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标题: 如何提高qPCR反应的灵敏度与特异性？ [打印本页]

作者: dealer 时间: 2018-3-8 09:06 标题: 如何提高qPCR反应的灵敏度与特异性？

1. 首先确定模板RNA完整性好，无DNA污染。

2. RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。

3. 为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。

4. 使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。

5. 若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。

6. 设计引物时，避免在引物3’端含有互补避免形成内部发卡结构。

7.可选用engreen的qPCR试剂，选用化学修饰的热启动酶，扩增效率和灵敏度更高。

作者: 17685573913 时间: 2018-3-26 08:42

要想解决这个问题，首先要了解定量pcr的定义。其包括反转录和qPCR两个步骤，所以要提高反应的灵敏度和特异性，就需要从这两个步骤入手：首先RNA模板要完好，无污染。防止模板降解或者含有其他杂质；其次，在PCR设计过程中，引物的设计很关键，建议用软件设计或者让有经验的人帮忙。还有需要的酶和反应程序都需要摸索。

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