 2011-12-4 16:33

老师,我想请教一下
彗星试验中,我是选择100个细胞计算拖尾率,然后选其中的30个计算尾巴长度,这样得出的结果有一个均数和标准差
然后我每个处理设置5个重复,那么最后得拖尾长度应该怎么表示,因为1个样品得到的不是一个固定数值(有均数和标准差,如第2段所说的)
想了好久想不通,结果应该怎么表示?
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:33     标题: 回复 #608 zhezhe 的帖子

这个问题在本专题前面的帖子提到过的，其实是统计上的问题，一，可以把5个放在一起处理，100×5＝500个，给出一个均数和标准差；二，5个已经得到的均数再计算均数和标准差。
作者: 了了    时间: 2011-12-4 16:34


刚开始做单细胞凝胶电泳，用普通载玻片做了几次，脱胶的现象很严重，哪位知道哪里有毛玻璃卖的，谢谢！
看了一叶老师做的微量电泳板
感觉很好，就是脑子比较笨，没看明白怎么做。能否寄个样板给小弟。不胜感激！
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:35     标题: 回复 #610 了了 的帖子

做SCGE需要的片子不多，定购毛玻片是要达到一定数量的，否则厂家不给磨，我手里有少量毛玻片，也是托人给磨的。
微量电泳板其实做起来很简单，只是看你是否愿意下功夫了。
作者: bohe221    时间: 2011-12-4 16:35


我的论文也是做彗星试验的，由于是我们试验室共同摸索出来的,所以就一直沿着自己的路线走了
现在已经毕业了,突然想想以前的匆忙也该停止了,就进来看看了,收获很多,对自己的薄弱之处有了更清楚的认识
谢谢大家,原来我以前都没有接触过CASP这个软件的，现在我自己也想试用了
作者: bohe221    时间: 2011-12-4 16:36

有专门出售毛玻片的产家,我们实验室就是使用这种玻片的.是我们的一

个老师联系的,价格也不贵.不过数量可能是要达到一定,我们是买了50盒,就是

一小箱,500多元,可以长期使用的.
作者: glass    时间: 2011-12-4 16:36

各位大侠，我想请教一下，各位在跑电泳时是怎样满足4摄氏度和避光的？是放在冰箱里吗？肌氨酸钠很难买到，十二烷基肌氨酸钠行不行，因为我在前面的帖子里看到有人用。谢谢啦！
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:37     标题: 回复 #614 glass 的帖子

避光比较容易做到，温度：电泳液提前在4度冰箱预冷就可以了。
就是十二烷基肌氨酸钠，不加也是可以的。
作者: bohe221    时间: 2011-12-4 16:38

避光我们实验室就是在大培养皿的上面用深色的纸张遮盖
做的过程中,同时避免室内亮度
作者: bohe221    时间: 2011-12-4 16:38

一叶 老师:

您好!
论坛的第一页有写到, 浓度的设置问题, 引起损伤的最低浓度,和半数致死浓度.
对照组也有彗星的出现,那么这个最低就是与对照组有统计学上差异的最低.
而半数致死浓度呢,是出现彗星细胞的拖尾率为50%的时候的浓度吗
作者: glass    时间: 2011-12-4 16:39


谢谢大家。另外我想问一下，有一篇文献上说银染法也比较灵敏，而且无污染又便宜，可以在普通显微镜下观察，可为什么用的人那么少呢？可不可以用银染法代替EB染色呢？还有，可不可以介绍几篇用CASP软件分析的彗星电泳结果的文献，谢谢了。
我这里还有一篇关于彗星电泳的硕士论文，有需要的可以说一声。呵呵
作者: bohe221    时间: 2011-12-4 16:39

可以查到2001年和2003年有3篇文章说明了银染法对彗星实验的染色效果,也都是同个作者的(赵蓉和衡正昌).
首先,试验都是针对碱性 凝胶电泳进行的, 通过筛选,对比几种银染法,有得出一种适合染色,详细配方也有给出(2003,杂志:卫生研究), 同样对染色的步骤的最适合条件进行了研究
其次，作者说明了采用干胶片的方法,解决了磨砂片在银染条件下的不足
在那篇文章中的最后一句, 说了银染法完全可以取代EB染色法.
可是在另外一篇文章中,2003年,杂志:卫生毒理学杂志; 那篇结果说了染色结果未达到最佳, 需要进行改进;那个方国卫的银染方法同上面文献的银染方法有点不同
所以我想, 如果要用银染法就用(赵蓉和衡正昌, 2003,杂志:卫生研究)这篇文章的
我还没有用过, 可以的话, 更方便了,避免了EB的毒性, 又可以用普通光学显微镜
我的个人观点是: 可以尝试, 毕竟新的东西都需要靠实践慢慢推广的
作者: windy+++    时间: 2011-12-4 16:40

一叶老师好：我现在也在做彗星试验，正在用casp软件做分析。我下了您提供的文章，读过后对软件的用法了初步的了解，但是它上面说分析前要对阈值调节，我就不知道以什么标准来调节了。还有分析结果在哪个范围内算是基因损伤？有没有这方面的资料可供参考？希望得到老师的指导。
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-4 16:40

一叶老师您好！我做SCGE用荧光显微镜看的时候，如果不加滤光片背景就会有很多蓝色荧光，但是细胞看的还很清楚，照下来就不好看，加590nm的滤光片背景就会发红，一片一片的红。是什么原因啊？我染完EB后没有冲洗，但是以前做也没有发现这种情况，最近总出现。谢谢指点！·
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-4 16:40


问一个比较弱质的问题，
我这几天也开始做了。我做的是虾的肌肉的，但是我总是做不好但细胞悬液。不知道各位有没有做组织的细胞悬液的战友。
请大家提供一些信息谢谢了
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:41

我的个人观点是: 可以尝试, 毕竟新的东西都需要靠实践慢慢推广的

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以前见过银染的文章，国内外都有，避免了EB，而且对显微镜的要求比较低，确是个优点，但我个人认为也存在一些问题，尾长这个指标比较容易做到，尾矩就不太容易了，它要用到强度指标来判断DNA的分布情况，银染法很难判断强度。
目前各大图像分析公司做的SCGE软件都是针对荧光染色的，针对银染法的估计还有困难。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:42

一叶老师好：我现在也在做彗星试验，正在用casp软件做分析。我下了您提供的文章，读过后对软件的用法了初步的了解，但是它上面说分析前要对阈值调节，我就不知道以什么标准来调节了。还有分析结果在哪个范围内算是基因损伤？有没有这方面的资料可供参考？希望得到老师的指导。

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软件安装好后在安装目录中有使用说明。
基因损伤这个问题很笼统，如果损伤定位在某个基因的话，就要用到FISH-SCGE了，用某个基因的探针标记来看是否有基因损伤。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:42     标题: 回复 #621 小鱼鱼 的帖子

EB染后要冲洗，背景那么红应该是多余的EB造成的，另外，低熔点琼脂糖在恒温放久了，铺胶染色后也容易造成背景很脏。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:42     标题: 回复 #622 小鱼鱼 的帖子

这方面的文献没接触过，好像见过做鱼类的SCGE文献。
作者: bohe221    时间: 2011-12-4 16:43

叶老大，又要请教您了，我现在学您做了几张微电泳槽，刚开始做彗星电泳就碰到几个小问题 ，希望您能帮帮我，谢谢。一个是自制的微电泳槽有点脏一泡酸或是酒精小玻璃条就掉下来了，您一般都是怎么处理用过的微电泳槽的？还有就是每张片子就铺100微升的胶是怎么铺平的？谢谢啦。
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:44     标题: 回复 #627 bohe221 的帖子

那是你用的胶水不好，我用的胶水也不知是什么牌子，两管，混合后使用，粘的很牢固。
第一层胶可以多铺点，第二层才是细胞层，铺上后小槽中央是平的，分析细胞数足够了。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-4 16:45



QUOTE:
原帖由 bohe221 于 2011-12-4 16:43 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
叶老大，又要请教您了，我现在学您做了几张微电泳槽，刚开始做彗星电泳就碰到几个小问题 ，希望您能帮帮我，谢谢。一个是自制的微电泳槽有点脏一泡酸或是酒精小玻璃条就掉下来了，您一般都是怎么处理用过的微电泳槽的？还有就是每 ...

谈一点我制作微电泳槽的经验：开始我也用"哥俩好"和“502”，和你的情况差不多，长时间泡水小玻璃条也会掉下来，后来我改用装修用的大管玻璃胶（粘鱼缸都不漏水的），一般的五金店都有卖。用玻璃胶粘的是很牢固，但又出现了一个新问题，就是有胶粘染槽内玻璃表面，而玻璃胶是油性的，导致第一层琼脂糖铺不开，象水滴在蜡版上，所以建议你粘槽时一定别沾染槽内玻璃表面，玻璃胶可用牙签小心操作，还可试着用一合适的纸片及糨糊把槽内玻璃表面贴上，待第二天胶干后用水浸泡除去纸片及糨糊。
下面是我做的微电泳槽，磨砂的一头可用中性笔标识：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9541

作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-4 16:45


放大的局部照片

图片附件: 40129212.jpg (2011-12-4 16:45, 8.02 KB) / 该附件被下载次数 0
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9542

作者: 笑弯了腰    时间: 2011-12-4 16:46

我想请教大家,老板刚布置下要我们做DNA方面的东西,关于单细胞凝胶电泳已经有了初步的认识，今天又看到DAN ladder,不知道这两者相关吗?
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:46

乌贼老弟：放大的局部照片

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看图片，你的活够细的呵呵。
作者: 盼盼    时间: 2011-12-4 16:47

我也将要做彗星实验了，问几个傻问题，关于实验前准备，载玻片，盖玻片应该怎样处理，是否要泡酸，灭菌，电泳槽许久没用了，又应该如何处理，及实验中配制的各种溶液是否要求无菌。谢谢!
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-4 16:47

我也将要做彗星实验了，问几个傻问题，关于实验前准备，载玻片，盖玻片应该怎样处理，是否要泡酸，灭菌，电泳槽许久没用了，又应该如何处理，及实验中配制的各种溶液是否要求无菌。谢谢!

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1.载玻片，盖玻片第一次用前最好泡酸，自来水（15-20遍）、蒸馏水（2-3遍）清洗后烘干备用，不用灭菌；电泳槽可用洗洁精溶液毛刷（注意别擦伤有机玻璃）清洗干净，自来水、蒸馏水冲洗后晾干备用。
2.细胞裂解液贮备液用去离子水配制，过滤除菌，室温保存；电泳缓冲液储备液用去离子水配制，电泳前新鲜配制无须过滤除菌。详细的配制方法可看前面的帖子（第7页等）。
作者: 盼盼    时间: 2011-12-4 16:48


我要问个很傻的问题 大家不要砸我啊 我们学校没有人做过单细胞凝胶电泳上丁香园让我学到很多东西 谢谢热心的坛友
我的问题是：电泳的时候 胶上面要加盖玻片吗？？
我知道这个问题很白痴 但我想把每一步都搞得很清楚
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:48     标题: 回复 #635 盼盼 的帖子

谁都有从不会到会的过程。
跑电泳时就不要加盖玻片了。
作者: 盼盼    时间: 2011-12-4 16:49     标题: 回复 #636 一叶 的帖子

谢谢楼上的帮助 准备下周开始做预实验 好紧张 养这批鼠花了好多钱 做不出来对不起老板啊
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:49     标题: 回复 #637 盼盼 的帖子

为什么不在预实验前先把方法摸好了呢？
作者: 了了    时间: 2011-12-4 16:50


冒昧又问大家实验中的几个小问题，希望大家不要烦阿，谢谢了。
1.在配裂解液时，本来加入NaOH时已经溶了，可是当加肌氨酸钠时又成絮状很难溶，而且起好多泡沫，配成后裂解液发臭味；
2.经过我几次摸索，修缮屋、哥俩好、中性树胶都试过了，发现中性树胶相对来说最好用，但是自制的微电泳槽上好是很油，导致第一层胶很难铺，不知大家有没有良计？我曾试过先在载波片上滴一滴PBS形成一层水膜，铺是中间能铺平了，但觉得可能会使胶浓度降低导致吸附性不好吧；
3.还有就是在电泳时，一直都是稳流，调不成稳压，而且电流最高是25mA,而电压只有4V，我的电泳仪是北京六一的，99年的是不是太老了。电泳液配方是：30ml 10 N的NaOH和5ml 200mM 的EDTA定容到1000ml，有什么问题吗？
作者: duoduo    时间: 2011-12-4 16:50

非常感谢各位老师给我的回帖以及提供的信息.
我现在做彗星电泳有几天了,原来的时候结果听好的.最近的几次,我总发现最后染色了， 镜检的时候很难看到细胞.我不止到是不是因为我做的单细胞悬液没有做好,还是什么别的原因.
我的单细胞悬液 是用胰酶+edta消化40分钟虾 的肝胰腺,然后200目过滤,然后离心作成单细胞悬液,离心的时候看到下边有好多的沉淀,我猜测哪个就是细胞了吧.
还有,我作成单细包悬液后,我用白细胞记数板来记数,我不知道是我不会做,还是我理解力太差了,我根本看不到细胞.我的具体方法是:把记数板洗干净,最后用酒精冲洗,盖玻片也是如此.先把盖玻片放上,然后在凹槽出滴上一滴细胞悬液,使其充满,然后10倍20倍40倍镜检,结果我什么都看不到.请大家指教.
谢谢了.我门实验室第一次做这方面的,没有经验.谢谢了
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-4 16:51     标题: 回复 #639 了了 的帖子

1.加肌氨酸钠时成絮状：可加热不超过50度，继续搅拌一小时即会溶解；起泡沫：如果搅拌转速不太高的话，泡沫就会少些，静置后一段时间大部分可消失。
2.中性树胶微电泳槽上很油：建议你粘槽时一定别沾染槽内玻璃表面，胶可用牙签小心操作，还可试着用一合适的纸片及糨糊把槽内玻璃表面贴上，待第二天胶干后用水浸泡除去纸片及糨糊。
3.你的电流电压数值大小是不是搞反了，应该是将电压设在25V，电流就可达到200-300mA,电泳仪、电泳液配方应该没问题。若电泳仪只能稳流，调不成稳压，可将电流设在200-300mA，电压自然就上去了。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-4 16:51     标题: 回复 #640 duoduo 的帖子

1.你的细胞计数没看到细胞当然最后染色时就可能找不见细胞了。有两种可能：一种是可能在整个实验中你将细胞弄丢了；另一种可能是计数板没用好，不知道你是否看到计数板上的方格线，如果看到了却没看到细胞那就说明你根本没收集到细胞。另外是不是你用胰酶+edta消化40分钟,时间长了把细胞消化溶解了？
2.“把记数板洗干净,最后用酒精冲洗,盖玻片也是如此”操作后，应该用纱布将计数板及盖玻片擦干然后充细胞悬液，否则有酒精占着凹槽，细胞悬液就充不进去了；
3.铺完含细胞的胶后，可在显微镜下看一看有没有细胞，若没细胞则细胞可能已丢失，后面就不用耗费时间再做下去了，而应往前面的步骤查找看是那一步把细胞丢了。
作者: 盼盼    时间: 2011-12-4 16:52

今天先尝试做小鼠外周血淋巴细胞分离
发现在加入淋巴细胞分离液后离心 能明显看到液体分成三层 上清液 底下红色的液体 中间有很薄的一层淋巴细胞的白膜 我尝试用移液枪及普通玻璃吸管来吸这层白膜 结果都要把底下的血浆吸上来 再用PBS离心洗涤 不能看到白色的淋巴细胞团 而是红色的沉淀
请问大家 有什么办法和工具可以充分将淋巴细胞层吸进来 而尽量少的吸到血层呢
作者: bohe221    时间: 2011-12-4 16:53

谢谢乌贼老弟战友的悉心指教，太谢谢了，看您回的信息是我继续做下去的动力，有点夸张，呵呵，只不过试验不太顺利，老是出问题。现在还有两个问题，一是用微电泳槽还是出现脱胶问题，是不是胶太薄了?还有就是电泳条件的问题，电流最大也就是26mA，再高电泳仪就支持不了了，而电压最高也只是4V，是不是可以通过延长电泳时间来实现阿。问菜鸟级问题希望大家能够包涵，谢谢。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-4 16:53     标题: 回复 #644 bohe221 的帖子

1.微电泳槽出现脱胶问题:我的感觉不是胶太薄而是胶太厚容易出现脱胶.。另外不知你电泳液是否事先置4度预冷,而且电泳时也要在电泳槽周围放冰块尽可能保持低温,有条件的话,可用专门的低温循环仪连接电泳槽保持恒定的低温。还有就是微电泳槽要保持干净尤其不能有油性污物，否则也易脱胶。
2.你的电泳仪电流最大26mA，而电压最高也只是4V，我没见过这种电泳仪，不知是不是说明书上明确给出了电流电压范围就是这样，还是电泳仪上标示出了以上范围，我的感觉电泳仪说白了就是一个可调变压器，若你的电泳仪
还不能确定范围，可试着多加点电泳液来调试一下。
3.至于是不是可以通过延长电泳时间来实现细胞电泳，我不能肯定，比较经典的文献介绍的条件电流电压都比较高的，你也可试试你的电泳条件并延长电泳时间看能否跑出彗星，但应设阴性及阳性对照。若阴性对照没有彗星，而阳性对照出现了彗星，也许结果可用，那样的话你可能发展了新的细胞电泳条件。
作者: 泡泡    时间: 2011-12-4 16:53


一叶老师:
您好!
请教一个问题,怎么我做的阴性对照也出现了很多彗星?
作者: 一叶    时间: 2011-12-4 16:54     标题: 回复 #646 泡泡 的帖子

要看你的实验过程，是否增加了额外的损伤？
作者: bohe221    时间: 2011-12-4 16:54


谢谢乌贼老弟群友,电压问题主要是电泳仪中间坏了一次，换个电泳仪就行的。还想问一下大家，为什么CASP不能分析银染的彗星图象？
前几天看到一篇文献，介绍了彗星电泳的升级版--FHA（The fast halo assay),省略了很多步骤，只经过裂解和染色两步，直接可以看到DNA的损伤，具有很多的优点，似乎有代替彗星电泳的趋势，（后附有FHA的照片）不知大家有没有接触过，对此有什么看法。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9543

作者: @STAR@    时间: 2011-12-4 16:55

1.你的细胞计数没看到细胞当然最后染色时就可能找不见细胞了。有两种可能：一种是可能在整个实验中你将细胞弄丢了；另一种可能是计数板没用好，不知道你是否看到计数板上的方格线，如果看到了却没看到细胞那就说明你根本没收集到细胞。另外是不是你用胰酶+edta消化40分钟,时间长了把细胞消化溶解了？
2.“把记数板洗干净,最后用酒精冲洗,盖玻片也是如此”操作后，应该用纱布将计数板及盖玻片擦干然后充细胞悬液，否则有酒精占着凹槽，细胞悬液就充不进去了；
3.铺完含细胞的胶后，可在显微镜下看一看有没有细胞，若没细胞则细胞可能已丢失，后面就不用耗费时间再做下去了，而应往前面的步骤查找看是那一步把细胞丢了。

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关于细胞计数的问题已经解决了。正如您所说，把细胞溶解了，没有剩下多少，所以就看不到细胞了，消化40分钟时间是太长了，我现在自己觉得10-15分钟效果还比较好，短了消化不开。长了细胞就少了。
作者: @STAR@    时间: 2011-12-4 16:56


我试验做了一段时间了，算是有结果了吧。
前些日子我的也总是脱胶，我看战友们的留言，看到一个战友说载玻片一定要洗干净，并且用刮片法，也就是，把胶滴在载玻片上，然后用该玻片刮去胶，使胶填满磨砂片的缝隙，使胶冷凝，然后再铺第二层，我没有用盖玻片，直接把胶滴上，然后用枪头迅速将之展平，冷凝，即可。效果很好。我的从来没有脱胶。
大家如果有兴趣，可以尝试一下。
作者: 一叶    时间: 2011-12-5 10:47

电压问题主要是电泳仪中间坏了一次，换个电泳仪就行的。还想问一下大家，为什么CASP不能分析银染的彗星图象？
前几天看到一篇文献，介绍了彗星电泳的升级版--FHA（The fast halo assay),省略了很多步骤，只经过裂解和染色两步，直接可以看到DNA的损伤，具有很多的优点，似乎有代替彗星电泳的趋势，（后附有FHA的照片）不知大家有没有接触过，对此有什么看法。

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我也看过这文献，The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level，确实非常简便，应该说是晕圈分析的升级版，但我觉得不能称为彗星电泳的升级版，二者各有千秋。怎样进一步准确量化晕圈的各项指标，以更加准确评价细胞的DNA损伤水平是这个方法需要进一步解决的问题。我想试一下，毕竟是一个新东西，选一个好的软件是很关键的吧。
作者: zhezhe    时间: 2011-12-5 10:49

请教用gene finder 染料的战友，在彗星电泳中的使用方法，谢谢。 使用这个染料时还用不用加大电压？我们实验室的电泳仪电压老上不去，一接通电源电泳仪就显示稳流，电压根本调不了，愁死了快。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-5 10:51

GENEFINDER就是按说明1：1000配制后，观察前滴片染色就可以。同时，电泳条件是相同的，这和用什么染料没关系。你的问题出在电泳液上，我在前面的帖子说过同样的问题。这我也好长时间才摸索清楚。
作者: 一叶    时间: 2011-12-5 10:57

请教用gene finder 染料的群友，在彗星电泳中的使用方法，谢谢。 使用这个染料时还用不用加大电压？我们实验室的电泳仪电压老上不去，一接通电源电泳仪就显示稳流，电压根本调不了，愁死了快。

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GENEFINDER就是按说明1：1000配制后，观察前滴片染色就可以。同时，电泳条件是相同的，这和用什么染料没关系。你的问题出在电泳液上，我在前面的帖子说过同样的问题。这我也好长时间才摸索清楚。

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乌贼老弟说的对！调整一下电泳液的量，你会有新的发现。
作者: zhezhe    时间: 2011-12-5 10:59

谢谢大家，我发现把电泳液刚刚没过载玻片时，电压就可以调到25V了，电流可以达到100mA ，师兄说是铺的胶薄所以电阻小来着，现在好多了，呵呵。刚做了一次，发现空白对照组的细胞好小阿，而且基本上都没有发现彗星细胞，照理说自身也应该有损伤的呀。传一张处理组的照片，大家帮忙慧眼辨识一下彗星细胞吧，谢谢啦。gene finder 染料用着还行，只是在荧光显微镜下萃灭的太快了，我感觉照像就跟打仗似的，呵呵。
作者: 一叶    时间: 2011-12-5 11:02

只是在荧光显微镜下萃灭的太快了，我感觉照像就跟打仗似的，呵呵。

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呵呵。
找了几个。

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作者: zhezhe    时间: 2011-12-5 11:05

您是怎么看出来的呀，我看它们长得都差不多，没脱尾阿，您是怎么看的？我有的片子彗尾斜了，可跑完电泳后载玻片并没有斜阿，不知道是什么原因阿。还有关于CASP软件的几个问题想请教一下:
1.有的时候CASP软件区分不了彗星的头部和尾部；
2.您说的CASP中第5个背景选择是调整工作框大小的，可我觉得，框的上下变化好像是针对不同的彗星方向的；
3.怎样设定分析完数据的保留位数；
4.背景选择框离彗星头部的距离影响分析的结果，那有没有一定的标准。
暂且这些吧，人有点笨，大家谅解呀。
作者: 一叶    时间: 2011-12-5 11:07     标题: 回复 #657 zhezhe 的帖子

电泳仪是不会欺骗你的。肉眼的分辨率肯定不能准确判断片子是否和电泳方向100％平行，呵呵。
1、这个问题我有点纳闷。是否和图像质量有关？
2、它是调整背景框的。针对不同的彗星方向？我有点没明白－－同一张片子会出来两个方向吗？
3、好像没有固定的设定方法，我觉得主要应该到你用的统计软件中设定就好了。
4、这个问题很好！分析框的位置变化确实存在一定的主观性，我觉得应该综合考虑这个问题：首先，根据彗星图像的位置随时调整，尤其是同一张图中有多个彗星时，要尽量避开，单独分析；其次，分析时要同时选择显示头和尾，能够第一时间浏览彗星的直观形态，根据这个形态的优劣，调整分析框的位置，第三，就近原则，背景框距离彗星最近，分析框稍大于一个彗星为佳，因为毕竟同一张片子彗星的大小还是比较一致的，遇到特殊情况，可以返回到预分析状态，调整分析框大小，然后继续。所以，分析前先大体看一下彗星大小，然后决定分析框的大小是很必要的。
个人看法，不一定正确，仅供参考。
作者: zhezhe    时间: 2011-12-5 11:10

谢谢您的解释。彗星头尾不分是有的时候分析对照组细胞时，CASP直接显示全是彗尾，头部DNA含量为零，很是纳闷。IQ老大，我想再传两张照片，请您给分析一下实验及照相过程中的问题，因为处理组的彗星细胞的OTM值太小了，都是零点几，谢谢啦。老是麻烦您，真不好意思，以后我也会倾尽我所有帮大家的。
作者: 园丁##    时间: 2011-12-5 11:12

我想再传两张照片，请您给分析一下实验及照相过程中的问题，因为处理组的彗星细胞的OTM值太小了，都是零点几，谢谢啦。

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文件格式不对，帮你改了直接贴出来。

图片附件: 62338143.jpg (2011-12-5 11:12, 30.86 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9545

作者: 一叶    时间: 2011-12-5 11:15     标题: 回复 #659 zhezhe 的帖子

全是彗尾?不对吧？看这张图，没什么彗星细胞，应该都是头部，而尾部不明显，尾部DNA百分含量接近0，这正是对照组的表现。
作者: zhezhe    时间: 2011-12-5 14:43

凋亡细胞应该也算是一种彗星细胞吧，那怎么分析呢，CASP不是分析不了凋亡细胞的吗？我做了好长时间的彗星电泳了，我觉得挺主观，有的骗子上一部分损伤的很厉害，一部分却损伤的很轻，更头疼的是，有一次实验中阴性对照组都损伤的很厉害，很是奇怪。还有，你们统计时计算相对尾部DNA含量吗，就是处理组的尾部DNA含量除于空白组的DNA含量，我觉得这种统计方法挺科学的。
作者: 一叶    时间: 2011-12-5 14:45     标题: 回复 #662 zhezhe 的帖子

CASP可以分析凋亡细胞的，但我没有把凋亡细胞的数据列入分析之内，我觉得计算凋亡率更好。
一部分损伤的很厉害，一部分却损伤的很轻，更头疼的是，有一次实验中阴性对照组都损伤的很厉害，很是奇怪
是否实验过程出现什么问题了？
你提到的相对DNA含量很好！多谢！！
作者: zhezhe    时间: 2011-12-5 14:46


实验过程跟以前都一样啊，只不过电泳缓冲液是两天前配的，是这个原因吗？相对尾部DNA含量是我在一篇中文文献中看到的，他对数据进行了归一化处理，挺好的。
作者: zhezhe    时间: 2011-12-5 14:47

这是一张用CASP分析凋亡细胞的图像，怎么分析不成呀

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作者: zhezhe    时间: 2011-12-5 14:47

还有，电泳时细胞不在同一层上，这样影响实验结果吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-5 14:50     标题: 回复 #666 zhezhe 的帖子

你的图像质量太差了。看看CASP自带的几张图，有凋亡细胞的，比较一下。
作者: caihong    时间: 2011-12-5 14:55

用comet assay测组织细胞（肝、肾、肺等），为什么细胞老脱胶呀？测外周血倒是效果挺好的。
作者: 一叶    时间: 2011-12-5 14:56     标题: 回复 #668 caihong 的帖子

这和细胞类型无关。~~~~~~~~~~~~·
作者: glass    时间: 2011-12-5 14:57

我是个新手，正想着做关于放射性安全性评估的实验，
我想选择scge
楼主啊
你能否给出较好的实验过程啊
好想有美国的标准
是吗？
作者: 园丁##    时间: 2011-12-5 14:57

玻片处理最好是用开水煮沸20分钟，这样既可以去掉胶，又可以清除EB，然后就是泡酸酒精擦洗这些常规处理，玻片就是干干净净的。
作者: glass    时间: 2011-12-5 14:58

我想请教一个问题,casp软件分析出来的指标中有几个我不太清楚具体含义及算法,望百忙中给予解答,谢谢!这几个指标是: HeadMeanX TailMeanX TailMoment OliveTailMoment .
作者: 一叶    时间: 2011-12-5 15:00     标题: 回复 #671 园丁## 的帖子

多谢！我现在是直接接开水泡，不知行不行？
作者: 一叶    时间: 2011-12-5 15:01     标题: 回复 #672 glass 的帖子

软件安装后有一个说明，很清楚了。
作者: 铜雀    时间: 2011-12-5 15:01

楼主您好:
我正准备做彗星试验,我用24*32的盖玻片是不是有点大啊?若加100Ul琼脂,用多少细胞比较合适呢?
谢谢!
作者: zhezhe    时间: 2011-12-5 15:01


冒昧请教大家是怎样处理彗星电泳获得的数据的，谢谢
作者: 铜雀    时间: 2011-12-5 15:02

大家好:我今天忙了一天来做这个彗星试验,到染色后观查时,那位老师说倒置的荧光显微镜不能看磨砂载波片,而且用的是EB怕污染他的镜子,刚好是周末也不好找其他的荧光镜.所以只好仍那,于是甚是郁闷...!
请问师兄师姐门都用什么样的荧光显微镜啊?必须正置的吗.谢谢!
作者: 一叶    时间: 2011-12-5 15:03


磨砂片在倒置下是不好，除非你用普通片子。
建议：你如果以后再遇到此类情况，可以用甲醇固定一下，以后看，许多文献报道可以的。
作者: 铜雀    时间: 2011-12-5 15:04

多谢!.
最后用的是20ug/ml 的PI染色十五分钟,怎么是这样呢,哎呀,郁闷死了.!第一次做用的用EB,都不让用他们的镜子看.白忙活了.
这次吧,都看不到细胞核的样子!每张板我是3000个细胞/100ul.不管有彗星没有,起码应该可以看到圆的细胞核吧??
这个是25倍下的.各位大侠帮我分析一下吧.不胜感激!!!
作者: 铜雀    时间: 2011-12-5 15:04


这个是40倍的

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作者: 铜雀    时间: 2011-12-5 15:04

这个是10倍下的,那些小圆点是细胞还是磨沙玻璃上的凸起 啊?

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作者: 一叶    时间: 2011-12-5 15:15

这个是10倍下的,那些小圆点是细胞还是磨沙玻璃上的凸起 啊?????????????????????

================

没有细胞，你用的啥？
作者: 铜雀    时间: 2011-12-5 15:16


我是将细胞染毒后计数,按3000个细胞/100ul铺的啊.应该很密啊,怎么会呢?
是不是裂解液有问题啊,,裂解液没有加肌氨酸钠,第一次配时没有肌氨酸钠就用十二烷基硫酸钠代替不能溶解加热高压的方法都用了
作者: 铜雀    时间: 2011-12-5 15:21

我的具体方法如下:
制细胞悬液:细胞贴壁后加药作用2h,消化,离心.PBS 悬液,计数.
铺胶: 第一层,100ul的0.5%正常熔点琼脂糖铺于磨沙载波片,盖片,4度凝固,去盖片
第二层:1ml含40000个细胞的PBS悬液中加1ml低熔点琼脂,混匀,取100ul
(2000个)于第一层胶,盖片,凝固.

裂解:去盖片,4度,裂解1.5h,(2.5m/LNaCl,
100mMEDTA2Na,
10mM/LTris
用前加入10%DMSO,1%TritonX-100 PH=10)
没有用肌氨酸纳.
PBS浸 洗
解旋:电泳液(1mM/L EDTA2Na,300mM/L NaOH PH=13)4度20分钟.
电泳:水平电泳25V,200mA,30min
中和:0.4m/LTris PH=7.5 3次5min/次吸取水分
染色:20ug/ml 的PI染色15分钟,缓水冲洗.1小时后荧光镜检.

恳请个位大侠指导
作者: 铜雀    时间: 2011-12-5 15:21

对了一叶师兄,忘了给你说了,我用的是小鼠的成纤维细胞.

希望不赁赐教!期待您的指教!
作者: 一叶    时间: 2011-12-5 15:22

问题出来了：
1ml低熔点琼脂？多大浓度？也是0.5％吧？和1毫升的细胞悬液混合，又稀释了1倍！裂解后，估计你要用笊篱从裂解液中捞你的细胞了，呵呵。
作者: baidukk    时间: 2011-12-6 09:58

我配的低熔点琼脂糖的浓度是1%的.对倍稀释后刚好是0.5%.所以没有用筢子捞,呵呵.

有个别的有脱胶现象但不严重,最后冲洗时胶 的边缘会有漂起来的,但我想不影响大局吧.

另外,今天又 做了一次.和上次基本一样,增加到3000个/100ul,铺好胶后镜下观查,还是没有细胞,很郁闷,干脆就把没有稀释的细胞全用上从新铺胶了,足有10万个细胞了.铺上后还是没有看到细胞很纳闷呢!!细胞跑到哪里了呢?
难道是显微镜的原因吗?但平常我们都用来计数了啊.然后也只管往下 做了,结果看荧光的话时间就来不及了..
我想请教一下,在一文章上看的说用甲醛固定5分钟,可以第二天在染色,但没有说 浓度,我们这有 37%的甲醛我就没有稀释直接用来固定了5分钟,放入湿盒里4度过夜明天染色过夜行不行啊??
作者: baidukk    时间: 2011-12-6 09:58


今天的结果出来了,有好多细胞,但是每张片子都有好多彗星,且尾巴都特别的长.
是不是电泳时间长了啊?我是25V 200mA 30min

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作者: baidukk    时间: 2011-12-6 09:59

再传一张,请帮忙分析一下.是不是因为电泳后用甲醛固定过夜的缘故啊?

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作者: 一叶    时间: 2011-12-6 09:59     标题: 回复 #689 baidukk 的帖子

文献报道有乙醇和甲醛固定的，应该都没问题吧。我从来没试过。
首先请您分享一下细胞是怎么出来的？什么原因？
是正常细胞吗？尾巴是挺长的。应该和固定没啥关系。裂解？电泳时间20试试。
作者: baidukk    时间: 2011-12-6 10:20

谢谢师兄的意见!
这次就按你说的电泳了20分钟,25伏,200mA. 对照组和试验组是有区别,但是没有刺激的对照组细胞不应该有尾巴的吧,,但还是有尾巴,就是比对照组的要短.
是不是还需要降低电压,电流啊.或者缩短时间啊?
作者: baidukk    时间: 2011-12-6 10:20

对了,想请教师兄一下用乙醇梯度固定法都是多大浓度,固定多长时间吗?
因为试验条件的限制不能马上看结果,需要过夜,但怕影响结果的观查
有文章上说用甲醛和乙醇梯度法可以第二天看的,但每有具体的说明.
作者: baidukk    时间: 2011-12-6 10:20


这张是裂解后,经过中和就染色的,看中心的黄色是不是因为没有解旋而留的DNA结合蛋白啊?

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作者: 一叶    时间: 2011-12-6 10:21     标题: 回复 #693 baidukk 的帖子

我们用的条件是20V，200MA，20MIN，你可以参考一下。
为什么要省去解旋呢？
作者: baidukk    时间: 2011-12-6 10:22

我们用的条件是20V，200MA，20MIN，你可以参考一下。
为什么要省去解旋呢？

==============================================================================================================

？
呵呵谢谢师兄的建议,我今天刚做的就是这个条件,但我们的电泳仪只能恒压,不能同时恒流,所以实测电流是180-190mA之间,电压基本恒定..而且只裂解了一个小时.尾巴还是拉的好长啊,.看来是不是还需要降低电流????
上次本来计划是解过旋后不电泳染色看看是需要改变电泳前的条件还是需要改变电泳后的条件..结果作的时候片子太多就弄错了.这次又试验了解旋后不电泳就没有黄芯了.
作者: 生物迷    时间: 2011-12-6 10:22

我刚开始接触SCGE，按照您前面所说的CASP分析的详细步骤，有一点还是有些问题，结果仍无法保存。在VIEW中也看到了结果，但File export 保存后打开只有指标，没有数据。不知道是什么问题？谢谢
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 10:22     标题: 回复 #696 生物迷 的帖子

你肯定是忘了按数据保存那个按钮，每分析一个细胞就要点它一下，否则没有数据。就是“分析”键右侧的那个，分析前是灰色，分析一个细胞后就可以点击了。
作者: loli    时间: 2011-12-6 10:23

不知道分析时框彗星 是否有个标准 框的大小不同结果也不同，准确点的四边离彗星多远？一个剂量背景框大小不能改变，但分析不同的彗星有时又需要改变 怎么办呢？
作者: 二丫头466    时间: 2011-12-6 10:23

你好啊.我做了几次彗星实验都遇到脱胶的问题.很是郁闷啊.
我用的是玻璃仪器厂定制的磨砂载玻片,单面全磨砂.细胞裂解液浸泡后就发生了脱胶.有人说铺第一层胶就直接拿磨砂载玻片放到正常熔点的琼脂糖中浸泡一下拿出来凝固,你试过这种方法吗?不知道可行否?他这种方法也要压盖玻片吗?
作者: 园丁##    时间: 2011-12-6 10:24     标题: 回复 #699 二丫头466 的帖子

你好，彗星电泳的脱胶问题的确是很难解决，我也是一步步走过来，我现在使用的方法就是磨砂载玻片烤胶，把干净的载玻片放在1%的正常熔点琼脂糖中蘸一下然后拿出来，在烘箱中50度烤干，然后再铺低熔点琼脂糖，这样在彗星电泳中就不会出现脱胶问题了。
作者: 二丫头466    时间: 2011-12-6 10:25     标题: 回复 #700 园丁## 的帖子

感谢你的回复.
我明天就用你说的蘸胶法来做一下实验..

还有就是我配的细胞裂解液总是不能完全溶解,　尤其是当加入了Triton X-100和DMSO后,液面上出现会很多泡沫还有白色的小固体不溶,磁力棒搅拌了20分钟也没溶,一直呈悬浊液状态.
下面是我依照的细胞裂解液(每1000m1)的配制方法:
2.5 m m o l/L N a Cl 146 .1g
100 mmol/L EDTA 37.2g
10 mmol/L Tris 1.2g
用NaOH调PH=10
1%肌氨酸钠 10g
用去离子水定容至890ml.120摄氏度高温灭菌，为贮备液，室温保存。

实验时进行细胞液裂解应用液(30ml)的配制:取贮备液26.7ml，应用
前30-60min加入0.3 ml(即总体积的1%)Triton X-100和3
ml(即总体积的10%)DMSO，冷藏。

您觉得有问题吗？怎么样让它溶解得更好呢？
作者: 二丫头466    时间: 2011-12-6 10:25


一叶版主:
你好．我想请教你关于微电泳槽的制作方法．
你说＂用玻璃刀割出几条2毫米的细条，用这些细小的玻璃条在普通载玻片上粘两个1.5厘米见方的槽．＂就是一个载玻片上割下来的玻璃条粘到另一个载玻片上吗？每一个玻璃条的形状都是长方体吗？你们用的玻璃刀的规格是什么？电泳时胶会不会浮起来又脱胶啊？
我们正在摸索怎么样不脱胶的问题，想各种方法都来试一下．谢谢你．
作者: ffooll    时间: 2011-12-6 10:26

目前,我也在做彗星试验,做了没多久..可是每次都是问题多多,尤其是脱胶的问题,今天我从制胶,裂解,漂洗到解旋、电泳胶都是好好的。可是当我加入Tris-Hcl 中和之后，发现胶全漂起来了。真是太郁闷了，我用的磨砂载玻片。我的Tris-Hcl（1000ml）配制方法是：将48.5gTris 溶于去离子水中，加约700ml 的去离子水，用>10mmol/L的Hcl 调PH至7.5后，再定容至1000ml,混匀，室温保存。
我觉得好奇怪哦,怎么一中和,胶就会掉呢?这是什么原因呀?希望解答一下~
作者: ffooll    时间: 2011-12-6 10:27


我是直接把载玻片放在装有中和缓冲液的容器中进行中和的.....大家都是怎么做的呢
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 10:35     标题: 回复 #701 二丫头466 的帖子

肌氨酸钠是很难溶的，不过用NaOH调PH后应该溶的很好，肌氨酸钠不是必须的，可以不用。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 10:42     标题: 回复 #702 二丫头466 的帖子

是一个载玻片上割下来的玻璃条粘到另一个载玻片上，围成一个1.5厘米见方的槽，应该说的很清楚了吧？玻璃刀的规格就不用说了吧，不限。只要能用就行。
没有出现过脱胶现象。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 10:42     标题: 回复 #703 ffooll 的帖子

我和你做的唯一区别就是：中和液我是放4度冰箱的。
另外，请明确您用的是Tris-Hcl还是Tris Base,如果用Tris-Hcl，应该是63.056克，如果是Tris Base,应该是48.456克。二者的MW是不同的。
作者: ffooll    时间: 2011-12-6 10:43

我配的是Tris Base没错.我再请教一下:
我是直接把载玻片放在装有中和缓冲液的容器中进行中和的,可以直接把Tris Base滴加在胶面上进行中和吗?
作者: ffooll    时间: 2011-12-6 10:47

对了.还问一下,在电泳结束后,中和之前要不要进行漂洗啊?用蒸馏水还是用PBS啊?
作者: ffooll    时间: 2011-12-6 10:52     标题: 回复 #709 ffooll 的帖子

漂洗是必要的，蒸馏水即可。
作者: guagua    时间: 2011-12-6 10:52

我也遇到前面别人提到的问题，casp软件安装后能打开，可是调节背景和彗星区域的框怎么也拖动不了，奇怪了，难道是软件过期了，可是我是刚从网上下载的啊。请问主任知道是怎么回事吗？我重启电脑、改变系统日期都试过了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 10:57

预分析状态下是可以调节的，但如果进入分析状态，就不能调节了。看看软件打开后上面的工具条，分析的小齿轮上有没有红色的小斜杠（如图的箭头所示），如果有，那是在分析状态，不能调的。必须把它点没了才可以。所以，进行正式分析之前必须经过预分析，把条件定好。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9554

作者: DNA    时间: 2011-12-6 10:58

一叶老师，这两天看了很多关于彗星实验的帖子，我想向你询问以下几个问题：
1.我是做2种化疗药物单用或联合应用对肿瘤细胞的杀伤效果，需要观察其对细胞的增殖抑制和诱导凋亡的差别，老板说需要加上彗星实验，我大概需要做50个以上的样本，这样花费时间多么，要花很多钱么，我时间和经费均不是太多；
2.你觉得我仅仅是观察化疗药物对肿瘤细胞的杀伤或观察凋亡有必要使用彗星试验么，我的研究中已使用了流式细胞检测凋亡，我现在很迷茫！
谢谢亚！
作者: zhezhe    时间: 2011-12-6 10:58

我已经注意到齿轮形状的改变，可是两种状态下都不能拖开框，更别提分析了。我换了电脑试了还是这个样子。是不是现在下载的软件过了它的时效了？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 10:59     标题: 回复 #713 DNA 的帖子

彗星检测药物对细胞的杀伤很有优势，检测凋亡相对流式就没有优势了。
可以用彗星测细胞的DNA损伤。
费用应该不会太高，周期也不会长，这是很有伸缩性的，你实验安排紧点，自己辛苦点，时间不会长，反之...............都是废话。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:00     标题: 回复 #714 zhezhe 的帖子

安装后把桌面的快捷方式删除，直接到安装程序里面做一个快捷方式到桌面，试试。
打开软件后一定要点住左键，把分析框和背景框拉出来。
实在不行再说。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:01

运用CASP软件分析时候，没有出现它自带片里那样的头（红）和尾（紫）分开图像，我的图片只有红色，但我觉得我拍的图像看起来还可以，不知道是什么原因，你能帮我看一下吗？非常感谢！

一定要仔细看说明！！
1、看了你的图片，说明中说的很明白，一定要让彗星的头部在左侧，尾部在右侧。这是你的最大问题。
2、你用的什么细胞，尾巴那么大！
作者: duoduo    时间: 2011-12-6 11:01


一叶老师：
你好！
有个关于彗星电泳的原理的问题我想向你请教。
我看到文献关于彗星电泳原理是这样描述的：“SCGE检测原理为当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时, DNA的超螺旋结构受到破坏, 在细胞裂解液作用下, 细胞膜、核膜等膜结构受到破坏, 细胞内的蛋白质、RNA以及其它成分均扩散到细胞裂解液中, 而核DNA由于分子量太大只能留在原位,在中性条件时, DNA片段可进入凝胶发生迁移, 而在碱处理和碱性电解质的作用下, DNA发生解螺旋, 损伤的DNA断链及片段被释放出来, 由于这些DNA的分子量很小, 所以在电泳过程中会离开核DNA向阳极移动, 形成彗星状的图像, 而未损伤的DNA部分保持球形。在一定条件下, DNA迁移距离（彗星尾长）和DNA含量（荧光强度）分布与DNA损伤程度呈线性相关, 因此, 尾矩（尾部DNA的含量与尾长的乘积）被作为SCGE定量分析的主要依据。”
其中提到“在细胞裂解液作用下, 细胞膜、核膜等膜结构受到破坏, 细胞内的蛋白质、RNA以及其它成分均扩散到细胞裂解液中, 而核DNA由于分子量太大只能留在原位”，我的问题是：1.核DNA为何未被细胞裂解液破坏并扩散到细胞裂解液中？2.即使核DNA为何未被细胞裂解液破坏，但实验造成的DNA链断裂小片段，是否也会扩散到细胞裂解液中，而使我们检测到的并不一定是DNA损伤？
另外还有一个和原理无关的问题：我的实验观察一抑制DNA修复的药物对电离辐射所致DNA损伤的影响，不知照射后多长时间后做SCGE合适？也即关于电离辐射所致DNA损伤修复时相的问题。
以上问题一直比较困惑，望给予解答，万分感谢！
作者: duoduo    时间: 2011-12-6 11:02


这是前人经过反复实验得到的。
回答很简单，其实不是核DNA不能被细胞裂解液破坏，如果裂解时间拉长到4小时，估计实验结果会是100％的彗星率，所以实验技术方法的严格掌握是很关键的，就像PCR的时间、染色体畸变的培养时间一样。
DNA损伤后的修复开始时间几乎和DNA损伤是同步的。如果我做这个实验的话，我会先选几个时间先摸一下。
作者: 盼盼    时间: 2011-12-6 11:02

运用CASP软件分析时候，没有出现它自带片里那样的头（红）和尾（紫）分开图像

谢谢一叶老师的指导，现在可以看了。

我做的是支气管上皮细胞，用CASP软件时，我发现这个软件对彗星头中心定位有误，我的彗星图像尾部有些亮时，它也会把尾部算做头的一部分，不知道有什么方法可以可以解决。

我做的是有关凋亡的实验，不知道用中性还是碱性裂解液好？前面我做的是碱性裂解液，我看了一篇毕业论文，他的中性裂解液配方和您的碱性配方一样，只是PH 值是7.5左右，这样可以吗？

还有一个问题，中和缓冲液和电泳液是否每次都要新配，可以重复用吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:03     标题: 回复 #720 盼盼 的帖子

1、是这个软件的一个弊端；
2、碱性配方比较一致，中性有所不同，个人感觉应该用SDS的配方比较好；
3、可以重复。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:03

1 荧光显微镜拍照拍的是一个细胞 ,还是拍视野内的好多细胞;如果拍好多细胞,那么怎么用软件单细胞分析.
2现在单细胞凝胶电泳是不是没有什么人做了 ,怎么新帖子很少.打扰您了 谢谢 盼答复
re：
1、一般用高倍拍单个细胞，一张图有几个细胞的也可以分析，先分析A，然后把分析框拉到B上，依此类推，接触任何一个事物前请先详细阅读它的说明书！
2、在这里帖子少不代表没有人做。
作者: ffooll    时间: 2011-12-6 11:03

请问：用溴化乙啶(2μg/ml) 染色后，过多久进行再用双蒸水冲去多余染液？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:08

EB与DNA结合的能力很强，染色时间很短即可，我一般滴上EB后10sec内就漂洗了，效果不错。
作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-6 11:09


请问文献里的The fast halo assay技术中文中称什么技术啊?
我只知道它也是一种检测DNA损伤的技术.和碱性单细胞凝胶电泳相比有什么优点啊?
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:10     标题: 回复 #725 爱老虎游tt 的帖子

快速晕圈分析？
没试过这个技术
作者: wu11998866    时间: 2011-12-6 11:11

看了你们的讨论受益颇深。

现有问题如下：

（1）你自制的那个电泳槽是四边都封上了么？如果这样，电泳是怎么跑的，不是被槽堵住了么？（跑DNA电泳的时候，胶的两端是裸露的）
（2）一般裂解液裂解多长时间比较合适？我看了一篇文献，说是裂解过夜。是不是时间过长了？我的control组和阳性对照组，都有彗星现象。
（3）彗星实验必须用统计方法说明问题么？如果对于细胞量很少的实验，可不可以定性的说有或无？

谢谢回复。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:12     标题: 回复 #727 wu11998866 的帖子

1、呵呵，电流会被堵住吗？电泳液要浸没胶板的；
2、越来越多的文献倾向于1.5～2小时，标准化！！；
3、应该是可以的。
作者: 园丁##    时间: 2011-12-6 11:12

也看了一些彗星电泳的文献 发现所用染料的种类和浓度各不相同 举例如下：
EB 2μg/ml及20μg/ml
吖啶橙 20μg/ml及10g/ml
PI 2.5μg/ml及50μg/ml

请问楼主：本人倾向使用吖啶橙或PI 怎么使用为好 请指点迷津 万分感谢！
作者: wu11998866    时间: 2011-12-6 11:13

一叶， 我按照你说的重复了一遍实验，但还是control和阳性都有彗星。

我用的是Hela细胞，阳性用0.6%的H2O2处理，阴性就是PBS悬浮细胞。然后中性裂解条件下裂解细胞2h，4h，过夜，作比较，结果差不多，control和阳性都有彗星，彗星的程度也差不多。

我的中性裂解液配方为（参考的文献）：
2％ sarkosyl, 0.5M Na2EDTA, 0.5mg/ml proteinase K (pH=8.0)。
我现在怀疑是不是裂解液配方的问题（过强了？）

电泳条件，你用多少V/cm去跑的？我的是10cm槽，30V电压，9mA电流，跑25min。我看文献上写0.6V/cm，可这样的话，我的电泳槽就是用6V去跑，我觉得有点离谱。不知你是什么意见。

等有时间，把我总结的protocol传上来一份，跟大家分享一下。
作者: tianmei001    时间: 2011-12-6 11:14

想请教几个问题：
1.彗星分析法有中性和碱性之分，中性检测双链损伤，碱性检测单链损伤，而双链损伤不易修复，所以有的文献上就说碱性适合检测初始损伤，中性适合检测残留损伤，并且由于初始损伤多不能反应放射敏感性，而以经过一定时间修复后的残留损伤或残留损伤与初始损伤的比值作为指标检测放射敏感性，我看的文献比较少，我想跟您请教，这个结论已经被大多数学者承认了吗？如果是的话为什么还有相当数量的文献上还用碱性彗星分析法检测放射敏感性？
2.还想跟您请教关于CASP小软件的使用细节问题：
2.1 关于casp里面那个frame的设定，frame有两个方框，那个小的没有包括彗星图像的方框有什么作用啊？好像是多余的，帮助文件上说在彗星图像有重叠的时候可以flip，可是我弄不明白有没有它有什么关系；
该把这个小方框放在上方呢 还是放在下方？好像有时候放在上方和下方结果有出入；
frame的大小如何设定，是参照这一批图片的最大图片设定的吗？那么如何根据最大图片设定，是大致只要包括彗星在内就行，还是紧贴着彗星，还是有别的要求？并且不同大小frame检测同一彗星结果不一样，有关系吗？还是只要同一批的frame固定就可以，相比较结果不变就行？
2.3 照像结果：图片结果的色调是不是不可以单独随意处理，会影响DNA含量的检测结果吗？我用的是跟显微镜连接的电脑上的照像软件，是不是应该保持所有的图片照像条件一致？
作者: 泡泡    时间: 2011-12-6 11:14


体内试验中,采集了动物的血细胞后要离心,然后重悬浮于PBS,请问这一步骤的具体作用是什么啊?
作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-6 11:15


如果是低等动物的血液,血细胞比较稀疏,那有必要离心吗?
强调一下该动物的血液中也包含几种不同类型的血细胞,且每种血细胞大小不一.那可以直接将抽出的血加抗凝剂后就进行SCGE试验吗?不同大小的血细胞的彗星拖尾可以进行综合分析吗?
谢谢~
作者: 小螺号    时间: 2011-12-6 11:15


请问一叶老师：

我最近刚刚才开始做碱性彗星试验，有几个问题向请教老师，
1. 老师提供的casp软件很方便，但是在分析的时候图像的大小是否需要标准化呢？ 是否一定要是老师所说得400*300呢？我尝试过不同大小的图片，结果是不同的；如果要用像素为标准发文章，那么比如对照组要达到什么要求呢？我觉得对照组不理想：总是有些细胞出现长一点的彗星。

2. 关于裂解液的问题，我看到过前面战友的问题和建议，加入DMSO和TritonX-100后出现乳白色，于是我特别注意了一下，我的溶液在加入这两个后，虽然是透明的，但是有少许不溶，于是我用磁石搅拌并加热，开始时更加浑浊且溶液成乳白色（我觉得可能是有气泡的影响），而后变得澄清一点但是在液面上会有漂浮着的液滴，请老师给一点建议。谢谢
作者: 西子    时间: 2011-12-6 11:16

一叶老师:
我最近在做小鼠多个组织（淋巴细胞、骨髓、肝脏、脾、肾、肺、睾丸等）细胞的彗星试验，但结果都不理想，主要是在显微镜下看到的细胞很模糊，边界不清楚，象是很多颗粒状物质组成。请老师帮忙分析分析原因，及在试验过程中的注意问题。裂解时间3小时，电泳23v、28mA条件20min。
有没有这些组织彗星照片呀？可以参考一下。
另外，彗星试验主要检测DNA损伤与修复，关于检测DNA修复过程，一般在给药后多长时间做，分为多少时间点，有没有最长时间限制？因为考虑到细胞代谢问题。（我是一次性给药）
非常感谢！
作者: 西子    时间: 2011-12-6 11:16

我也想要美国召开专门会议讨论SCGE的标准化的文献和CASP分析软件能发一份给我吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:17

看了各位前辈的讨论 受益匪浅 也看了一些彗星电泳的文献 发现所用染料的种类和浓度各不相同 举例如下：
EB 2μg/ml及20μg/ml
吖啶橙 20μg/ml及10g/ml
PI 2.5μg/ml及50μg/ml

请问楼主：本人倾向使用吖啶橙或PI 怎么使用为好 请指点迷津 万分感谢！！！

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我的看法，尽信书不如无书。
做两次预试验，用你的实践检验一下别人的说法，得到自己的结论。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:18

一叶, 我按照你说的重复了一遍实验，但还是control和阳性都有彗星。

我用的是Hela细胞，阳性用0.6%的H2O2处理，阴性就是PBS悬浮细胞。然后中性裂解条件下裂解细胞2h，4h，过夜，作比较，结果差不多，control和阳性都有彗星，彗星的程度也差不多。

我的中性裂解液配方为（参考的文献）：
2％ sarkosyl, 0.5M Na2EDTA, 0.5mg/ml proteinase K (pH=8.0)。
我现在怀疑是不是裂解液配方的问题（过强了？）

电泳条件，你用多少V/cm去跑的？我的是10cm槽，30V电压，9mA电流，跑25min。我看文献上写0.6V/cm，可这样的话，我的电泳槽就是用6V去跑，我觉得有点离谱。不知你是什么意见。

等有时间，把我总结的protocol传上来一份，跟大家分享一下。

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过夜？怎么处理的？不过夜试试吧。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:18     标题: 回复 #731 tianmei001 的帖子

1、碱性应该是检测单+双链断裂的，这也许是文献多采用碱性的缘故；
2、小框是背景框，目的是消除背景影响，分析时根据图片的背景情况，选择在上还是在下，分析同一批图片应该是固定分析框大小的，采集图像当然是应该保持所有的图片照像条件一致。
CASP用多了以后确发现一些问题，我们刚刚购买了美国联合的彗星分析软件，准备换软件了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:18     标题: 回复 #732 泡泡 的帖子

离心的目的是分离某些细胞，然后重悬浮于PBS是为了调节细胞密度。
可以进行全血的SCGE，关键要根据试验目的，细胞类型复杂必然增加以后数据处理的难度和结果的科学可信度。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:19     标题: 回复 #734 小螺号 的帖子

1、图像大小一定要固定！否则试验结果完全是废纸。
2、请先确定你的DMSO和TritonX-100是否新鲜，放置过久的话会影响使用；加入二者后充分混匀，然后放4度冰箱，过十几或二十分钟后再看看，也许你会有不同的发现！不必加热！
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:20     标题: 回复 #735 西子 的帖子

我做过淋巴细胞、骨髓、肝脏的SCGE，见过园内一个高手做的睾丸SCGE图像，都很漂亮。用本专题前面提到的条件再试试吧，贴张图上来看看？
后一个问题我认为应该问你的预实验结果。
作者: @STAR@    时间: 2011-12-6 11:20


我的彗星电泳正常细胞核有点散了的感觉,我解旋30min,电泳液PH13,其他处理组有慧尾,核也能看出来,请问这是怎么回事?
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:21


解旋20min~~~~~~~~~~~~
作者: tianmei001    时间: 2011-12-6 11:21

1、图像大小一定要固定！否则试验结果完全是废纸。
2、请先确定你的DMSO和TritonX-100是否新鲜，放置过久的话会影响使用；加入二者后充分混匀，然后放4度冰箱，过十几或二十分钟后再看看，也许你会有不同的发现！不必加热！

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谢谢老师耐心解答，问题2当天已经解决了，只是有点好奇别人提出来的方法和现象。关于问题1，其实我很想知道图像大小固定多少比较好，有没有相关“规定"？因为我看到的几篇文献中好像只表明软件也不标明这个啊，我觉得缺少可比性；想多提个问题，改变胶的浓度对结果影响大么？因为我这里总下雨，空气湿度差别大，胶有的时候凝得不好……当然还是要固定的，不然也是废纸，呵呵
作者: BOSS2011    时间: 2011-12-6 11:22


一叶老师：有2个问题想请教一下：

我做的是兔视网膜色素上皮细胞SCGE
1.正常组出现彗星细胞。我的大致步骤为：第二层胶铺完后，4C固定15min，裂解1h，电泳条件：15V 95mA 30min，EB染色5min
2.裂解液（保存液，于4C保存）结晶非常多，已使用2个月，使用前应如何处理？是否需要重新配制。
作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-6 11:22

谢谢一叶老师的之前的解答.
请问最后实验结果分析时,对DNA 损伤程度分级: 无无损伤(< 5%) ; 低损伤(5%～ 20% ) ; 中度损伤(20～ 40% ) ; 高度损伤(40%～ 95% ) ; 完全损伤(> 95%),是根据什么数据分析的啊?是拖尾率还是每个细胞头部DNA的百分含量?
作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-6 11:24


文献中说:"细胞DNA 损伤以损伤细胞(尾长> 头半径) 即彗星占总体细胞百分比和任意值表示. 任意值的意义为DNA 损伤不同则彗星形状不同, 据此将细胞分为5 级: 0 级为未损伤细胞, 4 级为损伤最严重细胞, 中间依损伤程度分为1 , 2 ,3 级. 1 张片子上每一种类型的细胞百分比乘以其级别号并相加在一起, 就得到一任意值, 此任意值即表示这一样品的损伤程度."
我还是不是很明白上面的DNA损伤程度即任意值的算法,请高手们讲解一下吧,谢谢.
作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-6 11:25

请问分析彗星细胞时那些凋亡了的细胞也一起分析吗?
凋亡细胞是死了的细胞,也算是彗星细胞吗?
作者: 蒲公英    时间: 2011-12-6 11:25

我想问一下：为什么我的裂解液很难溶解；我在电磁炉上煮也不溶解，微波炉里加热也溶不了
作者: 蒲公英    时间: 2011-12-6 11:26


想问以下各位老师,EB染色后需要用蒸馏水冲洗吗?
作者: 蒲公英    时间: 2011-12-6 11:26

麻烦问一下,你有没有做过全血细胞彗星实验,我取20血+80的LMP,
这样是不是细胞数太少了,怎么什么也看不到?
作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-6 11:27

请问彗星图像拍出来以后,进行数据分析时,那些凋亡细胞也要一起进行分析算入整个实验结果中吗?
凋亡细胞是死细胞了,它的数据结果会不会影响整个实验结果?
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:28

谢谢老师耐心解答，问题2当天已经解决了，只是有点好奇别人提出来的方法和现象。关于问题1，其实我很想知道图像大小固定多少比较好，有没有相关“规定"？因为我看到的几篇文献中好像只表明软件也不标明这个啊，我觉得缺少可比性；想多提个问题，改变胶的浓度对结果影响大么？因为我这里总下雨，空气湿度差别大，胶有的时候凝得不好……当然还是要固定的，不然也是废纸，呵呵

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这是个好问题，对于CASP来说，图像固定大小显得非常重要，因为软件给出的单位是象素，而不是微米，软件直接检测读入的图像。我一直固定在400×300。
而对于其他更好的软件，它是有内置标尺的，给出的单位是微米，标尺可以根据图像的大小而改变，所以给出的结果是实际长度。
胶的浓度是要注意的，尤其是反复煮沸的，不易掌握，还是新鲜配的比较好。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:28

我做的是兔视网膜色素上皮细胞SCGE
1.正常组出现彗星细胞。我的大致步骤为：第二层胶铺完后，4C固定15min，裂解1h，电泳条件：15V 95mA 30min，EB染色5min
2.裂解液（保存液，于4C保存）结晶非常多，已使用2个月，使用前应如何处理？是否需要重新配制。

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条件应因细胞的不同而不同吧，多几次实验看看吧。
裂解液用前要加DMSO和TRITON的，是否加了？用前是否把结晶充分溶解？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:29     标题: 回复 #753 爱老虎游tt 的帖子

最好计算率，不记如分析数据，它应是一个单独的指标。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:30

文献中说:"细胞DNA 损伤以损伤细胞(尾长> 头半径) 即彗星占总体细胞百分比和任意值表示. 任意值的意义为DNA 损伤不同则彗星形状不同, 据此将细胞分为5 级: 0 级为未损伤细胞, 4 级为损伤最严重细胞, 中间依损伤程度分为1 , 2 ,3 级. 1 张片子上每一种类型的细胞百分比乘以其级别号并相加在一起, 就得到一任意值, 此任意值即表示这一样品的损伤程度."
我还是不是很明白上面的DNA损伤程度即任意值的算法,请高手们讲解一下吧,谢谢.

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分级的文献很少，个人认为不能称其为“标准”，这个任意值还是有道理的，软件得到的数据往往分布不好，这个任意值可以避免这个问题，试想，损伤级高的细胞占的比例越大，这个任意值越大，当然损伤程度越高，应该不难理解。前提是每一样品的细胞数目应一致。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:31

麻烦问一下,你有没有做过全血细胞彗星实验,我取20血+80的LMP,
这样是不是细胞数太少了,怎么什么也看不到?

想问以下各位老师,EB染色后需要用蒸馏水冲洗吗?

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你要的什么细胞，淋巴细胞吧？根据细胞数计算一下你铺入胶的细胞浓度不就清楚了？如果没有这方面的数据，那就多几次预实验！还要考虑不同组别对血细胞的影响。
EB染后当然要冲洗。
什么东西那么难溶？看看配方。
作者: 阿敏    时间: 2011-12-6 11:32


请教一下一叶老师：
我做的阴性对照里，有拖尾，有不拖尾的，实在想不出来是什么原因，我用的是斑马鱼的鱼鳍细胞，用银染法染的，改天我把图片贴上来，您帮我看看
作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-6 11:37


感谢一叶老师的耐心解答.

想再问一下,如果不把凋亡细胞算做彗星细胞,那凋亡细胞的比率计算就是算它占随机所数的总细胞数的百分比吗?
作者: 阿敏    时间: 2011-12-6 11:37


这是我的图片，请一叶老师帮我看一眼

图片附件: 41324128.snap.jpg (2011-12-6 11:37, 65.32 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9555

作者: 阿敏    时间: 2011-12-6 11:38

这样的拖尾不是很多，但是还是有一些存在，大多数的图片是下面那样的

图片附件: 90071880.snap.jpg (2011-12-6 11:38, 64 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9556

作者: 阿敏    时间: 2011-12-6 11:38

还有以下两种，在一个片子上拍的

图片附件: 55664244.snap.jpg (2011-12-6 11:38, 43.78 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9557

作者: 阿敏    时间: 2011-12-6 11:39


另一种

图片附件: 47411883.snap.jpg (2011-12-6 11:39, 61.39 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9558

作者: HP007    时间: 2011-12-6 11:39

最近要做大鼠脑组织细胞的彗星试验。因为试验室条件有限，取完脑组织后需要运往另一个试验室做彗星试验，请问脑组织该如何运输？用液氮罐保存运输可以吗？会不会破坏细胞印象结果？
作者: 中国特色    时间: 2011-12-6 11:40

现在我有个疑问还望老师指教.由于实验条件所限,我们实验室的荧光显微镜无法接相机.请问我如果用相机从目镜下,对准镜头,拍下的照片可以用软件分析吗?
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:40     标题: 回复 #764 阿敏 的帖子

对这种细胞不熟悉，是否细胞类型决定的？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:41     标题: 回复 #766 中国特色 的帖子

恐怕很难！本身拍荧光的曝光时间就比较长，这样恐怕很难拍到理想的图像。什么镜子？居然没有接口吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:41     标题: 回复 #765 HP007 的帖子

各组保持同等条件。只能这样了，条件所限。
作者: 中国特色    时间: 2011-12-6 11:42

我们实验的镜子是80年代的老镜子了,可已接胶片相机,我没见我们实验室的其他人接过数码相机,那用胶片照后,冲洗后,再扫描到电脑上可以分析吗?
作者: 笑弯了腰    时间: 2011-12-6 11:42

我也想过有这种可能，但是在阴性对照里出现拖尾，我想不明白，难道这种细胞特别敏感？还有事想请教您，银染法做的不知道该怎么测量，我看文献里的一般都只测量彗尾长度，这个指标是不是单一了点，好像说服力不够，请您指点迷津
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:42     标题: 回复 #771 笑弯了腰 的帖子

还有很重要的指标：尾矩，OLIVE尾矩
银染法不知道是否能得到这两个指标，用软件试试。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:43     标题: 回复 #770 中国特色 的帖子

能接胶片机就能接数码！
作者: windy+++    时间: 2011-12-6 11:43

我最近在做单细胞凝胶电泳，但是每次在电泳以后就什么也看不到了，而且在铺胶、裂解后都看过，也有细胞的，可能问题是出在电泳上，但是具体原因一直没有弄明白 ，电泳完后也没有看到明显的脱胶现象。
以前师兄师姐也做过小鼠睾丸细胞、淋巴细胞的彗星，效果都挺好的。方法都是按照他们摸出的条件进行的，可是做了很多次都是没细胞 。
这是不是就是电泳的问题呀？可是不应该细胞全都丢失的。还请老师和各位帮忙分析一下原因。非常感谢大家！
作者: windy+++    时间: 2011-12-6 11:44


而且试验主要以SCGE为主的，当时没考虑到会有这种情况出现，很长时间了，一直都解决不了，实验根本没办法开展。恳请大家一定帮帮忙。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 11:44     标题: 回复 #774 windy+++ 的帖子

1、你用几层铺胶法？是否低熔点胶在电泳时融化了？
2、铺胶、裂解后是怎么看的细胞？是否染色没染上？
3、是否激发光用错了？
4、我觉得然后才考虑是否电泳的问题。
作者: windy+++    时间: 2011-12-6 11:45

铺两层胶，都是0.8％的浓度，试过三层，结果也都一样的。
电泳液预先在冰箱预冷，电泳后看到胶也在。
铺胶 裂解后都是用EB染色看的。
昨天又做了一次，解旋后细胞就没了（时间2 0min）
作者: windy+++    时间: 2011-12-6 11:45

在用CASP时，图像分析框怎么不能拖大呀，好像就是四个点，动不了。
作者: dotaaa    时间: 2011-12-6 14:31

我在配液的过程中遇到一些问题向您请教
1.裂解液是否非要用磁力搅拌器配置，我自己手动配制总觉得不能完全透亮。
2.配20 mmol/L Na2-EDTA的HANK'S液里的Na2HPO4究竟是多大量，园中各处讲得都不一样。
其中需要加葡萄糖吗，如果要加，可不可以用临床上的葡萄糖液配制
3.染色用的PI应用什么溶液配置？
作者: 缘yuan    时间: 2011-12-6 14:32


请问做精子细胞的彗星试验时,收集到的精子冷冻保存的最低温度是多少啊?能保存多久?
一般是直接用冰冷的PBS稀释后就放冰箱里吗?是不是还要加一些保护剂什么的?
作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-6 14:34


如果是做低等的水生生物的彗星试验,如贝类,它的精液和血液是相混合的,怎么样才能从血细胞和精子细胞分离出纯的精子细胞呢?保存方法又是如何呢?
期待高手们的指点!
作者: loli    时间: 2011-12-6 14:35

我做SCGE时，以前裂解２h刚好，可是最近裂解２h总是裂解不好，细胞的痕迹还在，中间有一个圆圆的亮核，或者是一团，好象是细胞框架．要不就什么也看不到，不知是什么原因．裂解液配好后放４度冰箱，用之前水浴溶解，这样会有影响吗？还有第二层胶的浓度对裂解的影响大吗？
作者: ladyhuahua    时间: 2011-12-6 14:37

做了几次，但做出来正常小鼠细胞（骨髓、肝、睾丸、脾等）都出现了很长的拖尾，而且每一个都是，有的连主核都看不到，只有散在的尾巴。
裂解时间减少到1h，电压、电流及电泳时间都降低，结果还是一样。
甚至不经过解旋直接进行电泳的片子上也都出现拖尾。
在解旋后看到细胞核就已经很分散了。
试验过程中PBS、裂解液、电泳液都是经过预冷的；（裂解液：2.5mol/L NaCl、100mmol/L Na2EDTA、10mmol/LTris、1%肌氨酸钠，用NaOH调节pH=10，溶解后置4℃保存；临用时加入10%二甲基亚砜、1% TritonX -100。电泳缓冲液：1mmol/L Na2EDTA，300 mmol/LNaOH，pH=13。NMA、LMA浓度都是0.8%）
麻烦老师帮忙分析分析这可能是什么原因引起的呀？非常谢谢!
作者: glass    时间: 2011-12-6 14:41

准备做中性彗星实验，请问您的正常熔点琼脂糖和低熔点琼脂糖分别是那家公司买的，用三蒸水配制可不可以？谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 14:42     标题: 回复 #784 glass 的帖子

sigma的，我用PBS配。
作者: 缘yuan    时间: 2011-12-6 14:45

这是最近做出来的，请大家帮忙看看能不能分析，好像细胞拖尾不好。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9561

作者: 缘yuan    时间: 2011-12-6 15:05


还有几张。细胞边缘很毛

图片附件: 57599314.jpg (2011-12-6 15:05, 21.91 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9562

作者: 缘yuan    时间: 2011-12-6 15:05

是不是裂解不充分的原因呀

图片附件: 95601221.jpg (2011-12-6 15:05, 24.63 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9563



图片附件: 37742221.jpg (2011-12-6 15:06, 22.86 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9564

作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:07     标题: 回复 #788 缘yuan 的帖子

最后一张还可以~~~~~~~~~~~~~~~~~~
作者: abc816    时间: 2011-12-6 15:07


第一张有拖尾的不是细胞，是杂质。
同样第二张中的个别也不是。
关键是显微镜的光没有调好，照相机的焦距没对好。
作者: 月牙牙    时间: 2011-12-6 15:08

请教一下：如果用数码相机照彗星照片，是不是要用与荧光显微镜配套的数码相机呢？是接在接CCD那个孔吗？这么接呢？是不是有专门的什么东西呢？我那天从目镜照了几张，感觉一是太慢了，二是很模糊，照了来分析根本不现实。请指点！
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:14     标题: 回复 #791 月牙牙 的帖子

对，这要看你找一个与显微镜比较配合的相机，关键在有合适的接口。找公司解决应该不是问题。
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-6 15:15

我做了好几次单细胞电泳了，每次的结果都是镜下基本看不到细胞，只是一些象细胞碎片的东西，偶尔看到一个两个还不能确定是否是彗星实验的结果。不知道大家在试验中有没有遇到类似的情况，我找了很多原因，最后照共聚焦显微镜，老师也是说只有些细胞碎片的东西，不象是细胞裂解电泳的结果，我用的一种肿瘤细胞hela，细胞数很多，每次用一瓶至少是3×10的6次方，我真的是不明白怎么会没有细胞呢？

一下是我的实验步骤（我用的是碱性条件，基本都是跟园子里讨论的差不多）：

1.铺第一层胶，正常熔点琼脂糖05%110uL立即盖上盖玻片，4度，15min 固化

铺第二层胶按1：1细胞与1％低熔点琼脂糖混合，80uL，滴到第一层胶上面，固化条件同上。

2 裂解，（2.5mol/LNaCL, 100mmol/LNa2EDTA, 10mmTris, 调PH10，用前加TritonX100， 10％DMSO，）裂解1.5-2小时。

3解旋：裂解后用蒸馏水洗去过多的盐，加入电泳缓冲液（1mmNa2EDTA, 300nMNAOH,PH13),闭光静置30分钟

4 电泳 18V 200mA， 25min

5 漂洗及染色：PH7.5Tris-HCL洗3次，5ug/mlEB染色5min，用蒸馏水冲洗掉多余

6镜下观察

（另外，我滴加EB之后盖上盖玻片，冲洗直到观察都没有把盖玻片拿掉）
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:15     标题: 回复 #793 小鱼鱼 的帖子

铺完胶后去掉盖片时是否都把细胞随胶拉掉了？
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-6 15:16


没有，无论是正常熔点还是低熔点的胶都是完整的，我真的是不明白细胞怎么就找不见啊，镜下基本就看不到细胞，偶尔看到点碎的东西，请问一叶，会不会是我的低熔点胶温度太高与细胞混合时把细胞都烫死了(实在是想不到，这个原因太牵强）
作者: lixi559    时间: 2011-12-6 15:16

请问各位大侠：
1、小弟正在摸索中性彗星电泳，关于裂解液，中外文献上都说是pH 8.2~8.5之间，究竟pH多少是最佳条件呢？
2、小弟以前做过碱性彗星电泳，最后得到的彗星很清晰，但最近摸索的中性彗星电泳得到的彗星总不是太清晰，无论怎样调焦显微镜，似乎都无法得到清晰的图像，这是为什么呢？

多谢了，各位高手！
作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-6 15:17

请问：铺完第二层胶后盖上盖玻片，隔了比较久才去揭盖玻片，胶变得很干，盖玻片很难揭下来，请问怎么补救啊？
是不是这样包埋在胶中的细胞也受到了一定的损伤啊？
作者: loli    时间: 2011-12-6 15:22

再向您请教一个问题，我是做放射生物学，根据您的实际操作经验，请问，碱性彗星电泳和中性彗星电泳能否检测到的DNA损伤，X射线辐射所需的最低剂量分别是多少Gy？
作者: loli    时间: 2011-12-6 15:23

实在是不好意思，向您请教第3个问题，中性彗星电泳的电泳参数众文献说法不一，文献上一般没有提到电流，我使用的是25V，25min。而且我的实际操作无法调到200mA，即便是改变电泳液体积也没办法，电泳液使用的是0.5*TBE。请问这是怎么回事？
作者: TAT    时间: 2011-12-6 15:23


请教一叶老师和各位高人：我做的彗星实验怎么彗星跑的很散呢？不像lq6688老师：老师做的感觉尾巴很漂亮。是不是裂解还是解旋时间的问题呢？请解答！！！
作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-6 15:24

请教高手门：
实验室要新买一个电泳槽专门做彗星试验，请问电泳槽买多大的为适合呢？凝胶板规格有250×240，120×240，60×240mm的，多大比较合适呢？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:24

没有，无论是正常熔点还是低熔点的胶都是完整的，我真的是不明白细胞怎么就找不见啊，镜下基本就看不到细胞，偶尔看到点碎的东西，请问一叶，,会不会是我的低熔点胶温度太高与细胞混合时把细胞都烫死了(实在是想不到，这个原因太牵强）

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不是37度吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:25

请问：铺完第二层胶后盖上盖玻片，隔了比较久才去揭盖玻片，胶变得很干，盖玻片很难揭下来，请问怎么补救啊？
是不是这样包埋在胶中的细胞也受到了一定的损伤啊？

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唯一的补救就是重做了，呵呵。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:25

再向您请教一个问题，我是做放射生物学，根据您的实际操作经验，请问，碱性彗星电泳和中性彗星电泳能否检测到的DNA损伤，X射线辐射所需的最低剂量分别是多少Gy？

万分感谢：）

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0.05Gy，我也是参考文献的，没试过。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:28

实在是不好意思，向您请教第3个问题，中性彗星电泳的电泳参数众文献说法不一，文献上一般没有提到电流，我使用的是25V，25min。而且我的实际操作无法调到200mA，即便是改变电泳液体积也没办法，电泳液使用的是0.5*TBE。请问这是怎么回事？

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好像很多人都有此类问题，很难同时做到恒流和恒压
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:28

请教一叶老师和各位高人：我做的彗星实验怎么彗星跑的很散呢？不像lq6688老师：老师做的感觉尾巴很漂亮。是不是裂解还是解旋时间的问题呢？请解答！！！

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图像还可以，是否染色前后放的时间久了？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:28

请教高手门：
实验室要新买一个电泳槽专门做彗星试验，请问电泳槽买多大的为适合呢？凝胶板规格有250×240，120×240，60×240mm的，多大比较合适呢？

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这个完全根据自己实验需要，每次跑的量。等等

没有特定的标准。
作者: 了了    时间: 2011-12-6 15:31

介绍给大家一个彗星分析软件 Comet Assay IV,从 cuturl('http://excellentfaith.com/')可以下载免费试用一个月.
作者: HP007    时间: 2011-12-6 15:32


有没有人用过北京六一仪器厂的DYY-7C型的电泳仪,实验室新买了一台,用的时候电压稳定后总是比预先设定的低2v,问了厂家,说是正常范围的波动,这算不算呀?照着样看是不是每次用的时候都得调高2v才行?不知道大家有没有遇到这种情况的?
作者: HP007    时间: 2011-12-6 15:32


一叶老师:想问一下用casp分析的时候,分析框的大小怎么确定呢?同一个图像框大小不同,最后分析结果有差别,多大比较合适呀?
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:33     标题: 回复 #809 HP007 的帖子

不是主要问题~~~~~~~~~~~~~~~·
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:34     标题: 回复 #810 HP007 的帖子

一般大小在肉眼看到的彗星图像大小的两倍左右比较合适。关键片子要做的好。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-6 15:35

现在才真正的接触到具体的实验－－单细胞凝胶电泳！我的实验进程比较顺利，而且图象也不用CASP或其他软件进行分析，直接用软件里的标尺（这个abc816和一叶老师也提过有这个取代像素的问题，真是有先见啊，佩服）就可以得到数据了！条件经过几次的摸索今天也定了下来，但是在这几次的摸索中，很多经验也是从帖子中得来的，电压的高低，裂解液要透明，裂解时间的把握等等，都是帖子里看来的。这里谢过所有的战友们，你们的问题使我有了今天的成功！
一叶老师说过：ALL FOR ONE , ONE FOR ALL!为了感谢一叶老师以及各位战友，我总结了一下我们实验室在这个试验当中关于防止EB污染的试验操作，在这些操作中我们尽量将污染降低到最小化，但是每个环节不可能都是最佳的，希望各位战友也说说你们实验室是怎样防止EB污染的，相互学习，做出一个最佳的防止EB污染的试验操作方法，将EB的污染最低化。为单细胞凝胶电泳技术的标准化做出些许努力！
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:36

我总结了一下我们实验室在这个试验当中关于防止EB污染的试验操作，在这些操作中我们尽量将污染降低到最小化，但是每个环节不可能都是最佳的，希望各位战友也说说你们实验室是怎样防止EB污染的，相互学习，做出一个最佳的防止EB污染的试验操作方法，将EB的污染最低化。为单细胞凝胶电泳技术的标准化做出些许努力！

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我们染色是不用枪的，用1毫升的一次性注射器，操作比较简单，只是稍显浪费，呵呵。
作者: bohe221    时间: 2011-12-6 15:36



但是我有一些问题，希望各位高人能帮我解决
1、我用的也是外周淋巴细胞，但我做的是猪的外周淋巴细胞，我需要一起集中采样，在做实验时不可能一次都做完。我想问一下，其保存方法是什么？是直接包存抗凝的全血还是将淋巴细胞提取后保存淋巴细胞悬液，
在保存过程中是否应加入营养物质或保护剂（如犊牛血清，RPMI1640）？
2、用SCGE时，对分析DNA损伤与细胞调忘上有什么区别嘛？
3、看其他文献说在磨砂玻片上每铺一层胶时滴加100ul，但用一叶老师发明的为电用槽时（可以跑2个样），是在每一个方格内都铺100ul（这样会不会太厚了），还是在整个槽内共加100ul？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:37     标题: 回复 #815 bohe221 的帖子

1这个不宜保存时间太长，否则结果就不准了，可以把片子都跑完，固定后保存。
2、没看懂；
3、每个小槽都加100，实践证明效果不错。
作者: bohe221    时间: 2011-12-6 15:43

我还有俩个比较弱质的问题想问一下：
1、用淋巴分离液分离出淋巴细胞后上层的血清可以再用来测血清生化指标和免疫指标嘛？
2、我们学校的实验条件有限电泳槽不够用（做分子的学生多），如果我要用 Na2EDTA和 NaOH配置的电泳液的话就和其他同学的电泳液不一样。我就的单独用一个电泳槽，但是电泳槽比较紧张，可不可以用TBE做电泳液？
作者: 911    时间: 2011-12-6 15:44


想问一下，我用的是恒压 ，25V,前几次正常，今天不知道怎么回事，电压达不到了，电流显示为0 ，我的电泳夜比上次实验的倒的多了点，难道是这个原因，电泳仪应该没有问题。
作者: 911    时间: 2011-12-6 15:44


帮我看看我的结果怎么回事吧，苦恼，做了几次都不成功

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9565

作者: 911    时间: 2011-12-6 15:46

您好，想问一下，我看见有文献说中和后可以使片子室温干燥，或中和后用乙醇处理了过夜第二天染色，哪第二天染色是直接加EB吗？会不会太干燥影响结果阿？
作者: zhezhe    时间: 2011-12-6 15:47


从头到尾看完了这长长的帖子，真为各位群友的无私情怀与探索精神所感动，而且从中学习到了好多东西。我从前没有接触过SCGE，甚至连电泳都没接触过，而且我们实验室没有做过分子方面的内容，在这方面真的是一穷二白！我想问问各位战友电泳电源和电泳槽都用的什么牌子和型号的呀，有用六一的吗？还有小鼠原代肝细胞培养能不能不用二氧化碳培养箱呀（我们只有超净台）？当然最好是能够找个实验室（地点在北京）可以让我去做，不知那位战友能帮忙介绍一个，付钱是理所应当的！谢谢
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:47

我还有俩个比较弱质的问题想问一下：
1、用淋巴分离液分离出淋巴细胞后上层的血清可以再用来测血清生化指标和免疫指标嘛？
2、我们学校的实验条件有限电泳槽不够用（做分子的学生多），如果我要用 Na2EDTA和 NaOH配置的电泳液的话就和其他同学的电泳液不一样。我就的单独用一个电泳槽，但是电泳槽比较紧张，可不可以用TBE做电泳液？

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1、最好不用，那是用促凝血清做的吧；
2、当然不能，买一个不就行了？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:48

想问一下，我用的是恒压 ，25V,前几次正常，今天不知道怎么回事，电压达不到了，电流显示为0 ，我的电泳夜比上次实验的倒的多了点，难道是这个原因，电泳仪应该没有问题。

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是，调整一下，肯定没问题。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:48

想问一下，我看见有文献说中和后可以使片子室温干燥，或中和后用乙醇处理了过夜第二天染色，哪第二天染色是直接加EB吗？会不会太干燥影响结果阿？

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我没试验过，我比较接受第二种办法。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:48

帮我看看我的结果怎么回事吧，苦恼，做了几次都不成功

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看不出来，什么都没有。
作者: qqq111    时间: 2011-12-6 15:50

不知道大家有没有遇到过同时需要处理多个样本的情况，比如要同时对25只小鼠的肝脏、肾脏、外周血淋巴细胞、脾脏、骨髓等器官制备单细胞悬液，然后进行SCGE，我觉得单是处理得到这些样品恐怕就得1整天时间，而药物的代谢过程是动态的，尤其是DNA断裂是个损伤与修复同时进行的动态过程，因此样品采集应尽可能保证同时进行，但现实的情况又该如何处理呢？这个问题已经想了好多天了，也和别人讨论过，也看了前面相关的帖子，总觉得还是没有一个特别好的办法，不知哪位群友做过这方面的试验，把经验分享一下吧！
作者: flower-201    时间: 2011-12-6 15:50


我做的图片都是散的，不是真正的前面一个圆的亮的，后面有托尾，无论损伤浓度达到多少图片都是散的，看到有人提到裂解过头的问题，我想请问大家：裂解过头是该怎么理解呢？因为我感觉DNA基因组被包在核膜里，裂解就是把核膜给去掉，应该不会把DNA给裂解散了呀？到底是为什么呢？
作者: DNA    时间: 2011-12-6 15:51

我有个问题就是碱性单细胞凝胶电泳可以检测DNA链的断裂和碱不稳定点，请问碱不稳定点是不是DNA上的脱嘌呤/嘧啶位点呀？还有个问题就是彗星试验检测到的DNA断裂其实是DNA损伤与修复的共同作用的结果，而且DNA修复的一个重要方式就是核苷酸切除修复，因此DNA修复过程也会造成DNA链的断裂，所以彗星试验所反映的时间－效应关系，可能并非与真实的DNA损伤有偏差，因为它无法鉴别修复过程中的DNA断裂。您说我这样理解对吗？
作者: 笑弯了腰    时间: 2011-12-6 15:51

刚刚做的彗星图　感觉效果不好　
背景有些红　彗星也不亮
请一叶老师指点下

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9566

作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:52     标题: 回复 #828 DNA 的帖子

太对了！！！！！！！！！！！
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 15:53     标题: 回复 #829 笑弯了腰 的帖子

背景不太好，染后洗过了吗？
作者: ha111    时间: 2011-12-6 16:05

染色后如何冲洗？是流水冲洗？冲洗时间需要多长？
如果用自来水冲洗会有什么样的影响？
一叶老师是用的双层胶，染色时间是三十秒　
我用三层胶，是否染色时间应该稍微长一点？
作者: ha111    时间: 2011-12-6 16:05

背景不太好，染后洗过了吗？

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染色后如何冲洗？是流水冲洗？冲洗时间需要多长？
如果用自来水冲洗会有什么样的影响？
lq6688老师是用的双层胶，染色时间是三十秒　
我用三层胶，是否染色时间应该稍微长一点？
作者: 克隆鱼    时间: 2011-12-6 16:06

体内彗星试验用的阳性对照是什么，有文献说是环磷酸铵，但剂量和时间没有明确，那位能解答一下，谢谢！
作者: qqq111    时间: 2011-12-6 16:06

我刚开始做彗星实验，看完这个专题后收获很多，非常感谢各位战友的无私奉献，特别一叶老师，能在这个专题坚持34个月，而且耐心的解答战友们甚至是重复的问题，我是由衷的敬佩。
前面一直提到的脱胶的问题，我请教了这边的师兄师姐，他们的方法是用无水乙醇提前浸泡磨砂载玻片和盖玻片，至少过夜（用前最好预热下），再使用。我试了效果还不错，希望对刚开始做此实验的群友能有帮助。
作者: bohe221    时间: 2011-12-6 16:14

一叶老师你好！
您说的所发过的细胞凋亡的彗星图片我已经看过了，但我还是没有发现“细胞凋亡的彗星图像”与“DNA损伤的彗星图像”有什么区别。
难道他们所跑出的彗星图象没有区别吗？
问题比较弱质，望见谅！
作者: one    时间: 2011-12-6 16:22


哪位知道肌氨酸钠与十二烷基肌氨酸钠（N-Lauroyl Sarcosine Sodium 有区别吗？文献上细胞裂解液成分中，有的写肌氨酸钠，但有的用十二烷基肌氨酸钠，我查了两者的分子量不同，应该不是一个东西，都搞糊涂了！
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-6 16:23     标题: 回复 #837 one 的帖子

肌氨酸纳可以不加的！！！！！！
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 16:23

您说的所发过的细胞凋亡的彗星图片我已经看过了，但我还是没有发现“细胞凋亡的彗星图像”与“DNA损伤的彗星图像”有什么区别。
难道他们所跑出的彗星图象没有区别吗？

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小头大尾和大头小尾的区别，以前提到过的。
作者: BUK    时间: 2011-12-6 16:24

我最近一直在做单细胞电泳，条件都是按园子里的做的，直认为没有甚么问题，可是最近几次总是出现凋亡细胞的图（头小尾巴很大），我的损伤模型是双氧水损伤二倍体成纤维细胞2BS5min后立即做彗星实验，实在是不知道问题究竟出在哪里？我的细胞保证都是没有凋亡的正常细胞，即使损伤也不至于5min就全部发生了凋亡了呀，请大家帮我找找原因吧
作者: BUK    时间: 2011-12-6 16:25

见图象：头很小，但是尾巴很大，我的电泳条件啥的都是碱性电泳条件，300mA，25V，20min，但是老是出现凋亡

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作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-6 16:25

请教一叶老师和各位高人：
彗星试验最后的分析指标有很多种，尾长、尾部DNA百分含量、尾矩、Olive尾矩等等。那最准最可靠的哪几种呢？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 16:27     标题: 回复 #841 BUK 的帖子

跑电泳的时候一定注意一下：电压和电流是否达到了你的设置值，经常出现设置好了以后，开始跑时实际条件是和你的设置值不一致，即使是叁恒电源也会这样，关键在调节电泳液的量来满足你的电泳条件。
作者: 西子    时间: 2011-12-6 16:28

请教一叶老师和各位高人：
彗星试验最后的分析指标有很多种，尾长、尾部DNA百分含量、尾矩、Olive尾矩等等。那最准最可靠的哪几种呢？

是啊，尾长没有单位啊，结果该怎么表示呢？很多用阳性率的，不知道行不？
作者: 阿敏    时间: 2011-12-6 16:33

我想请教一下，前面提到的“细胞凋亡的彗星图像”与“DNA损伤的彗星图像”的区别是“小头大尾和大头小尾的区别”，有没确切的理论依据，即有没文献上提到，如果有，还希望您能帮忙提供，谢谢。我已做过MTT证明了细胞的死亡，做彗星时图片中两中图像都出现了，我下一步准备做流式证明细胞的凋亡和坏死，如果彗星实验就可以说明凋亡就更好了，所以我希望有文献的支持，不知您是否能帮忙，在此表示感谢
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 16:34     标题: 回复 #842 爱老虎游tt 的帖子

两个尾矩应该是比较好的。
尾长是应该有单位的，多数是微米，有的是象素，比如CASP，世面上许多商业出售的软件是以微米为单位的。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 16:34


彗星做凋亡不是强项，绝对不如流式。
作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-6 16:35


谢谢您的解答，流式我是一定要做的。我现在只是想知道，在彗星实验中得出小头大尾的细胞为凋亡细胞的结论是从何而来的。
作者: caihong    时间: 2011-12-6 16:35


请教大家：裂解后，不染色，普通光镜下，是不是只能看到破碎的细胞？
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-6 16:35

应该是只能看到胶，看不到细胞
作者: dotaaa    时间: 2011-12-6 16:36

这个试验已经很成熟了，在Toxicology in Vitro 这个杂志上去查篇文献照着做就行，没什么难的！
作者: HP007    时间: 2011-12-6 16:38

我做了2次预实验，都没看到彗星细胞，也不知道问题出在哪？
作者: 969    时间: 2011-12-6 16:39


请教一叶群主、各位高手：我作了一次中性单细胞凝胶电泳。4Gy照射后，铺胶，裂解4度2h（2MNaCl，30mMEDTA，10mMTris，1%月桂肌胺酸钠pH8.2，1%Trtion-X100，10%DMSO），0.5%TBE解旋4度2h，而后电泳25V，8mA（最高就10mA）25min。没有彗星结果。我是按照师姐的论文上作的，但是没有得到一致的结果，不知是哪一步出了问题。电泳的电流是不是太低，但是师姐的论文上是这么写的，我做的时候也很难将电流调到100mA，否则电压很大。谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 16:40

200V , 200mA,
调节一下你的电泳液的量。
作者: 泡泡    时间: 2011-12-6 16:45


准备作彗星，想知道现在有没有EB替代品，最好作彗星的效果也比较好，能告诉我吗？在哪里买的，万分感谢！
作者: windy+++    时间: 2011-12-6 16:45


斑竹，您能推荐一个除了eb外，效果最好的染色剂么？谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 16:48     标题: 回复 #856 windy+++ 的帖子

AO~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
作者: yychen    时间: 2011-12-6 16:49

首先,感谢您无私的奉献!
我在做人精子的单细胞凝胶电泳,做了好多次,一直没有做出彗星. 我是用双氧水处理的,经裂解液\DTT\RNAseA酶和蛋白酶K去凝集,硷性电泳液(pH10),13V,130mA.不知为什么总是做不出来,是精子的裂解和去凝集的问题还是电泳的问题?很着急.麻烦您看看照片,帮忙分析一下?
非常感谢!

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作者: 盼盼    时间: 2011-12-6 16:49

老板让我做细胞毒理这方面的实验,要用到单细胞凝胶电泳技术,周围的同学都没有做过,我以前一点也没做过.我想请教老师能不能把配胶的具体步骤说一下.谢谢!用到那些试剂啊?
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-6 16:51     标题: 回复 #859 盼盼 的帖子

琼脂糖溶液的配制
正常熔点琼脂糖0.7g加入到 100ml 无钙镁磷酸缓冲液（PBS）中，搅拌，加热熔解，最终沸腾2次，至液体变透明，最终浓度为0.7％。分装到10ml的试管中，每管大约分装4-5ml 溶液，冷却后用封口胶封口，置4℃冰箱中储存。使用前加热熔解，每管加热熔解的次数不超过5次。分装用的试管使用前在紫外灯下照射15分钟。
低熔点琼脂糖0.65g，分别加入到 100ml 无钙镁磷酸缓冲液（PBS）中，搅拌，加热熔解，最终沸腾 2 次，至液体变透明，最终浓度为0.65％。分装到 10ml 的试管中，每管大约分装 4-5ml 溶液，冷却后用封口胶封口，置4℃冰箱中储存。使用前加热熔解，每管加热熔解的次数不超过 5 次。分装用的试管使用前在紫外灯下照射 15 分钟。
琼脂糖凝胶在 4℃冰箱中至少可储存 2 个月。
作者: 铜雀    时间: 2011-12-6 16:51


最近在作彗星实验，看了坛子里的经验之谈好很多，特别是lz，但是还是碰到很多问题：
1、为了防止脱胶，我采用磨砂片，正常熔点胶煮沸后，直接用滴管铺满整个玻片，再铺低熔点的胶，虽然胶有些浪费，但是解决了脱落的问题，但是不知道是不是这个原因，胶厚了些，显微镜下细胞比较模糊，不够清晰
2、作到现在为止，一直没有看到彗星，如果用UV 照射的话会出来吗？如何照射？是直接放在紫外线下照射吗？
3、镜下看到过细胞里面很亮，好像是核，是不是说明细胞没有裂解开来？
作者: loli    时间: 2011-12-6 16:54

各位高手:我在师姐师兄的论文里看到制备好单细胞悬液用台盼蓝染色后细胞的存活率应该达到90%左右才可以继续做彗星实验，我现在做的是人口腔颊粘膜彗星试验，我制备好的单细胞悬液（正常细胞）用台盼蓝染色后得到的细胞存活率只有33%，这已经是最大值了，不过继续做彗星实验可以观察到细胞。我想问一下各位为什么我测到的细胞存活率如此之低呢？我考虑是不是因为人的口腔颊粘膜细胞本来就是死细胞比活细胞多呢？哪位高手知道，请指点，万分感谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 16:54

首先,感谢您无私的奉献!
我在做人精子的单细胞凝胶电泳,做了好多次,一直没有做出彗星. 我是用双氧水处理的,经裂解液\DTT\RNAseA酶和蛋白酶K去凝集,硷性电泳液(pH10),13V,130mA.不知为什么总是做不出来,是精子的裂解和去凝集的问题还是电泳的问题?很着急.麻烦您看看照片,帮忙分析一下?
非常感谢!

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电泳条件是否需要调整一下？20V，200mA。
作者: 克隆鱼    时间: 2011-12-6 16:55

给位前辈，我想问问为什么我每次做都会脱胶，我的低熔点胶是0.5%,是一次配好后分装，每次用一小管，我老在中和的过程中脱胶。
作者: guagua    时间: 2011-12-6 16:56

用细胞裂解液处理后，细胞形状是完整的？还是只剩下核了？抑或，只剩下核DNA了？细胞裂解液的作用是将细胞内的膜结构裂解是吗？
另外，电泳时用大电泳槽和小电泳槽时所用的电压一样吗？都是20V吗？
谢谢了！
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 16:56


裂解是破坏膜结构的
槽的大小可能会有小区别，有按单位长度计算电压的。
作者: loli    时间: 2011-12-6 16:57

我做的是人口腔黏膜细胞的SCGE，裂解时间2h，电泳条件：21v,260mA，做出来的图像细胞比较散，毛边现象很严重。请帮忙分析分析可能是什么原因？谢谢！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9569

作者: loli    时间: 2011-12-6 16:57


再来一张，帮忙看看效果，这样能不能分析？

图片附件: 40763344.jpg (2011-12-6 16:57, 16.17 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9570

作者: loli    时间: 2011-12-6 16:57

很多都是这样的。

图片附件: 48491100.jpg (2011-12-6 16:57, 20.89 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9571

作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-6 16:58


请问单细胞凝胶电泳的电泳缓冲液能重复使用吗？
我每天都要做这个实验 ，每天都要重新配电泳缓冲液，有这个必要吗？如果不换电泳缓冲液对电泳效果有影响吗？
作者: 911    时间: 2011-12-6 16:59

实际上我做硕士时也做过彗星，只不过因为在别的课题组有一个师妹，做的彗星实验也非常好，结果就是我把细胞交给她，就不管了，收了结果请客了事。现在做博士居然还要继续做彗星，晕！！
看了你的帖子，好像没有完整的操作手册，能否贴出来分享？
另外对您制作的微电泳槽十分感兴趣，想问一下是4边围成的，还是两边围成的，还有微电泳槽能否重复使用，泡酸吗？泡酸边框是否会掉下来？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:00

我做的是人口腔黏膜细胞的SCGE，裂解时间2h，电泳条件：21v,260mA，做出来的图像细胞比较散，毛边现象很严重。请帮忙分析分析可能是什么原因？谢谢！

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毛边现象是正常的，因为已经破坏了细胞的膜结构，电泳后的细胞边缘不可能那么清晰，你的图应该没问题。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:00

请问单细胞凝胶电泳的电泳缓冲液能重复使用吗？
我每天都要做这个实验 ，每天都要重新配电泳缓冲液，有这个必要吗？如果不换电泳缓冲液对电泳效果有影响吗？

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那要看PH值了。
我对做实验的观点：无须教条，只要掌握规范和标准。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:01

看了你的帖子，好像没有完整的操作手册，能否贴出来分享？
另外对您制作的微电泳槽十分感兴趣，想问一下是4边围成的，还是两边围成的，还有微电泳槽能否重复使用，泡酸吗？泡酸边框是否会掉下来？

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操作流程可以参考许多文献，基本都差不多。
我的小电泳槽确实很好用，最近也买了现成的彗星玻片，还可以，英国有卖的，但比较贵，我买的国产的替代品，COMETSLIDE，都可以重复使用，我觉得没必要泡酸。
作者: 了了    时间: 2011-12-6 17:02


想请教一叶几个问题。比较菜的问题。
1，用数码相机照相，是对着荧光显微镜的目镜照吗？
2，能否看看您自制的电泳槽的图片，具体怎么做？
3，建议建个comet QQ群，这样更方便大家及时交流。
谢谢。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:03     标题: 回复 #875 了了 的帖子

1,这样做的效率太低！一般镜子会有接口，安装相机；
2，前面我发过的，原始图片找不到了，其实很简单的。可以买COMETSLIDES，我们也在用；
3、是件好事，但我还没用过QQ，呵呵。扩大交流是好事，还想搞搞comet的实验室比对呢。
作者: 生物迷    时间: 2011-12-6 17:03

请教一叶老师，
1. COMETSLIDES,在哪能买到？多少钱？相对普通玻片有何优点？
2. 我做了好多次预实验，阳性对照组都没观察到彗星，不知哪出错了。
作者: baidukk    时间: 2011-12-6 17:04

您好！
昨天刚下载了CASP软件，运行了setup_casp.exe program ，桌面快捷方式的图标显示的是不能运行的图标，就是点击它总是说快捷方式“casp.lnk”指向的驱动器或网络连接不可用。请确定磁盘插入正确或者网络资源是否存在，然后再试一次。总是出现这个问题，说快捷方式存在问题。能麻烦老师把具体的更为细节的安装步骤给讲一下吗？
谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:05     标题: 回复 #878 baidukk 的帖子

这个问题在这个专题早就提到了！
把自动生成的那个快捷删除，到安装目录找到那个可执行程序，建立一个它的快捷方式即可。
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-6 17:05

您好！有个问题想请教一下，我要从猪的血液中分离淋巴细胞，但没有猪的淋巴细胞分离液，只有人或鼠的。能否用人或鼠的淋巴细胞分离液来分离猪的血液淋巴细胞？
谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:06     标题: 回复 #880 乌贼老弟 的帖子

这个我也不知道，我当时分鼠的淋巴细胞就是用人的，效果很好。
作者: lixi559    时间: 2011-12-6 17:07

请教一叶老师彗星实验中的阴性细胞也有毛边吗？请帮忙看一下我这张图，是否为阴性细胞。有毛边但无慧尾。

图片附件: 21687122.jpg (2011-12-6 17:07, 26.58 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9572

作者: lixi559    时间: 2011-12-6 17:07

我下面这张图片中红线圈的是慧头，还是蓝线圈的是？

图片附件: 16704945.jpg (2011-12-6 17:07, 27.81 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9573

作者: lixi559    时间: 2011-12-6 17:07

我下面这张图片中红线圈的是慧头，还是蓝线圈的是？

图片附件: 88051376.snap.jpg (2011-12-6 17:07, 12.83 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9574

作者: lixi559    时间: 2011-12-6 17:08

请对照一下原图

图片附件: 17352706.snap.jpg (2011-12-6 17:08, 12.45 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9575

作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:09     标题: 回复 #885 lixi559 的帖子

你的图做的不错，背景很干净。可以用软件分析一下，红的小了，但蓝的又大了。
作者: lixi559    时间: 2011-12-6 17:10

感谢一叶老师的指导，能否发一张阴性细胞的图片看看？
作者: lixi559    时间: 2011-12-6 17:10

为什么我的CASP中选定框不能拉大？

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我也遇到了同样问题，不能拉大或拖动选定框
作者: 笑弯了腰    时间: 2011-12-6 17:11


染完色荧光显微镜下观察细胞，发现在同一块胶板，靠近胶板边缘的细胞的拖尾更长，而越往胶板中央细胞拖尾更短，这是什么原因呢？电泳的原因还是没裂解好啊？那拍照分析只要中央的细胞吗？
大侠们给我支支招啊！
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-6 17:11


各位同仁请教一下：我跑的片子在目镜中能看到但比较模糊，从照相软件系统中却不显示为什么啊？有谁遇到过啊？望赐教！！
作者: lixi559    时间: 2011-12-6 17:12


请教一叶老师，CASP软件参数指标太多，怎样才能在结果输出文件.text中去掉不想用的指标？手动删除太麻烦了，能否通过软件直接设定？万分感谢！
作者: caihong    时间: 2011-12-6 17:12

你好！我刚开始做彗星电泳，做了几张片子，用
H2O2损伤的，脱尾现象不明显，是否损伤剂量不够大？
令外想学习一下一下CASP分析软件，可是下面的网址下载不下来，是否有其他的下载方式？
cuturl('http://sourceforge.net/project/showfiles.php?group_id=91972')
作者: caihong    时间: 2011-12-6 17:13


有些群友用20*的镜头拍的片子非常好，

但我们只有10*、40*倍的镜头，请问一下，如何观察彗星电泳的结果？急求答案。谢谢！

有人拍出绿色的照片，请问如使用DAPI染色，在哪种光线下能拍出绿色照片？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:13     标题: 回复 #889 笑弯了腰 的帖子

胶是否不平？？？？？？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:14     标题: 回复 #891 lixi559 的帖子

我是用SPSS直接读取的，多余的指标可以直接删除。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:14     标题: 回复 #893 caihong 的帖子

最好用40的；
DAPI要用紫外，显蓝色。
作者: duoduo    时间: 2011-12-6 17:18

有几张片子的彗星图像怎么好像是被掏空了似的，而其他的则正常，那位同仁知道这是怎么回事呀？

图片附件: 71920380.jpg (2011-12-6 17:18, 12.9 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9576

作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-6 17:19


在一叶老师和各位群友的帮助下已经得出结论，可是最近这两天不知道为什么，低熔点琼脂糖凝胶再固化后，在取下盖玻片时，一部分胶就粘在盖玻片上了？各位谁知道是怎么回事？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:19


不加盖片不行吗？？？？？？
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-6 17:20     标题: 回复 #899 一叶 的帖子

我尝试过第二层胶不加盖玻片，50微升，就像您所说的，滴到中间，快速移动四角也能普的很平，但是在显微镜下观察，感觉细胞不是在一个平面上。
作者: 笑弯了腰    时间: 2011-12-6 17:20     标题: 回复 #894 一叶 的帖子

我的胶是铺平的，因为我看到靠近胶板（胶板是正方形）四个边的细胞都拖尾比中央要长。是什么原因，每次跑完电泳都是这个问题！急急急
作者: loli    时间: 2011-12-6 17:21

我们科室由于需要建立彗星实验的技术平台，因此想要购进一套彗星的分析系统，但是我们询问了好几家公司，报价都要几十万。我记得您曾在以前的回帖里说过你们现在也在使用这种系统，就想请问下相关的信息：大概的价格；使用的优缺点；该公司的联系方式。谢谢了！
作者: 西子    时间: 2011-12-6 17:22

我主要在铺胶中遇到问题， 我用的是毛玻璃载玻片（以前有人用过， 后洗干净我再用），铺第一层普通熔点胶的时候，加100微升0.8%NMP，然后盖上盖玻片在4°冰箱十分钟作用， 但取盖玻片的时候， 胶容易粘在盖玻片上， 有时候铺一批都成功不了几个。

请问是胶的问题？还是玻片用久了，毛玻璃洗平滑啦？还是其他
作者: 中国特色    时间: 2011-12-6 17:22

我最近在做彗星实验，想请教您一下EB染色后需要加盖玻片吗？因为我加片会有气泡产生，如果不加多长时间染色合适啊
作者: loli    时间: 2011-12-6 17:23

我主要在铺胶中遇到问题， 我用的是毛玻璃载玻片（以前有人用过， 后洗干净我再用），铺第一层普通熔点胶的时候，加100微升0.8%NMP，然后盖上盖玻片在4°冰箱十分钟作用， 但取盖玻片的时候， 胶容易粘在盖玻片上， 有时候铺一批都成功不了几个。

请问是胶的问题？还是玻片用久了，毛玻璃洗平滑啦？还是其他原因？
另外， 你说的cometslide 在哪儿能买到， 谢谢

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估计是你的盖玻片没有洗干净，上面还有灰尘颗粒，因此在取的时候容易把胶也一起扯下。另外cometslide 好多家公司都有提供，你直接上网搜cometslide 就可以了。这种专用彗星玻片价格比较贵，不过如果你样本量不大的话应该可以试试。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:24

我们科室由于需要建立彗星实验的技术平台，因此想要购进一套彗星的分析系统，但是我们询问了好几家公司，报价都要几十万。我记得您曾在以前的回帖里说过你们现在也在使用这种系统，就想请问下相关的信息：大概的价格；使用的优缺点；该公司的联系方式。谢谢了！

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荧光显微镜、彗星分析软件、计算机平台，确实需要几十万啊，但是，如果只用这个平台做彗星，有点浪费了，除非你那里做彗星常规量比较大，否则，一定要开发荧光显微镜的功能，荧光显微镜是这个平台的核心。
我目前用的CASP是免费的，另外，还有几家公司做的免费彗星分析软件，用起来比较方便，但有一个问题就是尾长的单位多是象素，不是微米，我们刚刚购买了美国联合的彗星分析软件，不过是在买染色体分析平台时赠送的，包括电动荧光显微镜、苹果电脑、染色体分析系统（常规核型、FISH、MFISH、CGH），好像￥60多万，后来谈的彗星分析软件是赠送的。
如果需要，我可以PM你那个公司的联系方式。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:24

我的胶是铺平的，因为我看到靠近胶板（胶板是正方形）四个边的细胞都拖尾比中央要长。是什么原因，每次跑完电泳都是这个问题！急急急

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我也考虑过这个问题，可能是靠近周边的胶稍高，电流和中心平坦区不同，所以在计数时尽量避免到周边。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:25     标题: 回复 #903 西子 的帖子

对于你的问题，一个很厉害的站友（abc816）很有经验，也很有创意，她不用盖片压，而是用稍软一点的塑料片，比如：我们买衬衣时里面衬的塑料板，软的，很容易弯曲，你可以随意把它剪成需要的形状，把热胶滴在毛玻片上，塑料片一端接触胶滴，向另一端拉过去，胶就铺好了，很实用。
可以在网站找到，google一下即可，国产的看起来比较粗糙，但用着还行，可以反复利用，英国一家公司也有，但价格比国产贵多了，看照片比较精细，我也没用过。
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:26     标题: 回复 #904 中国特色 的帖子

彗星用EB染色很简单，滴上去后半分钟足够了，如果加盖片不爽的话我建议你改用保鲜膜，很实用！
实验中一点点微小的创意和调整会给你带来意想不到的效果！而且更能从中获得乐趣和成功，呵呵。
作者: loli    时间: 2011-12-6 17:27

我们一般先在玻片上滴1、2滴EB，再转动玻片使EB在上面铺开，放入去离子水中浸洗一下就可以看咯，染色时间太长背景会很高。在看片时也是用的保险膜，先撕下一块铺在载物台上玻片就可以放上去啦。我们用的荧光显微镜是倒置的，所以要是不用保险膜的话可能更容易污染哦。
作者: ha111    时间: 2011-12-6 17:28


软件分析的尾长最小是3吗？（即认为没有拖尾）
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:28

CASP的尾长单位是象素，所以3是很小的
作者: ha111    时间: 2011-12-6 17:29

CASP的尾长单位是象素，所以3是很小的

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“3”这个像素值是所有细胞中最小的（CK做出来的），在判断是否是彗星细胞时候，可以用此值加以区分， 只要尾长像素大于3的，皆是彗星细胞。
作者: ha111    时间: 2011-12-6 17:29

您看我这细胞周围有好大的晕圈，正常吗？ 我用的是sp20细胞。

图片附件: 45523149.snap.jpg (2011-12-6 17:29, 8.45 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9577

作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:29     标题: 回复 #914 ha111 的帖子

很正常，图像很漂亮，背景控制的也不错。
你用的什么染料，挺漂亮的。
作者: ha111    时间: 2011-12-6 17:30     标题: 回复 #915 一叶 的帖子

我用DAPI 染的， 这个是用您发明的微电泳槽做的个试验， 效果还不错。

上面的一个问题：
（“3”这个像素值是所有细胞中最小的（CK做出来的），在判断是否是彗星细胞时候，可以用此值加以区分， 只要尾长像素大于3的，皆是彗星细胞。）

通过软件随机分析若干细胞，若分析结果中尾长像素值大于3的，则认为是彗星细胞，值为3的是正常细胞， 这样可以计算彗星率。

另外， 同一个片子，在彗星率较低的情况下， 但彗星细胞的尾长都很大，所有计算结果，Tail DNA% 均值：7.4717 标准差为：15.3548。 这个正常吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:32     标题: 回复 #916 ha111 的帖子

彗星细胞和非彗星细胞放在一起分析，肯定会造成数据比较离散，标准差很大，可以用彗星率，做卡方试试，或者把彗星细胞提出来做统计（可以的话），还是咨询一下统计高手吧，这个我也比较弱。
作者: hold住    时间: 2011-12-6 17:35

小弟最近才开始做彗星电泳，检测双链断裂的，使用中性裂解条件。刚刚使用双层法做了几次试验，结果还好，可是遇到了一个老师，是使用三层法做的，而且在铺三层胶之前，他还有一个用正常熔点琼脂糖铺胶后刮去的步骤，据他说是增加附着力，不知道一叶老师对此如何看？
还有，我使用中性条件是50度4hr，但是好像很多人使用的是4度条件，不知道两者之间有什么区别？还有，四度的话需要加DMSO，好像加量还挺大，这个东西是必须的吗？

作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:35     标题: 回复 #918 hold住 的帖子

铺胶方法不尽相同，这未可厚非。
50度？是否温度太高了？还是4度的好吧，DMSO是必须的。
作者: hold住    时间: 2011-12-6 17:36

谢谢一叶老师。
小弟又遇到了事情，就是没有经过处理的细胞也有彗星的尾巴出现。而且能够排除
细胞凋亡的可能，是不是因为我在实验过程中没有避光？或者还有RNA的影响？
小弟把图贴出来，请帮忙看下。

图片附件: 35379681.jpg (2011-12-6 17:36, 31.95 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9578

作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:36     标题: 回复 #920 hold住 的帖子

片子不错啊。
把温度降下来吧
作者: 泡泡    时间: 2011-12-6 17:37

急切的问你一个问题，我七月分彗星实验阳性对照都有尾巴，可是最近重复三次都没有尾巴，方法应该没问题，能是那里出问题了，试剂能失效吗？真的找不出哪里的错，我裂解两个小时，电泳20分钟
作者: 泡泡    时间: 2011-12-6 17:37


另外方法和以前的一样，操作也注意了，裂解液也保持澄清，用前加DMSO和triton.
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:38

试剂还用7月的吗？
作者: 泡泡    时间: 2011-12-6 17:38


试剂没有变，还是那些，今天老师还让重复，我做的很累，感觉不知道哪里出错了，做的时候也没希望
作者: 泡泡    时间: 2011-12-6 17:40


在图像上只看到圆形的细胞，细胞我是放在4度 冰箱里，第二天做的应该没影响吧，胶片是三层，我看过你的微电容槽，还没有做过，最近就在找原因了。谢谢你一直以来对我们的指导，看帖子后确实受益匪浅
作者: loli    时间: 2011-12-6 17:40     标题: 回复 #924 一叶 的帖子

不知我理解对没有，一叶老师的意思是问你是不是用的是七月份配的试剂？试剂的配方和操作方法虽然和以前一样，但要是配好的试剂放太久的话也会对实验结果有一定影响的。你用新鲜配制的试试？
作者: 泡泡    时间: 2011-12-6 17:40


试剂是现配的，找到问题了，是triton失效了。今天又做了不过对照组出现彗星好像避免不了
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:42     标题: 回复 #928 泡泡 的帖子

triton是表面活性剂, 这个有可能失效吗??

这个失效的可能性不大
作者: BUK    时间: 2011-12-6 17:42

请问你们做的单细胞凝胶电泳用的正常熔点琼脂糖以及低熔点琼脂糖是什么厂家的？有什么特殊的要求的吗？
作者: 小螺号    时间: 2011-12-6 17:42

请问版主，我用CASP分析图片的时候，为什么它总会突然关闭，有时候还没数到100个呢，数据都来不及看。另外，分析尾长尾矩和OTM三个指标就可以了吗？是否不用划分彗星细胞和正常细胞，只统计这三个指标即可？你还有美国召开scge标准化会议的文件吗？还有CASP的出处相关文件可以发给我吗？呵呵，怎么PM你？
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-6 17:43

有关电泳：
我用的是伯乐电泳仪（164-5050）,是天能（tanon）HE－90小号电泳槽，很难达到 18V， 300mA 的条件， 是否同时满足，还是只要电流或者电压恒定就可， 希望LQ6688老师或者达人指点，谢谢。

另外， 请问大家一般都用什么型号和牌子的电泳槽。
作者: dotaaa    时间: 2011-12-6 17:43

我也准备做SCGE，想问一下用EB染色后镜下观察，显微镜不是就污染EB了吗？大家怎么解决？
作者: dotaaa    时间: 2011-12-6 17:43


还有一个问题就是把玻片要放到裂解液中裂解，裂解液能回收重复利用吗？如果可以重复利用是不是临用前还要不加一遍DMSO和Triton-100？这样比例不是就不对了吗？
作者: loli    时间: 2011-12-6 17:44     标题: 回复 #932 乌贼老弟 的帖子

电泳仪和电泳槽的牌子型号不重要，只要是质量可靠的厂家生产的就行了。在电泳过程中一般很难做到同时稳压稳流，你可以试试通过调节液面高度来调节，实在不行的话起码要做到稳压。一定要根据你的电泳槽大小来计算合适的V/cm，一般要求是0.7－1.0V/cm就可以了。
具体内容可参考以下文献：
1. Single Cell Gel/Comet Assay: Guidelines For In Vitro and In Vivo Genetic Toxicology Testing 2000
2. The comet assay: topical issues 2008
作者: loli    时间: 2011-12-6 17:44     标题: 回复 #933 dotaaa 的帖子

这个问题一叶老师前面早就提到过了，EB虽然毒性很大，但胜在价廉物美，所以至今很多实验室仍在使用EB染色。只要在操作过程中注意防护，一般是不会有什么问题的，何况我们用来染色的EB浓度是很低的。首先染色时是将EB滴到玻片上而不是将玻片浸到EB里，在显微镜下看时也最好先铺上一张保鲜膜，玻片就放在膜上，看完一张就连膜一起取掉，这样就不会污染显微镜了。
另外裂解液的问题：裂解液里都是些一般的成分，成本并不高，可以不用回收吧？而且最好应该避免反复使用。你要是每次只作几张片子的话根本不需要倒很多裂解液，用个合适的容器把玻片装起来，液面只要浸过玻片就可以了，配一次应该可以用好一段时间的。
作者: 蒲公英    时间: 2011-12-6 17:45


我购买琼脂糖的时候出现问题的了，比如我说我要正常熔点琼脂糖，代理商给我好好几个，
1.Low melting point, Molecular Biology, DNase,RNase, NICKase,
2.Type VII, Low gelling temperature, plant cell culture tested
3.powder, Type VII, Low Gelling Temperature, cell culture tested, insect cell culture tested
4.Type VII-A, Low Gelling Temperature
究竟是怎么选琼脂糖的？》
作者: loli    时间: 2011-12-6 17:45


昨天下午本来想做一次实验看看的。结果就铺胶铺了一个下午，盖玻片试了，塑料薄膜也试了，0.5%的胶也改成0.7的了，24孔板的盖子也试了，还照楼主的样子给载玻片上做槽了（不过我是用刀片自己割的槽子很浅很细）都没有成功，用玻片胶倒是很平但总是粘在盖玻片上而不是载玻片上，用薄膜很容易把胶揭破。汗………………
我铺100ul胶，上面盖上东西胶总是很薄很薄，想塑料薄膜一样厚，大家是这样的吗？因为我第一次做没有经验。以后慢慢的就可以把成功的经验告诉新手啦，o(∩_∩)o...
作者: loli    时间: 2011-12-6 17:46     标题: 回复 #937 蒲公英 的帖子

第一个一看就是低溶点琼脂糖嘛，Low melting point。正常溶点的应该叫
Normal melting point才对啊。后面几个也像是低溶点琼脂糖，Low gelling temperature。正常溶点的Gelling temperature一般为37度左右。正常溶点琼脂糖应该很好买啊，一般实验室只要有跑电泳的都要用的。低溶点的价格较贵，不过好在用量少。我们现在用的正常溶点琼脂糖是BIOWEST的，低溶点琼脂糖是SIGMA的，你问下就知道了。
作者: loli    时间: 2011-12-6 17:47     标题: 回复 #939 loli 的帖子

铺胶是个基本功啊，我们也是先把铺胶练熟了再做实验的。
小绵羊姐姐的塑料薄膜铺胶是个好办法，不过我们也没有试过，没什么成功的经验，我们用盖玻片，效果也不错。
胶老是粘在盖玻片上是不是因为盖玻片没洗干净？盖玻片上要是没洗或是没洗干净的话很容易留有灰尘颗粒，这样在取的时候就很容易把胶也一起扯下来；要么还有一种原因就是胶可能还没干，你多放一会试试？
‘我铺100ul胶，上面盖上东西胶总是很薄很薄，想塑料薄膜一样厚’ 这句话我没看懂，到底是厚还是薄呀？
作者: 一叶    时间: 2011-12-6 17:47     标题: 回复 #932 乌贼老弟 的帖子

调整一下电泳液的量试试吧
作者: hold住    时间: 2011-12-6 17:48

请问，谁有除CASP软件另外的彗星分析软件，要能分析凋亡细胞的，因为CASP不能分析凋亡细胞产生的彗星。
作者: hold住    时间: 2011-12-6 17:48

请问，谁有除CASP软件另外的彗星分析软件，要能分析凋亡细胞的，因为CASP不能分析凋亡细胞产生的彗星。
作者: 泡泡    时间: 2011-12-6 17:50

铺胶是个基本功啊，我们也是先把铺胶练熟了再做实验的。
小绵羊姐姐的塑料薄膜铺胶是个好办法，不过我们也没有试过，没什么成功的经验，我们用盖玻片，效果也不错。
胶老是粘在盖玻片上是不是因为盖玻片没洗干净？盖玻片上要是没洗或是没洗干净的话很容易留有灰尘颗粒，这样在取的时候就很容易把胶也一起扯下来；要么还有一种原因就是胶可能还没干，你多放一会试试？
‘我铺100ul胶，上面盖上东西胶总是很薄很薄，想塑料薄膜一样厚’ 这句话我没看懂，到底是厚还是薄呀？

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呵呵！是自己没说清楚，我铺100ul胶，上面盖上盖玻片，胶总是很薄很薄，像塑料薄膜一样“薄”因为没有做过，看楼主老师做得槽子是2mm高的想必胶应该有些厚度，但我得很薄很薄，都没有1mm厚，不知道老师们的胶是什么样子的？
我的盖。玻片的确没洗，下次洗洗试试
作者: loli    时间: 2011-12-6 17:51

为什么CASP软件不能分析凋亡呢？
据我所知一叶老师就曾用CASP软件分析过的，凋亡的彗星软件右侧的分析曲线会呈M型双峰。
作者: 小螺号    时间: 2011-12-6 17:51


CASP 对有些图片的尾巴默认成彗星头部，因为头部的DNA含量很小，亮度不够。遇到这种情况的彗星该如何分析？？

另外，请问园子里有没有人做DNA 损伤的机理的？想做博士论文
作者: 阿敏    时间: 2011-12-7 10:29

昨晚做彗星预实验，在此特别鸣谢一叶前辈，仿制他的电泳槽做的，图片做的不好，不过和大家分享一下。呵呵

图片附件: 10671681.snap.jpg (2011-12-7 10:29, 11.06 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9579

作者: 阿敏    时间: 2011-12-7 10:30

上面的是阳性结果，再弄张阴性的。

图片附件: 56861829.snap.jpg (2011-12-7 10:30, 9.86 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9580

作者: @STAR@    时间: 2011-12-7 10:30


老师，您好。我是目前也需要做单细胞凝胶电泳实验，做了几次预实验，在谱第一层胶的时候，去掉盖玻片的时候，胶就掉了，我想请教老师几个问题：1.是不是不同的细胞需要不同的裂解、电泳等实验条件，试剂有很大的差别吗（比如PH）？2.老师您提到的为电泳槽，在铺胶的时候是需要全部铺满吗？那怎么保证第二层胶的厚度从而确定细胞是单层分布呢？
作者: 阿敏    时间: 2011-12-7 10:31

做电泳槽一叶老师的电泳槽很好用。哈哈 这是我做的。方法如一叶老师所叙述。

图片附件: 90745648.snap.jpg (2011-12-7 10:31, 26.86 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9581

作者: loli    时间: 2011-12-7 10:32     标题: 回复 #949 @STAR@ 的帖子

取盖玻片掉胶的原因有几种，可能是玻片（普通？磨砂？）、胶（浓度？凝固时间？）或是盖玻片（是否洗净？）。
1 如果是一般的体细胞（如淋巴细胞）的话应该不需要特殊的实验条件，只有少数特殊细胞（如精子细胞）由于其DNA结构的特殊性才会需要不同的处理。至于电泳时的PH主要跟你的实验需求有关（测双链还是单链DNA损伤）。
2 至于一叶老师所用的微电泳槽我没有学着用过，只能根据他以前的介绍来回答了。他铺胶好像实际上是把凝胶加到电泳槽中央，然后迅速转动让胶流动铺满玻片，铺第二层胶也用同样的方法。他只铺两层胶，而且能铺得很薄。不管用什么铺胶方法都很难保证细胞在同一平面上，一叶老师的方法只要使中间的胶是平的就可以了，照相时也主要检测这一区域的细胞。
作者: @STAR@    时间: 2011-12-7 10:35

我用前面讨论群里的方法，尝试过预实验了，效果很好，胶没有掉，谢谢老师啊，呵呵
作者: 911    时间: 2011-12-7 10:36

你介绍的微电泳槽, 我也做了几个.跑出来效果不错. 但是有几个问题我不清楚是什么原因, 请指点

问题: 1: 同一个处理即同样处理的细胞铺2张玻片, 玻片之间有显著性差异?

2: 做微电泳槽使用的小玻璃条, 宽度不是十分一致, 所有围成的每个小槽大小稍有不同, 这样在电泳液中, 会不会导致加在每孔凝胶上的电压不一致?? 导致细胞在不同的条件下电泳?

也希望其他群友,多多发表看法.
作者: duoduo    时间: 2011-12-7 10:37

我今天第一次做彗星电泳，照了几张照片，我用的荧光染料也是DAPI，但是照片是发绿色，能帮忙分析一下吗？谢谢！

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9582

作者: 一叶    时间: 2011-12-7 10:43     标题: 回复 #953 911 的帖子

嗯，问的好！
希望大家也讨论一下哈。
1：至今好像还没发现
2：严格的说是吧，不过这种差别到底有多大？是否可以忽略不计？
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 10:49     标题: 回复 #954 duoduo 的帖子

做的挺好的！
明显是一张正常的
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-7 10:50

多谢你给予的鉴定，最近我又做了两次，你帮我分析一下，有几个问题．１片子里的细胞很少，有的甚至没有，但是在铺胶的时候确实细胞密度挺大，到最后细胞不知去哪了，是不是裂解不好啊？没有裂解开是不是就染不上色了啊？２　细胞没有拖尾，看到的细胞都是圆的，但是应该是有彗星的啊．
　　现在好郁闷，身心俱惫．实验室没人做着方面的，我还是通过导师联系到另外的学校去做，很麻烦，老师还一直催结果，．能帮我分析一下吗？谢谢了．
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 10:50     标题: 回复 #957 小鱼鱼 的帖子

re:
1、有一个常见问题就是电泳后你的胶还在不在？再有，调密度时是否真的看见细胞了？我们实验室的学生有出现类似问题，后来我看了他的过程，镜下计数的根本不是细胞！所以...........
2、那要看你的实验条件和方法了，是否裂解液的问题？时间的问题？电泳的问题？
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-7 10:51


一叶老师，你好:
谢谢您的回复，我在铺胶时确实加进细胞去了，这个不会看错的，因为我用的是我们实验室养的细胞系，我是加药处理后，消化下来，放在pbs中的。最后也没有脱胶，只有在中间过程出问题了。我的步骤如下：
1 铺两层胶，每层85ul，盖玻片是18x18的。
2 裂解，裂解液Nacl 73.2g EDTA 18.6g tris 2.91g定溶至500ml,临用前加1%的Triton-100. 裂解时间为1-1.5小时。PH 10 4°C
3 解旋，解旋液和电泳液是一样的，NaOH 12 g,EDTA 0.3775g定溶至1000ml，解旋40分钟，
4 电泳 17 v,135mA,30分钟。
5 中和，中和液，12.11gTris 定溶至500ml,PH 7.5,中和三次，每次5分钟。
6 染色，DAPI ,立即观察。
我裂解后没有清洗就直接放在解旋液了，会不会影响？我铺胶后把盖玻片抽下来，是不是把细胞带走了？裂解时是把片子竖着放的，这样放的比较多，是不是细胞跑到裂解液去了？是不是电泳时间或其他有问题？
我今天又做了一次，13个片子里面只有一个细胞比较多，其他只有一两个，不知跑哪去了。。。。大多是正常细胞。。

麻烦老师分析一下吧，谢谢。。谢谢。。
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-7 10:51

再帮帮看看这张中间是彗星吗?就这个片子有细胞，其他都是一两个。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9583

作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-7 10:52

是正常的吧？

图片附件: 31718979.snap.jpg (2011-12-7 10:52, 15.04 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9584

作者: tianmei001    时间: 2011-12-7 11:00

CASP软件我怎么分析不了呢？我安装好了CASP，并导入了图片，但是不知道要怎么才能分析图片，我现在就能做到下面这么界面，能不能交下我接下来要怎么分析啊?万分感谢！

图片附件: 18335811.jpg (2011-12-7 11:00, 16.49 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9585

作者: 一叶    时间: 2011-12-7 11:01     标题: 回复 #959 小鱼鱼 的帖子

是不是把细胞带走了，这个很有可能！
是不是细胞跑到裂解液去了？这个不可能。
还有一个关键问题，铺第二层胶的时候，是细胞和低熔点胶的混合物，铺胶前是否用枪把它吹匀了呢？这很关键啊！！
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 11:02     标题: 回复 #960 小鱼鱼 的帖子

低倍镜拍的吗？我看它不像细胞啊
包括你的另一张图。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 11:03     标题: 回复 #962 tianmei001 的帖子

不客气的说，如果再有人问这个问题我就要疯了！
有心的人在遇到问题时会先把本专题以前的所有帖子看一下，也许已经找到答案了。重复提出以前站友提出的问题，说明你根本没有用心浏览以前的帖子。
看这个图中第一个细胞核右下方，四个小点，这就是分析框，只是你没有把它拉大！按你这图的显示，现在这状态是不能拉大的，你现在是分析状态，要想把分析框拉大，就要回到预分析状态。
其实这个软件安装好后自动生成英文的使用说明，好好看看就可以。或仔细浏览一下本专题的以前的内容。
多谢了。
作者: 阿敏    时间: 2011-12-7 11:04

我是在四十倍下看的啊，不知道为什么这么小，但是形状规则，而且非常亮，你在帮忙看看这两张是不是细胞啊，感觉比你们的小。谢谢了。

图片附件: 75583300.jpg (2011-12-7 11:05, 97.26 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9586

作者: 阿敏    时间: 2011-12-7 11:05

感觉很小，但还是规则的啊，有点像卵状，是不是不同细胞大小有差别，还是我确实看错了啊？

图片附件: 80041967.jpg (2011-12-7 11:05, 106.91 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9587

作者: loli    时间: 2011-12-7 11:08

我昨天才用一叶老师给我的casp软件分析彗星，才开始的时候也遇到了这个问题，急得差点出了一身汗。实在没办法只好又打开本贴查找求助，一叶老师在第四页专门做了个casp软件的使用图示，但说实话对于这个问题没有很明显的提到，所以当时我也没拉不开这分析框。在之后跟贴中又有人反复问到了这个问题，一叶老师真的回答了N次！在22页时又有人问了，我才突然如醍醐灌顶般明白（智力有限，惭愧）。
分析框一定要在选好待分析的文件后，点分析键之前，由自己点出拉开，要是等四个小点出现后就拉不动了。也就是说：打开文件夹——选好文件——点OK（此时软件左侧就会出现待分析的图片）——鼠标点在左图上，左键按住不动，再拉开，就成了！——之后再点什么result windiow啊，head和tail前打勾啊啥的，再点分析就行了。
作者: loli    时间: 2011-12-7 11:08


一叶老师您好，昨天我试着分析了一下自己做的彗星图片，别的问题没有，只是觉得软件分析的彗星头部比我们肉眼看到的要大很多。我看以前的讨论中有说到要是尾部荧光强度很强的话，软件有可能会把尾部认成头部，但我做的彗星感觉头部的荧光都比尾部强啊？上两张图片您帮我分析下好吗？

图片附件: 75390684.snap.jpg (2011-12-7 11:09, 10.6 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9588

作者: loli    时间: 2011-12-7 11:11


再来一张

图片附件: 16179891.jpg (2011-12-7 11:11, 15.2 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9589

作者: loli    时间: 2011-12-7 11:12

还有一张

图片附件: 78073094.jpg (2011-12-7 11:12, 14.97 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9590

作者: loli    时间: 2011-12-7 11:13


这是我用软件分析的彗星，这是分析前

图片附件: 63284107.jpg (2011-12-7 11:13, 74 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9591

作者: loli    时间: 2011-12-7 11:14

这是分析后，怎么它圈起来的头的部分比肉眼看到的大啊？

图片附件: 96463957.jpg (2011-12-7 11:14, 80.61 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9592

作者: 泡泡    时间: 2011-12-7 11:17

我用阳性物质MMS(甲基甲磺酸酯)在4ppm下对斑马鱼染毒,得到的彗星照片都是头小尾大, CASP不能分析. 请问为什么会出现这样的彗星类型, 和实验条件有关系吗??
附图:

图片附件: 39137653.snap.jpg (2011-12-7 11:17, 6.61 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9593

作者: ffooll    时间: 2011-12-7 11:18

请教一个低级问题，DAPI一定要用紫外激发吗？别的光波可以吗？我们的荧光显微镜没有紫外光谱。谢谢回复。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 11:19

我是在四十倍下看的啊，不知道为什么这么小，但是形状规则，而且非常亮，你在帮忙看看这两张是不是细胞啊，感觉比你们的小。谢谢了。

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你用的什么细胞？我看你的图中不像是细胞。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 11:21     标题: 回复 #973 loli 的帖子

你做的图很好啊！
分析的也很正常。
彗星是把细胞裂解后的，边界不清，所以会出现实际分析的要比肉眼看到的略大，很正常。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 11:21     标题: 回复 #974 泡泡 的帖子

像是凋亡的细胞，对于不同细胞，裂解条件需要调整一下，如果你的细胞比较敏感的话，试试缩短裂解时间，最好在预试验中把问题解决好。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 11:23     标题: 回复 #975 ffooll 的帖子

没有紫外？老的机器吗？注意，老的镜子一般是配三个常用激发块，但只能放两个激发块，需要的时候把其中的一个换下来即可。不知道你的是什么镜子。
作者: 月牙牙    时间: 2011-12-7 11:23

我也遇到过找不到细胞的问题，最后发现是细胞没吹匀，一定要先加胶后再把细胞加进去，否则很难吹开
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 11:24     标题: 回复 #980 月牙牙 的帖子

呵呵，是啊，看似简单的问题，可就是有许多人过不去，就像有人分淋巴细胞，把细胞放在分离液下面..
作者: qqq111    时间: 2011-12-7 11:30

我也想做大鼠肝细胞和血细胞的彗星电泳实验，由于时间的原因，杀完大鼠后不能马上做，请问冻存的组织是否可以做，如果可以该如何冻存？
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 11:31     标题: 回复 #982 qqq111 的帖子

还是马上做的好，可以先跑完电泳，以后再染色分析。
作者: 四福晋    时间: 2011-12-7 14:13

做了一段时间彗星， 和战友汇报一下， 请多指教！！

1、 关于铺胶： a 开始用盖玻片铺三层胶， 这种方法易出现的问题是， 第一层的正常熔点的胶，很容易粘在盖玻片上， 导致铺片失败, 我很少用
b 用LQ6688老师介绍的 微电泳槽 来做, 这种方法很简单, 就是制作过程需要仔细.
c 用毛细管涂片法, 这个是我自己摸索着弄的, 把100ul的胶滴在玻片上, 用毛细管平铺一定面积,然后放在水平桌面上, 稍等片刻, 即可利用同样方法铺另外两层低熔点的胶. 这种方法较a 成功率高, 速度快,效果也不错.

2、关于目标细胞: 我是做农药对环境生物安全性评价的, 发现不同种生物细胞(血细胞)的敏感性差异很大, 不知道这种情况在其他领域内存在否??

3、关于分析软件: 我用的是CASP , 有时候有些头小尾大的图像不能分析, 望战友推荐好的其他相关软件。

望提宝贵建议。
作者: 泡泡    时间: 2011-12-7 14:14

请您到我的网络U盘下载CASP软件，左键点击那个CASP，弹出对话框，然后点击“直接下载”就OK了，双击安装，没问题的，我已经试验过了。下面附上这个软件的使用说明。

cuturl('http://lq6688.vdisk.cn')
这是网络U盘的链接，直接点击即可。

CASP使用说明.rar (82.34k)

一叶老师，我下了半天CASP软件，就是下不下来，能不能也发一份CASP软件给我呢
作者: ha111    时间: 2011-12-7 14:14

一叶老师您好，我也想做大鼠肝细胞和血细胞的彗星电泳实验，由于时间的原因，杀完大鼠后不能马上做，请问冻存的组织是否可以做，如果可以该如何冻存？

还是马上做的好，可以先跑完电泳，以后再染色分析。 ”

一叶老师:
跑完电泳后不染色是否要盖盖玻片，如何保存？
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 14:15     标题: 回复 #986 ha111 的帖子

跑完后要保湿，可以放在平皿里，皿底部铺纱布，滴点蒸馏水即可，观察前染色.........
作者: loli    时间: 2011-12-7 14:22

从开始做彗星实验到现在已经快一年了，虽然我的实验还没有做完（样本量太大，没办法），但还是积累了一些经验和想法，在这里跟各位老师和站友分享一下：
我的实验方法与常规操作的最大区别就在于玻片和铺胶的选择不同。首先，我不是用的磨毛玻片，我用的只是普通的透明玻片，这种玻片的好处在于1.便宜。2.染色后背景干净。（磨毛玻片在EB染色后会出现很多被染色的凝胶颗粒，影响照片质量）3.如果你的玻片需要脱水保存的话，透明玻片是最好选择。当然，它的缺点人人都知道——容易脱胶。
为了解决脱胶问题，在预实验之前就看了很多文献和经验介绍，我手笨又不会做一叶老师的微电泳槽，最后是本贴前面一位大侠的经验介绍——浸入法铺胶给了我灵感，后来这个方法我在文献中也得到了证实。我现在就是一次准备100张玻片，用浸入法铺好第一层胶后入60度烤箱烤过夜，然后室温保存，用时直接往上铺第二层细胞凝胶。我用这种方法制好的玻片已经做了几百例彗星实验了，从没出现过掉胶问题。
另外还有一点就是盖玻片问题，以前有站友问为什么取盖玻片时会把胶一起扯下，我也帮忙回答过，我想说的是除了前述原因之外还需注意一点，就是胶固化的时间，最好不要放到冰箱时间太长，我记得一叶老师说过他只放一分钟就够了，我放三分钟。有的protocol说放十分钟，固化时间太长的话胶就会变干，跟盖玻片结合的很紧，取盖玻片的时候就很难取，还容易把胶一起扯下来。
最后要说的就是玻片的脱水保存，我由于实验的样本量大，怕一次看不完，因此在最初就积极寻找可以保存片子的方法。很多文献也提到了脱水的问题，一般都是用无水乙醇，有的还要加其他的试剂。我只用无水乙醇，现在看来效果也很不错。具体的方法就是在玻片中和完后不染色，放入无水乙醇的染缸中15分钟，捞出晾干后避光保存，要看时再染色就行了。放三个月绝对没问题。但是如果需要脱水的话就只能选择透明底的玻片，因为磨毛玻片表面不平，在酒精脱水后凝胶干燥形成颗粒，会被EB染色而严重影响读片质量。
作者: utt0989    时间: 2011-12-7 14:23

微量全血彗星试验的图片怎么分析呢？粒细胞的核是分叶的，头尾不好测量啊
作者: glass    时间: 2011-12-7 14:25

我的单细胞电泳为什么裂解后直接EB染色,有一大片的细胞，而解旋后却什么也没有了，只是偶尔会有，我铺的是双层胶，第一层1%的胶 二层是0.5%的胶加细胞悬液，电泳液是常用的电泳液 ph13 是标准的浓度NaOH 12 g,EDTA 0.3724g定溶至1000ml的 ，用的是磨面的载玻片
有什么原因能导致这个现象的发生呢，是第二层胶脱落了吗？不过，裂解液浓度这么高都没事，解旋就出事呢！
最近快毕业了，但是试验却很不顺利......
作者: lixi559    时间: 2011-12-7 14:26

从开始做彗星实验到现在已经快一年了，虽然我的实验还没有做完（样本量太大，没办法），但还是积累了一些经验和想法，在这里跟各位老师和站友分享一下：
.....................其他的一时也想不起来了，就说这么多吧，最后祝各位站友在新的一年里实验顺利，生活开心！！

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谢谢你的帮助。按照你说的那样我做了一次预试验，总体结果还是比较好的！看到了很清晰的彗星！图片没有拷回来，等下次传上来。
但是还是有问题出现就是：等跑完电泳以后还是有一小部分出现了脱胶的问题。我用的是普通载玻片。裂解完以后没有发现脱胶，就是跑完中和时发现有的全部掉下来了，有的一部分脱落。铺完第一层，我在60°烘烤了两个小时。看着已经很牢固了，不知为什么还会出现这种情况，望给予帮助(*^__^*)
作者: lixi559    时间: 2011-12-7 14:26     标题: 回复 #990 glass 的帖子

估计是脱胶了，你的电泳液是4度预冷的吗？
作者: loli    时间: 2011-12-7 14:27

第一次预实验就做出了彗星，真是恭喜！
我们以前遇到的脱胶也多发生在电泳后，我觉得可能有几点需要注意：
1.第一层凝胶在经过裂解、解旋及电泳步骤后早就已经恢复了凝胶状态，与光滑玻片的粘合肯定不如以前紧密，因此在电泳及中和后更要轻夹轻放，玻片最好水平的取出，千万不能晃荡，要不然水的力量很容易把凝胶拖歪甚至全部扯下。
2.中和液不要太多，能浸过玻片就可以了，液体太多浮力就大，凝胶容易漂起来。
3.中和的时间不能过长，一般5分钟就可以了，时间长了也容易掉胶。
4.中和的次数：我们实验室只中和一次。一般文献上写三次，那是因为电泳液中的强碱颗粒会附着在磨砂玻片的粗颗粒上，如果不中和干净的话很容易被EB染色。但我们如果使用普通透明玻片的话就不会有这样的问题，一般染色后的背景都很均匀干净。我们在预实验中就验证过中和三次跟一次后的效果没有差异，再加上反复中和更容易掉胶，因此我们就都改为中和一次了。
5.另外还有一点，我们在电泳完之后会先把玻片放在一个装有双蒸水的盒子里浸一下，洗掉多余的电泳液，然后把玻片捞起来竖放到吸水纸上吸干多余的水分，然后再中和。我个人感觉这样既能使中和的效果更好，又更不容易掉胶。
作者: baidukk    时间: 2011-12-7 14:27

最近开始做彗星试验了，在这论坛上学到的东西，让我少走了不少弯路，谢谢老师们了。不过我还有一点疑问，我想在分析彗星率的基础上选择彗尾 和尾矩进行分析。请问在用CASP进行分析时，是只分析出现彗星的细胞，还是随机选取有尾巴和没尾巴的一起分析。谢谢
作者: loli    时间: 2011-12-7 14:29

为了全面评价细胞的DNA损伤情况，现在的文献中使用得最多的指标有以下几个：彗星率、尾长、尾距或Olive尾距、头或尾部DNA含量。除了彗星率要靠人工计数之外，其余的指标都要通过彗星分析软件得出。
比如说，你分析一个样本先人工计数200个细胞，数出彗星率，再用软件随机分析20个彗星细胞，得出其他指标。那这个样本的彗星率、尾长等指标的均数或中位数就能代表这个样本的DNA损伤情况了。
因此，CASP软件是用来分析彗星细胞的，它分析正常的没有尾巴的细胞是没有意义的，没有尾巴的细胞它分析的尾长都是3，头部DNA都是100或99。
作者: baidukk    时间: 2011-12-7 14:30

这还是在你的帮助下完成的！
是的！我中和的时候还晃了几下。我怕中和不好！现在听了你的叙述明白了！下个星期做试验的时候注意下！
就是！我感觉做这个试验的过程中要特别注意在昏暗一点的环境下完成，强光对DNA的损伤还是比较严重的！我这次做预试验的时候，就是在强光下完成的！发现DNA损伤严重！
作者: baidukk    时间: 2011-12-7 14:30

我想请教一下，我的彗星试验做完了，可是拍照的时候发现一个问题，就是在同一张片子上有的细胞根本就没有损伤，而有的却损伤比较严重，这是为什么啊？好有我一共做了四次试验，应该是每一次的损伤都应该加重的，可是第二次的却一点损伤都没有！我想我的原因是不是在裂解之前我的胶都干了，这时细胞也都干了，再裂解之时就裂解不开了？因为做第二次的时候有急事，所以我就铺好胶之后放到四度冰箱了，等过了四五个小时之后我才回来裂解的，请老师和高手帮忙分析一下是不是这个原因啊？
作者: 彼岸花opp    时间: 2011-12-7 14:31

年前做了一次彗星电泳，镜下一片红，其他的什么也没看见。前一段时间仔细看了本专题，学到很多东西，谢谢一叶老师。昨天又做了一次，今天5ug/mlEB,40ul染色5分钟后，双蒸水浸泡两次，每次5分钟，然后观察，镜下黑黑的，什么都没有，考虑染料被冲掉了，再次染色，这次没冲，结果如图，请大家给与意见，谢谢。为什么我拍的片，图像都在右半部分，走边黑黑的，在电脑上看到的也是这样。

图片附件: 12203077.jpg (2011-12-7 14:31, 8.97 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9594

作者: loli    时间: 2011-12-7 14:32

我想请教一下，我的彗星试验做完了......请老师和高手帮忙分析一下是不是这个原因啊？

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"在同一张片子上有的细胞根本就没有损伤，而有的却损伤比较严重",我觉得一张片子就应该是这样的呀，一般只要不是严重损伤或是操作问题片子都不会出现细胞全拖尾的现象的，同一张片子上肯定是有正常细胞和损伤细胞的，而受损细胞的损伤情况又可能都不相同。要是只要有损伤，细胞就都拖尾的话就不会用彗星率这个指标了。有的玻片在铺胶的过程中产生了气泡，或是凝胶被刮花了，导致玻片上的细胞不能在同一条件下裂解、解旋和电泳，这样有可能电泳后会出现凝胶某一区域全拖尾，而其他区域却正常的情况。

“共做了四次试验，应该是每一次的损伤都应该加重的，可是第二次的却一点损伤都没有”，不知道第三、第四次是不是损伤都加重了呢？要是第一次有损伤，之后做的都没有，有可能是试剂、溶液的问题；要是只是第二次没有损伤，有可能是当时操作中出了问题。我们没有试过在裂解前把胶放在冰箱里这么久，一般最多一、二小时，而且要把胶片放在一个容器里盖上盖子，不能直接放在冰箱里的。
作者: loli    时间: 2011-12-7 14:32

年前做了一次彗星电泳，镜下一片红，其他的什么也没看见。前一段时间仔细看了本专题，学到很多东西，谢谢lq6688老师。昨天又做了一次，今天5ug/mlEB,40ul染色5分钟后，双蒸水浸泡两次，每次5分钟，然后观察，镜下黑黑的，什么都没有，考虑染料被冲掉了，再次染色，这次没冲，结果如图，请大家给与意见，谢谢。为什么我拍的片，图像都在右半部分，走边黑黑的，在电脑上看到的也是这样。

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“今天5ug/mlEB,40ul染色5分钟后”，不知道为什么要染色这么久？一般EB染色后最多十来秒钟就要清洗了，染色时间太长背景会很亮，对观察细胞没什么好处啊。

“双蒸水浸泡两次，每次5分钟”，这是中和还是清洗EB？如果是中和的话这个步骤肯定是该在染色之前做的，要是清洗EB的话也要不了这么久。把EB滴在玻片上，快速转动玻片使EB铺匀，然后把玻片放在双蒸水里浸几次就可以看啦！

“为什么我拍的片，图像都在右半部分，走边黑黑的”，不知道在镜下看和在电脑上都是左边黑，也不知道是不是所有的视野、所有的片子都是左边黑。如果说是玻片或凝胶的问题的话，同一玻片不会所有方向，所有视野都是这样；要是几张玻片都是这种情况，就更要考虑显微镜或电脑的问题了。就我们实验室的荧光显微镜来说，它的侧边有个slide—eye相互转换的旋钮，要是从eye换到slide，那个旋钮没有扳到位的话，在电脑上的视野左边一半就是缺失的，但镜下看应该是正常的。（除非你连目镜都没有调节到位）
作者: 彼岸花opp    时间: 2011-12-7 14:33

“5ug/mlEB,40ul染色5分钟”是和一叶老师学的，我记得他好像写过，我下次试试染十几秒怎么样。
所有的片子在镜下看是正常的，只是在电脑上和照出来的片子左边是黑的，好像也不是slide-eye转换旋钮的问题，不知道为什么？
作者: loli    时间: 2011-12-7 14:34     标题: 回复 #1001 彼岸花opp 的帖子

“5ug/mlEB,40ul染色5分钟”肯定不是一叶老师说的，一叶老师的染色浓度一般是2ug/mlEB，注射器滴1-2滴，时间绝不会超过30秒，不信可参看本帖2、5、6、12、16、26页一叶老师的回答。
如果片子在镜下看是正常的，问题就出在显微镜或电脑的设置上，你可以问问负责这台显微镜的人或公司。
作者: 四福晋    时间: 2011-12-7 14:35

一口气把近100页东东看完了，收获不小。
这里聚集了很多宝贵的经验。包括如何做微电泳槽，如何铺胶，如何裂解，如何电泳等等。
我看了有点累了，要是分类将这些东东总结归类一下，对后人绝对是一宝贵财富。。
我将试着do it。

作者: 四福晋    时间: 2011-12-7 14:36


请大家帮忙分析一下，用casp分析的结果，为什么高剂量组的TM和DNA%的均值比低剂量组和中剂量组的高，而OTM却低呢？该怎么理解？
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-7 14:36

关于整理数据的小方法 仅供参考
用CASP处理后数据保存的格式为.txt，数据格式较乱，对不齐，这时可以全盘复制到word 中，之后点击全选，添加表格，这时所有数据归到相应的条目中，此时，在全选复制，直接黏贴到excel 中 即可。
很方便了
作者: loli    时间: 2011-12-7 14:37

《单细胞凝胶电泳技术检测碳离子束和X射线照射对Lewis肺癌细胞的DNA损伤》
作者: 彼岸花opp    时间: 2011-12-7 14:41

我做的是药物毒性实验，不是关于射线方面的；我一直都没有找到原因
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 14:42

说实在的,如果能有人将整个实验过程中的,各种配液都贴一下的话,相信对我们这种菜鸟级人物是最大的帮助.先谢了

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不客气的说，如果这是你发自肺腑的话，相信你永远是菜鸟，
稍微看看文献，实验过程、配液就能搞定了，如果有问题再来讨论......
有人学一辈子也不会学习，也许是我们的教育把思维都禁锢了.....唉
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 14:42

“5ug/mlEB,40ul染色5分钟”是和一叶老师学的，我记得他好像写过，我下次试试染十几秒怎么样。
所有的片子在镜下看是正常的，只是在电脑上和照出来的片子左边是黑的，好像也不是slide-eye转换旋钮的问题，不知道为什么？

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荧光显微镜的汞灯是可以调位置的，一定要把最亮的视野调的中央，否则经常出现一边黑，我最初做的时候遇到此问题，找了NIKON的售后，解决了，估计你这可能是这个问题。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 14:43

这里聚集了很多宝贵的经验。包括如何做微电泳槽，如何铺胶，如何裂解，如何电泳等等。
我看了有点累了，要是分类将这些东东总结归类一下，对后人绝对是一宝贵财富。。
我将试着do it。

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感谢大家的认可！
兴趣使然，包括对科研的兴趣，有兴趣我就有信心做好。
我们设计的微电泳槽经过进一步的改良，已经申请专利了，呵呵
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 14:43

关于整理数据的小方法 仅供参考
用CASP处理后数据保存的格式为.txt，数据格式较乱，对不齐，这时可以全盘复制到word 中，之后点击全选，添加表格，这时所有数据归到相应的条目中，此时，在全选复制，直接黏贴到excel 中 即可。
很方便了

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这个方法好！abc816早就用这个办法了，呵呵。
还有一个好办法，适用于使用SPSS的朋友，我做了一个格式文件，CASP输出的.txt文件被SPSS直接读取，然后选择套用这个格式文件，可以直接把这个txt文件很整齐的保存为SPSS的数据库文件，直接分析，很方便。
如果有人用SPSS，并对这个格式文件感兴趣的话，我可以贴上来。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 14:43

很棒的解释！
不同的射线种类决定了它的生物学效应，例如，同样是被击中一次，如果是α射线，造成的生物效应远远大于γ射线，但是，α射线的穿透力又远远弱于γ射线，一张纸就可以挡住，而这张纸对于γ射线不能起任何屏蔽作用。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 14:44

我做的是药物毒性实验，不是关于射线方面的；我一直都没有找到原因

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重复实验都是这样结果吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 14:44

我现在要作SCGE，很多基础的操作不清楚，
1、那个磨沙载玻片是全体都是磨沙的吗，我只用过普通的在边缘有1/5左右的磨沙，便于标记。
2、自制电泳槽，那电泳槽是四边封闭的，可是跑电泳的时候顺着电场的方向应该拿开啊，是象普通的电泳铺板，两端先用胶布粘上，电泳的时候把胶布拿开还是怎样啊。
3、电泳后用EB染色的话，那用凝胶成像系统观察不可以吗，就像普通的电泳图一样来照像不行吗，非得用荧光显微镜吗。
re：
1、磨砂的可以，我们的微电泳槽是用普通玻片的；
2、周围是固定好的，胶铺好后，基本就平了，不必去除周围的“围栏”，美国有卖彗星玻片的，和我们的微电泳槽很类似，只是他们用的疏水材料，铺胶时不太好铺，中间鼓起来，感觉不如我们的微电泳槽，我在卖瓜。
3、一般的凝胶成像没有显微作用吧？在单个细胞水平上的DNA损伤检测，能用它拍吗？肯定啥都拍不到，必须借助显微镜吧？
作者: loli    时间: 2011-12-7 14:46

群友所说的把帖子分类总结的事其实我一早就做过了，在我看第二遍的时候。我看第一遍是也是觉得知识点很多，但较为分散，以后需要什么信息时又得从头翻。因此我后来又看了第二遍，并把一些知识点的位置记了下来。由于我只是想到让自己看帖子更方便，所以记下的知识点也只是自己感兴趣的，并不全面。不过我可以先贴在这里
1、彗星凋亡图像、CASP软件使用图解——第4页
2、彗星实验原理、彗星软件介绍——第5页
3、SCGE操作步骤——第6页
4、微电泳槽的照片、中性/碱性SCGE的区别——第9页
5、文件格式转换——第13页
6、EB的处理——第16页
7、琼脂糖凝胶的配制——第30页
8、彗星尾巴“公鸡尾巴”——第8页
其实我觉得，最重要的内容基本上都集中在都在本贴的最前面，后面几乎都是一叶老师在不厌其烦地重复回答问题，或是帮人家解决问题......
作者: 铜雀    时间: 2011-12-7 14:46

我用植物原生质体做彗星电泳，从始至终都是一个人在做，试验结果是好是坏，自己或周围的人都没法判断，我把自认为好看的一张图贴上来，让老师们看看怎么样？裂解一小时，解璇15分钟，电泳10分钟，EB染色，40X下数码相机照相。

图片附件: 56397818.jpg (2011-12-7 14:46, 6.28 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9595

作者: whitesheep    时间: 2011-12-7 14:47

我因为赶时间，就用了广西一家公司的试剂盒来做彗星实验。每个步骤都是按照试剂盒说明来做，但重复了很多次，几十张玻片，都没有在荧光显微镜下看到任何东西。绿色激发光下只看到一片红色。就算是把光源调暗，荧光强度调适后，仍然是一无所见。真好急人。也打听过在其他地方买过他家试剂盒的同道，人家说第一次就有结果了~~~晕！能有谁告诉我，问题会是出在哪里吗？使用说明书是这样说的：
1，各种细胞用冰冷的PBS 洗一次，离心收集，用PBS 重悬，密度为1×104-5 个/ml。
2. 铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS 配制。
3. 第1 层凝胶的制备：将加热熔解的正常熔点琼脂糖(NMA)，冷至45-60℃，取适量铺于载玻片CometSlide上，再置4℃下10min 使NMA 凝固。也可以先铺胶，晾干后无尘存放，1周内使用（据经验，此法较优）。
4. 第2 层凝胶的制备：低熔点琼脂糖LMA在60-70℃水浴加热至少20min 使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃，低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时）。将20μL 细胞（约 104个）和75μL的LMA 混合均匀。然后，迅速将适量含细胞的LMA 滴到第1 层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片，置4℃10min 使第2 层LMA 凝固。注意，使用盖玻片的目的是使琼脂糖平整，显微镜下方便观察，经验丰富者，可以不用，也可以达到好效果。
5. 第3 层凝胶的铺制：:第2 层LMA 凝固后，在室温下小心移去盖玻片，重复第二层的步骤。（此步可以不作，一般铺一层细胞就足够）
6. 细胞裂解： 移去盖玻片，将玻片置于平皿中，轻轻加入预冷的新鲜配置的细胞裂解混合液。4℃下裂解1-3h。取出载玻片用蒸馏水漂洗2次，要求动作轻柔，以免琼脂糖脱落。
7. DNA 碱解旋： 将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的电泳缓冲液约覆过载玻片胶面0.25cm 左右，室温放置20min，以便使DNA在碱性条件下解螺旋和产生碱易变性区段，使DNA 断链在电场中易于迁移。
8. 细胞电泳： 电压15-25V，电压、电流可用改变缓冲液面高低来调节，电泳时间为10-20min。建议预实验，摸索最佳的电压、电流及时间。
9. 电泳后将载玻片置于平皿内。加入蒸馏水，漂洗2次，每次5min，弃去蒸馏水，每载玻片加2-3滴染色剂，盖上盖玻片（也可以不盖上），避光染色10min。盖上盖玻片的目的是可以隔日分析，或便于操作。
10. 观察、拍照和分析： 荧光显微镜515-560nm （绿光）波长的激发光，可清楚地观察到核DNA 和迁移的DNA(即慧星尾)。色泽和图像十分精美，每个样本随机选择20-100 个细胞，图片保存后，用相应的软件分析结果。

本人非常茫然，恳请高人指点迷津，跪谢！！！
作者: loli    时间: 2011-12-7 14:48     标题: 回复 #1017 whitesheep 的帖子

我可不敢称高人哈，只是想跟你探讨一下：
虽然我没有用彗星试剂盒做过，但我看看这说明书应该是没什么问题的，但为什么没有细胞呢？问题在哪里呢？
我觉得要是镜下看不到东西的话可能有两种原因：一是胶上没有细胞；二是连胶都没有—掉胶了。
先说第二种可能：掉胶。这个应该很好分辨，在实验的每一步注意看看胶还在不在就行了。但是我觉得这个不一定是你问题的原因，因为你不可能几十张片子都掉胶吧，而且CometSlide是不太容易掉胶的。
还有一种可能就是细胞处理、铺胶的问题了。这里面会出现的情况就太多啦！1、“各种细胞用冰冷的PBS 洗一次，离心收集，用PBS 重悬，密度为1×104-5 个/ml。”不知你把细胞收集重悬后有没有记过数，细胞数有没有这么多，尤其是预实验的时候。每个样本所能收集到的细胞可能有的多有的少，还有可能由于操作问题根本就没收集到......“2、将20μL 细胞（约 104个）和75μL的LMA 混合均匀。然后，迅速将适量含细胞的LMA 滴到第1 层琼脂糖上，”是20μL约10的4次方个吧？104个就太少啦。但是你要是重悬的细胞密度才1×104-5 个/ml的话，20μL就肯定没有这么多细胞，然后你还要“将适量含细胞的LMA 滴到第1 层琼脂糖上”，用句lq6688老师说过的话——那你的细胞就要用爪笠来捞啦。3、那要是你说细胞数肯定够呢——还有一种情况，就是胶没有混匀。一般来说都是细胞往胶里加，而不是把胶加在细胞里，这你应该没弄错吧？那加了之后有没有把胶仔细混匀呢？关于这一点本贴前面就有讨论：凝胶都是有点粘稠度的，细胞加在里面后要用枪头仔细混匀，吸的时候也要吸加样处的胶，免得没混匀，又吸到其他位置的没有细胞的胶......4、要是你细胞数够，胶又混匀了呢？要是盖盖玻片时太用力，或是细胞凝胶加的位置太靠边，或是其他的什么原因，细胞全部被挤在凝胶边缘，中间一个细胞也没有也是可能的。
总之，要是你还找不到原因的话，你就铺好胶后先在光镜下看看，有没有细胞。要是有，实验完了又没有，问题就出在后面的步骤；然后再电泳完了，染色之前再看看（虽然细胞膜溶解了，细胞核应该看得到的嘛），要是有，实验完了又没有，问题就出现在后面的步骤......
作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-7 14:48


用comet实验测凋亡细胞，原理是什么呢？请一叶老师帮忙解释一下。此法与其他方法，如AnnexinV/PI双染实验相比，有何优点和缺点呢？
作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-7 14:49     标题: 回复 #1017 whitesheep 的帖子

我第一次做彗星电泳的时候，镜下也是一片，当时染色后没冲洗，后来再做，染色后冲洗再上镜观察，就看见彗星。看了你的描述过程，染色后也没有冲洗，不知道是否和我当初一样。
作者: 生物迷    时间: 2011-12-7 14:50


我要做小鼠骨髓细胞和精子的彗星试验，因一次取材后需要处理的指标较多，请问在取材料后（均浆、过滤），细胞可否保留几天再做彗星试验，如可以应该如何保留。请赐教。
作者: loli    时间: 2011-12-7 14:51     标题: 回复 #1021 生物迷 的帖子

小鼠骨髓细胞和精子的彗星实验方法是不同的，你现场又要取材又要同时做两种彗星的话应该有困难。不过精子可以取材后先冻存起来（冻存方法有讲究，可查文献），之后再做。
骨髓细胞的彗星实验最好是现场做。不知你一次取材的标本数是多少？要是一次取材的小鼠数量不是很多（<20）的话，只要安排好时间是完全来得及的。
作者: 生物迷    时间: 2011-12-7 14:51

因为我一次取材是一组孕鼠的全部胚胎，而且还要做微核等，所以当时就做彗星的时间就不够了。
另外，不好意思，问一下，用来配凝胶的PBS液的PH有否要求？
作者: loli    时间: 2011-12-7 14:51

PBS的PH7.4~7.5都是可以的。
要想同时取材、做微核、做彗星，一个人肯定不行，除非有人帮你。我们科里遇到这种情况都是能帮忙的都来帮忙，流水作业，当天做完这些是没问题的。呵呵
作者: bohe221    时间: 2011-12-7 14:53

我用植物原生质体做彗星电泳，从始至终都是一个人在做，试验结果是好是坏，自己或周围的人都没法判断，我把自认为好看的一张图贴上来，让老师们看看怎么样？裂解一小时，解璇15分钟，电泳10分钟，EB染色，40X下数码相机照相。

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嘿嘿，我好寂寞啊，不过通过对本贴的浏览，我觉得进步很大，图片比以前好看多了，与软件也更吻合的好了。但是植物原生质体与动物细胞相比，彗星电泳还是有差别的，而酶解法与机械分离法得到的细胞或核也有所差距，培养中的一些分裂能力强的植物细胞材料，个体大小不一，最小的也比动物细胞大很多，里面还有一个大液泡，用这种材料尝试了多次，变换了多次参数，图片还是很不一样。
作者: loli    时间: 2011-12-7 14:53     标题: 回复 #1025 bohe221 的帖子

植物原生质体......呵呵，实在是一窍不通，所以也不好意思回复哈。等你实验结果稳定了再发些图片上来，我们也来学习学习下
作者: pengke1983    时间: 2011-12-7 14:54


我作过很多次碱性彗星，现在想做中性彗星，我看文献碱性和中性不管是正常熔点的凝胶还是低熔点凝胶的浓度都是不一样的，请问这有影响吗？另外我配制的电泳液（90mM Tris 90mM 硼酸 2mM EDTA ph8.5)在20V的电压下电流只有8mA,请问大家配制的电泳液也这样吗？不胜感激
作者: TAT    时间: 2011-12-7 14:57


我作过很多次碱性彗星，现在想做中性彗星，我看文献碱性和中性不管是正常熔点的凝胶还是低熔点凝胶的浓度都是不一样的，请问这有影响吗？另外我配制的电泳液（90mM Tris 90mM 硼酸 2mM EDTA ph8.5)在20V的电压下电流只有8mA,请问大家配制的电泳液也这样吗？



同问

[ 本帖最后由 TAT 于 2011-12-7 15:03 编辑 ]
作者: loli    时间: 2011-12-7 14:57

彗星实验虽然已经有了标准化的protocol，但它也不是一成不变的教条哦，由于各实验室仪器设备和选择的裂解、电泳方案的不同，所以文献报道的实验条件都各有差别，不过这肯定是最适合他们实验室的方案哈。凝胶的浓度也是一样，一般0.5-1%都是可以的，就看你的选择了，凝胶只是承载细胞的载体，只要不掉胶就行了，对实验结果没有太大影响的。碱性和中性彗星的区别在于电泳液和电泳条件，凝胶肯定没有影响。
中性电泳没有做过，没有发言权，不知道你在保证电泳液没有问题的基础上有没有试过调节电泳液面？要是这也试过我就没办法了，还请大家来帮忙参考哈。
作者: caihong    时间: 2011-12-7 14:58

俺早些时候做的comet，请各位群友老师指教。

图片附件: 25323030.jpg (2011-12-7 14:58, 60.32 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9596

作者: loli    时间: 2011-12-7 14:59     标题: 回复 #1030 caihong 的帖子

不错不错呦，是什么细胞的彗星啊？
作者: abc816    时间: 2011-12-7 15:00

我用植物原生质体做彗星电泳，从始至终都是一个人在做，试验结果是好是坏，自己或周围的人都没法判断，我把自认为好看的一张图贴上来，让老师们看看怎么样？裂解一小时，解璇15分钟，电泳10分钟，EB染色，40X下数码相机照相。

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我觉得实验相对来说比较成功，但有以下比较缺陷的地方：
1.用植物细胞做彗星实验，确实有一定的难度，因为涉及到破壁。在制备原生质体的时候，有可能对细胞造成损伤，从你的图片中也能看到，所以建议你选择一种较好的原生质体制备方法。
2.裂解时间不够，可适当增强到1.5小时或2小时。
3.不知道你这个细胞是阴性对照组还是实验处理组，也不清楚你电压是多少，所以应对电泳的时间和电压进行调整。
作者: caihong    时间: 2011-12-7 15:00     标题: 回复 #1031 loli 的帖子

是293FT细胞，经1J UV照射后不同时间点做得电泳
作者: whitesheep    时间: 2011-12-7 15:01

请教一叶老师，根据您的帖子我一直都做的挺好的，可是最近出了挺诡异的事情:同一批细胞有的挺好的，可是其余的根本连细胞都找不着，真是太让人苦恼了。首先我绝不可能没有一个细胞在玻片上，再怎么不均匀，总会有细胞在上面吧，可是居然一个细胞都找不着；其次绝对没有脱胶的现象，电泳完都可以看到很多细胞在胶里的；一样的步骤和样本我重复了一个星期，每天都做，可是居然有时候就看得到细胞，有时候就是连一个细胞都看不到。God save me!
作者: whitesheep    时间: 2011-12-7 15:02


另外，还想请教一叶老师，彗星的数据统计，OTM指标并不是正态分布，用方差分析是否太牵强了?否则应该怎样统计分析呢，不好意思我没找到相应的帖子。
作者: whitesheep    时间: 2011-12-7 15:02


我看一篇2009发的外文，说的是碱性彗星会使蛋白变性，难以维持其空间结构，检测的多是单链断裂。而中性可以保住双链之间的空间结构而检测双链断裂。不知对不？各位能否解答一下，真的有点混了。还有就是中性指的是什么？是裂解液还是什么啊？大部分文献都是说PH值10几，最少的也是8.0多，根据中学的化学知识那我理解的PH值是7.0左右的才是中性吗？请各位指教一下。呵呵。
作者: TAT    时间: 2011-12-7 15:03

请问各位做过彗星实验的tx们，有用冻存组织做过彗星实验吗？本人在用冻存组织取细胞悬液，跑电泳后发现，根本找不到细胞，用新鲜组织做的彗星细胞结果就很好，有人遇到过这样的问题吗？本人考虑是不是DNA降解的原因
作者: 园丁##    时间: 2011-12-7 15:04

看了本群的专题讨论后我已经对裂解时间、电泳时间及电压进行了调整，彗星图片与软件已能较好吻合。还有一个疑惑是我所用的那种植物材料游离出的原生质体电泳后头部边缘通常比较清晰，没有出现毛边，后来又试了其他材料，条件一样的情况下，跑出来的图形就比较好看了。两种材料不一样的地方是前者原生质体大，并且有一个大的液泡，后者原生质体小，液泡相对可能也小。不只道是不是裂解时膜系统被破坏后在类核旁留下一个大的空隙，使得解旋变得相对容易些造成的？
作者: loli    时间: 2011-12-7 15:04     标题: 回复 #1037 TAT 的帖子

我没做组织，没有发言权。这个问题好像lq6688老师以前也提到过，据说最好还是用新鲜组织做，组织冻存后效果不好哦。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 15:06     标题: 回复 #1035 whitesheep 的帖子

不服从正太分布当然不能用方差，预实验应该先做一下样本含量，保证了足够的检验效能后，再看数据的分布，选择合适的分析方法，如果不是正太分布，可以选择做数据转换。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 15:06

安装后，自动生成一个快捷方式，这个是不能用的，要删除这个快捷方式后再建一个，就没问题了。
作者: 了了    时间: 2011-12-7 15:07

有二个问题请教大家：
1.一叶老师的自制电泳槽
您的电泳槽用的破片是厚度在1mm？是的话，这小槽子的体积：15mmX15mmX1mm=225微升，两次铺胶，每次100微升，是可以的。按照您的提示，我也做了几张小槽子，昨天试用了一下，感觉不踏实，转动玻片，胶水不是均匀的流动，很难铺的匀啊。转动时，第一层胶就有溢出小槽的现象，第二层更明显，不知道一叶老师怎么控制的
2.我的裂解液没有用NaOH条PH值到10这步骤，裂解液中其它成分都一样，我的裂解液PH值只有7.0，后面的电泳解旋液用：Na2EDTA+NaOH,这符合碱性电泳条件吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 15:07     标题: 回复 #1042 了了 的帖子

1，这样铺胶不成功的几率很大啊，铺胶前最好把玻片清洗干净，一个小窍门：铺胶前把玻片放在水浴上熏一下，或用嘴哈一下气，很容易铺平的；
2，喊了很长时间的方法学的标准化，这样有利于这个技术的发展，还是按常规方法做吧，
我正在起草这个方法用于职业性损伤评价的GB/T，希望有用
作者: 了了    时间: 2011-12-7 15:08


谢谢您的点拨，请看看我的最近几天做的最好彗星照片

图片附件: 39372644.jpg (2011-12-7 15:08, 10.14 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9597

作者: 了了    时间: 2011-12-7 15:08

再来一张，一叶老师发明的电泳小槽子，真好！不脱胶。有点美中不足：细胞不在同一层面，不好看呀

图片附件: 36225687.jpg (2011-12-7 15:08, 16.8 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9598

作者: DNA    时间: 2011-12-7 15:09

各位老师，看了大家的帖子收获很大，我最近也被老板逼着做彗星实验，哎，我是一点生物底子都没有的人，所以超没底气的，看了大家的帖子心情好多了。

想请问下各位老师，我到处都买不到肌氨酸钠，不知道这个药品能不能用别的东西代替？这里的肌氨酸钠跟十二烷基肌氨酸钠是一回事么？因为试剂公司都只有十二烷基肌氨酸钠卖的说。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 15:11     标题: 回复 #1046 DNA 的帖子

可以不用了。。。。。。。
作者: fsdd817    时间: 2011-12-7 15:11

有几个问题想问问，谢谢大家了。
我选的专业偏血液学，所以想选白血病和彗星试验，看有没有交集，以前从没做过SCGE，上周做了几天的试验，觉得挺不容易的，我用的是人的淋巴细胞。
1.看过一篇文献说可以用全血代替淋巴细胞提取液，我用的全血，最后还是看到彗星的，但是我看很多老师仍用的淋巴细胞提取液，为什么呢？这样做的试验是质量更高些吗？因为如果可以用全血的话，会节约不少步骤。
2.我试了96孔板，24孔板---铺单层胶，结果裂解，电泳后胶基本脱完了。。。胶用的是1%的LMA和细胞悬液4：1混悬，有老师用这种方法成功的吗？
我还试了将载玻片在0.6%的NMA中镀膜后再铺胶一种是滴加80ul的细胞悬液后用盖玻片压平4摄氏度凝固5min，结果取盖玻片时脱胶了，是不是手法不对？还是凝固时间不够？
我用的最后一种方法要繁琐些，就是载玻片镀膜后用三张盖玻片搭小室，在小室中灌胶80ul，这样取上面的盖玻片不会脱胶，但是面积不好控制，而且很繁琐，尽管最后看到彗星了
这些方法都是文献上看的，试的我够呛，因为这个帖子是我现在才看到的，所以还没有试lp6688老师讲的方法，打算有时间试一试。
3.有没有老师做过白血病与SCGE的设计的？我现在脑子里很乱觉得找不到方向，大家能帮帮忙指点下吗？
现在暂时就这些问题，因为读在职，试验时间太少，有的问题可能幼稚了，希望大家别笑啊~~~~~
作者: 月牙牙    时间: 2011-12-7 15:12

我们导师也是让我做单细胞凝胶电泳的试验，研究纳米材料对细胞DNA的损伤，我以前从未接触过电泳试验，我们实验室现够买了北京六一厂的电泳仪和水平电泳槽，我看了文献上说的都有少许出入，是不是这些铺胶的药品的浓度和裂解液等的浓度不是要求非常严格，我实在是不知道该从哪里下手，希望老师不厌其烦的给我一些帮助，想和老师好好交流一下！谢谢老师了！
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 15:13     标题: 回复 #1048 fsdd817 的帖子

脱胶是个大问题，不过许多群友已经解决了这个问题。
市场上有卖彗星玻片的，国内的能用，但不好用，可以买进口的，在普通玻片上粘上了疏水材料，疏水材料上挖的圆形孔。我们是用以前提到的方法，已经申请专利了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 15:15     标题: 回复 #1049 月牙牙 的帖子

实验当然应该严格按照操作步骤执行啊。裂解液、电泳液等的配制应该都是比较统一的。
作者: fsdd817    时间: 2011-12-7 15:15     标题: 回复 #1050 一叶 的帖子

谢谢老师，那您用过全血做试验吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 15:16     标题: 回复 #1052 fsdd817 的帖子

全血我做过的，效果也不错，细胞密度不太好掌握，裂解后红细胞就没有了，背景也不错。
作者: whitesheep    时间: 2011-12-7 15:16

请问老师我们这里只有一个大号电泳槽和电泳仪，直接把铺好胶的载玻片放进去电泳仪中就行么？这样会不会浮上来？还有就是整个电泳过程要保持在黑暗和4摄氏度条件下进行么？可能问的问题有点弱，但是就是很困惑，希望老师给我说说，万分感谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 15:17     标题: 回复 #1054 whitesheep 的帖子

1、非常愿意和大家讨论，我们共同进步；
2、是否浮上来？不会的，你试过了吗。看到这样的问题很郁闷，这不应该在这里问，应该到实验室问自己，根本不去实践，永远没有答案。
3、黑暗的问题，我们没必要找一个暗室，电泳的时候把槽用盒子罩起来就可以了，我觉得没必要放4度，但电泳液一定要存放在4度，用前拿出来即可。
作者: whitesheep    时间: 2011-12-7 15:18     标题: 回复 #1055 一叶 的帖子

很对不起老师了，由于我今年才考上研究生，导师提前叫我掌握仪器，我实在不知该如何下手了，实验室没有人接触过，所以问问题显的很轻率，由此给大家带来的不便我表示歉意！还是祝大家实验顺利，我会努力摸索的！出现问题再和大家讨论！
作者: 二丫头466    时间: 2011-12-7 15:18

请教个问题，染色时能否用goldview， 如果可以浓度多大合适，谢谢大家！
作者: 二丫头466    时间: 2011-12-7 15:19


老师您好，我在订药品的时候，厂家推荐不要使用EB染料，是剧毒物质，推荐使用goldview，我查了一下发现其灵敏度不如EB,我看了几篇外文文献，里面使用的是SYBR Green染料，请问到底如何选择呢？谢谢老师~
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 15:19     标题: 回复 #1058 二丫头466 的帖子

是啊，EB毒性大，可以用SYBR Green，吖啶橙替代，文献上应该可以查到工作液的浓度。
作者: HP007    时间: 2011-12-7 15:20


好疑惑:看了好些文献,只有动手后才发现有问题,今天准备先配点做彗星试验用的PBS,可却发现网上关于PBS的配方好多,同一浓度的都发现配方不一样,各种试剂的用量也不一样.请教一下:用于彗星试验的配琼脂糖的PBS浓度是多少,配方是怎样的.
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-7 15:20

看一叶老师的意思，gold view 不行啊！
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 15:21     标题: 回复 #1061 小鱼鱼 的帖子

这倒不是，实践一下吧，担心的是荧光淬灭会不会快？
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 15:21     标题: 回复 #1060 HP007 的帖子

是啊，PBS不少配方，估计在这里讨论的群友们用的都不尽相同啊，我想这也不必教条。
我用的是含有磷酸二氢钠和磷酸氢二钠的那种。
作者: zhezhe    时间: 2011-12-7 15:22

您用的是不是下面的配方啊:

PBS缓冲液的配制
母液的配制：
0.2M Na2HPO4：称取 71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于 1000ml 水
0.2M NaH2PO4：称取 31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水
各种浓度PB(pH=7.4)的配制：
先配 0.2M PB (pH=7.4，100ml)：取19ml 0.2mol/L的 NaH2PO4， 81ml 0.2mol/L 的 Na2HPO4, 即可。
然后 只需将0.2M PB (pH=7.4)按相应比例适当稀释 即可，如：
0.1M PB（PH=7.4） ：取 500ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。
0.01M PB （PH=7.4）：取50ml 0.2M PB，加水稀释至 1000ml 即可。
0.02M PB （PH=7.4）：取100ml 0.2 M PB，加水稀释至 1000ml 即可。
若需要 NaCl的话，加入 NaCl 至0.9%（g/100ml）即可。

但是该用哪个浓度呢?
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 15:22     标题: 回复 #1064 zhezhe 的帖子

当然是0.1M的。
我用的是：
A：Na2HPO4:0.2M(称量克数依水合分子的数目而定，有Na2HPO4•12H2O和Na2HPO4•2H2O)
B：NaH2PO4:0.2M(称量克数依水合分子的数目而定，常用为NaH2PO4•2H2O和NaHP2O4•H2O)
A和B按18：7的比例混合，然后再加等体积的ddH2O（稀释1倍）即可。
作者: 笑弯了腰    时间: 2011-12-7 15:23

请问大家都是体外染毒还是细胞染毒呢？

一叶老师:

我做的是淋巴细胞直接染毒，想问一下淋巴细胞是不是必须悬于PBS缓冲液里面（我看到一些文献上说PBS可以替代Hank’s液使用，不知道具体有没有影响）

我看到很多文献上细胞染毒都是将毒物按一定比例与PBS菌悬液混合，得到自己想要的毒物浓度。但是我做的是环境废水，无法随意改变废水的浓度，可是与菌悬液混合的话势必会使废水稀释，所以想请问下老师直接将废水与淋巴细胞沉淀混合行么？淋巴细胞离开了PBS缓冲液可以么？
作者: 缘yuan    时间: 2011-12-7 15:23


各位老师，请帮忙看一下我做的彗星实验图片。

感觉细胞有点太圆了，几乎找不到受损细胞，请问这是怎么回事呢？我们裂解时间是2h，解旋30min，25v、300mA下电泳30min，可是即使是紫外灯照过的细胞也很难找到彗星，不知道是怎么回事。（台盼蓝染色后蓝色细胞的比例很大呢）

请各位老师指教下，万分感激啊！
作者: 缘yuan    时间: 2011-12-7 15:24

各位老师，这是我的照片

图片附件: 27154870.jpg (2011-12-7 15:24, 12.46 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9599

作者: 缘yuan    时间: 2011-12-7 15:24


偶尔有一个下面这样的细胞，但是数量非常非常少，很难找，大部分都是上面那样的。

图片附件: 33633981.jpg (2011-12-7 15:24, 12.11 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9600

作者: loli    时间: 2011-12-7 15:24     标题: 回复 #1066 笑弯了腰 的帖子

你将环境废水经固相萃取后再染毒细胞行不？
一般淋巴细胞的彗星实验裂解1小时，解旋20分钟，电泳20分钟就够了，你的实验条件有点不同呦，是文献上说的吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 15:25     标题: 回复 #1067 缘yuan 的帖子

中性还是碱性？
紫外致DNA损伤的原理？是否考虑有交联？
作者: loli    时间: 2011-12-7 15:25


我以前在预实验时想做出阳性的结果，也曾试过用紫外线照，但没什么效果。后来改用了双氧水，彗星就很明显了。
作者: 969    时间: 2011-12-7 15:26


各位老师好！
我们做了几次预实验，一张片子里也就几个拖尾的，连阳性对照也没有，阳性对照用的是100mmol/L的重铬酸钾，电泳条件是25V，300mA,30min，但我们的电泳槽较大，一次大概能装20多张载玻片，是不是我们的电压太小了呢？
还有就是裂解液在加入Triton X-100和二甲基亚砜后混匀，放在冰箱里静置一段时间后，溶液是会变得透明，但倒出后还是会浑浊，不出现彗星是不是裂解液的问题呢？
麻烦各位老师帮我分析一下是不是以上的原因呢？谢谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 15:26     标题: 回复 #1073 969 的帖子

是啊，裂解液很关键！电泳槽大的话，单位电压不够也不行。
作者: 白白的    时间: 2011-12-7 15:27

刚做完碱性慧星实验，第二次感觉就成功了，贴几张图片给大家看看。

图片附件: 20965241.snap.jpg (2011-12-7 15:27, 6.13 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9602

作者: 白白的    时间: 2011-12-7 15:27

继续，我是用博来霉素做的阳性结果

图片附件: 78459922.snap.jpg (2011-12-7 15:27, 5.71 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9603

作者: 白白的    时间: 2011-12-7 15:27

对照组如下图

图片附件: 86892796.snap.jpg (2011-12-7 15:27, 6.08 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9604

作者: 白白的    时间: 2011-12-7 15:28

阳性对照上基本上90%的慧星细胞，但就是不知如何用Casp软件，慧星细胞上的条线框是做什么用的呢，还有最外面这个框的大小有什么标准吗？再有就是结果无法直接统计在结果窗口的表格里？？？？请会的老师指导一下。

图片附件: 30973870.snap.jpg (2011-12-7 15:28, 49.32 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9605

作者: 园丁##    时间: 2011-12-7 15:29

中性还是碱性？
紫外致DNA损伤的原理？是否考虑有交联？

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紫外线照射后60-120min拖尾才达到最大值

照完就铺片是看不到拖尾的
作者: loli    时间: 2011-12-7 15:29     标题: 回复 #1079 园丁## 的帖子

这样呀，怪不得我照了半小时也没什么用也。
作者: 白白的    时间: 2011-12-7 15:29


近期想做Comet-FISH,不知哪位仁兄做过，能否把操作步骤共享一下呢，谢谢。
作者: tieshazhang    时间: 2011-12-7 15:30


最近准备做comet，准备用吖啶橙染色，
请问：吖啶橙浓度多大为好，另外，一般用PBS，还是D-hanks液，一般 pH多大比较好。染色多久，谢谢！
作者: utt0989    时间: 2011-12-7 15:31

新手求助:实验室电泳槽是38A的，比较老的那种，加了碱性电泳液以后发现没过玻片以后电压下降，只能升到6伏左右，还显示超负荷，要是电压在20V左右根本没不过玻片的，怎么办啊？愁死了！拜托老师指点下！
作者: loli    时间: 2011-12-7 15:32     标题: 回复 #1083 utt0989 的帖子

不同实验室的仪器设备都有不同，型号老一点也没有关系，只要不是坏的就行了。至于电泳中出现的问题，由于没有实地见到，我也不好乱推测哈。你在电泳前可否先不放玻片，先把电泳液倒入电泳槽把电流电压调好再放玻片试试。还有就是电流电压的设置，不同的仪器设置后的电泳效果也不同，你最好各个不同的电流电压条件都试一下，电压低就设置高点，不要只调到25V，可能调到28V才跑出23V也不一定哦。另外还有一点就是电流电压不是绝对的，还可以根据电泳槽的大小长宽来计算，这个我以前就说过的。最后如果还是不行的话，就要考虑你的电泳液问题了。
那个图我也看了，个人觉得可能不是细胞哦，有点像碎片。
作者: 中国特色    时间: 2011-12-7 15:33

谢谢一叶、abc816、loli、园丁##等前辈们丰富的经验和无私地给予。近期就可能开始做了，希望到时候仍能得到大家的帮助。准备做射线照射后正常组织细胞的中性SCGE。贴子里中性SCGE的资料不如碱性的多，估计摸条件就得很长时间。
作者: loli    时间: 2011-12-7 15:34


记得一叶老师说过他们现在也在做中性SCGE，我也查到过他们发的中性SCGE的文章，所以你不用担心哈，有问题一叶老师应该都能帮你解决的。
作者: 中国特色    时间: 2011-12-7 15:34     标题: 回复 #1086 loli 的帖子

借您吉言喽!

不过我要做的是正常组织，预实验是一定要做的，首先是组织分离成单细胞，再是摸电泳条件。现在什么都是零，试剂没有买，仪器设备还要到处去打听。呵
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 15:35

请问大家都是体外染毒还是细胞染毒呢？

一叶老师:

我做的是淋巴细胞直接染毒，想问一下淋巴细胞是不是必须悬于PBS缓冲液里面（我看到一些文献上说PBS可以替代Hank’s液使用，不知道具体有没有影响）

我看到很多文献上细胞染毒都是将毒物按一定比例与PBS菌悬液混合，得到自己想要的毒物浓度。但是我做的是环境废水，无法随意改变废水的浓度，可是与菌悬液混合的话势必会使废水稀释，所以想请问下老师直接将废水与淋巴细胞沉淀混合行么？淋巴细胞离开了PBS缓冲液可以么？

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这个应该不是问题，你应该分几个组：废水组，废水＋PBS组，（分出不同的浓度比例）
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 15:35

新手求助:实验室电泳槽是38A的，比较老的那种，加了碱性电泳液以后发现没过玻片以后电压下降，只能升到6伏左右，还显示超负荷，要是电压在20V左右根本没不过玻片的，怎么办啊？愁死了！拜托老师指点下！
另外，这是我电泳了半小时的图，没有尾巴，但是CASP能分析出来，和标准的那种图也不一样，请问这个图是DNA损伤嘛？能看出什么不？谢谢了！

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你的不是细胞啊
作者: 中国特色    时间: 2011-12-7 15:36

有个问题，想请教一下各位前辈。

我查了一下，SCGE的原理主要为：“在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA及其它成分均可进入凝胶而扩散到裂解液中，而核DNA分子量很高不能进入凝胶，只能留在原位”。

那么在裂解过程中，线粒体膜也应受到破坏，其内的DNA(动物细胞mtDNA分子量约为9.6×10的6次方，道尔顿；线粒体基因组共含16569个碱基对bp)是因为分子量不足够大也进入凝胶并扩散到裂解液中去，还是留在原位，并有可能影响核DNA片段的电泳结果呢？

今天突然想到这个，查了查资料，也搞出个所以然，谢谢大家的帮助。
作者: one    时间: 2011-12-7 15:37

各位大侠好：我做毒物对孕鼠影响的血液的彗星试验。由于每次尾部只能取50μl血液，如果用淋巴细胞分离液的话，得到的淋巴细胞就很少了，并且老板也不赞成用淋巴细胞分离液，所以我用全血。前几天做了全血的彗星试验（阴性对照），但是背景很脏，细胞几乎看不到。但是我同时还做了一个肿瘤细胞的彗星试验，背景挺干净的，阴性对照和阳性对照效果还可以。所以现在就很可恼，原因不知道在哪，请教：
1.全血的处理：
（1）抗凝剂我用的是EDTA，不知道是否会影响结果？
（2）取的抗凝全血是直接和1.0%LMA 1：1混匀铺胶？还是取的抗凝全血和PBS等量稀释后，再和1.0%LMA 1：1混匀铺胶？我上次做时采取的是抗凝全血直接和1.0%LMA 1：1混匀铺胶。
（3）抗凝全血取好后可以在37℃长期保存吗？半小时可以吗？如果不可以，是否应在4℃保存？4℃能保存多长时间？我上次做时抗凝全血取好后37℃保存半小时才和1.0%LMA等量混匀铺胶。
2.裂解1h，解旋25min，电泳25V，300mA 25min，可以吗？或者有更合理的条件？一般都是避光，4℃进行。
3.染色时，加完EB后，晃动载玻片使EB在上面均匀后，不加盖片，不漂洗可以吗？或者不加盖片，漂洗？
谢谢！
作者: 中国特色    时间: 2011-12-7 15:37

我还有点问题，大家用24孔或96孔细胞培养板盖做电泳槽的时候，是用什么工具把它切割成小块的？另外，是不是用的都是新的板盖啊？好象有点浪费啊!

盼回复，谢谢。
作者: loli    时间: 2011-12-7 15:38     标题: 回复 #1092 中国特色 的帖子

我觉得应该是玻璃刀，因为一叶老师好像就是用玻璃刀来做他的微电泳槽的。至于是不是新的板盖，我觉得可能不是，因为一叶老师好像说过他的微电泳槽就是使用之后再浸泡清洗重复使用滴。
作者: loli    时间: 2011-12-7 15:38     标题: 回复 #1091 one 的帖子

由于自己没有做过全血的彗星实验，所以前两个问题我都不好回答你哈。没有办法，我只好去查了下文献，找到了三篇，你先看看，希望能解决你的问题。至于第三个问题我是可以回答的：“染色时，加完EB后，晃动载玻片使EB在上面均匀后，不加盖片，不漂洗可以吗？”我个人认为不加盖片是可以的，但应该漂洗。漂洗能洗去玻片上多余的EB，避免背景过亮。这样既降低了EB浓度，减少被EB污染的几率，又能使拍照的效果更好。
作者: loli    时间: 2011-12-7 15:39

由于自己没有做过全血的彗星实验，所以前两个问题我都不好回答你哈。没有办法，我只好去查了下文献，找到了三篇，你先看看，希望能解决你的问题。至于第三个问题我是可以回答的：“染色时，加完EB后，晃动载玻片使EB在上面均匀后，不加盖片，不漂洗可以吗？”我个人认为不加盖片是可以的，但应该漂洗。漂洗能洗去玻片上多余的EB，避免背景过亮。这样既降低了EB浓度，减少被EB污染的几率，又能使拍照的效果更好。

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《微量全血单细胞凝胶电泳评定过度训练大鼠淋巴细胞DNA损伤》
作者: loli    时间: 2011-12-7 15:39

还有一篇哈

《 微量全血彗星实验法的建立及在生物监测中的初步应用》
作者: one    时间: 2011-12-7 15:40



不过我记得一叶老师自制的微电泳槽是用玻片制作的，是玻璃的，所以用的是玻璃刀，并且使用之后再浸泡清洗，重复使用。

细胞培养板不会也是用玻璃刀吧。
作者: @STAR@    时间: 2011-12-7 15:41

那个裂解液在配制时并不是清亮的，有的乳白色的感觉，但在4度冰箱中放1-2小时后，看起来是完全清亮的，这个究竟算不算是好的（完全溶解的）
作者: loli    时间: 2011-12-7 15:41


一叶老师是用玻璃刀来划的玻片，但我的理解是既然玻璃都能划肯定划细胞培养的塑料板也没问题吧（也不知道对不对，呵呵）。不过我后来又咨询了一下专业人士，他说玻璃刀是肯定能划的，但拿来划这个有点杀鸡用牛刀的意思，用普通的锯子就可以了！要不你试试？
作者: loli    时间: 2011-12-7 15:42     标题: 回复 #1098 @STAR@ 的帖子

裂解液在配制时一定要完全溶解变清亮才可以哟，出现乳白色可能是由于它的PH还没到达合适的程度。一般裂解液的PH都是10左右，我个人感觉在PH8以上时才会变澄清。你可以先一次调到11左右，再慢慢调低，PH一上去立马就会有改变了。
作者: one    时间: 2011-12-7 15:42     标题: 回复 #1099 loli 的帖子

真是太感谢你了，我试试。

不过我后来想，如果我检测的样本多的话，就不用锯啦。直接拿来用不就得了？除非电泳槽不够大，放不进去。
作者: loli    时间: 2011-12-7 15:43     标题: 回复 #1090 中国特色 的帖子

这个问题真的很难啊，对我来说。查了查文献，也都语焉不详。想放弃吧，又有点不甘心。今天又学习了一下，有了一些自己的认识，说在这里大家交流一下，有不正确的还望各位老师来补充。
“包埋于琼脂糖中的细胞经裂解时细胞膜、核膜及其它膜结构受到破坏,胞内蛋白质、RNA 及其它成分均可进入凝胶而扩散至裂解液中,而核DNA 分子量很高,不能进入凝胶,只能留于原位。”这仅仅是彗星实验原理的第一步，我认为更重要的原理是“DNA 受损产生链断裂时,正常的DNA 超螺旋结构变得松驰,DNA 环向外伸展,链缺口暴露了阴电荷,高pH促使DNA 变性和解螺旋从而有利于单链和双链DNA 断片的移动。在电场力作用下,细胞核中带阴电荷的DNA 断片离开核DNA 在凝胶分子筛中向阳极移动,形成“彗星”状图像。含DNA 链缺口越多,则进入尾部的DNA 越多,表现为尾长和尾部荧光强度增加。”也就是说，核DNA的双链线型结构，遇高温、高热或者机械剪切等外力容易断裂和降解的特性决定了彗星实验的方法。
“线粒体DNA是单链环状结构，相对线性的核DNA，比较稳定，不容易降解。核DNA的遗传遵循孟德尔遗传定律，而线粒体的遗传是以母系遗传的方式进行的。”从这里我们可以看出，线粒体DNA和核DNA的结构是不一样的。不知能否理解为基于核DNA特点设计的彗星实验方法对线粒体DNA无效？再加上其分子量太小，因此是否对于线粒体DNA我们可以忽略不计？
作者: one    时间: 2011-12-7 15:44     标题: 回复 #1102 loli 的帖子

看来关键还是在分子量大小上。

不过值得注意的是，mtDNA是一条双链环状的DNA分子,其基因组含16569个碱基对bp。

希望继续讨论。
作者: tieshazhang    时间: 2011-12-7 15:44


很弱地问个问题，各位的荧光显微镜的镜头是油镜吗？如果是的话，染色漂洗吸干水后，观察时可以直接在凝胶上滴油，然后观察吗？
作者: duoduo    时间: 2011-12-7 15:49


用的可以是40+的，也可以用油镜（可以在盖上盖玻片，或在凝胶上玻片上盖上保鲜膜，然后滴上甘油，就可以看了）
作者: BUK    时间: 2011-12-7 15:50

配裂解液时，加入DMSO和Triton X 100以后，pH调到10以上都还是乳白色的，但是放入4度冰箱一段时间以后就变清亮了.....这是为什么？
作者: BUK    时间: 2011-12-7 15:50

请大家帮我看看我这张comet照片的效果怎样？

第一次做啊，请大家多多指正。曝光时间100ms 。谢谢！


图片附件: 83054601.snap.jpg (2011-12-7 15:50, 12.26 KB) / 该附件被下载次数 0
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9650

作者: loli    时间: 2011-12-7 15:51


配裂解液时先把原液配好，PH调到10，溶液变澄清时就可以放到冰箱里了，使用时直接按比例加入DMSO和Triton X 100就可以了，不用再调PH了。Triton X-100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。就像洗衣粉里加的表面活性剂一样，加了之后会有点浑浊，需要放到冰箱里静置一会。为什么要放冰箱？个人感觉裂解液温度越高越浑浊(曾经试过把裂解液放到37度，结果浑到不行）。至于荧光显微镜的镜头倍数，一般20或40，常用40，油镜放大倍数太大了，没有必要。
作者: loli    时间: 2011-12-7 15:51     标题: 回复 #1107 BUK 的帖子

个人感觉，1.细胞密度高了点，细胞太多太紧密会影响彗星的迁移。
2.细胞照的不是非常清楚，不知是焦距没调好还是染色的问题。
3.这张是正常细胞的阴性对照吗？好像没看到彗星细胞也。
4.第一次做，这种效果已经很不错了，呵呵。
作者: BUK    时间: 2011-12-7 15:52     标题: 回复 #1109 loli 的帖子

多谢，正是阴性对照。

效果可能和焦距有关系，

如果是染色问题，该如何调整呢，谢谢！

我用的AO：（20ug/ml，20ul）染5分钟。帮我分析下问题在哪里？
作者: yychen    时间: 2011-12-7 16:04

今天电泳的时候遇到一个问题，
本来设置的参数是：25v，300mA，
电泳时，指示参数是24v，但电流随着电泳的进行，电流从190不断上升，最后升到了200mA.

电压的问题，我重新设置了一下参数，把电压设置到了26v，结果指示电压为25v。

最后就在指示参数为：25v，200mA条件下电泳20分钟，大家帮我分析下这个问题，对结果是否有影响，该如何调整。谢谢！
作者: yychen    时间: 2011-12-7 16:05


细胞悬液中细胞的观察，400x

图片附件: 22631488.snap.jpg (2011-12-7 16:05, 36.62 KB) / 该附件被下载次数 0
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9681

作者: yychen    时间: 2011-12-7 16:05


0.7%LMA凝胶中细胞的观察，400x

图片附件: 72090968.snap.jpg (2011-12-7 16:05, 16.39 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9683

作者: yychen    时间: 2011-12-7 16:05

另外一张凝胶中的细胞，条件同上。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9685

作者: yychen    时间: 2011-12-7 16:06


AO染色后的结果，200x

图片附件: 54481294.snap.jpg (2011-12-7 16:06, 6.37 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9687

作者: yychen    时间: 2011-12-7 16:06


AO染色后的结果，400x

图片附件: 20976622.snap.jpg (2011-12-7 16:06, 6.2 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9688

作者: yychen    时间: 2011-12-7 16:06

AO染色后的结果，400x 另外一张

图片附件: 32048908.snap.jpg (2011-12-7 16:06, 5.93 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9689

作者: yychen    时间: 2011-12-7 16:08

大家帮我分析一下问题在哪里，该如何解决。

感觉在200x时很亮，但到400x时很暗，不好清楚，不知道什么原因，谢谢！
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:09


个人感觉：
1.悬液中的细胞看上去好像不是同一种，似乎有好几种（细胞碎片？）。细胞太杂的话对实验是有影响的，过滤时可能要注意一下。
2.混入凝胶后，细胞密度太低，而且就此可看出杂质较多。两张片子的细胞数明显不一，细胞悬液加入凝胶时要注意仔细混匀。
3.我上次忘了说，曝光时间100ms稍低了一点，这样的荧光效果会偏暗，600-800可能比较合适。你可以使用手动曝光，不同的曝光时间都看一下，根据实际情况选用最合适的曝光时间。
4.“200x时很亮，但到400x时很暗”，我们的显微镜也是这种情况。看400X时电脑图像系统的参数是要从新设定的，放大倍数不同设置肯定不同，你要多试试这个图像系统的各种功能，不同参数、设置，以期获得最佳的图像效果。
作者: yychen    时间: 2011-12-7 16:09

4.“200x时很亮，但到400x时很暗”，我们的显微镜也是这种情况。看400X时电脑图像系统的参数是要从新设定的，放大倍数不同设置肯定不同，你要多试试这个图像系统的各种功能，不同参数、设置，以期获得最佳的图像效果。

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非常感谢，这里的参数，具体指的什么参数啊？

曝光时间，焦距，我致知道一般调节者两个参数。

其他的还有什么可以调节的嘛？

再次感谢？
作者: yychen    时间: 2011-12-7 16:10

个人感觉：
1.悬液中的细胞看上去好像不是同一种，似乎有好几种（细胞碎片？）。细胞太杂的话对实验是有影响的，过滤时可能要注意一下。

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过滤时，该怎么调整呢？
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:10


我们实验室使用的是Nikon ECLPSE TE2000-E型荧光显微镜，搭配使用Nikon NIS Elements Basic Research图像采集系统。从电脑上就可以对图像的曝光时间、对比度、背景明暗、采集图像的大小等进行调节，焦距是要从显微镜上调的。由于不像以前一样用相机直接从目镜中照相以采集图片，现在从电脑上采集的图像是要以电脑上显示的效果为准的。如果你们也是使用图像采集系统的话，电脑上该系统的各项功能及参数应该好好熟悉利用，以获得最佳效果。要是对显微镜和电脑软件功能不熟的话可能需要问问管理仪器的老师或是公司的技术人员。
由于没有做你这种细胞的经验，细胞碎片的说法也只是我看到你提供的照片后的个人看法，仅供参考。是否细胞碎片，还是其他的杂细胞，做这种细胞的你应该比我更清楚。不管是碎片还是杂细胞，怎样在取材过程中尽量保证实验细胞的纯度是你需要解决的问题，过滤只是我想到的其中一个可能的影响因素。你所选用的滤网目数是否合适？滤网是否已使用过久？剪组织的时候是否剪得过于细碎？为了保证彗星实验的顺利可靠，你应该从实验的最根本因素—细胞抓起。
作者: yychen    时间: 2011-12-7 16:11

现在贴两张阴性对照图，大家帮忙分析一下，能否进行CASP分析，是否能达到最后图像分析的标准。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9690

作者: yychen    时间: 2011-12-7 16:11

请大家帮忙分析一下，另外一张。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9691

作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:12     标题: 回复 #1123 yychen 的帖子

那么小？怀疑是否细胞，200×的？
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:12

这两张照片看着还是很可疑呀，大小不一、密度太低、荧光太弱，看来细胞、铺片、染色等步骤都尚有问题有待解决。加油啊
作者: 盼盼    时间: 2011-12-7 16:13


刚开始做实验，出现好多问题
我用油镜观察，AO染的色，染完色也漂洗过了，但背景有点太清楚了，都能看到胶上的红色纹路，而且夹杂着绿色的一块块物质，形状特别清晰，大小也差不多，请问绿色的物质是不是就是剩下的细胞核？是不是不应该用油镜看？或者会不会是染色染过了，让背景太亮了？
谢谢
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:13

只用普通光镜就可以了，20X或40X，不用油镜。
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:14

另外我还想谈谈这段时间在帮助战友的过程中产生的一点想法：1.这个讨论帖从开贴到现在已经好几年了，也长达40页，其中讨论到的问题已经涵盖了各个方面，在彗星实验当中所遇到绝大部分问题都能在帖子里找到。所以各位战友如有疑问时请先耐心翻看下前面的内容，可能你的问题就能迎刃而解了，只知道张嘴来问的人可以说他根本就没有自己求知的想法，只想多快好省的解决问题。看帖子就像查文献，你想不用自己去查文献、看文献，就等着文献自己来告诉你答案吗？
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:14

2.个人感觉，查文献、看帖子都是做的理论准备，不管你看了多少文献，看了多少人家的经验总结，最终还是要落实到自己的亲自实践中去。不同的实验室，不同的仪器设备，不同的药品试剂，不同的操作者，稍有不同都可能对实验结果产生影响。很多文献报道的彗星实验的条件都略有差别，这个条件肯定是最适合他们实验室的，但是否就适合你呢？不一定。不要教条主义，最适合你们实验室的条件需要你自己在实践中去摸索，去体会。
作者: 盼盼    时间: 2011-12-7 16:14

向各位高手请教一个问题，我照着帖子前面提到的微型电泳槽做法，自制了几个微型电泳槽，但是今天铺胶的时候发现胶就是不能铺不上去，总是聚在一起，成为一个大水滴，很郁闷。我用的是光面的载玻片做的，是不是应该用毛面的载玻片做啊？
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:15

一叶老师就是用的光面的载玻片哈。
如果是再次使用时出现这种情况可能是因为玻片没有洗干净，如果是新的可能是因为玻片本身就不干净，有油啊啥的
作者: 盼盼    时间: 2011-12-7 16:15

我用洗洁精洗的玻片，可能还是没有彻底洗净吧，下午订了一盒毛面的玻片，明天再试试
作者: 盼盼    时间: 2011-12-7 16:16


还有，如在北方室内温度低胶凝的快会成水滴状的
作者: one    时间: 2011-12-7 16:16

GENEFINDER就是按说明1：1000配制后，观察前滴片染色就可以。同时，电泳条件是相同的，这和用什么染料没关系。你的问题出在电泳液上，我在前面的帖子说过同样的问题。这我也好长时间才摸索清楚。

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怎么我查到的资料上写的是10000倍呢？另外，每次染色的时候，为保证染色效果滴加多少ul呢？从染色后到观察最好在多长时间以内？跟EB是一样的吗？
作者: 盼盼    时间: 2011-12-7 16:17

我今天换成24孔板的盖子铺胶了，只铺了一层低熔点胶，用SYBR green染色的，做出来了，背景也不高，就是细胞密度高了些，另外好像模型组和正常组没有区别。

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作者: 盼盼    时间: 2011-12-7 16:17


上面那张是模型组的，这是正常的

图片附件: 35923928.snap.jpg (2011-12-7 16:17, 34.12 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9693

作者: loli    时间: 2011-12-7 16:17


好可爱的照片呀，呵呵。
是做的什么细胞呀？看起来小小的，是10倍镜下看的吗？
细胞密度是稍高了一点，以第一张的密度再少一半可能就比较合适了。
另外这些细胞看上去好像都有点彗星的感觉，都像带着一点尾巴。是正常细胞就是这个样子吗？如果是彗星的话它的方向应该是从左到右才对啊，是照片反了吗？
作者: 盼盼    时间: 2011-12-7 16:18

是Hep 2细胞，4倍下拍的，因为是预试，所以拍的时候我没注意放的方向，所以可能弄反了，呵呵。第一张是模型组的，第二张是正常组的图片，很奇怪，正常组有很多尾巴出来呢，而阳性对照的却没什么尾巴。
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:18


再做一次看看吧，先把细胞密度降下来再说。
作者: 盼盼    时间: 2011-12-7 16:18


今天的电泳很奇怪，所有组都没跑出尾巴，好像电泳没有跑动的感觉。我用的是0.5%的胶，40V跑了15min
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:19


0.5%的胶是可以的。40V电压可真高啊，电流是多少mA?如果这么高的电压都没跑出尾巴来，你可能要检查下裂解液了
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:20

我今天换成24孔板的盖子铺胶了，只铺了一层低熔点胶，用SYBR green染色的，做出来了，背景也不高，就是细胞密度高了些，另外好像模型组和正常组没有区别。

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是啊，正像loli所说，照片很好啊，如果细胞密度没有这么高，那就很完美了！come on！
裂解前没调细胞密度吗？
作者: 盼盼    时间: 2011-12-7 16:20

谢谢一叶老师的夸奖啊：）
那是我的预试，没调细胞密度就做了，感觉结果还不错呢。
但是第二次的实验结果不理想，所有组都没跑出尾巴，刚才看到loli老师说可能是裂解液的问题，但是我的裂解液和上次做的是一起配的，就是临用前加了DMSO和Triton，看到之前的帖子说可以这样的，我裂了1.5小时呢，在TBE中平衡了35min
还有一个问题，就是我不知道怎么算电压
每次就是大约设个三四十伏的样子
作者: 盼盼    时间: 2011-12-7 16:21


我设的40V，电流才19mA，是不是很低啊
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:21


40V电压是你实验要求吗？实际电泳过程中也有40V吗？19mA肯定低了。对于常规的细胞，一般文献上说要25V、300mA，由于设备和电泳液的不同可能在实际操作中不一定能这么绝对，但也不会相差太多。我们实验室一般在23V、260mA，电压过大会对细胞造成额外的损伤。你应该先把电泳的条件试好之后再跑。把电压稍降一点，电流设高一点，调节下电泳液面高度试试？
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:21


我用的bio-rad跑普通凝胶电泳的槽，机器要么是恒压，要么恒流，我调到25V的时候电流只有十几毫安，如果调成恒流260mA的话，电压就变成两百多伏了，所以我就调成了恒压，然后把电压调成40V
我再调节一下电泳液面试试吧，谢谢loli老师哈！：）
作者: one    时间: 2011-12-7 16:22

我今天换成24孔板的盖子铺胶了，只铺了一层低熔点胶，用SYBR green染色的，做出来了，背景也不高，就是细胞密度高了些，另外好像模型组和正常组没有区别。

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今天用蒸馏水模拟在24孔板盖上“铺胶”，似乎液体量太少了(100微升)，蒸馏水都聚在一起，不论怎么摇晃都不能平铺在板盖上。请问一下，您是怎么铺的？怎样才能铺好呢？

倒是在玻璃“自制电泳槽”(以前的一个师弟在lq老师的指导下做的)上，100微升的蒸馏水很快就平铺好。

不过我还是很想用24孔板盖，因为正式试验的时候，样本量大，一天要做20个样本，再加上阴性及阳性对照，用24孔板盖铺一层胶刚刚好够用，而且节省时间。即使这样，对于我这个新手来说，难度估计还是挺大的。。
作者: 泡泡    时间: 2011-12-7 16:23


刚开始了解彗星，哪位战友能详细讲解一下原理啊？碱性解旋是怎么回事？是把超螺旋解成非螺旋的DNA双链呢，还是把双链直接解成单链啊？有没有相关资料？
作者: 泡泡    时间: 2011-12-7 16:23

这个问题真的很难啊，对我来说。查了查文献，也都语焉不详。想放弃吧，又有点不甘心。今天又学习了一下，有了一些自己的认识，说在这里大家交流一下，有不正确的还望各位老师来补充。
“包埋于琼脂糖中的细胞经裂解时细胞膜、核膜及其它膜结构受到破坏,胞内蛋白质、RNA 及其它成分均可进入凝胶而扩散至裂解液中,而核DNA 分子量很高,不能进入凝胶,只能留于原位。”这仅仅是彗星实验原理的第一步，我认为更重要的原理是“DNA 受损产生链断裂时,正常的DNA 超螺旋结构变得松驰,DNA 环向外伸展,链缺口暴露了阴电荷,高pH促使DNA 变性和解螺旋从而有利于单链和双链DNA 断片的移动。在电场力作用下,细胞核中带阴电荷的DNA 断片离开核DNA 在凝胶分子筛中向阳极移动,形成“彗星”状图像。含DNA 链缺口越多,则进入尾部的DNA 越多,表现为尾长和尾部荧光强度增加。”也就是说，核DNA的双链线型结构，遇高温、高热或者机械剪切等外力容易断裂和降解的特性决定了彗星实验的方法。

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有没有资料或图片形容一下在解旋之前DNA是什么结构？为什么强碱性会解旋？解旋以后DNA变成什么样的？
作者: 盼盼    时间: 2011-12-7 16:23


我现在在24孔板上铺胶，每孔滴50ul，刚滴上的时候确实是一个大水滴，你可以用枪头轻轻搅一下，把液滴铺平就行了，很容易的，试试吧：）
作者: one    时间: 2011-12-7 16:24

嗯，我配好胶后再试一试。谢了。

不过，昨天碰到一件极其郁闷的事情。我们科病房(因为是独立的一栋小楼)临时被院里征用为甲流病房，今明两天医护跟病人统统搬到其它地方。可怜我收拾了一个月的实验室啊，不能用了。还得再联系其它实验室，郁闷ING。
作者: 盼盼    时间: 2011-12-7 16:24


我调节了电泳的液面高度，可是电压还是很低，没有任何变化啊，电泳有时可以跑出来有时跑不出来，郁闷呢
作者: one    时间: 2011-12-7 16:24


今天在生工的目录上看到玻璃涂棒和不锈钢涂棒，不知道用来铺胶好用不好用？呵呵，改天弄下试试。有兴趣的话，看看下面的图。
cuturl('http://www.chukou.com.cn/products/detail-99777.html#big')
作者: one    时间: 2011-12-7 16:25

有个疑问，配低熔点琼脂糖凝胶的PBS有两种版本，一种是0.1M的，另一种是58mmol/L的Na2HPO4+17mmol/L的KH2PO4+68mmol/L的NaCl,pH7.4。后者按磷酸根来计算的话，是0.0966M，约等于0.1M。

那么配制LMA的PBS要用0.1M的PBS，为什么不用0.01M的呢？想不出这是什么道理。既然是要将单细胞悬液与凝胶混合，就应该用适合细胞浓度的PBS啊，细胞培养的时候是用0.01M的。
作者: tianmei001    时间: 2011-12-7 16:25

看了这个帖子，的确收益很多。感谢版主无私的精神。
我今天又做了彗星试验，结果不理想，我怀疑是裂解液的问题。我是这样配裂解液的：先溶氯化钠（146克），再溶tris（1.212克）,在加入NA2EDTA(37.22),加8克氢氧化钠后在用8M氢氧化钠调pH到10，最后定容到890毫升。
我看有的文献说加8克氢氧化钠，有的文献说加12克，我觉得加8克还稍微少一点，所以再用8M氢氧化钠调节pH到10。还有的文献说需要12克氢氧化钠，我觉得12克又太多了。到底应该怎样配啊？希望知道版主配裂解液的详细步骤。
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:26

我调节了电泳的液面高度，可是电压还是很低，没有任何变化啊，电泳有时可以跑出来有时跑不出来，郁闷呢

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试试先将电压调到最大，电流300mA，然后再通过液面来调节电压
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:26

看了这个帖子，的确收益很多。感谢版主无私的精神。
我今天又做了彗星试验，结果不理想，我怀疑是裂解液的问题。......希望知道版主配裂解液的详细步骤。

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不同的实验室条件，不同的实验细胞，裂解液的配方可能稍有不同哦。一叶老师就是用的中性的裂解液。单看你上面的介绍应该是可以的，但如果确实是裂解液的问题的话，那你还要想想有没有其他可能的原因，比如裂解液配制好后溶液有没有变澄清？是不是裂解液放置的时间过长？临用前加有没有Triton和DMSO？加了之后是不是溶液变澄清后才开始裂解的？裂解的时间够不够等等。
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:27

用于彗星实验的PBS都是0.1M的吧，我好像都没见过用0.01M的浓度。0.1和0.01M浓度PBS的区别我还真不太清楚，问了下其他做细胞实验的同事也都说不好，据我所知0.1M的浓度才是用于细胞的啊，0.01M浓度的PBS一般都用于蛋白、病毒或免疫实验。如果有用这种浓度PBS的文献可发上来我们学习一下。一叶老师也是用的0.1M浓度（参看他在38页的回答）。而且在彗星实验中PBS的用途并不是培养细胞啊，它只是用作混悬细胞的载体而已。
作者: one    时间: 2011-12-7 16:27

用于彗星实验的PBS都是0.1M的吧，我好像都没见过用0.01M的浓度。0.1和0.01M浓度PBS的区别我还真不太清楚，问了下其他做细胞实验的同事也都说不好，据我所知0.1M的浓度才是用于细胞的啊，0.01M浓度的PBS一般都用于蛋白、病毒或免疫实验。如果有用这种浓度PBS的文献可发上来我们学习一下。一叶老师也是用的0.1M浓度（参看他在38页的回答）。而且在彗星实验中PBS的用途并不是培养细胞啊，它只是用作混悬细胞的载体而已。

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我搜到的，，，“浓度低 缓冲能力就低一些，但是可以避免离子浓度过高对实验的影响。”
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:27


晕，只是把它加在胶里，混匀之后浓度已经很低了，不需要什么缓冲能力吧......
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:28

loli:用于彗星实验的PBS都是0.1M的吧，我好像都没见过用0.01M的浓度。0.1和0.01M浓度PBS的区别我还真不太清楚，问了下其他做细胞实验的同事也都说不好，据我所知0.1M的浓度才是用于细胞的啊，0.01M浓度的PBS一般都用于蛋白、病毒或免疫实验。如果有用这种浓度PBS的文献可发上来我们学习一下。一叶老师也是用的0.1M浓度（参看他在38页的回答）。而且在彗星实验中PBS的用途并不是培养细胞啊，它只是用作混悬细胞的载体而已。

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赞
我们注重实践......
作者: one    时间: 2011-12-7 16:29


谢谢loli老师和一叶老师。本贴上的前辈都是用的0.1M PBS，而我有一个公共卫生系做毒理的同学，向她请教的时候她跟我说就是0.01M的PBS，所以我有点困惑，呵呵。

另外，还有一个问题，就是裂解液的应用液，在临用前加1%Triton X-100和10%DMSO。
这里面的1%和10%是所加液的浓度，还是在裂解液中的终浓度？

也就是说在临用前加1%的Triton 10ml(有的文献写加新配制好的Triton)，此时终浓度是0.01%？还是加100%的Triton 10ml(有的文献写加入Triton至1%)，此时的终浓度是1%？

我的理解是指前者，不知道对不对？希望前辈们不要见笑。
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:29

指在裂解液中的终浓度。比如配1000ml裂解液，临用前加入Triton10ml，Triton在裂解液中的终浓度为1%；加入100mlDMSO,其在裂解液中的终浓度为10%.
作者: 911    时间: 2011-12-7 16:29

各位老师：我有个问题想要请教，单细胞凝胶电泳裂解的条件是不是必须是4度，请各位老师指教
作者: one    时间: 2011-12-7 16:30


4度冰箱，这个条件很容易的呀？
作者: BOSS2011    时间: 2011-12-7 16:30

彗星实验做了也有两个月了，实验手法上已经很熟练了，但是从实验数据来看还是有些疑惑。我做的是化学物质的DNA损伤研究，每个片拍100个细胞拿来分析，把尾长小于3的细胞作为无彗星细胞计算彗星率，尾长大于3的细胞拿来分析Oliver尾矩，我有一个疑问是这些数据用SPSS分析出来完全不符合正态分布，这样的话数据还可靠吗，能用吗？
另外我想要看看那篇标准化文献，哪位同行能给我PS一下吗，呵呵，谢谢了！
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:31


一叶老师推荐的综述：
Journal of Chromatography B, 1999, 722: 225–254
Single cell gel electrophoresis assay: methodology and applications
E. Rojas, M.C. Lopez, M. Valverde

Mutagenesis. 2003 , 18(1):45-51.
Recommendations for conducting the in vivo alkaline Comet assay. 4th International Comet Assay Workshop.
Hartmann A, Agurell E, Beevers C, Brendler-Schwaab S, Burlinson B, Clay P, Collins A, Smith A, Speit G, Thybaud V, Tice RR; 4th International Comet Assay Workshop.

Environ Mol Mutagen. 2000;35(3):206-21.
Single cell gel/comet assay: guidelines for in vitro and in vivo genetic toxicology testing.
R. R. Tice, E. Agurell, D. Anderson, B. Burlinson, A. Hartmann, H. Kobayashi, Y. Miyamae, E. Rojas, JC. Ryu, and Y. F. Sasaki
作者: 911    时间: 2011-12-7 16:31


我是体内染毒，取小鼠肝细胞，在做彗星实验。可是最近我的结果很是不好，明明镜下看到好多细胞，可是最后片子上却没有细胞。有人在做小鼠肝组织吗？你们是怎么做的啊？主要是单细胞悬液的制备，我觉得可能大部分都是红细胞，所以到最后就没有细胞了。到底应该怎样制备小鼠肝细胞的单细胞悬液啊？恳请各位帮忙！不胜感激！
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:31     标题: 回复 #1169 911 的帖子

没做过这个，不方便评论哈。只是不知道肝细胞和红细胞是不是长一个样，难道从形态学上看是分不清楚的吗？红细胞没有核呀。
要是你实在拿不准，把细胞先培养下看看嘛，我在网上搜的：“用含10％新生牛血清的RPMI 1640培养液进行培养，12h后细胞开始贴壁生长，48h伸出伪足，呈现典型的上皮样细胞的外形形态，胞浆内有空泡和脂滴，可以见到双核细胞。相邻细胞伸长的伪足相互连接。”
如果能肯定取下的细胞是红细胞，那就是分离的问题了。
作者: 911    时间: 2011-12-7 16:32     标题: 回复 #1170 loli 的帖子

红细胞当然是没有核的，可是在细胞计数版上，你是看不到核的。我是想知道如何在细胞计数板上区分？
作者: 911    时间: 2011-12-7 16:32


实验室现有电泳仪最大电流只能到100mA, 这样的电泳仪适合做彗星实验吗？
作者: 911    时间: 2011-12-7 16:32

彗星实验做了也有两个月了，实验手法上已经很熟练了，但是从实验数据来看还是有些疑惑。我做的是化学物质的DNA损伤研究，每个片拍100个细胞拿来分析，把尾长小于3的细胞作为无彗星细胞计算彗星率，尾长大于3的细胞拿来分析Oliver尾矩，我有一个疑问是这些数据用SPSS分析出来完全不符合正态分布，这样的话数据还可靠吗，能用吗？
另外我想要看看那篇标准化文献，哪位同行能给我PS一下吗，呵呵，谢谢了！

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难道说彗星试验的结果必须符合正态分布吗？只要选择合适的统计方法就可以吧
作者: one    时间: 2011-12-7 16:33

我是体内染毒，取小鼠肝细胞，在做彗星实验。可是最近我的结果很是不好，明明镜下看到好多细胞，可是最后片子上却没有细胞。有人在做小鼠肝组织吗？你们是怎么做的啊？主要是单细胞悬液的制备，我觉得可能大部分都是红细胞，所以到最后就没有细胞了。到底应该怎样制备小鼠肝细胞的单细胞悬液啊？恳请各位帮忙！不胜感激！

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不知道你是如何制备单细胞悬液的，如果采用麻醉后行灌流的话(也是从文献上看的，没有做过)，这时候再取肝脏组织制备肝细胞悬液，可能就少有红细胞了哦。
作者: 911    时间: 2011-12-7 16:33

实验室现有电泳仪最大电流只能到100mA, 这样的电泳仪适合做彗星实验吗？
作者: 阿敏    时间: 2011-12-7 16:33

主要我们发现37度才可以裂解一种虫子
作者: 911    时间: 2011-12-7 16:34


Electrophoresis buffer (900 ml, 300 mmol dm -3NaOH, 0. 1% 8-hydroxyquinoline, 2% dimethyl sul-phoxide, 10 mmol dm -3 disodium EDTA) was gently poured into the assembly . This volume usually covers the slides to a height of 6 mm above the surface of slides . This solution must not be reused . After 20 min to allow for DNA unwinding, electrophoresis (25V, 60 min) and recirculation (100 ml/min) were started simultaneously. The temperature of the buffer was 22 . 5° C at the beginning of electrophoresis but increased to 27 . 5 ° C by the end of run.
这是一篇文献里面的内容,recirculation (100 ml/min) were started 怎么理解,恳请高手给与帮助
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:35     标题: 回复 #1177 911 的帖子

个人认为：流速为100 ml/min。
但一般来说，在电泳过程中永远保持恒压恒流是不太可能的，随着电泳时间的延长，电流会逐渐加大，而流速也肯定会随之变化哟。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:36

我是体内染毒，取小鼠肝细胞，在做彗星实验。可是最近我的结果很是不好，明明镜下看到好多细胞，可是最后片子上却没有细胞。有人在做小鼠肝组织吗？你们是怎么做的啊？主要是单细胞悬液的制备，我觉得可能大部分都是红细胞，所以到最后就没有细胞了。到底应该怎样制备小鼠肝细胞的单细胞悬液啊？恳请各位帮忙！不胜感激！

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肝脏的单细胞悬液很好做，我们做染毒后的肝脏细胞SCGE时，取出肝脏后，剪碎，匀浆器打匀，过细胞筛，然后自然沉淀，（当时我试了用淋巴细胞分离液分离，发现效果并不好，反而发现自然沉淀法最好，简单而且实用！！），第一次沉淀，取中间部分，稀释，再沉淀，第一次做要多次取样，镜下观察细胞情况，如果管底多是细胞团，就还是取中间部分，再次沉淀，只要方法摸成熟了，以后就照做就行了，很好用的！
肝脏细胞比红细胞大的多呀！自然沉淀过程中重力的作用就分开了。你当时镜下看到的是不是都是红细胞啊？
还有，也可以不必过匀浆器，用剪子剪碎肝脏，尽量碎，然后直接用筛子把肝脏碎片捞上来，留下来的就有足够多的肝细胞了，还是自然沉淀发分离肝细胞，同样好用。
凡事多实践几次，方法是我们实践检验出来的......
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:36


另外，肝细胞单细胞悬液制备好的话，肝细胞的彗星是很漂亮的！
作者: 911    时间: 2011-12-7 16:36

肝脏的单细胞悬液很好做，我们做染毒后的肝脏细胞SCGE时，取出肝脏后，剪碎，匀浆器打匀，过细胞筛，然后自然沉淀，（当时我试了用淋巴细胞分离液分离，发现效果并不好，反而发现自然沉淀法最好，简单而且实用！！），第一次沉淀，取中间部分，稀释，再沉淀，第一次做要多次取样，镜下观察细胞情况，如果管底多是细胞团，就还是取中间部分，再次沉淀，只要方法摸成熟了，以后就照做就行了，很好用的！
肝脏细胞比红细胞大的多呀！自然沉淀过程中重力的作用就分开了。你当时镜下看到的是不是都是红细胞啊？
还有，也可以不必过匀浆器，用剪子剪碎肝脏，尽量碎，然后直接用筛子把肝脏碎片捞上来，留下来的就有足够多的肝细胞了，还是自然沉淀发分离肝细胞，同样好用。
凡事多实践几次，方法是我们实践检验出来的......
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谢谢版主，感谢版主无私的帮助。还有一个问题是您用的多少目的筛网啊，我用的200目的，过滤后还是好多的细胞碎片，当然已经有细胞了。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:37     标题: 回复 #1181 911 的帖子

200目的挺好了。。。。。。
作者: 911    时间: 2011-12-7 16:37


谢谢版主，今天又做了，结果还可以，细胞碎片也有不多，不影响分析。请教版主另外一个问题，就是电流和电压的问题，我也查阅了外文文献，都是大概20V，电流200-300mA，0.7-1.0V/cm，时间一般是20分钟。我们实验室的电泳仪，电压最大可以达到600v,电流只有100mA。您说我是不是可以把电压调至25V,电流也调到最大100mA,通过延长电泳时间，40分钟。期待您的无私帮助！
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:38     标题: 回复 #1183 911 的帖子

我觉得没必要，20分钟就好。
作者: 西子    时间: 2011-12-7 16:38

我最近也要做Comet assay，这个专题对我的帮助很大。

关于中性电泳和碱性电泳我是不是可以这么说：中性用来检测DSB，而碱性可以吧SSB变成DSB，然后检测到的可能是DSB和SSB的混合，从而提高敏感性？

还有，一叶老师，你自制的玻片看上去很实用，用的时候你还是要先铺一层高熔点胶，我觉得这层胶是不是可以省去，直接铺低熔点胶？
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:39     标题: 回复 #1185 西子 的帖子

你好，中性是检测DSB的，而碱性是把DSB变成SSB，得到的是二者的叠加数值。
我个人认为还是铺两层胶的好，因为在第二层时，正好和小槽水平了，应该有利于片段的迁移吧。
作者: one    时间: 2011-12-7 16:39

从我仅仅两次SCGE的经验来看，单层胶的确容易掉，我用的也是一叶老师设计的微电泳槽。

尤其是染色后用3蒸水冲洗，很容易把胶冲掉(部分)。不知道一叶老师是用流水冲洗，还是泡在容器内洗。

我也试过用24孔板盖来做，也是在染色后冲洗这一步，胶就掉了(也是单层胶)，有意思的是今天是从一个孔掉了以后，完整的铺到了另外一个空白的孔里。

另外，我还试着把微电泳槽和24孔板盖表面包被了明胶，结果还是一样。
作者: one    时间: 2011-12-7 16:40

再请问一叶老师，我们单位的电泳仪是Bio-rad的，我发现：

碱性条件的时候，恒流(不论是设置成100mA、200mA还是300mA)，而电压则会在设置成25V的情况下，变成13-17V范围内(调节电泳液面的高度)

而中性条件的时候，恒压(不论是设置成25V，100V还是200V)，而电流则在10-20mA范围内变化，最大的一次达到过95mA.

请问，这是怎么回事呢？多谢!
作者: 园丁##    时间: 2011-12-7 16:40

将casp软件分析数据结果，res文件转换成xls文件（excel）方法-原创

批量的把casp中res文件中贮存的数据转换成excel数据,
第一步:把res文件的数据导出,扩展名直接改为*.xls,但会发现导出的每行数据都是在一个excel文件的格子里,下面就想办法把不同数据分开
第二步:选中excel 数据中所有数据,然后操作菜单:数据-分列-选中分隔符号-选中空格-下一步-完成----------------大功告成

通过上面的操作,就可以把数据分成单独的数据了,用excle的强大的数据处理功能就可以轻松的进行数据分析了，和大家一起分享！
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:40


大家说的都很好，我也不多说什么了，我只把一点我知道的告诉大家。我刚读研一的时候，我们三个人，做了将近一年，才做出自认为较好的实验结果。
单细胞彗星电泳主要原理是：细胞发生损伤以后，DNA会断裂成不同大小的片段，在裂解液的作用下，从细胞膜中释放出来，在电场的作用下，DNA会向正极移动，片段越小，由于在凝胶中受到的阻力越小，故移动距离越大，同理片段越大，移动距离越短，但大多DNA还在原位，移动很少。总体看来，好像是彗星一样，EB和（或）吖啶橙染色头部在荧光显微镜下很亮，后面带有一个长长的尾巴，计算损伤程度就是依靠尾巴的长短来反映，尾巴越长说明损伤越严重，这有专门的软件可分析。
作者: 蒲公英    时间: 2011-12-7 16:41


嘿嘿，请教大家一个问题：因制作的彗星玻片较多，在电泳时，电泳槽平铺不下，那能不能叠起来跑电泳呢？
不知道大家有没有遇到这种情况·····
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:41     标题: 回复 #1191 蒲公英 的帖子

我曾经这么干过，没问题的，挺好。加油，祝好运
作者: one    时间: 2011-12-7 16:42     标题: 回复 #1191 蒲公英 的帖子

好奇怪哦，怎么叠起来呢？是将自制的玻璃微电泳槽叠在一起，还是将单张的玻片叠在一起？

那么胶会不会粘到上一层玻璃片的底上呢？
作者: 蒲公英    时间: 2011-12-7 16:42

哇塞，一叶老师回复咯，谢谢老师解答，那我更放心的做了，哈哈····

我现在还在练习铺胶呢···嘿嘿···不过我发现，我在铺第一层胶的时候，等它凝固的时候，胶会出现花花状，不是透明的，不知道对实验有没有影响·····
作者: 911    时间: 2011-12-7 16:42

请教一个问题，用casp软件分析彗星，需要放大多少倍啊？
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:43     标题: 回复 #1194 蒲公英 的帖子

应该是胶的问题，铺好后是透明的，浓度？
作者: 西子    时间: 2011-12-7 16:43

我最近做了一次该实验，我觉得结果挺好的，但是我们实验室的显微镜物镜最小也是40倍，拍照后，一个彗星就占一个屏幕宽，每张照片只能放下一个彗星，而且边缘十分模糊，慧头也不清楚。您在拍照时用几倍的显微镜？慧头要比同来源的活细胞大好多，这正常吗？
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:44     标题: 回复 #1197 西子 的帖子

一叶老师是用的40倍哟，但他的照片没有这么大，可能跟当初他使用的是数码照相机取像有关。而且在照完相，用CASP分析之前，要经过图像转换，把照片缩小到一定比例的。我们实验室使用了尼康的图像采集系统，40倍下也很大，而且不太清楚，因此我们都是分析的20倍的。彗星是把细胞裂解后的，边界不清，所以会出现实际分析的要比肉眼看到的略大，很正常。
作者: 克隆鱼    时间: 2011-12-7 16:44

这是我刚做的彗星试验，是培养的细胞用药物处理过的，为什么处理以后，整个片子上没有一个正常的细胞，全是彗星细胞？

图片附件: 40110449.jpg (2011-12-7 16:45, 51.77 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9694

作者: 克隆鱼    时间: 2011-12-7 16:45


这是溶剂对照组，是没有加药的，几乎整个片子上都是正常细胞，这样正常吗？

图片附件: 30372705.snap.jpg (2011-12-7 16:45, 10.61 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9695

作者: 克隆鱼    时间: 2011-12-7 16:45


请各位老师达人指教一下，O(∩_∩)O谢谢

还有顺便问一下，我是连续两天一直在做彗星试验，请问那个裂解液是不是可以一直用？
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:46     标题: 回复 #1201 克隆鱼 的帖子

做的很好啊！
裂解液的储存液是可以提前配好的，用前要加DMSO和triton,用过后最好不用了，再用新鲜配的。
作者: 克隆鱼    时间: 2011-12-7 16:46

请各位老师达人指教一下，O(∩_∩)O谢谢

还有顺便问一下，我是连续两天一直在做彗星试验，请问那个裂解液是不是可以一直用？

做的很好啊！
裂解液的储存液是可以提前配好的，用前要加DMSO和triton,用过后最好不用了，再用新鲜配的。

谢谢老师，

我每次取样中间就隔了三四个小时左右，是不是可以用两三次以后再换新的？
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:47     标题: 回复 #1203 克隆鱼 的帖子

我还没有重复使用过，还是用新鲜配制的吧
作者: 西子    时间: 2011-12-7 16:47

还要麻烦各位，如下图，为什么我的CASP软件打开图向后，上面的measruement frame 不能移动？大小也不能改变？另外，想用鼠标再拉出一个工作框也弄不出来，急得要命，请给为帮忙！！

图片附件: 64283651.snap.jpg (2011-12-7 16:47, 31.21 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9696

作者: 西子    时间: 2011-12-7 16:48

，我知道，小齿轮那个标志点击后，测量框才固定不动，但是你看我的截图，我只是打开图片，那个框就不懂，鼠标也不能画出另外的框来，请指教，多谢。
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:48     标题: 回复 #1206 西子 的帖子

分析框一定要在选好待分析的文件后，点分析键之前，由自己点出拉开，要是等四个小点出现后就拉不动了。也就是说：打开文件夹——选好文件——点OK（此时软件左侧就会出现待分析的图片）——results window，head和tail前打勾——鼠标点在左图上，左键按住不动，再拉开，就成了!在分析框拉出来之前鼠标一定不能在左图上随便点，一旦出现你截图中的四个小点的话就不行了。
好久没做了，都快不记得了，为了回答你还把CASP重装了一遍，呵呵。肯定没问题的，再试试吧。
作者: 西子    时间: 2011-12-7 16:49


终于划出那个框来了
不过这两天我试着用Cometscore这个软件，觉得更好用。可以不用考虑背景的问题，而且效率很好，在这里推荐给大家。缺点就是文件必须是.bmp格式的，而且要灰度图。
作者: 白白的    时间: 2011-12-7 16:49

再请教大家一个问题，如何将CASP 分析结果：像素转换为微米。
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:50     标题: 回复 #1209 白白的 的帖子

实验已经做完了吗？
CASP的结果是以像素表示的，据说有能转换成微米的公式，不过我也没有找到，不知lq6688老师有没有办法哈。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:50     标题: 回复 #1210 loli 的帖子

我曾经尝试过，后来放弃了，觉得不大可能的。
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:51


好一点的文章都是写的用的某某彗星分析系统，可这一套实在太贵，国内一般的实验室都买不起呀，CASP和CometScore倒是免费了，但又都是用像素表示的，唉，这是一个问题呀。不过我觉得只要对文章的IF要求不是太高的话，这两种软件也是可以的。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:52     标题: 回复 #1212 loli 的帖子

是啊，最近一直想换个软件呢，还没遇到合适的彗星分析系统，去年在意大利的环境诱变剂会议上看到一个法国的软件，还不错，做彗星的越来越多，确实需要一个好的分析系统，CASP不是长久之计。
作者: 969    时间: 2011-12-7 16:52

我最近在做小鼠肝细胞的彗星实验，不知道条件是不是和你所说的一样呀？
作者: one    时间: 2011-12-7 16:52

我的CASP软件，每次用的时候总是用了一段时间以后自动关闭，郁闷。好多次，都分析了很多数据，然后它自己就关闭了。还得重新分析，有时候得弄好几次。

你们的软件有没有这个毛病？

另外，我做的试验，阴性对照的彗星率似乎很高（中性和碱性的都是），不知道哪里出了问题。我都是尽量避光的。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:53     标题: 回复 #1215 one 的帖子

看看裂解时间、电泳条件？
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:53     标题: 回复 #1214 969 的帖子

一样的，我也做过肝细胞
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 16:54     标题: 回复 #1215 one 的帖子

遇到过！
我发现尽量少调整分析框的大小。
作者: ffooll    时间: 2011-12-7 16:54


为什么我一个流程做下来，胶还在，但上荧光显微镜后什么都看不到啊？是不是第二层胶脱胶了？谁能给我点意见啊？谢谢了
作者: one    时间: 2011-12-7 16:55     标题: 回复 #1216 一叶 的帖子

我想原因可能有下面几个：

第一，消化细胞用的是EDTA，10mM的，本身对细胞有损伤，另外10mM的浓度大？（EDTA消化液可能偏碱性？也可能引起额外的损伤。明天测一下pH值）
第二，电压条件可能偏高，25V；
第三，电泳时间长？20-25min；
第四，裂解时间都是2小时。难道这个条件也是因细胞而异的吗？
第五，避光的问题，据我所知，紫外线是不能穿透玻璃的，所以屋子里关上灯是不是可以了？我们这里没有暗室，屋里都没有窗帘，有时候我把超净台或是通风橱用床单挡住光，在里面操作。

今天用未处理的正常昆明小鼠做了一次，用的EDTA浓度改为1mM，电压20V，电泳时间分别为10，15，20，25，30min。明天照像看看结果。（今天跟实验室的老师借了一个有窗帘的屋子，在里面操作的）

还想再做一次，不同电压的，10，15，18，20，25V，电泳时间20min。
时间有限啊，科里催着上班呢，郁闷。

请一叶老师点评一下，谢谢。
作者: one    时间: 2011-12-7 16:56     标题: 回复 #1218 一叶 的帖子

非常感谢，这一点我没想到过，每次都“精雕细琢”地调整分析框，呵，原来如此。
作者: one    时间: 2011-12-7 16:56

还有一个小问题问问一叶老师，您发明的自制电泳槽，每一个小槽之间的玻璃条连接处会不会有缝隙？

我现在用的是我们科室里已经毕业了的一个师弟仿照您的方法做的玻璃电泳槽，有的地方，加了样后，一晃，就有一少部分流到旁边的小槽里去了。

怎样才能使玻璃条之间的连接处没有缝隙呢？
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:57

我想原因可能有下面几个：

第一，消化细胞用的是EDTA，10mM的，本身对细胞有损伤，另外10mM的浓度大？（EDTA消化液可能偏碱性？也可能引起额外的损伤。明天测一下pH值）
第二，电压条件可能偏高，25V；
第三，电泳时间长？20-25min；
第四，裂解时间都是2小时。难道这个条件也是因细胞而异的吗？
第五，避光的问题，据我所知，紫外线是不能穿透玻璃的，所以屋子里关上灯是不是可以了？我们这里没有暗室，屋里都没有窗帘，有时候我把超净台或是通风橱用床单挡住光，在里面操作。

今天用未处理的正常昆明小鼠做了一次，用的EDTA浓度改为1mM，电压20V，电泳时间分别为10，15，20，25，30min。明天照像看看结果。（今天跟实验室的老师借了一个有窗帘的屋子，在里面操作的）

还想再做一次，不同电压的，10，15，18，20，25V，电泳时间20min。
时间有限啊，科里催着上班呢，郁闷。

请一叶老师点评一下，谢谢。

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第一条说不好哈，因为不知道是什么细胞。
第二条是可能的，我们实验室的条件是23V，25V几乎会全拖尾。
第三条也可能，20分钟差不多了。
第四条裂解的时间肯定是因细胞而异的，一般1小时就可以了呀，可参看相同细胞的文献。
第五条避光问题，60W以下、黄光下操作都是可以了，如果是日光灯的话最好避一下。长波紫外线UVA，波长320～400 nm，穿透力强，太阳光中98%的UVA紫外线能穿透臭氧层到达地球表面，可穿透大部分透明玻璃、衣物、塑料等。
作者: one    时间: 2011-12-7 16:57     标题: 回复 #1223 loli 的帖子

感谢您的回答。

我做的是小鼠小肠上皮细胞；今天测了一下EDTA（D-Hanks液配制），ph值并非碱性，而是7左右（忽略了缓冲液的缓冲能力，呵）

我昨天的条件是20V，不同时间（10、15、20、25、30min），几乎全出现拖尾，只有10min组没有出现头尾分离；

裂解时间还是2小时。

下一步，试试用胶原酶II来消化肠上皮细胞、进一步降低电压条件，缩短裂解时间等再进一步摸一下条件。
作者: zhezhe    时间: 2011-12-7 16:58

看看裂解时间、电泳条件？

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我也遇到了同样的问题，不加任何处理的阴性对照也出现了大尾巴，做了好多次了，避光、预冷都做了，电压、电流逐次变化25V/300mA、18V/180mA、15V/150mA，均做过，但结果类似，没有太大变化。真是郁闷啊！希望能得到一叶老师及其他慧友的帮助！
作者: loli    时间: 2011-12-7 16:59

如果实验因素都排除了的话可能要考虑一下细胞本身的问题了，是培养细胞吗？大尾巴是大部分细胞都有还是小部分细胞出现呢？裂解时间有多长？是不是离心次数太多力量太大对细胞造成了额外的损伤了？
作者: zhezhe    时间: 2011-12-7 16:59

感谢loli的回答！我的细胞是培养的贴壁细胞（大肠癌LOVO），今天又做了，裂解时间分别1小时、40分钟，离心1000转3分钟，解旋20分钟，电泳20分钟，25V恒压，电流在120mA左右波动。未加别的处理，但全部细胞都有长尾巴
作者: flower-201    时间: 2011-12-7 17:00

这是我今天刚做的图片（10倍），拍下的图片没有镜下的尾巴长，但也不短啊
以下是我的步骤：
1、细胞悬液的制备：
各组收集细胞2~3×106个，必须分散成单个。悬浮于1ml pH7.4 PBS中，此步在暗室及较低温度下进行。（为了避免额外的DNA损伤）
2、玻片制备：
磨砂玻片预处理：清洁剂中清洗，酒精浸泡过夜，取出后烘干备用。
制备0.5%正常熔点琼脂糖(NMPA)和0.5%低熔点琼脂糖(LMPA)各20ml。用pH7.4 PBS配制。
PBS配置：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4•H2O 1.56g，KH2PO4 0.2g，pH7.4 灭菌。
铺第一层胶：将玻片浸入热的1%的NMPA溶液中，迅速取出，放置于4℃至少一个小时使其凝固；
铺第一层胶：0.5%NMPA 100μl于磨砂玻片面，迅速盖上盖玻片，4℃下凝固，即为第一层胶；
第二层胶：37℃ 0.5%LMPA 100μl+10μl细胞悬液(10:1)混匀，迅速铺于第一层胶上，盖片，移入冰箱使其固化。
* 余下的细胞1000g×5min离心，于0.15ml悬浮缓冲液中混匀，37℃ 30min，加入蛋白酶K至0.1mg/ml，37℃过夜，-20℃保存。
3、细胞溶解：
玻片缓缓浸入新鲜配制的冰凉细胞溶解液中，4℃过夜。
细胞溶解液配制（裂解时可在100ml的玻璃染缸中进行）
NaCl（2.5mM） 146.1 g
Na2EDTA（100mM） 37.2 g
Tris base 1.2 g
用约8克NaOH调节pH至10。
用去离子水定容至890ml。过滤除菌，为贮备液。室温保存。
应用液临用前加入 Triton X-100 10ml 1%；
DMSO 100ml 10%；
应用前4℃冷藏30~60分钟；加DMSO的目的是为了清除血液或动物组织中血红蛋白释放的铁产生的自由基；Triton X-100广泛使用的非离子表面活性剂，用于非变性条件下膜成分的恢复。
4、碱化处理及电泳：取出玻片，放入水平电泳槽中(正极端)，并列放置，不留空隙。倒入新鲜配制的冰冷电泳缓冲应用液，高于胶2mm，无气泡。放置10~30 min（一般是20min），使DNA解链。恒压25V, 300mA电泳25分钟。（可通过调节液面高低来调整电流使其达到300mA，一般需要电泳液约350-400ml）
电泳缓冲应用液：
10N NaOH 30.0 ml
200mM EDTA 5.0 ml
定容至1000ml，混匀，电泳前新鲜配制。
可通过改变液面高度来调节电流；电压亦可依电极之间的距离以0.78V/cm来确定。
5、中和：
切断电源，取出玻片，置染缸，中和缓冲液浸洗，3次×5min。
中和缓冲液：
Tris base （0.4M，pH7.5） 48.5 g
去离子水 定容至1000ml
用>10 N 浓盐酸（HCl）调节pH约23ml至7.5。室温保存。
6、染色
呈中性后，凉干玻片，10-15μl 溴化乙锭（EB）应用液染色，盖上新盖玻片。
EB染色应用液体（20μg/ml）
EB（10mg/ml储备液） 2μl
去离子水 1ml
室温避光保存。
以上除中和及染色外，各步均应在暗处进行，以避免额外的DNA损伤。

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作者: flower-201    时间: 2011-12-7 17:01


这是40倍的，但也远没有镜下的尾巴长。

图片附件: 96520868.jpg (2011-12-7 17:01, 21.57 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9698

作者: 一叶    时间: 2011-12-7 17:01     标题: 回复 #1229 flower-201 的帖子

注意：拍到的没有镜下看到的尾巴长，那是你的拍摄条件不合适，试试把曝光时间加长一点。
你的背景处理的不错，但也是和你的曝光时间短有关系的。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 17:02     标题: 回复 #1228 flower-201 的帖子

红色部分也许是你的问题所在。
3、过夜？岂不是时间太长了？
4、20伏试试吧，能调到300毫安吗？计算过单位长度的电压吗？
COME ON !
作者: loli    时间: 2011-12-7 17:02

是啊，你前面才说是裂解1小时，后面的步骤又是4度浸泡过夜；前面说是“25V恒压，电流在120mA左右波动”，后面的步骤又是“恒压25V, 300mA电泳25分钟”......到底哪个才是真的啊？裂解液的作用是裂解细胞膜，肯定要不了这么长的时间；电压低一点再试试，一定要电压低哦。
作者: 缘yuan    时间: 2011-12-7 17:03

最近也在做彗星，但是结果还是很不理想。按照一叶的方法制作了微电泳槽，解决了脱胶问题。但是有关电压跟电流的问题还是没解决好，我一般把电压调到25V,这时电流就只有150mA。好像加入电泳液只能调节电流，总算把电流调到300了，电压又降到了18V。这种情况我该选择哪个呢？是电压25V，还是电流300mA呢？还要电泳的时候，玻片是放在正极还是负极啊？我看群友说是放在正极端，不是说DNA向正极运动吗？按我的理解应该是放在负极啊！
下面是我最近拍的一张图片，但是彗星的尾巴方向不一致，这又是什么原因呢？请各位帮我分析一下，谢谢！
作者: 缘yuan    时间: 2011-12-7 17:03

请教各位，你们裂解液和电泳液一般可以放置多长时间，我的大概用了两周了，前面做的时候还能看到彗星，但是这两次做就不行了，是不是跟裂解液和电泳液也有关系啊？
另外裂解液加入DMSO跟Trxi-100后又变浑浊了，有一些白色的乳状块块，这个会影响细胞裂解吗？
作者: 缘yuan    时间: 2011-12-7 17:04


有没有用吖啶橙染色的？你们是用绿色荧光观察吗？不知道为什么荧光显微镜老是调节不好，拍出来的照片很模糊，是不是跟滤光片有关系啊？因为教研室没人做彗星实验，也是看文献看论坛自己摸索的，最近老是遇到各种各样的问题，麻烦各位帮我解答一下。谢谢！
作者: 缘yuan    时间: 2011-12-7 17:04


这是最近拍的照片，大家帮我看看有什么问题。

图片附件: 41591040.snap.jpg (2011-12-7 17:04, 10.74 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9704

作者: caihong    时间: 2011-12-7 17:05

我的裂解液只用一次就不要了，电泳液也只用两次，有师姐说应该这样的，感觉太浪费了，真的可以重复用吗？还有我上次照了4Gy的剂量可是一个彗星都没看到，全是圆圆的细胞，还没找到原因呢，我刚刚开始做，请老师们帮帮忙，谢谢！
作者: caihong    时间: 2011-12-7 17:05


之前有看到用24孔板盖来铺胶的，想请教一下，这个盖子四周都有挡板，电泳的时候会不会影响电泳液流动导致电泳失败呢？
作者: caihong    时间: 2011-12-7 17:05

配裂解液时先把原液配好，PH调到10，溶液变澄清时就可以放到冰箱里了，使用时直接按比例加入DMSO和Triton X 100就可以了，不用再调PH了。Triton X-100是一种非离子型表面活性剂（或称清洁剂），它能溶解脂质，以增加抗体对细胞膜的通透性。就像洗衣粉里加的表面活性剂一样，加了之后会有点浑浊，需要放到冰箱里静置一会。为什么要放冰箱？个人感觉裂解液温度越高越浑浊(曾经试过把裂解液放到37度，结果浑到不行）。至于荧光显微镜的镜头倍数，一般20或40，常用40，油镜放大倍数太大了，没有必要。

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我前些天配得裂解液没用完然后放在4度冰箱结果第二天底下沉淀了好多白色絮絮的东西，放在37度水浴里一会就变清了耶
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 17:06     标题: 回复 #1237 caihong 的帖子

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2729243&sty=1&tpg=1&age=0')
这是我们以前做的不同剂量照射后的淋巴细胞彗星
裂解液还是新鲜配制的好，各种试剂溶解后可以常温密闭保存，作为储存液，用时新鲜加入DMSO和TRITON，电泳液我只用一次
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 17:06

我前些天配得裂解液没用完然后放在4度冰箱结果第二天底下沉淀了好多白色絮絮的东西，放在37度水浴里一会就变清了耶

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这是肯定的，用前可以放水浴，都溶解后，加入DMSO和TRITON，然后放4度，你准备细胞、铺胶等步骤完成后，裂解液也正好能用了.........
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 17:07     标题: 回复 #1234 缘yuan 的帖子

配好的裂解液储存液我觉得最好常温密闭保存，实验用多少就取多少，常温下加入DMSO时就不至于出现沉淀，然后再放冰箱。
另外，我遇到过用时间比较久的DMSO在配裂解液时容易出现浑浊，还是比较新买的好
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 17:08     标题: 回复 #1235 缘yuan 的帖子

abc816群友是用吖啶橙的，镜下应该是黄色的吧。
彗星图像就是模糊的，边界不清楚，看看文献或站友们的照片就知道了，另外你的照片只能看出细胞密度有点高，其它的好像给大家的信息太少了。
作者: qqq111    时间: 2011-12-7 17:08

红色部分也许是你的问题所在。
3、过夜？岂不是时间太长了？
4、20伏试试吧，能调到300毫安吗？计算过单位长度的电压吗？
COME ON !

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谢了，一叶老师。我又做了，把电压调到5v，电流55mA，结果还不错，未处理的没有尾巴，处理的有彗星
作者: caihong    时间: 2011-12-7 17:09

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2729243&sty=1&tpg=1&age=0')
这是我们以前做的不同剂量照射后的淋巴细胞彗星
裂解液还是新鲜配制的好，各种试剂溶解后可以常温密闭保存，作为储存液，用时新鲜加入DMSO和TRITON，电泳液我只用一次。

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谢谢一叶老师，你们做的这个彗星我看过了，好漂亮。我做的是Hela细胞的，上次配裂解液还是借的十二烷基肌氨酸钠，等我们的买回来再做，现在在做微核，也看了老师发的图片了，遇到问题再向老师请教，谢谢！
作者: ffooll    时间: 2011-12-7 17:09

但是玻片到底放在哪一极呢？我上面的图片是放在负极跑电泳拍的，怎么我看前面有人说要放在正极端呢？一般细胞数目在10的6次方可以吧，为什么我的跑完电泳还是那么密呢？我那张图是重铬酸钾作用4小时后的结果，感觉尾巴方向不对，跑电泳时玻片放得很好啊，不知道为什么会这样。
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 17:10

我认为放哪端不重要，DN***段是向阳极移动的，放中间最好，我就是这么做的。
你的细胞密度太高了！
作者: one    时间: 2011-12-7 17:10

记得有战友说，阴性对照的彗星率应该在10%以下，那么判断彗星的标准是什么呢？是肉眼大概判断？还是利用软件分析后，尾长>3的记为阳性细胞？

如果不能将阴性对照的彗星率降到10%以下（小肠上皮细胞消化或是匀浆，是由于实验方法所致，而非人为的操作因素），但是阴性对照组和实验组的数据利用CASP软件分析后，统计学处理如果有统计学意义。那么对于存在阴性对照的彗星率偏高的情况，这样的实验结果是否可信？
作者: baidukk    时间: 2011-12-7 17:11

我做的，讨论一下。。。

图片附件: 92419234.snap.jpg (2011-12-7 17:11, 11.59 KB) / 该附件被下载次数 0
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9716

作者: baidukk    时间: 2011-12-7 17:11

损伤较严重的

图片附件: 42978153.snap.jpg (2011-12-7 17:11, 10.76 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9718

作者: baidukk    时间: 2011-12-7 17:11

再一张

图片附件: 27313077.snap.jpg (2011-12-7 17:11, 9.32 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9720

作者: baidukk    时间: 2011-12-7 17:12

请大家指教

图片附件: 28062862.snap.jpg (2011-12-7 17:12, 6.51 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9722

作者: guagua    时间: 2011-12-7 17:12


你做了阳性对照吗？用了什么阳性物？
作者: flower-201    时间: 2011-12-7 17:13


我想用过氧化氢作为彗星实验的阳性对照，但是买来的是30%的过氧化氢，我想配成0.2MMol/L，该怎么稀释啊？请大家帮忙换算一下，谢谢！！
作者: flower-201    时间: 2011-12-7 17:13


本人想做细菌彗星试验，不知道能不能选择过氧化氢做为阳性对照物？不知道哪位朋友有做这方面的研究，请多多交流一下。
作者: ladyhuahua    时间: 2011-12-7 17:15

请各位战友帮我看看下面的结果：:
首先非常感谢百科网的各位群友无私的奉献，我就是看来这个讨论的帖子后才对彗星实验技术有了初步的了解。下面是我做的人精子细胞的图像，做了好几次，其他都还可以就是出不来彗星图像很着急呀。请大家帮我看看到底下面的图是没有裂解好，还是电泳的问题，或是其他什么原因？
实验条件：我买的是彗星试剂盒，0.75正常熔点琼脂糖100ul,低熔点琼脂糖75+25ul精子细胞铺两层胶，用的也是一叶老师发明的自制电泳槽；裂解用的是试剂盒提供的，共2h；去离子水冲洗2次，解旋20min；电泳：20V,300MA，20min，用去离子冲洗2次，共10min；然后染色。
非常期待大家的回复！！！

图片附件: 32099555.snap.jpg (2011-12-7 17:15, 9 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9730

作者: ladyhuahua    时间: 2011-12-7 17:15

非常期待大家的回复！！！

图片附件: 76080706.snap.jpg (2011-12-7 17:15, 9.01 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9732

作者: ladyhuahua    时间: 2011-12-7 17:16

3~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~·

图片附件: 21155728.snap.jpg (2011-12-7 17:16, 9.84 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9734

作者: loli    时间: 2011-12-7 17:17

请各位战友帮我看看下面的结果：:
首先非常感谢百科网的各位群友无私的奉献，我就是看来这个讨论的帖子后才对彗星实验技术有了初步的了解。下面是我做的人精子细胞的图像，做了好几次，其他都还可以就是出不来彗星图像很着急呀。请大家帮我看看到底下面的图是没有裂解好，还是电泳的问题，或是其他什么原因？
实验条件：我买的是彗星试剂盒，0.75正常熔点琼脂糖100ul,低熔点琼脂糖75+25ul精子细胞铺两层胶，用的也是lq6688老师发明的自制电泳槽；裂解用的是试剂盒提供的，共2h；去离子水冲洗2次，解旋20min；电泳：20V,300MA，20min，用去离子冲洗2次，共10min；然后染色。
非常期待大家的回复！！！

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问题在裂解解旋步骤。不知道你是不是用的一般的彗星实验试剂盒，用的是常规的裂解解旋电泳步骤，如果是这样的话肯定不行。
精子是一种高度分化的生殖细胞，高度压缩的单倍染色体几乎是成熟精子头部的全部内容。精子的核蛋白是由85 %鱼精蛋白和15 %的组蛋白组成，DNA 链与鱼精蛋白之间有牢固的二硫键连接，形成精子细胞核的独特致密结构。精子的这种结构可以保护精子DNA免受伤害；另一方面，由于这种独特的致密结构，常规体细胞的SCGE方法很难将精子DNA从核蛋白中分离，在精子的彗星实验中，裂解和解旋之间，需要加入额外的步骤或试剂才能解决鱼精蛋白与DNA的分离问题，才能做出彗星。
作者: loli    时间: 2011-12-7 17:17


这是我以前做的......

图片附件: 55464899.snap.jpg (2011-12-7 17:17, 9.52 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9739

作者: yychen    时间: 2011-12-7 17:18

您的图做的非常漂亮。能不能发一下您的具体操作步骤，文献上关于精子彗星试验有好多不同的地方。还有我看文献上的需要加入 二硫苏糖醇10mmol/L，蛋白酶K 200ug/L,以上我的都是粉剂的，能不能直接加入到相应的中性溶液中。
作者: yychen    时间: 2011-12-7 17:18

再请教一下。我在加入蛋白酶K这一步中溶液溶解不了，您看我加的对吗？

(90ml去离子水+NaCl14.61+EDTA3.72+蛋白酶K10mg+10% DMSO 10ml)。ph值调至7.4，但不能溶。
这个是原文：proteinase K (Amresco) (100 ug/mL in 2.5 M NaCl,100 mM EDTA, 10% DMSO, pH 7.4。
作者: loli    时间: 2011-12-7 17:18

是蛋白酶K不溶还是配溶液的时候溶液不溶？蛋白酶K是要先溶解后分装，临用前再加的。用前先把它取出来解冻，解冻后的可能有点析出，再吹打一下就行了。蛋白酶K消化液和裂解液的主要区别在于一个是临用前加Triton和DMSO，另一个是加proteinase K和DMSO。
作者: yychen    时间: 2011-12-7 17:19

您好：
是配溶液时呈乳白色溶解不了，我的蛋白酶K也是稀释后临用前加的。我今天就是按照您的方法做的，没溶解好的我就按照那样做了。就等着明天看结果了,有好消息后告诉您。

非常感谢您的帮助！
作者: yychen    时间: 2011-12-7 17:19

您好：

您説蛋白酶K消化液和裂解液的主要区别在于一个是临用前加Triton和DMSO，另一个是加proteinase K和DMSO。
但是蛋白酶K消化液中不含有 trase base ,裂解液的ph值为10，用氢氧化钠调节时就可以溶解。
作者: loli    时间: 2011-12-7 17:20

我说的是主要的哈......其实区别多着呢，作用都不一样......
作者: yychen    时间: 2011-12-7 17:21

您好：

这是我按您发给我文献上面做的，有一张好像是彗星。中间特别亮的黄色是怎么回事，是不是我的细胞膜没有裂解呀？这个能分析吗？

图片附件: 17749952.snap.jpg (2011-12-7 17:21, 18.6 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9748

作者: yychen    时间: 2011-12-7 17:21


第二张

图片附件: 72149538.snap.jpg (2011-12-7 17:21, 9.77 KB) / 该附件被下载次数 0
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9749

作者: yychen    时间: 2011-12-7 17:22


第三张

图片附件: 49877858.snap.jpg (2011-12-7 17:22, 24.61 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9751

作者: 克隆鱼    时间: 2011-12-7 17:22

您好，我也是刚开始做单细胞凝胶电泳的预实验，做的是高浓度氟化钠对大鼠肝肾细胞DNA的损伤。我取出脏器后，剪一小块组织放到EP管中，滴一定体积的胰酶剪碎组织消化五分钟，再滴加相同体积的含血清培养基终止消化，用移液枪吹打。（之前有个老师是这样做的）放到100倍显微镜下为什么看不到细胞？400倍下看也不像细胞。还有，为什么我配的0.8%的低熔点琼脂糖在37度下会凝固，无法和细胞悬液混匀？
作者: 克隆鱼    时间: 2011-12-7 17:23

请问在线的各位同盟能帮我解答一下上面的问题吗？我下周就要做正式试验了，但是预实验还没看到细胞。很是心急。我原来不是做实验的，因课题需要才转行做试验。大家都是在多少倍镜下观察细胞的？
作者: tieshazhang    时间: 2011-12-7 17:23

花了三天时间好好把五年的帖子研究了一遍 终于觉得自己不孤单了 有这么多人并肩作战 我刚跟师姐学做这个实验 实验过程中遇到好多问题 基本上都在论坛里找到了 很兴奋 还有一些问题 希望得到指点
1 彗星实验要求存活率吗 我师姐告诉我要求存活率达到90%以上 彗星实验才有意义 我在计存活率的过程中遇到问题 发现所有台盼蓝染色的细胞 都是圆圆亮亮的 看不到所谓的蓝色为的死细胞 做了好多遍 都没找到半致死浓度 这是什么原因 我用超纯水配的0.4%的台盼蓝染液 很崩溃
2 我发现做辐射损伤实验的图片彗星率比较高 而且效应关系比较明显 我做的是小鼠淋巴细胞化学物染毒 从0ug/ml-50ug/ml 感觉剂量效应关系很小 10ug/ml可以看到很多的彗星现象 可是后来随着浓度的增大 彗星现象特别少 按我的预期是浓度越大彗星现象越明显的 很不解 电泳的条件是师兄师姐以前摸得25v 310mA
3还有就是导师想让我用其他生物的检测方法 检测遗传毒性 来和这个方法对比 因为我只是比较欠缺 请高手指点简单一点的标准方法
下面是0 10 50gu/ml的彗星图像 请批评指正

图片附件: 60312376.png (2011-12-7 17:24, 52.31 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9759

作者: tieshazhang    时间: 2011-12-7 17:24

10ug/ml

图片附件: 35711335.snap.jpg (2011-12-7 17:24, 9.22 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9761

作者: tieshazhang    时间: 2011-12-7 17:25


50ug/ml的 大部分都是这个样子 没有明显的彗星现象

图片附件: 46536612.snap.jpg (2011-12-7 17:25, 3.85 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9762

作者: tieshazhang    时间: 2011-12-7 17:25


我做的过程中遇到的 我感觉是凋亡细胞

图片附件: 67847225.snap.jpg (2011-12-7 17:25, 16.91 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9764

作者: loli    时间: 2011-12-7 17:26

这是我按您发给我文献上面做的，有一张好像是彗星。中间特别亮的黄色是怎么回事，是不是我的细胞膜没有裂解呀？这个能分析吗？

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第三张肯定是彗星呀。这么快就做出来了，恭喜恭喜！中间高亮的地方是仍高度凝聚的DNA，由于荧光强度太高因此会显黄色，不影响分析的。CASP软件自带的分析照片也是这样的哈。
作者: 月牙牙    时间: 2011-12-7 17:26

感谢您的帮助我的试验才能顺利进行，我拍的所有图片就只有一个是彗星图，我想是不是和电泳的时间、电流有关系。我的是20v，260MA，40min ？
我看好多文献説是精子的彗星要用中性电泳液，（我按您提供文献是12.3），您也是12.3吗？
CASP软件和图像转换软件ACDSee能给我邮箱发一份吗？我在lq6688提供的地址上下载，老是不成功。
这个是文献上关于精子彗星电泳液的，（彗星试验是检测精子DNA单、双链断裂，期间的差别是电泳缓冲液的pH值。检测单链DNA断裂用pHl2—13的电泳液，检测双链DNA断裂用pHi9～l0电泳液。但是，由于精子DNA内存在大量的碱不稳定位点，用强碱性电泳液会使正常的精子出现大量的彗星细胞。因此，精子彗星试验多用于检测双链DNA断裂。）所有我现在对精子彗星用碱性还是中性电泳液很迷茫,想听听您的意见？
作者: tieshazhang    时间: 2011-12-7 17:27

我的彗星图像跟大家的不一样啊 不知道这样的结果怎么样 我是新手 希望批评指正
作者: 月牙牙    时间: 2011-12-7 17:27

非常感谢您的帮助，您的无私奉献使我受益非浅。这是我在中性条件下做的小鼠精子的彗星图像，请指教。

图片附件: 66590823.snap.jpg (2011-12-7 17:27, 23.17 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9766

作者: loli    时间: 2011-12-7 17:28     标题: 回复 #1279 月牙牙 的帖子

很漂亮啊！要是细胞数再降一点，背景再干净一点就完美了哈。
作者: bohe221    时间: 2011-12-7 17:28

各位老师好，我想请问一下，在分析图片时。怎么遵循随机原则，上次老伴非要我说出随机选取100个细胞的随机原则出来。我查了很多文献也没有详细说明是怎么个随机原则。请各位帮忙！！！谢谢
作者: flower-201    时间: 2011-12-7 17:29

分析方法应该是随机选视野拍照,计数200个细胞,先人工算其彗星率,然后选有彗星的细胞30-50个分析、比较 这样的结果相对比较可靠
作者: flower-201    时间: 2011-12-7 17:29


做了几次都是染毒三小时以后还可以看见细胞 但是拍照的时候死活找不到 这种情况经常出现 不知道什么原因 会不会是我电泳时温度不够低 因为电泳调电压时外界温度高冰箱的温度升高到八度 这个温度不会把低熔点的胶给融化了吧
作者: loli    时间: 2011-12-7 17:29     标题: 回复 #1283 flower-201 的帖子

因为电泳调电压时外界温度高冰箱的温度升高到八度”，这句没看懂，是指电泳时的温度是八度吗？那肯定是不会溶的哈，25度以下都是可以的。
我看你前面不是有做出来的照片吗？只有最后一张不太像，其他的都还不错呀，是什么染色呀？“做了几次都是染毒三小时以后还可以看见细胞”是指染毒三小时后的玻片上还看得到细胞吗？具体的操作流程说来分析下嘛
作者: flower-201    时间: 2011-12-7 17:30

就是因为调电压 外界空气进入 冰箱温度升高了 我们是在冰箱里电泳 细胞悬液里加药品染毒 三小时以后我用计数板计数 可以看见细胞 但是拍照时就看不到了
作者: flower-201    时间: 2011-12-7 17:30

1． 小鼠淋巴细胞悬液的制备
本实验采用小白鼠淋巴细胞作为实验对象。首先用乙醚使小鼠昏迷，对小鼠的胸部进行碘酒和酒精的局部消毒，采用心脏取血法采集1mL血液（加入30μL肝素抗凝），采血注射器针尖部分再次酒精消毒，全血按照1：1比例加入小鼠淋巴细胞分离液上层（装分离液的离心管用封口膜隔离细菌），2000RPS离心10min。第一次离心后用1mL注射器吸取上层血浆与下层分离液之间的致密白色层，即淋巴细胞，移入另一无菌离心管中，加入适量培养液2000RPS再次离心10min，弃去上层溶液，加入适量新鲜的培养液稀释为0.8mL（细胞悬液体积根据离心得到的淋巴细胞量和实验样品的需要而定），细胞浓度大约105~106个/mL的细胞悬液待用。细胞悬液制备过程为半开放式，部分操作在超净工作台以外，因此需要特别注意工作台以外保持离心管的密封隔离和进入工作台操作前的灭菌消毒，保证实验过程的无菌条件。


2． 染毒
把目标物配置成不同的浓度，以一定的比例和细胞悬液混合，在培养箱中放置3个小时。


3． 凝胶板的制备
本实验采用双层铺胶法。第一层0.75%的正常熔点琼脂。称取0.15g正常熔点琼脂，加入20mLPBS中加热溶解至微沸，用移液枪吸取150μL平铺于预制微电泳槽中，4℃下固化10min。第二层凝胶的制备：制备0.75%的低熔点琼脂。称取0.075g低熔点琼脂，加入10mLPBS中加热至微沸，然后放入37℃水浴中冷却及防止再次凝固，将细胞悬液和低熔点琼脂按照1：2的比例混合均匀取100μL平铺在第一层凝胶上（每板约103个细胞），4℃下固化10min。铺胶时要尽量做到胶面平整，厚度一致，否则会造成电泳时电压不均与，局部电压过大或过小，影响实验数据的准确性。
5． 裂解
根据单细胞凝胶电泳标准化会议上统一的实验室条件，确定淋巴细胞的裂解时间不宜超过2h，因此本实验选择2h最为最佳裂解时间。将固化好的凝胶板浸入新配制的4℃细胞裂解液中（2.5mo1•L-1NaCl，100mmo1•L-1Na2-EDTA，10mmo1•L-1Tris，使用前加入1%TritonX-100，10%DMSO），置于4℃冰箱中避光裂解2h。
6．解旋
将凝胶板从裂解液中取出，用超纯水洗涤三次，除去多余水分并置于水平电泳槽内，由于本实验不存在点样，所以凝胶板两端朝向问题不需要考虑，但建议靠近阳极端，将电泳槽置于4℃冷冰箱中，缓慢注入新配置的4℃电泳缓冲液（1mMNa2-EDTA，300mMNaOH，pH13.0或>13.0）至液面高于凝胶板2-3mm，解旋40min。
7． 电泳电压的优化
鉴于细胞种类和受试物致DNA损伤方式的差异性，不同实验选择的电泳条件不尽相同。电泳电压是根据电泳槽两极间的距离与电场强度（0.8-1.0V/cm）的乘积设定的，本实验中采用的电泳槽两极距离为32cm，设定电压为27V，电流320mA，电泳时间为20min。
8． 中和
电泳完毕后，将凝胶板从电泳槽中取出，用4℃的0.4M，pH7.5的Tris缓冲液缓缓滴入凝胶上，中和5min，然后更换中和液再中和5min，超纯水洗净后用滤纸吸去多余水分。
9． DNA染色
用注射器将0.5mg•L-1的EB溶液滴到载玻片上，染色2min，用超纯水洗涤多次，吸去多余水分，实验过程中注意防止EB污染。
10． 荧光检测
将凝胶板置于荧光显微镜下，采集淋巴细胞图像。本实验采用零级150万像素黑白数码成像采集系统。
11． 图像分析
实验采用的CASP1.22是目前通用的免费图像分析软件，软件提供了13项分析指标，即HeadArea、TailArea、HeadDNA、TailDNA、HeadDNA%、TailDNA%、HeadRadius、TailLength、CometLength、HeadMeanX、TailMeanX、TailMoment、OliveTailMomen。

这就是我们实验室的实验过程 以前帮师兄师姐做 板上细胞的数目都是很多的 可是我自己做就老看不见细胞 不知道有何原因？
作者: loli    时间: 2011-12-7 17:31

我觉得要是镜下看不到东西的话可能有两种原因：一是胶上没有细胞；二是连胶都没有—掉胶了。
先说第二种可能：掉胶。这个应该很好分辨，在实验的每一步注意看看胶还在不在就行了。但是我觉得这个不一定是你问题的原因，因为你不可能几十张片子都掉胶吧。
还有一种可能就是细胞处理、铺胶的问题了。这里面会出现的情况就太多啦！1、“细胞悬液里加药品染毒”,根据你后面所说，细胞悬液应该是800ul，就是不知道加了多少的药，会不会液体太多又把细胞悬液稀释了呢？把细胞加到胶里之前有没有混匀一下呀？2、那要是你说细胞数肯定够呢——还有一种情况，就是胶没有混匀。一般来说都是细胞往胶里加，而不是把胶加在细胞里，这你应该没弄错吧？那加了之后有没有把胶仔细混匀呢？关于这一点本贴前面就有讨论：凝胶都是有点粘稠度的，细胞加在里面后要用枪头仔细混匀，吸的时候也要吸加样处的胶，免得没混匀，又吸到其他位置的没有细胞的胶......总之，要是你还找不到原因的话，就铺好胶后先在光镜下看看，有没有细胞。要是有，实验完了又没有，问题就出在后面的裂解解旋步骤；然后再电泳完了，染色之前再看看（虽然细胞膜溶解了，细胞核应该看得到的嘛），要是有，拍照时又没有，问题就出现在电泳后面的步骤......
作者: 二丫头466    时间: 2011-12-7 17:31


请问大家磨砂载玻片是在哪儿买的呢？查了很多地方，好像都没有。
作者: 二丫头466    时间: 2011-12-7 17:32

请教各位高手：配胶用的PBS的PH，看到有的是7.4，我们实验室之前也做过，可是PBS都是6.8的，到底是哪个呢？
作者: loli    时间: 2011-12-7 17:32


全磨砂的载玻片是有卖的哟，实在找不到的话可以找玻片厂定做。不过我们都没有用磨砂的玻片......
PBS7.4
作者: zhezhe    时间: 2011-12-7 17:33

第九步：没关系，把结果稍微调整一下就好看了，（要把结果直接转入SPSS统计软件分析，必须做调整！！！）。调整文本框的宽度（绿色箭头处），把分析的指标都放到第一行，可是各个指标的英文单词比较长，简化一下，如：taillength 变成tl，cometlength变成cl，红色圈定区，我不再一一赘述。调整后，左侧就是图像的name，向右依次是各个指标的数据，注意！！！各个指标名和数据之间一定要有空格相隔！！！否则无法转入SPSS统计软件！

请问老师，我已经完全按照你的做法把数据排列好了，但怎么转入SPSS呢，请老师详述！我无法把数据转进去，是粘贴、复制吗，我试过了，不行啊
作者: 一叶    时间: 2011-12-7 17:33


SPSS可以直接读取.txt文件的
作者: 四福晋    时间: 2011-12-8 08:32

我做的是植物细胞的SCGE,想向您请教几个问题：
1,观察到的彗星图像是细胞S核的还是整个细胞结构
2 你们用的PBS是多少你浓度的啊？植物动物的区别很大吗？
3如果我能分离得到游离的细胞核的话我的试验可以进行吗
4 电泳一定要在4摄氏度的环境下进行吗？
我做了一个前期的预实验，得到图片都是这样的，你帮我看看与彗星有区别吗？
那个图片中有好多的绿色亮点，但我不能确定是否将DNA染色

图片附件: 31040049.snap.jpg (2011-12-8 08:32, 9.65 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9770

作者: 一叶    时间: 2011-12-8 08:33     标题: 回复 #1293 四福晋 的帖子

1、观察到的是核
2、请看以前的帖子吧，很详细了
3、没做过植物的，没有发言权
4、电泳液在用前4度预冷就行
我认为你的图中没有细胞
我记得下载过一个有关植物的SCGE，找找看，有的话附上来。
作者: loli    时间: 2011-12-8 08:34

最近遇到一个问题：彗星的分析。要怎么样的计数彗星细胞才能最大限度的避免误差，得到客观公正的分析结果呢？其实这个问题在前面也有讨论，但一直没有很明确的解答，有的是随机分析细胞（即是不是彗星都分析）；有的是分析彗星细胞，但无论那种方法都有缺陷，因此也是让我很困惑。今天终于下定决心再研究一下这个问题（也是被某人逼的...），在翻看了若干文献之后，终于找到一篇专门讨论彗星的分析问题的文章，谈到了很多方面，从彗星指标的选择到彗星实验的设计；从数据的分布到各统计方法的优缺点......
作者: utt0989    时间: 2011-12-8 08:34

有人做过小鼠心脏取血 然后分离获得淋巴细胞吗 具体步骤是什么 谢谢 我在怀疑我获得的是不是淋巴细胞 我的具体步骤是，采用心脏取血法采集1mL血液（加入30μL肝素抗凝），全血按照1：1比例加入小鼠淋巴细胞分离液上层，2000RPS离心10min。第一次离心后用1mL注射器吸取上层血浆与下层分离液之间的致密白色层，即淋巴细胞，移入另一无菌离心管中，加入适量培养液2000RPS再次离心10min，弃去上层溶液，加入适量新鲜的培养液稀释到所需浓度。我用这种方法最后可以很明显的看到白色的沉淀物，但是后期做单细胞凝胶电泳拍到的图像有时细胞很大 有时细胞很小 差异很明显
作者: utt0989    时间: 2011-12-8 08:35

请问大家磨砂载玻片是在哪儿买的呢？查了很多地方，好像都没有。

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上海生工有卖
作者: 一叶    时间: 2011-12-8 08:39     标题: 回复 #1296 utt0989 的帖子

发个图看看吧？不应该差别那么大的，是否其中一种不是细胞？
作者: lixi559    时间: 2011-12-8 09:29

请教大家：今天试着做了一下一叶老师用的微电泳槽，可是有一个问题不太明白，因为之前用的是磨砂载玻片，铺上胶以后要盖盖玻片，我觉得应该是能使胶铺开吧，可是微电泳槽是不加盖玻片的，这样的话滴上胶以后能散开吗？第一层胶温度高，应该没问题，可是第二层呢？因为温度低，感觉是不是散不开呢？只是今天想到这个问题了，还没试过，不知道大家做得怎么样呢？
作者: utt0989    时间: 2011-12-8 10:08

发个图看看吧？不应该差别那么大的，是否其中一种不是细胞？

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老师。一张只有一个细胞 因为我们显微镜只有400倍的 没有200倍的 一张是我感觉正常的 拍照时细胞的荧光很亮 可以很轻松地拍到图片 一张是不正常的 感觉细胞小 一张片子上都是这样 拍的时候忒别费劲 感觉没有荧光一样 这两张在同一放大倍数下看的 另外第三张是我拍到的彗星图像 感觉尾巴特别散 不要你们的拍出来很漂亮的尾巴 麻烦老师帮我分析一下
作者: TAT    时间: 2011-12-8 10:08


请问有没有人做细菌的彗星试验？？
作者: utt0989    时间: 2011-12-8 10:09

请问电泳时电压可以恒定在26 电流调不到300 都480了 对结果影响大吗
作者: wu11998866    时间: 2011-12-8 10:10

我想向您请教，用CASP分析彗星图像时，细胞应该在分析框的什么位置，我试过把细胞放在左、中、右，结果有些指标得出的结果不同。请您指教。
作者: 月牙牙    时间: 2011-12-8 10:11

您好，
最近我在做人精子彗星实验，请帮我看看我的图像。
另外，精子周围有很多晕一样的东西。
我分析可能裂解的不好，您能给些建议吗？

谢谢！

图片附件: 90158792.snap.jpg (2011-12-8 10:11, 11.8 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9771

作者: 一叶    时间: 2011-12-8 10:13

我在睾丸的彗星实验时，看到了大量的成梭状的细胞不认识，请问大家这是什么细胞呀。图片是在40倍镜下看到的。拜求了！

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应该是精子
作者: 一叶    时间: 2011-12-8 10:13     标题: 回复 #1304 月牙牙 的帖子

对，精子裂解是和淋巴细胞不同的，看看文献吧，要裂解充分。
作者: loli    时间: 2011-12-8 10:14

这问题都出在裂解消化解旋步骤。能把具体的操作说一下吗？
作者: whitesheep    时间: 2011-12-8 10:15

请问一下，做睾丸彗星实验是不是，对精子进行特殊的处理呀。
作者: loli    时间: 2011-12-8 10:32

睾丸彗星实验我没做过，只做过精子的，所以资料肯定是没有滴，查查文献吧。精子彗星实验跟睾丸细胞的彗星实验是不一样的哟，睾丸里处于各种时期的细胞都有啊，你不可能都做吧，哪种细胞才是你的研究对象呢？
作者: whitesheep    时间: 2011-12-8 10:33

我做的是睾丸彗星实验呀。谢谢了！
作者: 笑弯了腰    时间: 2011-12-8 10:33

好图祝您成功！

图片附件: 22753855.snap.jpg (2011-12-8 10:33, 7.93 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9772

作者: 笑弯了腰    时间: 2011-12-8 10:34


好图祝您成功！

图片附件: 48143049.snap.jpg (2011-12-8 10:34, 10.08 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9773

作者: 园丁##    时间: 2011-12-8 10:35

大家给了许多建议，改进了铺胶技术。上面的问题主要是铺胶不平，并且以前精子只铺两层胶，改为三层就好多了。
终于做出来了。
还有个问题abc816\一叶老师给解答下。
跑出来的彗星尾巴不齐，比较难看。
casp软件我用的是绿色版，分析完后，按export result后保存不了结果，要么直接退出、要么没反应，但也没错误提示。
多谢多谢。

图片附件: 43198853.jpg (2011-12-8 10:35, 20.13 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9774

作者: 园丁##    时间: 2011-12-8 10:36

多谢多谢。

图片附件: 33890923.snap.jpg (2011-12-8 10:36, 5.75 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9775

作者: 园丁##    时间: 2011-12-8 10:36

多谢多谢。

图片附件: 51316885.snap.jpg (2011-12-8 10:36, 33.58 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9776

作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-8 10:37

我最近在16HBE做彗星实验，我铺的是两层胶，铺第1层胶： 0.5%NMPA 100μl于磨砂玻片面，迅速盖上盖玻片，4℃下凝固，即为第一层胶；第2层胶：37℃ 0.5%LMPA 100μl+10μl细胞悬液(10:1)混匀，迅速铺于第一层胶上，盖片，移入冰箱使其固化。细胞溶解：玻片浸入新鲜配制的冰凉细胞溶解液中，4℃1小时。碱化处理20分钟，恒压25V, 300mA电泳25分钟，中和缓冲液浸洗，3次×5min，EB染色应用液体（20μg/ml）15μl 染色。发现染液不能铺满胶面，有气泡存在！且背景不清晰，存在很多杂志，附上图片！请高手指点！

图片附件: 16124522.snap.jpg (2011-12-8 10:37, 27.35 KB) / 该附件被下载次数 8
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9777

作者: zhezhe    时间: 2011-12-8 10:37


老师你好，我做的精子的冷冻损伤，铺的是单层胶，采用先裂解后铺片，玻片也是普通的毛玻璃片，但是电泳时经常会脱胶，怎么样才能改进这个脱胶问题呢？
作者: 一叶    时间: 2011-12-8 10:38     标题: 回复 #1317 zhezhe 的帖子

有一个很不错的文章，发表在nature protocol上的，推荐你看下。

《 thod to measure DNA damage in individual cells》
作者: 园丁##    时间: 2011-12-8 10:40

本人做了一段时间的肿瘤细胞的彗星实验，有以下几点心得体会：
1.防止掉片最重要，制片质量是实验成功的首要因素，采用了一些高手的经验，先用50ul 0.75%正常熔点胶推片，室温5min左右，再用200ul铺片，盖上玻片，室温放置15min（切记室温晾干，经验发现这样比较容易去掉玻片，否则胶与玻片沾得太紧）。然后铺100ul 0.75%低熔点胶与细胞的混合液并盖上玻片，4度30min，冰箱拿出后，稍微室温放置一会，等玻片上出现一层水蒸气后再去掉玻片（可能是减少摩擦力）。
2. 肿瘤细胞我是裂解过夜的。电泳25V，300mA，30min。
3。在实验过程中要防止片子过干，那样也会影响制片。其他就没什么问题了。

以上小小经验与各位同行分享。
作者: 生物迷    时间: 2011-12-8 10:42

各个高手，我把论坛又看了一遍 还有一个问题不太明白 论坛上说的“镜下观察100个细胞，看彗星细胞率，”是什么意思，是不是目测是不是圆的就是彗星细胞吗？我不太清楚，彗星细胞到底是个什么标准，是目测？还是有一些指标作标准，比如说大于某个数值就是彗星细胞。这个标准不知道，我没办法计算我的彗星率。不好意思啊，又一次把这个问题拎了出来。
作者: 四福晋    时间: 2011-12-8 10:43


各位高手，请问有没有人做过细菌的彗星实验啊？不知道为什么到最后染色观察时什么都没看到，也不知道哪里出问题了？我把实验流程也写上，大家帮我找找问题啊！！
1.第一层胶：正常熔点琼脂300ul于自制的载玻片上，4℃凝固10min
2.第二层胶：20ul菌液（2×10的6次方）与180ul低熔点琼脂混匀，4℃凝固10min
3.第三层胶：低熔点琼脂+溶菌酶（5mg/mL）+肌氨酸钠（0.25%）取200ul铺于第二层胶上，37℃作用30min.
4.裂解：配方2m NaCl,100mM EDTA-2Na 1%肌氨酸钠，10mM Tris,1%TritonX-100,4℃裂解1.5h
5.电泳：配方300mM醋酸钠和100mM Tris,作用20min以保持平衡，然后电压12V，电泳1h。
6.电泳完毕后将载玻片置于含1M醋酸胺的乙醇中作用10min。
7.吖啶橙染色观察。
可是结果视野中什么都没有！！！到底是为什么？重复了很多次都是这样！请大家帮忙想想办法!!谢谢！！！！
作者: loli    时间: 2011-12-8 10:43     标题: 回复 #1321 四福晋 的帖子

细菌没做过，不好说...
不过如果基本原理和步骤是和细胞一样的话，你可以参看45页，在实验的各个步骤都检查一下，看是不是哪一步出了问题。
另外还有一点不明白：你那胶铺的好厚啊，是因为细菌而特别要求的吗？
作者: 盼盼    时间: 2011-12-8 10:44

首先我要感谢这个帖子 ，让我学习了很多。我从专题讨论的第一页看到最后一页。从对彗星实验一无所知到今天我看到了自己做的彗星了。这个版块让我走了很多弯路，节省了大量时间。感谢那些无私奉献的学者。我现在还有些细节问题 ，我看版主的彗星背景很黑，彗星很清晰。我的背景很红，彗星有时看的不是很明显，请问如何能减低背景色？
作者: loli    时间: 2011-12-8 10:45     标题: 回复 #1323 盼盼 的帖子

染色时间短一点；胶铺薄一点；用透明玻片而不是磨砂玻片的话效果会好一点；实在不行就把图像采集系统的背景调低一点......
作者: 盼盼    时间: 2011-12-8 10:45


我想问各位老师 因为害怕EB毒性太大，所以改用吖啶橙染色 ，染色时间一般多长？还有我在荧光显微镜下看到的彗星 与图像采集系统中的有很大区别 这是何原因？在同一块胶上每一次采集用的曝光时间等参数都应该一样吗？ 要是一样 ，我有的图像有很不清楚了。这是不是与我的胶不平有关呢？谢谢答复
作者: glass    时间: 2011-12-8 10:48


大家好，我是第一次接触到彗星实验的内容，而且是植物方面的，在刚开始时就碰到了很棘手的问题，就是利用机械法提取植物叶片的细胞核分离出的很少，用酶解法又有很多的杂质，不知道老师们有没有什么好方法可以说一下吗？
作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-8 10:48


请问各位老师，做精子彗星实验时怎么处理游动的精子呢？它们会不会聚集在一起呢？
作者: 铜雀    时间: 2011-12-8 10:49

请问一下，我用吖啶橙染色，那一种背景好呀？
作者: 泡泡    时间: 2011-12-8 10:49


请教各位老师：请问用TNFa刺激内皮细胞能做彗星实验吗？文献上没有查到。另外，彗星和检测DNA损伤后8OHDG含量这两个组合有意义吗？多谢赐教！
作者: qqq111    时间: 2011-12-8 10:50

老师您好：
我做过几次预实验总是有脱胶的问题，浏览本讨论后发现老师的微电泳槽非常好，但不知道您是怎么做的，希望能够得到您的指点。非常感谢！
作者: 彼岸花opp    时间: 2011-12-8 10:51


请问使用磨砂玻璃还会掉胶啊？全片磨砂的玻片厂家要购满100盒才肯发货，我想请问有没有朋友愿意与我合买啊？还有好心人知道哪里有零售的全片磨砂的玻片卖啊？
作者: 爱老虎游tt    时间: 2011-12-8 10:53     标题: 回复 #1331 彼岸花opp 的帖子

上海生工的卖，不需要100盒，1盒就可以，找当地的代理商就可以了。
作者: bohe221    时间: 2011-12-8 10:53

大家好，这是我做的大豆的，用的是20倍镜，但因为软件问题，使得图片过大，想问一下，为什么没有拖尾呢？
作者: bohe221    时间: 2011-12-8 10:54

这种是核吗？？？？？？
作者: baidukk    时间: 2011-12-8 10:54

做了一段时间的彗星了，总不出结果.晕啊。
作者: loli    时间: 2011-12-8 10:56     标题: 回复 #1335 baidukk 的帖子

是什么问题呢？是看得见细胞，只是不见彗星吗？阳性对照也没有彗星吗？
作者: loli    时间: 2011-12-8 10:56     标题: 回复 #1327 爱老虎游tt 的帖子

精子是采了之后马上做彗星吗？如果是这样的话，精子也是要先用PBS洗的吧，经过洗涤离心程序之后还活的了多少啊，怎么会游到一起？而且精子是要混到正常熔点胶里的，胶本身就是粘性的，精子又怎么游得动！
作者: 了了    时间: 2011-12-8 10:56

做彗星为什么要调电流？这个电泳不是纯电压依赖性的么？电流与电泳液的横截面积和长度是有关的，只需要按照电泳液长度调整每厘米电压不就可以了么？
作者: baidukk    时间: 2011-12-8 11:14


我的彗星终于出结果了，但是不恒定。为什么在正常组的既有正常，也有异常哟

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作者: 一叶    时间: 2011-12-8 11:15     标题: 回复 #1339 baidukk 的帖子

看你的结果，多数都是正常细胞，有两个貌似凋亡细胞，但还有看是否是两个细胞部分重叠或距离很近，而且不在一个焦距面，动一下微调就知道了，感觉像是两个细胞。
作者: ladyhuahua    时间: 2011-12-8 11:15


有没有人有正版的casp，可以发一份给我吗?多谢。我出现的问题就是casp软件经常自动关闭。有时候一张图片都没有分析完，它就自己关了
作者: flower-201    时间: 2011-12-8 11:19

这是我第一次做的彗星电泳，用的是单细胞草履虫，麻烦您指教下，这是彗星细胞吗？我用的是双氧水染毒30min。

图片附件: 94031090.jpg (2011-12-8 11:19, 4.14 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9779

作者: flower-201    时间: 2011-12-8 11:19


再贴个图片，麻烦指教下~


图片附件: 79344209.snap.jpg (2011-12-8 11:19, 78.94 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9780

作者: flower-201    时间: 2011-12-8 11:19

3~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

图片附件: 72007676.snap.jpg (2011-12-8 11:19, 80.57 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9781

作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-8 14:16

我做裸藻，方法跟R. R. Tice的Single Cell Gel/Comet Assay: Guidelines for In Vitro and In Vivo Genetic Toxicology Testing中基本一致。从去年开始跟着师姐做了六七次彗星预实验，全没做出来。背景很红，而且在染色前在荧光显微镜下看做好的片子就是红色的。每次重做都会把某一项条件改变下对比，但是就是没想到EB，有点菜。。

要是早点发现这个帖子就好了。也就是说可能EB染色时间过长，没漂洗。但是，在染色前观察也是红色的吗？这个会不会是荧光显微镜没调对的原因？？可是荧光也是绿色的，不知道还要怎么改（我真的很菜）

麻烦各位高手给分析下，师姐已经崩溃了，决定毕业论文不写这块了。但是我之前写了一篇paper，就差彗星结果了，一定得做出来。。麻烦各位了O(∩_∩)O谢谢
作者: 小鱼鱼    时间: 2011-12-8 14:16

补充下，裂解前是能看到细胞的，胶也没脱。。。
作者: ha111    时间: 2011-12-8 14:17


有一个问题请教，我做单细胞凝胶电泳的时候，把铺好的0.5%的胶放进lysis buffer（2.5M NaCl,100mM EDTA, 100mM Tris）以后，老是感觉胶会被溶解掉，万分着急，请指教。
作者: 阿敏    时间: 2011-12-8 14:18

我是刚开始学着做SCGE，有个问题是实验室没有荧光显微镜，只有Tanon-2500全自动数码凝胶图像分析系统，像素好像只有130W，这个是不是不能用啊？必须要用荧光显微镜吗？
作者: whitesheep    时间: 2011-12-8 14:19

请问各位老师这个应该怎样分析：

我做的中药（水煎液灌胃）对小鼠胸腺淋巴细胞尤其DNA的影响，结果出现：高剂量组头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、尾长与阴性对照组比较，有统计学意义，中、低剂量组与阴性对照组比较没有统计学意义；水煎液高、中、低剂量组TM(Tail moment，尾距)和OTM(Olive tailmoment，Olive尾距)值与阴性对照组比较，均没有统计学意义。谢谢了。
作者: 园丁##    时间: 2011-12-8 14:19     标题: 回复 #1347 ha111 的帖子

Tris应该是10mM吧~
作者: ha111    时间: 2011-12-8 14:20

谢谢更正，是笔误，现在问题已经解决了，只是视觉上感觉胶在溶解，实际上胶没事。
作者: 一叶    时间: 2011-12-8 14:26     标题: 回复 #1342 flower-201 的帖子

没做过，没有发言权，但首先要明确的是草履虫的膜结构和我们常用 的细胞一样吗？
作者: 一叶    时间: 2011-12-8 14:40     标题: 回复 #1345 小鱼鱼 的帖子

可以肯定的是，你的荧光显微镜没有调好，打开荧光的时候一定要把白光光源关掉，否则就是你说的，没有染色就是一片红.....
作者: 一叶    时间: 2011-12-8 14:40     标题: 回复 #1349 whitesheep 的帖子

TM是尾部DNA含量和尾长的乘积，尾部DNA含量和尾长有统计学意义，而乘积后就没有统计学意义了？你用的什么方法？
作者: 911    时间: 2011-12-8 14:40

现在基本能做出彗星细胞了（自认为是，因为没有人用草履虫做过）。我做的是转基因水稻对草履虫的影响。我的思路是做个阴性对照（加普通培养液），阳性对照（双氧水），还有实验组。我是每次每个小组拍50个细胞，通过统计3者的彗星细胞数，再用SPSS软件比较三者彗星细胞数的差异性。老师您觉得这样的实验思路可行吗？有没有必要再用CSAP分析细胞尾长头长的数据？
作者: fsdd817    时间: 2011-12-8 14:41

本人想做彗星实验，菜鸟一个，有些问题想请教各位大侠

1.做好的胶放到裂解液中，裂解液的体积一般是多少呢？我看到有人讲裂解液包括lysis solution，DMSO,Trion-X100，还有人讲用碱性裂解液，搞不懂是什么意思？

2.电泳缓冲液能直接买到么，还是自己配？买什么样的缓冲液呢？

请大家给我宝贵意见，多谢！
作者: 一叶    时间: 2011-12-8 14:41     标题: 回复 #1356 fsdd817 的帖子

裂解液一般都是要新鲜的，DMSO和Trion-X100是在使用前加入裂解液当中的，一般一次配个30ml就够了吧，看自己实验而定。电泳缓冲液应该是自己配的，不麻烦，买应该也能买的到。
作者: guagua    时间: 2011-12-8 14:42

本人想请教下电泳槽的问题，请大家不要见笑，我从来没接触过，可能问题会很菜。像我传的这样的电泳槽应该不行吧，如果行的话载玻片应该放在什么地方呢？实验室没有师兄师姐做这个，所以只好请各位大侠相助了。另外附一张图，桥式的水平电泳槽可以做彗星实验的电泳槽么，如果可以的话，载玻片我应该放在什么地方，应该怎么放，恳请各位给予解答，本人不胜感激。
作者: loli    时间: 2011-12-8 14:43     标题: 回复 #1358 guagua 的帖子

水平电泳槽，为什么不行？就是这个啊，第一张照片上的那种。

载玻片放在中间就好了啊。载玻片应该顺着电泳的方向水平放置的，不要歪来倒去，如果一次做几张的话，各张都应该排列整齐的靠在一起的。
作者: guagua    时间: 2011-12-8 14:44

我现在已经开始了这个实验，第一次出来了张图像，过几天传上来请大家帮忙分析下，现在遇到的问题是容易脱胶，我现在只铺一层胶，以前用96孔板盖子做的，现在换成24孔板了，结果明天见分晓，有结果再跟大家讨论。
作者: hold住    时间: 2011-12-8 14:47

我想问一下，单细胞凝胶电泳只适合做单一种的细胞吗？如果样品包含了几种不同细胞是不是不适合用彗星实验做了呢？
作者: ffooll    时间: 2011-12-8 14:49

我想问一些CASP软件的问题，我看到前面讲背景框和工作框的问题，一般来讲工作框要大于背景框，可是我做的时候就遇到些问题，如果把工作框设计的大于背景框，往往会出现一个问题，那个圆形会超过工作框的大小，而且此时的结果ltail达到50，其实DNA损伤远没有这么大，目测就能看到是个正常的细胞；但是如果工作框和背景框如果调整一下的话就会正常，我想知道的是，是不是背景框跟工作框的大小不是硬性规定，看怎么合适怎么来，另外，那个圆形是不是来圈定DNA的？
作者: 西子    时间: 2011-12-8 14:49

两位老师，我在做药物对MCF-7细胞的毒性，第一次做，做了两次，用的是EB染色，绿光观察没发现红色的细胞啊，竟是一些背景干扰，一个师兄说我的载玻片太花了，我在揭盖玻片的过程中发现总是不免会弄伤胶层得，怎么能够减少背景呢？
作者: 一叶    时间: 2011-12-8 14:51     标题: 回复 #1361 hold住 的帖子

我觉得这样没有意义。因为彗星分析的结果不能区分细胞类型。得到的结果.....
作者: 一叶    时间: 2011-12-8 14:51     标题: 回复 #1363 西子 的帖子

首先要确定是否脱胶了，要保证你的胶里面有细胞。

其实背景处理不难，缓冲液、胶要保证干净，减少杂质影响，关键在染色，染液不要太多，染色时间不必太长，染色后一定要把多余染液洗掉，否则背景很亮。
作者: 一叶    时间: 2011-12-8 14:51     标题: 回复 #1362 ffooll 的帖子

工作框、背景框还是最好根据每张图的具体情况进行调整，不必拘泥。
作者: 一叶    时间: 2011-12-8 14:52

PNAS上好像出了一篇新的关于彗星分析的文章................

彗星分析的发展新趋势..............

cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20534572')

Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays.
作者: 乌贼老弟    时间: 2011-12-8 14:52

有一款英国的专做SCGE的仪器，使用起来比较方便。

comet-40
作者: 四福晋    时间: 2011-12-8 14:53

我是第一次接触彗星实验，也没有人可以带我，都是自己一个人摸索。我做了好多次了，结果都不行，请大家帮帮忙，小妹在此先谢谢了。我是这样做的：
铺第一层胶：0.8%NMPA ，但我是用的普通载玻片，不是用枪铺的，是直接将玻片放入到胶中；
第二层胶：50μ（0.75%LMPA ）+25μl细胞悬液，
裂解液：Na2EDTA 18.61g、Tris 0.61g、NaCl 73g、NaOH4g溶于445ml水，临用前加1%Triton X-100 、10%DMSO ，调PH至10.
电泳液：Na2EDTA 0.372g、NaOH12g溶于1000ml水
裂解1.5h.解旋30min,25v、300mA电泳30min.


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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9784

作者: 四福晋    时间: 2011-12-8 14:53

做了好多次，只有两次看见明显的彗星细胞了，但是后来每次做出来的都感觉像凋亡细胞。即使是头大的细胞尾也不是成梭形的，是往外发散的，圆圆的。细胞形态也不是很规则，感觉头不圆。我现在都不知道那到底是不是彗星细胞了,感觉尾长只有一点点。我的试剂都是新买的。我有考虑到是不是剂量上大了的问题，但是在低剂量中还是有这样的情况。还有就是我的受试物可能有促进凋亡的作用。我用0.1mmol/L的重铬酸钾做阳性对照也不能出现全拖尾，想请大家帮我看看到底是哪出问题了，我实在是想不出来了。下面是我做的图，请大家帮忙分析分析，谢谢了。

图片附件: 30919424.snap.jpg (2011-12-8 14:53, 241.84 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9785

作者: 四福晋    时间: 2011-12-8 14:54

3~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

图片附件: 32052303.snap.jpg (2011-12-8 14:54, 202.71 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9786

作者: 四福晋    时间: 2011-12-8 14:54

4~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9787

作者: 四福晋    时间: 2011-12-8 14:54

5~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

我是想用彗星实验做DNA的损伤。

图片附件: 50298004.snap.jpg (2011-12-8 14:54, 200.56 KB) / 该附件被下载次数 5
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作者: 中国特色    时间: 2011-12-8 14:55

你所有的胶都用PBS溶的吗，你最好在第一层跟第二层之间加一层.0.5%的低琼脂，你再试试。
作者: 一叶    时间: 2011-12-8 14:55     标题: 回复 #1371 四福晋 的帖子

我觉得你的图挺好的呀？背景很好，彗星图像也很清晰。很棒。
作者: 四福晋    时间: 2011-12-8 14:56

我的第2、4、5张图片上的那些发散的也都是DNA损伤的细胞吗？是不是细胞不一样，跑出来的尾不一定都是平行向右拖了，可以有发散的呢，尾后圆圆的也是可以的吗？或者说是有什么原因导致成发散状了。谢谢了。

作者: 四福晋    时间: 2011-12-8 14:57     标题: 回复 #1374 中国特色 的帖子

中国特色:
你好，我想请问一下，你说的在第一层跟第二层之间加一层.0.5%的低琼脂的目的是什么了？还有就是我的胶都用PBS溶的。谢谢！
作者: 中国特色    时间: 2011-12-8 14:57

我觉得：细胞层在没有凝固的时候，细胞会由于重力作用沉到胶底，会到第一层里面。这样细胞就不是在0.5%的胶里跑了。如果中间加一层0.5的胶能解决这一问题。你可以试试嘛 ，下次做的时候可以多做两张片子，就加铺一层，反正也不耽误时间。我给你看一下我做的拖尾.

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作者: 中国特色    时间: 2011-12-8 14:57

再来一张拖尾长的

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作者: BUK    时间: 2011-12-8 14:58

最近作了次彗星实验 发现把胶跟细胞悬液混合后滴在片子上 然后我用光镜下看 怎么看的都是一块块的胶呢 满视野都是 根本分不清哪个是细胞了
作者: duoduo    时间: 2011-12-8 14:58


我是订的北京博乐通公司的试剂盒 里面的载玻片已经铺好了第一层胶了 我用光镜看了一下 镜下胶很明显 满视野都是玻璃晶体样的胶 我再铺细胞悬液跟胶混合的第二层 拿到光镜下看 还是只能看到胶 完全分不清细胞是哪个了 不知道应该怎么办是好 之前见这帖子30多页有位战友发了光镜下的 背景颜色很淡 细胞很明显
作者: 中国特色    时间: 2011-12-8 14:59     标题: 回复 #1381 duoduo 的帖子

你是不是焦距没调好，耐心调一下
作者: 小螺号    时间: 2011-12-8 14:59

最近想做单细胞凝胶电泳，能不能问一下，各位做的微电泳槽 的尺寸？ 看起来一叶老师的是 1.5cm*1.5cm的，但槽子的深度一般是多少？ 比较高的话 有影响吗？ 还有 什么胶好一些？好像有人用 AB胶，有人用 玻璃 胶，
作者: loli    时间: 2011-12-8 15:02     标题: 回复 #1383 小螺号 的帖子

一叶老师是把玻片切割下来围成槽子的，因此玻片的厚度基本就是槽子的深度了。用什么胶区别应该不大吧，只要不漏易清洗就好了呀，反正也不贵，可以先买来试试看的。我没有用过微电泳槽
作者: 小螺号    时间: 2011-12-8 15:02

请问用哪种水平电泳槽比较好？是不是六一的就可以了？
作者: 蒲公英    时间: 2011-12-8 15:03

再次请教，在使用 casp 分析电泳图像的时候发现，对于比较好的图片，选择分析区域 对于 头部及尾部 DNA所占百分比影响不大，但是对于 尾长，尾距以及 olive 尾距 影响都很大，请问这是为什么呢？ 还有，在选择分析区域的时候应该注意什么，或有什么原则？
作者: @STAR@    时间: 2011-12-8 15:03


请问单细胞凝胶电泳一般一次电泳可以做几块胶（玻片）？谢谢
作者: dotaaa    时间: 2011-12-8 15:04

近一段时间都在做碱性彗星电泳，细胞系是人肺癌H1299，贴壁细胞。处理因素为MNNG（一种DNA烷化剂）。

裂解1.5h，电压25V，电流100mA，时间20min，PI溶液染色。

但是每次未处理组结果都有很长拖尾，基本跟处理组一样，而且个处理组之间基本无差异，都是严重拖尾。而且形状并非彗星形，而是羽毛球形的，好像反了一样。

我改变过很多条件，电压、电流、裂解时间、电泳时间，但结果依然如此。所以极度困惑。。。

我们实验室细胞间都用移液枪，是不是处理细胞过程损伤了？顺便问下处理操作细胞制成悬液时需要避光么？还有电泳的时候，是不是光损伤造成的?

还请楼主老师不吝赐教啊！！！

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作者: 一叶    时间: 2011-12-8 15:04     标题: 回复 #1388 dotaaa 的帖子

看图不太像是DNA跑出来的，裂解、解旋用的什么条件？
作者: 盼盼    时间: 2011-12-8 15:05

我想问一下abc816老师，最近一直在做大鼠精子的彗星实验，但是做完的片子还能看到隐约的精子形态，不是呈现圆形，另外有时图像边缘很毛糙，我觉得应该是细胞裂解的问题，我的方法是铺好的玻片在裂解液里处理4°C，1小时，然后在加了蛋白酶K的裂解液里再处理37°C，3小时。我看到有些文献里蛋白酶K的处理过程要15小时，不知道是不是裂解的时间不够，但是15小时过长，我担心脱胶。另外，也有可能是蛋白酶K液的配制问题，我把配好的蛋白酶K液体直接加入裂解液里，会不会溶解不均？老师能不能发一个你做的protocal让我参考一下，谢谢了。

作者: 盼盼    时间: 2011-12-8 15:06

还有一个问题就是，37度3小时的处理过程一般都是怎么做的，我是把玻片放在裂解缸里，然后裂解缸放在37度水浴锅里，盖上盖子。有些文献里还提到了一个转速问题，不知道是怎么实现的。
作者: windy+++    时间: 2011-12-8 15:06

我想请问下各位大师，你们好，最近开始做彗星实验，做了两个月了，尝试了各种方法，把能变的条件都变了，但是基本每次裂解完，就找不到东西了，你们那里谁方便能不能让我们去学习一下。
作者: tianmei001    时间: 2011-12-8 15:06


你好，我想请问一叶老师，做中性SCGE时，采用解旋液PH13，对双链DNA有影响吗？EB染色后多长时间可以镜下观察？谢谢
作者: tianmei001    时间: 2011-12-8 15:07


我的意思是PH13会不会使DNA双链变为单链，变成检测DNA単链断裂了？我按照您的方法制作了微电泳槽1.5*1.5cm, 100ul的胶好像不够铺的，如果加盖盖玻片，又没有大小合适的盖玻片，玻璃刀划不出大小合适盖玻片。我想请教您有没有好的方法解决？谢谢
作者: 分子式    时间: 2011-12-8 15:07


大家好，刚开始摸索单细胞凝胶电泳实验，想问个问题，电泳的环境一定要4摄氏度吗？谢谢！
作者: 分子式    时间: 2011-12-8 15:08


老师，您好，学生最近在做单细胞凝胶电泳，遇到些问题，希望您能给予指导，我做的是重金属对泥蚶DNA损伤影响，细胞悬液直接抽取泥蚶的血做一些过滤，后面经裂解，电泳，中和，染色，荧光显微镜下只看到一片红，什么都没有，老师有做过相关的实验吗，是不是血中红细胞数多，所以都裂解了？什么都没了。可是我有看过有做血液的单细胞凝胶文章。这怎么回事，希望老师给予指点
作者: @STAR@    时间: 2011-12-8 15:09


我也做了一段时间了，彗星图像还可以，但是难以忍受每次都有很多脱胶了，真不知道为什么，我用的磨砂载玻片，双层胶，知道裂解完都不会脱胶，但是缓冲液加进去一会儿就脱胶，找不到原因 ，好难过啊，有没有知道的前辈帮帮我啊？
作者: 分子式    时间: 2011-12-8 15:10

老师您好，看过您发的关于彗星实验帖子，对我有很大的帮助，现在遇到些问题，我想咨询您一下，我做的是重金属对泥蚶DNA损伤，做的是血细胞，图片在下面，可是一直没有彗星拖尾现象，不知道什么原因，希望老师帮助分析下。谢谢！具体的步骤是

第1层凝胶的制备：加热熔解的正常熔点琼脂糖，冷至45-60℃，取100μL铺于载玻片上，盖上干净的盖玻片，置4℃下10min使琼脂糖凝固。

第2层凝胶的制备：将10μL细胞（约 104个）和75μL的0.7%低溶点琼脂糖（在37℃水浴加热30min使之完全溶化）混合均匀。然后，迅速将含细胞的低溶点琼脂糖滴到第1层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片，置4℃下10min使第2层琼脂糖凝固。

3．细胞裂解： 移去盖玻片，将载玻片置于平皿中,倒入预冷的裂解液， 4℃裂解1～2h，取出载玻片用PBS漂洗。裂解液配方是

2.5 m m o l/L N a Cl 146 .1g
100 mmol/L EDTA2NA .2H2O 37.2g
10 mmol/L Tris 1.2g
用NaOH调PH=10
1%肌氨酸钠 10g
用去离子水定容至890ml.120摄氏度高温灭菌，为贮备液，4度保存 实验前至少一小时进行细胞液裂解应用液的配制:加1%)Triton X-100和10%DMSO，冷藏。

4 解旋和电泳

将玻片放在电泳液：Na2EDTA 0.372g、NaOH12g溶于1000ml水 中4度解旋半小时，然后电泳，条件为25V，300MA，30min
5 中和 tris pH7.4中和15min
6 20ug/ml EB染色，观察。


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作者: 白白的    时间: 2011-12-8 15:11

我已经做了4轮的Cometassay ，可每次做出来都不尽人意，虽说最后一次结果基本可以，组间差别也行，可为何有时我跑出来的尾不是水平的,而有点倾斜呢？

图片附件: 92688338.snap.jpg (2011-12-8 15:11, 94.3 KB) / 该附件被下载次数 5
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作者: 969    时间: 2011-12-8 15:12

您好！很感谢您的这个专题讨论，让我从中学到了不少东西，可是我有几个问题要向您请教。
1、我跑的电泳为何有的拖尾是斜的，这应该不是我的切片放斜了的缘故，因为即使同一张玻片也是有的斜，有的不斜呐。
2、我要检测的是一种中药对照射引起的DNA损伤的协同效应，不知道这应该用中性电泳好还是碱性电泳好，一般认为中性检测的是双链DNA，碱性检测单链DNA（主要从您的专题中学到的），是不是目前观点有所更新，认为碱性既可检测单链也可检测双链呀？因为我们实验室跑cometassay的电泳仪的说明书是这样写的。而且我两种都试了，感觉碱性的跑出来漂亮些，可我老板坚持认为应该用中性的。不知道怎么搞了。
还请一叶老师或者其他弟兄姐妹能帮我解答。小妹不甚感激
作者: 克隆鱼    时间: 2011-12-8 15:16

请问楼主老师
我做的彗星电泳未处理组细胞也有较大拖尾。我的裂解液和解旋液都是滴几滴在胶上的，并没用将片子整个泡在里面，是不是这样所以细胞没用得到迅速裂解，而产生凋亡了呢？
裂解液：
2.5 m m o l/L N a Cl 146 .1g
100 mmol/L EDTA2NA .2H2O 37.2g
10 mmol/L Tris 1.2g
用NaOH调PH=10
为贮备液，4度保存 实验前至少一小时进行细胞液裂解应用液的配制:加1%)Triton X-100和10%DMSO，冷藏。
裂解1.5h后，Tris-HCl洗涤。
解旋:
在玻片上滴加电泳液：
Na2EDTA 0.372g、NaOH12g溶于1000ml水中 ，pH=13
4度解旋半小时
作者: 西子    时间: 2011-12-8 15:17


想问一下哪儿有公司代做这个实验的 我实验室条件不够啊
作者: 生物迷    时间: 2011-12-8 15:18

前几天做了下预实验，很高兴能看到图，一天的实验总算是没白做，想请教各位大虾一些问题
第二张图中的圆点比比一般的大，不知道是什么原因啊，大多数出现的都和第一张的图片差不多
第三张图有点糊，不知道是不是胶太厚了
以前都没用过荧光显微镜的，希望大家帮帮忙解决下问题

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作者: 生物迷    时间: 2011-12-8 15:18

前几天做了下预实验，很高兴能看到图，一天的实验总算是没白做，想请教各位大虾一些问题
第二张图中的圆点比比一般的大，不知道是什么原因啊，大多数出现的都和第一张的图片差不多
第三张图有点糊，不知道是不是胶太厚了
以前都没用过荧光显微镜的，希望大家帮帮忙解决下问题

图片附件: 72210924.snap.jpg (2011-12-8 15:18, 6.49 KB) / 该附件被下载次数 2
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作者: 生物迷    时间: 2011-12-8 15:18

前几天做了下预实验，很高兴能看到图，一天的实验总算是没白做，想请教各位大虾一些问题
第二张图中的圆点比比一般的大，不知道是什么原因啊，大多数出现的都和第一张的图片差不多
第三张图有点糊，不知道是不是胶太厚了
以前都没用过荧光显微镜的，希望大家帮帮忙解决下问题

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9796

作者: wu11998866    时间: 2011-12-8 15:20

最近想做单细胞凝胶电泳，实验室之前没有人做过这方面的，想请问一下可不可以在载玻片上铺胶，然后把载玻片放到跑蛋白凝胶电泳的电泳槽里电泳？谢谢各位了
作者: glass    时间: 2011-12-8 15:21

最近在做单细胞凝胶电泳，遇到几个问题：
1.单细胞凝胶电泳碱性电泳液是检测双联损伤，单链损伤还是两个都会检测到呢？
2.为什么我的图形拖尾像伞一样呢？我们老师说这个不是损伤。会不会是因为损伤类型不同或者损伤剂量不够大啊？
下面是我的几张图片，希望大家给点建议，谢谢：这是SYBR GREEN I染色的。

图片附件: 96443605.snap.jpg (2011-12-8 15:21, 30.77 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9797

作者: glass    时间: 2011-12-8 15:21

补充一个问题：
铺第二层胶压盖玻片时，细胞老被压到边缘，中央检测时就比较少了，这个问题如何处理呢？

图片附件: 78293554.snap.jpg (2011-12-8 15:21, 23.57 KB) / 该附件被下载次数 5
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作者: HP007    时间: 2011-12-8 15:21

呵呵，各位老师：你们好，我想清问一下我从动物组织中取的细胞，新鲜组织还可以看到细胞，但在-20度条件下放了几天做出的结果就什么也看不到了，不知道应该怎么保存，细胞是否一定要是活的呢？
作者: 月牙牙    时间: 2011-12-8 15:22

今天第一次做单细胞凝胶电泳，从上午九点一直忙到现在细胞刚刚裂解，还好胶没凝，这点还是很高兴的。我打算做脑胶质瘤细胞放疗后DNA损伤，时间点是照过之后即刻、照后0.5h、照后6h、照后24h，照光我要把细胞从实验室拿到医院，单程最少半个小时。照过之后即刻的这个时间点我觉得很难操作，我打算把细胞放在冰上，运回实验室，收获后放4℃冰箱和0.5h时间点一起做实验，不知道影响大不大？各位师兄师姐有没有更好地建议？谢谢了！
作者: zhezhe    时间: 2011-12-8 15:22


各位老师好！我做单细胞凝胶电泳好几次了，一直都没有成功，现在最大的问题是，跑完电泳在显微镜下观察时，胶都烂成一块一块的了，我所用的低熔点琼脂糖似乎已经变质了，是不是跟这个有关？我用的是Life Sciences的Agarose L.M.P，这种胶是不是不太好，这是我实验中遇到的最大问题了，很着急啊，做实验这么久都没成果，希望各位给我一些建议，十分感谢！



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