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标题: [讨论帖]“黑胶虫”问题 [打印本页]

作者: vvmmoy 时间: 2011-12-8 15:27 标题: [讨论帖]“黑胶虫”问题

[讨论帖]“黑胶虫”问题（转载）

有关细胞技术的热门话题——“黑胶虫”问题

1.我们实验室最近一次的情况:
我们前后从上海细胞中心买了三批细胞，细胞刚到的时候，观察均生长良好，密度适中，培养液清亮，也没有见小黑点，但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点，有时候在一夜之间暴长，给培养液加庆大霉素，也无济于事，对贴壁细胞用生理盐水及D-hanks液冲洗七遍后见减少，但是随后几天又出现，刚开始怀疑操作有问题，但是由有经验的老师操作也出现这种问题，陆续对培养液，血清及胰酶进行培养也没发现问题。
同时培养箱也有本实验室保存的3t3细胞进行培养，生长快，很快铺满，仔细观察也可以见到少量的黑点。
后来还有从军科院过来的Hela细胞，没有使用我们的血清，直接吸出多余的培养液后，进行培养，传代后用原来吸出的培养液进行培养，同样发现了问题。
可以发现如下的特点：
（1）  与细胞共生，细胞长的好或密度大的话，小黑点就少，反之则多；
（2）  对抗生素无效；
（3）  可能通过培养箱空气进行污染；
（4）  单用培养液及血清培养没发现问题。
（5）  换掖冲洗后也无效。

以下是论坛里我找来的相关帖子内容
“黑胶虫”是近十几年才发现的一种细胞污染物，“黑胶虫”的分类目前尚无鉴定确认。
“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，开始时对细胞并没有什么影响，但当黑胶虫的数量多到一定程度的时候，细胞生长就会受到影响直至死亡，严重影响了科研活动的开展和进行。所以“黑胶虫”的污染常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。
目前比较公认的观点认为“黑胶虫”是一种微生物，增殖缓慢但对细胞有损害，数量达到一定程度可引起细胞死亡，其来源可能是细胞本身的污染或从动物取材时污染造成的。该污染在全世界细胞实验室中普遍存在，解决该问题是一个世界性难题
关于是什么的问题的讨论
A.  玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西（曾经有文献报道过）
B.  据说这是黑胶虫，又有人说是原生动物，好象也没个统一的说法
C.  据病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。
D.  有人说是纳米级的细菌

其他的特点
（1）形态上有些像细菌，直径约在0.5~1微米，
（2）在400X倒置显微镜小，有典型的布朗运动（不规则的原地小距离抖动）。
（3）细胞内好像也有存在，
（4）但并不引起培养液混浊
（5）时间稍长，细胞状态明显恶化，并最后死亡

大家的处理：
1.换好一点的血清（我觉着和血清的关系不大）。
2.如果是贴壁细胞的话，可用无菌的PBS洗几次，可一定程度上缓解。若是悬浮的话，就不太好处理拉，可以向其中少加一点滋养细胞（从小鼠腹腔内取的巨噬细胞，这种细胞不分裂，过一阵就死掉了，做抗体杂交瘤融合的同志肯定知道）。加滋养细胞对有黑胶虫的刚复苏的细胞很有效！还有就是实验环境要注意好，保持细胞间整个环境的洁净度。
3.换用进口的一次性塑料培养瓶。
4.建议清理无菌室所有物品，重新灭菌，用KMnO4熏蒸，按首次使用无菌室做，细胞重新复苏，。
5. 在换液前先加入生理盐水并轻轻拍打，冲洗干净后再加入培养液，坚持天天洗，传代时加生理盐水再离心一次，接种密度稍大一些，一段时间后，虫子就会大大减少，对细胞的生长也不会有大的影响。
6.有材料称minocycline具有一定的作用，可以和换液结合起来使用。

作者: 彼岸花opp 时间: 2011-12-8 15:28

最近培养的Hela细胞，经住了考验，小黑点变的细碎，也不在动了，但是还有一个细胞株仍然存在问题！附上照片，10×20

图片附件: 42887468.jpg (2011-12-8 15:28, 13.85 KB) / 该附件被下载次数 12
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9799

作者: 园丁## 时间: 2011-12-8 15:28

杀黑胶虫培养基在这里有卖 , 中国医学科学院肿瘤研究所肿瘤生物学检测中心cuturl('http://www.cicams.ac.cn/marker/service.htm')

作者: 中国特色 时间: 2011-12-8 15:29

很难根除。

最好的办法就是舍弃并进行全面的熏蒸杀菌

我们实验室也污染了一次，后来熏蒸了一个星期，换气也用了1个星期，后来就好了，期间我也用什么换血清等方法弄过，不过作用不大，过几天那个又多了。呵呵

还是彻底的消毒一次好啊。

作者: loli 时间: 2011-12-8 15:29

我近期培养的细胞中也发现类似的东西, 不知是不是黑胶虫污染, 曾经将其涂片及细菌接种均没发现细菌, 但我的细胞状态不好, 有较多碎片.

请教对实验室全面消毒必须用熏蒸吗?我用新洁尔灭擦洗后再用紫外线照射不可吗? 实验进展严重受阻了.

作者: duoduo 时间: 2011-12-8 15:31

你怎么知道它不是支原体污染呢？应该首先进行支原体的检测。黑胶虫之说很难让人信服。

作者: pengke1983 时间: 2011-12-8 15:32

我的细胞也遭此大难，状态不好，看了感觉很有帮助，谢谢！

作者: DNA 时间: 2011-12-8 15:32

同感同感！我们试验室的细胞全面染菌，像极了“黑胶虫”，这家伙很顽固，那都有，我们都无从下手了，上面说过它的直径是0.5-1微米的话，用0.22的滤膜应该能滤掉呀，我在刚买的血清空培养中发现了它，现在根本不敢复苏细胞，快疯掉了

作者: ha111 时间: 2011-12-8 15:33

各位战友:
我是进行海马神经元培养的,也发现在培养的后期开始出现黑色点点,而且不像是死细胞,应为是成大片状,根据上面所描述的有可能是黑胶虫感染,想问问是不是与培养箱污染也是有关的?经常打扫培养箱能根除吗?

作者: 铜雀 时间: 2011-12-8 15:33

啊！我们实验室也遭过的！但是同一个培养箱里有的有，有的没有，不知道怎么回事！

作者: one 时间: 2011-12-8 15:33

可能就是所谓的黑胶虫，我们实验室昨天刚发现这种情况，细胞消化离心后，在离心管底部肉眼都能清楚地看到黑色的颗粒！
不知道该怎么做才好

作者: 小鱼鱼 时间: 2011-12-8 15:34

我养的内皮细胞也发现了类似的现象，我估计是这个问题，有很多小小的黑色颗粒，因为我买的血清是国产四季青的，我决定换成paa的，看是否还有问题

作者: 月牙牙 时间: 2011-12-8 15:34

我养的是PC12细胞里面也有好多小片片黑色的。可是又复苏一枝还是有，细胞现在长得很慢，不知是不不是这原因

作者: lixi559 时间: 2011-12-8 15:35

我养的人的肝细胞也出现类似上面楼主说的“黑胶虫”。自己的观察和楼主还是有点区别：我用条件培养基(不含血清和二抗)长期培养细胞，每两天就更换，新配的培养基。在培养一个星期就出现类似“黑胶虫”的东西。胞浆和上清中均有那种东西，换液以后好像澄清了一点，第二天又出现了，这东西对细胞的生长也有些影响，细胞有的脱落死掉了。因为培养时间不久，还不知道是细胞在培养的过程中本身的原因还是黑胶虫的的影响。可以肯定可以和细胞共生。奇怪的是：我在用含血清（PAA公司小牛血清）培养基作对照的六孔板中发现，那上清中却是澄清的，三个复孔也是澄清的。
1.当时怀疑是我是不是没加二抗的原因，后在条件培养基中加入二抗以后，发觉效果还是不明显。
2.怀疑是不是条件培养基本身就含有那东西，于是将一部分培养基也放入培养瓶中培养。也没发现有那东西。
最后个人的结论：这种东西在可能本身就寄生于人和动物的细胞内。二抗对其效果不明显。血清中可能存在有一种物质可以抑制其生长。细胞离开特有的免疫环境，很多被抑制生长的，寄生于细胞内的生物就开始生长，这种情况类似于HIV感染引起的感染一样。
解决的办法也是很迷漫。至今也没什么办法。
在和群友们的的交流和学习中找到对付这种黑胶虫的办法。

作者: 泡泡 时间: 2011-12-8 15:35

我现在有点怀疑是不是支原体污染，今天我做了一个小小的测试，把不加任何细胞的培养液在加到一个小皿中，同时穿了一瓶被污染的细胞，6小时后观察，只有传代的有小黑点在动，只加培养液的小皿里面没有，我想这已经说明不是血清的问题，是不是也说明不是黑胶虫污染，而是支原体的问题呢？

作者: 泡泡 时间: 2011-12-8 15:35

作了一个小小的测试，又感觉不是黑胶虫污染了而是一般的支原体什么的，测试如下：
我把新鲜的培养液加到一个小皿里面，里面不加任何培养物，6小时后观察，结果没有小黑点出现，而传入细胞的那一个一定有了？这是不是说明血清没有污染，也间接的说明不是黑胶虫污染呢

作者: ffooll 时间: 2011-12-8 15:36

我养的细胞也出现了你说的情况,老师说使衣原体感染,可是不知道怎么检测是衣原体感染?老师没说我也不知道.能告诉我吗?谢谢了!还有啊我分别培养了胰酶和培养液感觉培养液里有了,可是别人和我用的是同一种培养液怎么没事呢?好奇怪啊!!

作者: vvmmoy 时间: 2011-12-8 15:36

有关血清使用中的常见问题解答

有关血清的问题，数十年来我们始终面临的是同样的问题。因此，我们特别整理了一些实验室里常会遇到的问题，供大家参考：

1.保存血清最好的办法？

我们建议血清应保存在-5℃至-20℃。若你一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

2.如何解冻血清才不会使产品质量受损？

我们建议您将血清从冷冻箱中取出后，先置于2-8℃冰箱中使之溶解，然后在室温下使之全溶。但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。

3.血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理？

血清中沉淀物的出现有许多原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性造成的；而血纤维蛋白（形成凝血的蛋白之一）在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成血清沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。

若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管中，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。

4.何谓热灭活？有必要做热灭活吗？

一般以56℃，30分钟来处理已解冻的血清，因为此加热步骤，可以使补体去活性，而补体所参与的反应有：溶细胞活性，平滑肌的收缩，肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用，淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。

实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经过处理的血清对细胞生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。

而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者认为是微生物的分裂扩增。

因此我们建议您，若非必须，您可以不需要做热灭活这一步。如此以来，不但节省您宝贵的时间，更确保您血清的质量！

5.如何避免沉淀物的出现？

我们建议您在使用血清的时候，注意正确的血清解冻步骤，并尽量避免灭活血清及长时间的将血清置于高温环境中。

来源：cuturl('http://www.perbio.com.cn/Hyclone/page/note.htm')

作者: vvmmoy 时间: 2011-12-8 15:37

我认为所谓”黑胶虫“应该是血清中的物质在热灭活后形成的聚合物，在常温下做无规则的布朗运动，看上去像虫子而已。因为血清中的营养物质聚合，变得不能被细胞利用，所以细胞失去营养支持，逐渐”状态不好“，甚至死亡。

作者: 爱老虎游tt 时间: 2011-12-8 15:37

我的细胞昨天下午观察时，在培养基中也观察到了做布朗运动的“小黑点”。
今天看了群友们的帖子，有了进一步的了解。
可是，我到底该如何解决呢？
有没有明确的解决方案呢？

作者: wu11998866 时间: 2011-12-8 15:38

这些天正为这些“小黑点"烦恼,细胞状态明显变差.变圆,脱落。悬浮细胞也有同样问题。今天重新复苏，看一看。谢谢各位了！

作者: 克隆鱼 时间: 2011-12-8 15:38

我的细胞也是在前一段时间出现问题，不长，变圆，脱落
最近将原来用过的全换了，重新复苏，细胞状态还是不好，已排出血清问题
真是挠头

作者: tieshazhang 时间: 2011-12-8 15:38

我也遇到这样的问题,不知怎么回事?细胞长的好慢

作者: loli 时间: 2011-12-8 15:39

这种事情我也遇到过，我认为是支原体污染，一旦发现污染则只能丢弃细胞，并将培养室全面熏蒸，才能保证以后不出现问题。

作者: 园丁## 时间: 2011-12-8 15:39

“最后个人的结论：这种东西在可能本身就寄生于人和动物的细胞内。二抗对其效果不明显。血清中可能存在有一种物质可以抑制其生长。细胞离开特有的免疫环境，很多被抑制生长的，寄生于细胞内的生物就开始生长，这种情况类似于HIV感染引起的感染一样。”
我观察到的现象和群友一样，我养的是u251细胞，刚开始养在皿里面的时候有双抗有血清，生长很好，两天传代一次，之后我就开始铺在12孔板作转染，作转染的时候我们是换无血清无双抗培养基，而且转染之后不换液培养48h，结果全面污染了，我想可能是操作有问题，重复了一次又失败，我觉的我手气不好，就另请同学做了一次，铺板转染全是她做的，结果也是全面污染，我想是不是因为在皿里面养的时候一直加双抗抑制了细菌的生长，有隐性污染，我就换了无双抗有血清的培养基培养细胞，结果还是长得好好的，两天传代，一点问题都没有，我想做转染唯一换了条件的就是换成无血清培养基，那些细菌一样的东西就出来了，后来我就把皿里面的培养基换成双无只1640的培养基，结果24小时之后，那些东西就按耐不住，全钻出来了，我也觉得它们是寄生在细胞里面的，就像人体的寄生虫一样，血清撤掉了，没有营养了，它们饿了就全钻出来了，说得比较通俗，见笑，我被这株细胞搞得心慌慌的，也不敢动其他细胞了，害怕造成交叉污染。这种东西藏的很好，细胞正常培养是一点问题都没有，好的不得了，混在好细胞当中，要是他把别的细胞给污染了，我就要气死了。最后他全面释放出来的时候像是细菌污染，因为培养基变浑浊了，细胞全都死了，它密密麻麻繁殖了很多，浮在培养基上。我也搞不清楚到底怎么回事，也没有办法解决，仅提出自己的实验现象供大家参考。

作者: 缘yuan 时间: 2011-12-8 15:40

今天看了好多黑焦虫的帖子，感觉大家都有过这种经历，我的细胞现在也是这样，刚开始长的好好的，但是等传了10代后就突然长不起来了，细胞没有污染，开始怀疑是支原体。于是重新复苏细胞，更换营养液，血清，等好不容易长满，结果一传代细胞又不行了。主要症状就是细胞贴壁不好，瓶上没有细胞的地方充满了白色发亮园颗粒，营养液清亮，但发黄。
又重复复苏几次，还是照旧。老板就说我的无菌操作不行，已经不敢复苏细胞了。信心全无啊，实验被迫停止。
感觉大家说是黑焦虫但没有确实的依据，那位大大能给大家发个有确切报道的文章，如果那位大大英文可以的话，能否给找点外文资料？？？

作者: HP007 时间: 2011-12-8 15:41

我和楼上的缘yuan的情况极为相似.我前两天复苏了一管别人冻存的小鼠成纤维细胞,长得还可以,四天后传代了1托3,今天是传代后的第二天发现三瓶中有一瓶的培养液很快就变成橘黄色,另外两瓶还可以. 于是我就把那瓶变色的换液了,可是换完液就觉得又变黄色了, 镜下观察细胞很不规则,胞核有的就看不到,而且胞质和胞核里面有很多黑色小点.

图片附件: 24777476.jpg (2011-12-8 15:41, 75.49 KB) / 该附件被下载次数 5
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9800

作者: 一叶 时间: 2011-12-8 15:41

发个必定被砖的贴。
我觉得对于黑胶虫的定义非常需要规范化。我对这种东西持保留态度，一是我自己还没有遇到过，二是我们的的确确还不知道这种所谓的“微生物”本质是什么东西。也就因为界定的模糊，现在有很多同行遇到问题很容易就往“黑胶虫”上归咎，其实很有可能只是细胞状态不好时漂点碎片，包括支原体污染导致的，或者血清灭活时间长了出沉淀之类，可一旦归咎于“黑胶虫”，就好像名正言顺的成了“不可抗力”：反正我也不知道是怎么回事，姑且就当是“黑胶虫”吧。可能进来的同行看到这里砖头已经举到半空了，但我认为这问题是确实存在的，需要大家重视。除了上面几位令人尊敬的积极做实验证实的同行们，进这贴的人可能有很多都是细胞不明原因的状态不好，进来看看能不能靠上“黑胶虫”的边的。
我们是做科学的，而现在“黑胶虫”已经快成了我们科研中的迷信，请慎重讨论“黑胶虫”，不要轻易用一个不知道是什么的东西来试图解释手中的现象，希望你相信自己的困惑是可以用我们目前已知的原因解释并且可以解决的，认真寻找原因才是正道。

作者: 中国特色 时间: 2011-12-8 15:41

我们用泰乐菌素消除过一次黑胶虫.不知是否有依据,反正当时是死马当作活马医,后来就没用泰乐菌素了.

作者: guagua 时间: 2011-12-8 15:42

今天观察前几天复苏后传代的细胞（MDBK），症状：细胞瓶里面已经没有贴壁的细胞，为了知道还有没有东西在长，早晨换液，DMEM+10%血清，结果晚上7点观察营养液已经变黄，但还是清亮。什么东西再长？？400倍观察瓶上有许多聚成团的黑色颗粒样物质，还有少量分布均匀的小颗粒样东东。实验条件没有办法照相，无法贴图。

同一培养箱内别人的细胞（ST，BHK）表面也有了好多黑色的颗粒，真的象有的大大说的能空气传播？

作者: 园丁## 时间: 2011-12-8 15:42

我养DC时也碰到这种情况，在400×的倒置显微镜下可见大量小黑点在原地做颤动，但大约一周后，这些这黑点在原地不再运动了。细胞的生长没有受到严重影响。这些小黑点是不是微生物目前还不敢断言，这种现象在我们实验室也是普遍存在的，显然对这种现象进行科学的解释很有必要。

作者: 阿敏 时间: 2011-12-8 15:42

我们实验室也有过这种情况,请教对实验室全面消毒必须用熏蒸吗?我用新洁尔灭擦洗后再用紫外线照射可以吗?

作者: 中国特色 时间: 2011-12-8 15:43

黑X虫就是以讹传讹造出来的，大家不要再人云亦云了，拿出点实证的科学精神出来。事实和证据是科学家的空气，虚无缥缈的东西应该从脑海里清除出去。

作者: 四福晋 时间: 2011-12-8 15:43

我的细胞也出现了楼主所说的情况．买了个支原体检测的试剂盒检测，结果强阳性．不知道是不是支原体污染就会出现＂黑焦虫＂．
有遇到这种情况的战友们不知道都有没有做过支原体检测的，大家齐心协力把这个罪魁祸首给揪出来！！

作者: 一叶 时间: 2011-12-8 15:44

很多人还在沿用热灭活血清的老传统，但是这样会使血清中产生蛋白质的聚合体，像线状的小虫，做布朗运动。其实血清不应该热灭活的。这种情况应该能回答很大一部分同学的黑jiao虫现象。其他的可能是一般污染，或者是死细胞的碎片。总之，一种莫须有的虫子不应该成为大家讨论的话题。

作者: 缘yuan 时间: 2011-12-8 15:44

我刚复苏的ES细胞种在胎鼠成纤维细胞饲养层上，第二天早上的时候没有看到什么，但是细胞贴壁很不好，但是晚上再看的时候，整个培养液中已经布满了，像线状的小虫，做布朗运动的“鬼东西” ，细胞还是没有贴壁，生长很差！！！现在很是郁闷，不知改怎么处理！！请这方面有经验的同事和老师指点一下迷津，拜谢！！！！

作者: 爱老虎游tt 时间: 2011-12-8 15:44

异想天开一下：

黑胶虫这么体积这么小，“有人说是纳米级的细菌”，可不可以通过滤器过滤：使黑胶虫通过滤器，而细胞不通过滤器，从而去除黑胶虫。

作者: 园丁## 时间: 2011-12-8 15:45

有人说它是“黑焦虫”
有人说它是“黑胶虫”
还有人说它是“黑蛟虫”
这3个名称都有人用。
难道是一种未曾发现的新的生命形式？或者是已知物种，而我们鉴别不出来？或者根本就不是什么虫子？
我也曾培养出这种“黑X虫”，很像的，在20X10的倒置显微镜下，是半个细胞长度的黑色线状物体，密密麻麻，还在原地微微的动。把培养液直接37度孵育24小时，也有这种线状物体出现。后来再也没有与它遭遇了。
希望培养出“黑X虫”的同学能发图片上来，高倍清晰的，让大家看看各自的虫子都是什么样的。我的图片可惜已经找不到了。

作者: loli 时间: 2011-12-8 15:45

这个肯定是支原体污染，我们这有细胞也这样，但是加了去除支原体的溶液后，好了很多，大家可以试试

作者: 一叶 时间: 2011-12-8 15:45

上面说的比较清楚，当细胞状态好的时候，那所谓的原胶虫很少，当细胞状态不好的时候，逐渐变多，而且是形成一种所谓的共生关系．我们现在也遇到此种问题，上病毒的细胞由于有病毒的侵袭，可能活力会降低，逐渐的就会有很多的小黑点出现，而空白对照的细胞根本就不会出现此种现象，所以如果只用单种因素来排除而不从整体上进行，是不合理的

作者: 生物迷 时间: 2011-12-8 15:46

有点意思。自己遇到过。但是对此“黑胶虫”保留态度，认为和血清有一定关系。
而“虫子”、还有所谓“专杀培养基”觉得有点夸张了，还是“全世界范围普遍存在，解决该问题是一个世界性难题。哈哈，这样的话多少科学家会自动放下手中的工作，暂时攻克这一“世界性难题”？
科学发展至今，科学疯子们会容许这样一个模棱两可的未知生物在眼片地下而置之不理？

作者: 缘yuan 时间: 2011-12-8 15:46

这几天一直被这所谓的"黑胶虫"折磨,刚刚取材的胎鼠成纤维细胞就被他给污染了,密密麻麻,像黑沙子一样多,成布朗运动,细胞根本就不贴壁,有些贴壁的也被他干扰的胞体变得很搜小,最后崩界,最典型的是看到一细胞质内满满的那东西,细胞在原地抖动,镜下很明显!!细胞好像在挣扎,很痛苦!! 而且发现没有细胞的培养液没有那黑东西,从有黑东西的培养瓶中吸出的培养液再培养那黑东西就会不动了,贴在壁上,有活细胞它就会复苏!!!他和细胞好像是共生的!!不知道这种黑东西到底是什么?难道这么多的人就没有一个真正知道的,泱泱大国难道连一个在光镜下可以看到的东西都鉴别不了????!!期待有识之士尽快搞清楚到底是什么

作者: wu11998866 时间: 2011-12-8 15:47

类似的情况，形态和特征与大家说得都一样。细胞完完了!不知如何解决

作者: hold住 时间: 2011-12-8 15:47

磷酸钙很有说服力

作者: fqswdzd 时间: 2011-12-8 15:47

我最近培养细胞的时候也遇到这种情况。
空的培养液，血清都做了实验，也都有小黑点。
不能肯定到底是污染还是所谓的‘黑胶虫’。
不管是什么，哪位有经验的战友，能说说要采取什么办法才可以挽救？

作者: loli 时间: 2011-12-8 15:48

我今天作了一个小小的测试，又感觉不是黑胶虫污染了而是一般的支原体什么的，测试如下：
我把新鲜的培养液加到一个小皿里面，里面不加任何培养物，6小时后观察，结果没有小黑点出现，而传入细胞的那一个一定有了？这是不是说明血清没有污染，也间接的说明不是黑胶虫污染呢？

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我个人觉得不能说明什么问题。因为很多现象说明，黑胶虫是寄生予细胞，而且与细胞呈现营养竞争的，所以你的实验可比性应该不是很大，也说明不了什么。

作者: loli 时间: 2011-12-8 15:48

我最近培养细胞的时候也遇到这种情况。
空的培养液，血清都做了实验，也都有小黑点。
不能肯定到底是污染还是所谓的‘黑胶虫’。
不管是什么，哪位有经验的战友，能说说要采取什么办法才可以挽救？

===============================================================================================================

近两天我也有遇到同样问题。在高倍镜下观看，现象很恐怖，有些让人恶心的感觉。同意观点：血清所致。换进口血清，并彻底打扫实验室，熏蒸。明天我就这样做！！！真叫这个咚咚给气死了！害了我的原代，也害了我复苏的细胞。细胞培养者的公敌！~~~~~~~~~~
气愤中。。。。。。。。。。。。。。

作者: loli 时间: 2011-12-8 15:49

还有阿，我在高倍镜下看到的好像不是小黑点阿，是些黑色的细长的东西，不停的布朗运动，繁殖甚快。
难道不是同仁们所说的黑胶虫？？

作者: loli 时间: 2011-12-8 15:49

在别处看到的，转载来，大家看看：

有人认为是“黑胶虫”，也有人认为是支原体，还有些专家更倾向于是非微生物，系血清中的杂质。下面就我所知道的谈谈两者的情况和对付方案把：

“黑胶虫”
胶虫成熟后呈线状,可以快速移动。而且形态是椭圆形，作不规则布朗运动。如果血清从-20取出后在室温下融化就易出现“黑胶虫”，建议血清在4度融化。加入双抗后好像能够抑制生长（具体原因不明，抗生素应该对细菌起作用）。

建议：
一、停止复苏，停止养细胞，彻底消毒所有用于细胞培养的一切用品，包括所用的培养瓶，培养基，吸管，胰酶，孵箱，超净台、空间等等你能想到的和细胞培养相关的所有物品。一个星期后，再复苏污染之前冻存的细胞，注意你的白大衣衣袖污染即可。这样你可能觉得动作太大，但可以用一个星期的时间挽救两个月的时间，还有其他你为了找到污染源，去除污染所耗费的精力，和财力。

二、如用伯氨奎、磺胺、四环素、贝尼尔，也有建议庆大霉素500ug/ml洗涤。如果细胞非常珍贵，可以用PBS多洗几次，培养基内加浓度高些的抗生素，勤换液，勤观察。

三、所有东西最好重配；如果实在要抢救，重点突破，留几瓶污染不是很严重的细胞抢救，其余弃去．

四、另外尽量用质量好的血清，当然最好是进口胎牛血清（国产血清太脏），就是价格高的离谱，经济条件不允许，可以用进口新生牛血清代替。建议如果使用的是Hyclone或GIBCO的血清可不必灭活，这样可以有效减少“小黑点”的形成。

支原体污染
由于口腔支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。
去除支原体污染：
1. 抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）
2. Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine
3. Anti-sera
预防与控制方面可从以下各点加强注意：
a)设备方面：
1. 使用已作支原体测试ok的细胞株
2. 于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染的细胞
3. 使用不添加抗生素的培养基培养细胞
b)检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。
c)实验操作人员的无菌观念与无菌操作技术的要求

作者: vvmmoy 时间: 2011-12-8 15:50

HYCLONE给的解释如下：

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9801

作者: caihong 时间: 2011-12-8 15:50

刚买回来的血清中就有这种小黑点，37度培养血清，黑点明显增多，国产进口都有，只是数量上有差别。我在用的方法是过滤培养基，传代时离心，有明显改善，但是尚未根除

作者: 乌贼老弟 时间: 2011-12-8 15:50

其实黑胶虫是有药可以杀灭和抑制的。这个药就是“biomyc－3”。我同学在一个很牛的医院实验室做实验，他们都是用的这个药，而且效果很好。但是有点贵500块钱10ml。
这个药是杀支原体的，所以那个实验室的牛人们倾向于认为黑胶虫是支原体。
大家可以上网查一查这个药。

作者: 乌贼老弟 时间: 2011-12-8 15:51

我有黑胶虫图片，不过没人能肯定它就是，只是几个“老手”看看凭经验断定的。真希望有人能把这东西研究透。
下面说说我“养”的黑胶虫，10％“四季青”胎牛血清+1640,培养箱里培养两天后就是这个样子，个人认为是血清有问题。

图片附件: 21073285.snap.jpg (2011-12-8 15:51, 65.47 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9802

作者: 蒲公英 时间: 2011-12-8 15:51

细胞复苏了两瓶，一瓶长的比较快一点我就先传代了，结果第二天传代的那瓶长了小黑点，棒状，运动能力比较强，有些游动很快，有些在原地快速打转，大多数在原地扭动。而没有传代的那瓶没有发现小黑点，怀疑是胰酶污染。于是我取胰酶放在小平皿里观察发现了小黑点，没有处理，室温放置，第二天观察发现黑点变多。这个有可能是黑胶虫吗？怎么能在胰酶里生长？有可能是别的什么污染吗？（除培养基和胰酶所用其他物品均在前一天消毒过）

作者: 二丫头466 时间: 2011-12-8 15:52

我们实验室养的细胞中也出现了做布朗运动的小黑点,但并不影响细胞生长也没有出现过细胞死亡的现象。听昆明动物所的专家说这些小黑点是细胞凋亡后形成的凋亡小体。
我们开始用1640培养细胞时小黑点比较多后来由于1640用完了换成MEM+LH后小黑点明显减少了，所以我觉得可能与培养基有关。
我们实验室以前也出现过“黑胶虫”污染，但是我们污染“黑胶虫”后，传代后第二天培养液就会变黄，在培养液中直径小些的“黑胶虫”做快速转圈运动，直径大的做慢速的摆尾运动。而且可以通过0.22um滤膜。更换血清后就再也没有出现这种情况了。

作者: 乌贼老弟 时间: 2011-12-8 15:53

同感同感！我们试验室的细胞全面染菌，像极了“黑胶虫”，这家伙很顽固，那都有，我们都无从下手了，上面说过它的直径是0.5-1微米的话，用0.22的滤膜应该能滤掉呀，我在刚买的血清空培养中发现了它，现在根本不敢复苏细胞，快疯掉了

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0.22能滤掉它的卵么？所以~~~~~~~~而且很可能它可以寄生在细胞内部

作者: 缘yuan 时间: 2011-12-8 15:53

埃至今还没有人能够拿出一个可靠的方案来对付所谓的黑焦虫我是深受其害，现在实验都没办法做下去了！！
痛苦啊

作者: baidukk 时间: 2011-12-8 15:53

我也遇到了这种情况，我养的A549

开始的时候细胞状态还可以
后来边缘轮廓开始淡化
同时细胞核周围出现细小颗粒（不知道是细胞内容物凸显还是小东西附着在上面）
消化的时候细胞也是圆的
但是边缘相当模糊，有点像小学生画的太阳
而且细胞外好像有长须状的东西（会不会是小东西入侵细胞的方式？）

再然后
细胞就在贴壁的时候被一群晃动的小虫虫吞噬，片甲不留

那些小东西
一开始是小点点，像布朗运动似的活动，也有的像火箭似的游的快极了
后来变的长了一点，就像杆状的微生物，有振动的也有扭动的，在细胞周围
然后就变成绳索状了，基本是小团了（不规则形状）

各位有遇到这种情况的吗?
以前没见过这种污染

作者: flower-201 时间: 2011-12-8 15:54

我们最近也遇到了，细胞内可见明显和黑色小颗粒，细胞表面也有贴附，
胞外培养基内也散在，高倍镜下仔细观察，可见小颗粒做布朗运动。
不知这是什么污染？有什么方法去除？有没可能是支原体污染？

作者: loli 时间: 2011-12-8 15:54

我也说两句。
我们学校电脑的网络换了，换了之后网速慢的要死，大家经常反映，学校最后在校内网，发出公告，说部分同学的电脑中毒，导致网速很慢，请同学及时杀毒。我就奇怪了，以前没换网时怎么就没事呢？现在有个怪现象，就是电脑方面的事都喜欢往病毒上靠。
现在在细胞培养上，有个怪现象，什么都喜欢往“黑胶虫”上靠。我不敢否定“黑胶虫”的存在，因为我对他没有太多的了解，没有太多的了解的东西，一般是没有发言权的。但是，它是一个没有肯定，没有明确定义的东西，为什么那么多的战友很肯定的说，自己曾经或者正在被它污染呢？
我看上面群友发了张照片，这很好，我感觉，也是我想说的就是大家都把自己的“黑胶虫”照片帖出来，细胞培养，照片很重要的。我很奇怪的就是，大家说的眉飞色舞，滔滔不绝，怎么就不发照片呢？我是很怀疑的。群友发的照片，我说说我的看法，有很多战友说“黑胶虫”是细胞内的，和细胞关系很紧密的，但群友发的照片上，我没怎么看到细胞呀？是否可以说，很多战友间说得所谓的“黑胶虫”并不相同。
我认为我们做事应该本着实事求是的态度。我刚培养的时候，买来胎牛血清，上面写明未灭活。有资料显示要灭货（56摄氏度，30分钟）。但是我就没灭活，因为我有个疑问，为什么厂家不灭活？他们灭活多简单呀。什么原因呢？如果资料或者胎牛血清上写明：现用灭活效果好的话那也可以理解，但没有这样的字样。那就说不通了，为什么厂家自己不灭活？后来我在丁香园找到了答案，现在一般不主张灭活。
现在“黑胶虫”的问题还没有定论，我们不能否定它的存在，有可能我们很多年后对它有认识，有了解，但也有可能它根本就不存在。我们现在就否定“黑胶虫”是不正确的，但是把什么都说成“黑胶虫”就更不正确了。我的建议是，我这帖以下的说发现“黑胶虫”的战友都把照片帖上来，以前发帖说发现“黑胶虫”的把照片补贴上。
不知大家同意否？

作者: guagua 时间: 2011-12-8 15:55

我以前也有这种问题。最后把那些污染的细胞都扔了。换了进口的血清就好很多了。还要注意细胞室、培养箱、何超净台的消毒

作者: 一叶 时间: 2011-12-8 15:55

我做细胞培养工作已经有二十余年,上面提到的“黑胶虫”问题经常碰到,采取了许多措施也不易挽回被污染的细胞,后来每次发现有这种微生出现时,我就吸取少量液体进行高渗培养,结果大部分标本培养出细胞L型,少部分标本经过很长时间仍不能诱导培养出L型菌生长.分析认为:在正常高渗培养时,也会有一部分标本培养不成功,这是主要原因,这些“黑胶虫”主要来源于细胞培养板,因此大家在做培养时一定要处理好培养用具.以免影响实验结果.

作者: 一叶 时间: 2011-12-8 15:56

再说两句:因为每次遇到的“黑胶虫”其形态是不一样的,我想许多同道也发现过类似的结果.而L型细菌具备形成多种形态的条件

作者: 乌贼老弟 时间: 2011-12-8 15:56

建议先作菌检，我遇到这种情况时首先取瓶中的培养液涂布LB培养基，真的长菌了，应该是L型细菌。培养液不变混浊还真的不好发现

作者: 分子式 时间: 2011-12-8 15:56

我样的细胞有这样的情况，都要被这个小东西给折磨死了。处于同一培养箱的同一层的其它细胞就没有这样的情况，都要疯掉了啊！在操作上是严格按无菌的操作要求做的啊，真的是拿着小东西没办法吗？这到底是什么东西啊？

作者: 911 时间: 2011-12-8 15:57

真是崩溃！我的情况也是如此。群友描述的很典型啊：那些小东西
一开始是小点点，像布朗运动似的活动，也有的像火箭似的游的快极了
后来变的长了一点，就像杆状的微生物，有振动的也有扭动的，在细胞周围
然后就变成绳索状了，基本是小团了（不规则形状）

原来那么多战友都遇到了啊！实验被迫中止了，所有的东西全重新高压，该扔的扔。

作者: 邓布利多 时间: 2011-12-8 15:57

其实我也觉得这种东西的存在根细胞状态有联系。我接毒的细胞放时间长了，就会在200X光镜下看到在细胞空隙有细长的小颗粒（黑色）游动，并非原地颤动，但也就在细胞周围做无规则运动。我接毒之前，细胞状态良好，病毒拿滤膜过滤后接毒，24H后没发现，但48H后6个当中2个出现了。
另外还有一次，我们实验室新买的细胞做扩大培养准备冻存，复苏长好的细胞传到大DISH里，我看小方瓶里还有少许细胞，就加培养基一直养着，等细胞长得差不多了，消化了一次。我看自己要冻存的细胞没污染，就一直把小方瓶放那没管，过几天一看培养基黄了，里面还有小黑点游动，第二天细胞就大量死亡了，小黑点增多。我以为是细胞污染，立刻复苏了一只刚冻存的细胞，但养了两天了，复苏后一直没换培养基，细胞状态还很好，无小黑点。
因为培养基（进口），血清（进口），PBS，都用得同一瓶，所以觉得还是细胞状态不好才引发的该现象。我们老板也说可能是血清中的小颗粒，根细胞状态有关，新细胞不会有。

作者: 二丫头466 时间: 2011-12-8 15:58

请问LZ，我养的THP-1细胞是不是也是这种污染？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9803

作者: 二丫头466 时间: 2011-12-8 15:58

还有，HTP-1经PMA诱导贴壁后

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9804

作者: glass 时间: 2011-12-8 15:59

我也遇到了类似问题刚复苏的细胞内就有很多黑色的渣滓倒是不影响细胞生长我的细胞长得挺快但是长满以后就开始死先从瓶口再是两边细胞变成圆形半透明的就像是被烧过一样很荒凉的景象之后这些地方就没细胞了瓶底干干净净不知有和我一样情况的么？有什么好方法么？

作者: 969 时间: 2011-12-8 16:00

同意楼主说法！但是在我养的6孔板内还发现边缘细胞比中间细胞状态好，黑点点也少！

作者: 月牙牙 时间: 2011-12-8 16:00

我刚复苏的乳腺癌435s细胞，开始长的也还是可以，第二天换液后发现贴壁的细胞少了很多，开始有小黑点了。第三天，肉眼下整个培养基变黄、浑浊，在显微镜下发现整个背景都是模糊的，还有不少小黑点在原地打转。那些贴过壁的细胞看着就像癌症晚期的病人一样，胞膜也不清楚了，胞浆里面很多圆形的小点，也不完全是黑色的，像是一些小气泡。大家帮我分析下，是什么问题啊。现在做培养基的验证。

作者: yychen 时间: 2011-12-8 16:01

我的细胞中也有很多小黑点
不过好像是贴壁的
时间长了，细胞就都死掉了
小黑点越来越多
真是奇怪的

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-8 16:01

同意各位说的呀，我养得原代一接种过两三小时观察就出现大片的黑色团状物，原本可以长出突触的神经细胞也不长角了，第二天换液时几乎看不见正常的细胞了，黑黑的一大片，有时候换液后几天情况好点。但是细胞明显感觉营养不够，长的扁扁的。
怎么解决呀，焦虑死了

作者: flower-201 时间: 2011-12-8 16:01

我的细胞株是刚从武大买进的,买来就看见那玩意儿了.打电话问了,他们说查过了,全国的都有;就按一般的培养法培养就可以了;不满意,就请退货.闷啊!:

作者: BOSS2011 时间: 2011-12-8 16:02

看到这些，吓出一身冷汗啊！虽然没有污染，不过珍贵细胞一定要冻存保种啊！一定一定！

作者: one 时间: 2011-12-8 16:02

今天我在培养成骨细胞的原代时也是突然发现了有类似黑胶虫的东西，而且细胞活力也明显减弱（两天前看时还没有），听从师姐的建议是将培养基完全换掉了，加入含1000单位的PBS反复清洗了两遍后，加入了此PBS在室温下呆了10分钟后，培养基清洗后加入配置好的培养液！现在还是不太放心我的细胞，因为另一名博士后的培养瓶里也发现了类似黑胶虫的东西！！哎呀实验室的培养箱也应该清洗消毒了！

作者: 了了 时间: 2011-12-8 16:03

黑胶虫的现象我也观察到过，但是我发现，细胞状态越好，黑胶虫越少，或是没有。但是如果诱导细胞成熟，崩解，死亡后，那么黑胶虫就特别特别多，就好像细胞死后的“寄生虫”。
我认为细胞状态是因，而它是果。

作者: 了了 时间: 2011-12-8 16:03

这里还要问一下，胞浆内的黑点和培养基中的黑点不是一回事吧？我刚开始养细胞时，胞浆内有很多小黑点，我查书上说这说明细胞状态不好，后来传代养了一段时间，细胞有的就变的透明些了。不过有时还是会有很多黑点。但是这些黑点并不影响细胞的生长。至于培养基中的黑点，有运动的，也有不运动的，我也没有去理会，细胞照样生长。

作者: ffooll 时间: 2011-12-8 16:04

我也碰到了同样的问题
我养的是CNE-1和CNE-2，上星期复苏两个细胞株时，CNE-1有这种“黑胶虫”，而CNE-2则没有，后来CNE-1基本都不长了，贴壁也越来越差，最后我丢弃CNE-1。一周以后，CNE-2也出现了这样“黑胶虫”，细胞由原来的生长旺盛，形态规则，逐渐变成形态不规整，且胞内出现很多的透亮空泡，而培养基并未见混浊。可惜上次都没留下图。
这次同样复苏两株细胞，和上次一模一模，下面是我养的两株细胞，CNE-1细胞周围出现好多不规则形态的黑色颗粒，在40倍镜下，可发现少量会现原地抖动，用无菌PBS反复吹打都未见好转，反而见细胞脱落。而CNE-2则暂时未发现有此现象。我用的是GIBCO1640+HYCLONE血清，10%。

CNE-1

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作者: ffooll 时间: 2011-12-8 16:04

CNE-2

图片附件: 34725647.snap.jpg (2011-12-8 16:04, 19.37 KB) / 该附件被下载次数 3
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9806

作者: 小鱼鱼 时间: 2011-12-8 16:04

我们实验室现在养的鼠的干细胞都出现这个问题了，但是人的干细胞好像没有。现在怀疑是小鼠成纤维细胞带来的，愁死了，复苏一个，污染一个，从小黑点变成大黑点，再变成杆状或不规则状，速度也越来越快。我可怜的细胞啊~怎么办呢？

作者: duoduo 时间: 2011-12-8 16:05

我养的细胞液出现了这种情况，换液后的第一天细胞状态很好，只有极少的小黑点，过一两天后细胞状态就开始变差，同时黑点越来越多!苦了我的细胞。

作者: loli 时间: 2011-12-8 16:05

据我个人观点判断，所谓的“黑胶虫”极有可能是一种阮病毒！不知大家有没有对此感兴趣的可以合作研究下！
据报道，黑胶虫对抗生素不敏感，对各类干扰素也不敏感，耐高温高压，耐酸，直径100-200nm等，很符合阮病毒的特点。
本人认为，开展此方面的研究必定会有极大的意义！无论是在应用领域还是基础研究领域。

作者: 分子式 时间: 2011-12-8 16:06

有了黑胶虫，就用环丙沙星，效果超级好。

作者: TAT 时间: 2011-12-8 16:06

我在做单抗的过程中遇到了这个问题，但是我所遇到的问题更奇怪：
同一个单克隆的细胞，在96孔板做亚克隆长的好好的，剩下的细胞放到24孔板（当时加了饲养细胞）长的也特别好，当24孔板长满之后，我用没加饲养细胞的完全培养基将其移到6孔板中继续扩大培养，就出现了所谓的黑胶虫，接着细胞逐渐停止生长，细胞全变成细胞碎片，完全死亡，而最初亚克隆的96孔板中的细胞长势依然良好！
呵呵呵，郁闷啊，做单抗已经做到最后了，没想到出现了这个问题！！！我先加点饲养细胞试试，看看能否改善？

作者: 园丁## 时间: 2011-12-8 16:06 标题: 回复 #84 loli 的帖子

同学，你太天真了吧，阮病毒你能在光镜下看到？太搞笑了，不用说阮病毒了，就是普通病毒你看的到么？很怀疑你微生物是怎么学的！
　　“朊病毒与常规病毒一样，有可滤过性、传染性、致病性、对宿主范围的特异性，但它比已知的最小的常规病毒还小得多（约30～50nm）。电镜下观察不到病毒粒子的结构，且不呈现免疫效应，不诱发干扰素产生，也不受干扰作用。朊病毒对人类最大的威胁是可以导致人类和家畜患中枢神经系统退化性病变，最终不治而亡。因此世界卫生组织将朊病毒病和爱滋病并立为世纪之交危害人体健康的顽疾。”

另外，我始终认为，不存在所谓的“黑胶虫”，一定是其他的东西。支原体的可能性更大一点，为什么声称自己被虫子污染的战友不去做个检测呢？

作者: DNA 时间: 2011-12-8 16:07

我认为所谓”黑胶虫“应该是血清中的物质在热灭活后形成的聚合物，在常温下做无规则的布朗运动，看上去像虫子而已。因为血清中的营养物质聚合，变得不能被细胞利用，所以细胞失去营养支持，逐渐”状态不好“，甚至死亡。

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如果是血清中的营养物质的话，为什么小黑点会不停的增加？
但是奇怪的是细胞的接种密度大的话就不影响细胞的生长，但是密度小的话细胞的生长就会减慢？

作者: DNA 时间: 2011-12-8 16:07

有了黑胶虫，就用环丙沙星，效果超级好。

==================

能具体说说用的剂量吗？

作者: zhezhe 时间: 2011-12-8 16:08

作了1个月元代PMNC EPC，每次都是这样，愁人啊。

作者: qqq111 时间: 2011-12-8 16:08

真是麻烦事啊,问题很严重啊,细胞状态一直不好

作者: fqswdzd 时间: 2011-12-8 16:09

发个必定被砖的贴。
我觉得对于黑胶虫的定义非常需要规范化。我对这种东西持保留态度，一是我自己还没有遇到过，二是我们的的确确还不知道这种所谓的“微生物”本质是什么东西。也就因为界定的模糊，现在有很多同行遇到问题很容易就往“黑胶虫”上归咎，其实很有可能只是细胞状态不好时漂点碎片，包括支原体污染导致的，或者血清灭活时间长了出沉淀之类，可一旦归咎于“黑胶虫”，就好像名正言顺的成了“不可抗力”：反正我也不知道是怎么回事，姑且就当是“黑胶虫”吧。可能进来的同行看到这里砖头已经举到半空了，但我认为这问题是确实存在的，需要大家重视。除了上面几位令人尊敬的积极做实验证实的同行们，进这贴的人可能有很多都是细胞不明原因的状态不好，进来看看能不能靠上“黑胶虫”的边的。
我们是做科学的，而现在“黑胶虫”已经快成了我们科研中的迷信，请慎重讨论“黑胶虫”，不要轻易用一个不知道是什么的东西来试图解释手中的现象，希望你相信自己的困惑是可以用我们目前已知的原因解释并且可以解决的，认真寻找原因才是正道。

说得很有道理的。

作者: 生物迷 时间: 2011-12-8 16:09

大家帮忙看一下这是什么污染？

图片附件: 67871340.snap.jpg (2011-12-8 16:09, 36.26 KB) / 该附件被下载次数 11
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9807

作者: 白白的 时间: 2011-12-8 16:10

我们实验室养的肿瘤细胞中也出现了类似的问题，细胞传代密度低时就长不起来，而且在贴壁细胞生长的空隙里密密麻麻布满了小黑点，如果细胞密度大状态好，小黑点就少。还有像colo205这种半贴壁细胞，密度低细胞就不长，密度高细胞就抱成一团成为很难看的形态。如果勤换液并且每次换液时都以较低转速（700-800rpm）离心的话，黑点就能明显减少。我们用Hd的MycoScan支原体检测试剂盒分别检测了培养基，血清，以及细胞培养上清，PCR的结果是培养上清（+），培养基（-），血清（-）。用药典上的方法，VERO细胞染色结果跟PCR结果一致。

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-8 16:10

我们尝试在培养基中加入sigma的Tylosin，按照说明书1ml/L的用量，持续传代了将近一个月的时间，又去做了检测，PCR的结果和hochest染色结果仍然都呈阳性。我拍了污染物油镜下的荧光照片，但是不知道怎么放上来。
我有疑问的是，如果如检测结果显示，是支原体污染，那么支原体是我们平常在细胞间10X的目镜下就能看见的么？还有，支原体会动么（我们可以清楚观察到它们在“布朗运动”）？
还有，我认为如果操作小心的话，是不会在空气中传播或者交叉污染的，因为我用来做检测的VERO细胞是跟这些细胞养在同一个培养箱里面，也是同一个安全柜里操作的，用的PBS和胰酶是同一瓶，不过不会同时操作，VERO一直都是干净的。

作者: hold住 时间: 2011-12-8 16:10

而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者认为是微生物的分裂扩增。

作者: windy+++ 时间: 2011-12-8 16:11

很感谢，我现在养的NCI-H157也有类似的情况，刚复苏的一两代，细胞生长很好，也到后面细胞就自己凋亡了。很郁闷。

作者: 阿敏 时间: 2011-12-8 16:11

我现在养的细胞也有小黑点，没有人试过加氨苄和卡那处理么？我去年加过，小黑点没有了，但是今年重新养了隔壁实验室拿来的细胞后，就又出现小黑点了，而且培养基不变浑浊。如果是培养基沉淀物的话，那么为什么抗生素有效呢？如果是细菌污染的话，为什么我照射紫外，培养箱和安全柜都用碘酒擦过之后再用75%酒精擦拭之后，再养未污染的细胞，细菌又出来了呢？细菌没这么顽固吧。

作者: abc816 时间: 2011-12-8 16:12

最近自己培养的细胞也出现了同样的问题，我是同时培养两种细胞，使用的基础培养基、血清都是一样的，但是就是其中一种几乎看不到黑胶虫，另一种细胞受影响却非常大。因为是贴壁细胞，使用无菌的PBS洗几次之后，感觉情况要好很多。血清换了新的，抗生素也加过，但是基本没有什么效果。同批复苏的几瓶细胞，总会有1瓶，在一夜之间就充满黑胶虫。不知道有没有战友有经验的。

作者: 笑弯了腰 时间: 2011-12-8 16:12

我用的时GIBCO 胎牛血清，SIGMA的DMEN 培养基，养的是hek293 开始还可以，大约是第四代吧，突然就不行了，细胞多的时候，不明显。细胞少的时候，就很多，而且增长很快，高倍镜下，呈小黑点样，好像有些有融合。做布朗运动。

我是有一天，冻存了细胞以后，在空培养瓶里加了一些培养基，在镜下发现的。开始细胞多的时候没有发现，或者没有注意。

现在我把严重的培养瓶等都扔了，包括六孔板等。

作者: 盼盼 时间: 2011-12-8 16:13

好贴，我养的细胞最近也出现这种情况，长得慢而且有点衰老的迹象，挠头啊

作者: tianmei001 时间: 2011-12-8 16:13

我感觉黑胶虫就是支原体污染，虽然支原体我们看不到，但那些小黑点有可能是支原体的聚集体

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-8 16:13

我们实验室也出现了同样情况，用三代头孢试了一下，效果还可以，一般用1:1000的比例。黑胶虫，主要是跟细胞的状态有关，当细胞状态好的时候，基本没有，细胞一旦状态差，它就疯狂生长，所以，大家在处理细胞的时候，尽量调整细胞状态，避免出现黑胶虫。另外，感觉黑胶虫跟空气有关，有层流的实验室出现的几率很小，实验条件差的却经常有此污染。

作者: loli 时间: 2011-12-8 16:14

我见到的大多也是这种情况，原来在学校做细胞污染物检测时用过免疫荧光法检测支原体，镜下被染出来的支原体分布，密度，大小形状，和上图极其类似，教员说现在支原体污染是个很普遍的形象，国内买的（没听错的话是原始细胞库吧？）细胞90%上是支原体污染的，国外实验室的情况也不怎么样。由于学校细胞中心是做细胞生产药物的GMP中试，产药工程细胞对病毒，支原体这些比较“隐晦”的污染要求是比较严格的（当时教员拿着一管抗体粉末说拿出去贴标签就可以给人打了-_-||）。所以我还是比较倾向于支原体一说的。

作者: loli 时间: 2011-12-8 16:14

这个也是，有同志说这里面没有细胞，是不是细胞都已经掉完了才拍的照啊

图片附件: 21073285.snap.jpg (2011-12-8 16:14, 65.47 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9808

作者: bohe221 时间: 2011-12-8 16:15

我们是医院的中心实验室，在这里实验的人特别多，今天发现所有人的细胞都被所谓的“黑胶虫”污染了！

作者: 了了 时间: 2011-12-8 16:15 标题: 回复 #106 bohe221 的帖子

我的细胞也是，出现了这种情况，传代后变多，请问应该怎么处理呀，好不容易弄来的细胞，还没养到该冻存的时候，不能丢弃，你们是怎么处理的呀，急求帮忙

作者: 911 时间: 2011-12-8 16:15

我的3t3正出现这种情况，用PBS洗，当时很干净，第二天又长满了黑呼呼的东西，不知道是不是“黑胶虫"

作者: yychen 时间: 2011-12-8 16:16

这个也是，有同志说这里面没有细胞，是不是细胞都已经掉完了才拍的照啊

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我用孔板养的肿瘤细胞，也是和这个很像，但是都是贴壁的。
有的孔里面，黑点的密度很大，显得细胞是白色的，特别明显。
不知道怎么办才好。

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