标题:
包涵体蛋白的纯化策略
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作者:
17685573913
时间:
2018-3-12 09:21
标题:
包涵体蛋白的纯化策略
楼主最近计划用大肠杆菌表达体系表达包涵体蛋白,用于实验动物免疫来获取相应的多克隆抗体。听闻包涵体蛋白的复性是一个策略与经验并存的过程,也是一个及其复杂的事情。故在此想请各位高手能不能提供一些比较好的复性方法和经验。之前做过两个变性蛋白的复性,复性效果不好的话用于实验动物免疫,产生的
抗体
含量很低!谢谢各位!
作者:
Kiwi2021
时间:
2022-5-5 12:45
感谢楼主分享
https://168won.com/view/zsh/index.html?lottype=sgAirship
作者:
chenzhen2016
时间:
2023-6-8 14:38
包涵体蛋白的纯化是分子生物学和生物工程中的关键步骤之一。包涵体是大肠杆菌表达系统中的一种常见表达产物,其纯化策略对于后续的功能研究和应用具有重要意义。本报告将介绍一些常用的包涵体蛋白纯化策略,以帮助楼主有效地纯化目标蛋白。
一、细胞破碎和包涵体溶解
细胞破碎方法:常用的方法包括超声波破碎、高压破碎、乳化剂破碎等。选择适合的细胞破碎方法,以高效地释放包涵体。
包涵体溶解条件:选择适当的溶解缓冲液和条件,如Tris-HCl缓冲液、尿素或胍等变性剂,以促进包涵体的溶解。
二、包涵体蛋白的分离和富集
亲和柱层析:利用融合标签或特定亲和剂与目标蛋白相互作用,如His标签、GST标签等。通过柱层析纯化包涵体蛋白,并通过洗脱步骤得到高纯度的目标蛋白。
钠剖析层析:利用钠离子与包涵体蛋白中的DNA/RNA结合,形成蛋白-钠-DNA/RNA复合物,通过柱层析分离包涵体蛋白。
逆流层析:根据包涵体蛋白在逆流条件下与柱填料的亲和性差异,通过逆流层析分离包涵体蛋白。
三、包涵体蛋白的纯化和再折叠
超滤和凝胶过滤:通过超滤或凝胶过滤技术,去除杂质和小分子化合物,进一步富集包涵体蛋白。
再折叠和复性:对于失去天然构象的包涵体蛋白,可以通过温度梯度、缓冲剂和还原剂等条件进行再折叠和复性。
四、包涵体蛋白的纯化验证和储存
SDS-PAGE和Western blot:利用SDS-PAGE分析纯化后的包涵体蛋白的分子量和纯度,通过Western blot确认目标蛋白的存在。
储存条件:包涵体蛋白的长期储存应在低温(-80°C)下,避免反复冻融。
包涵体蛋白的纯化是一项关键的实验步骤,可以通过细胞破碎、包涵体溶解、亲和柱层析、钠剖析层析、逆流层析等策略实现高效的纯化。在纯化过程中,应注意包涵体蛋白的再折叠和复性,以获得具有活性和稳定性的目标蛋白。通过适当的验证方法和储存条件,确保纯化的包涵体蛋白的质量和稳定性,为后续的实验和应用奠定基础。
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本帖最后由 chenzhen2016 于 2023-6-8 06:43 编辑
]
作者:
chenzhen2016
时间:
2023-6-9 14:54
感谢分享!
作者:
chenzhen2016
时间:
2023-6-9 14:54
感谢分享!
作者:
chenzhen2016
时间:
2023-6-9 15:25
独特小吃“嗍丢”惊现夜市!
作者:
chenzhen2016
时间:
2023-6-10 10:29
独特小吃嗍丢惊现夜市!
作者:
chenzhen2016
时间:
2023-6-10 10:29
独特小吃嗍丢惊现夜市!
作者:
chenzhen2016
时间:
2023-7-26 16:33
复性是将包涵体中的变性蛋白重新折叠成其正确的三维结构的过程,确实是一个复杂的步骤。以下是一些常用的包涵体蛋白复性的策略和经验:
1. 缓冲液的选择:选择适当的缓冲液对于复性非常重要。常用的缓冲液包括Tris-HCl、PBS、HEPES等。此外,添加还原剂(如DTT)和氧化还原剂(如GSH和GSSG)可以帮助促进蛋白的正确折叠。
2. 温度和时间:复性的温度和时间是需要优化的参数。一般情况下,温度会在4℃到30℃之间进行尝试。时间方面,较长的复性时间可能有助于更多的蛋白折叠,但也需要避免过度折叠导致聚集体形成。
3. 溶剂和助溶剂:添加适量的溶剂(如尿素或胍盐)和助溶剂(如甘油)有助于维持蛋白的溶解性,并促进折叠。
4. 渗透剂:添加一些渗透剂(如PEG)可以增加包涵体蛋白的折叠效率。
5. 逐步稀释法:在复性过程中,可以采用逐步稀释法,即将变性的包涵体蛋白逐渐稀释到复性缓冲液中,有助于避免快速折叠造成的聚集体形成。
6. 低温复性:在较低温度下进行复性(如4℃),可以有助于避免非特异性聚集体形成。
7. 常规检测:在复性后,可以使用SDS-PAGE、Western blot或CD光谱等方法来检测蛋白的折叠状态和纯度。
8. 应用辅助蛋白:有些包涵体蛋白复性难度较大,可以尝试添加辅助蛋白或分子伴侣来帮助蛋白正确折叠。
以上是一些常用的包涵体蛋白复性策略和经验,但需要根据具体蛋白的特性和实验条件进行优化。复性是一个需要耐心和实验反复验证的过程,希望这些策略对您有所帮助。祝您成功地获得高质量的多克隆抗体!
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