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标题: [讨论帖]如何把细胞养的更漂亮 [打印本页]

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:19 标题: [讨论帖]如何把细胞养的更漂亮

[讨论帖]如何把细胞养的更漂亮（转载）

我今天主要谈细胞污染之后的拯救。继续我的专题！

7.细胞污染之后的拯救！

对于贴壁生长的细胞，相对来说比较简单但很麻烦。以下我主要讨论贴壁生长的细胞。
在讨论之前，大家首先要有一个概念，即洁净区，并不是没有细菌，而是细菌的数量非常少，国家标准100级的洁净标准是浮游菌数不得超过5个每立方米，沉降菌数不得超过1个每培养皿.而国外的标准比我国的还要高一点，要求的数量更少。
所以在我们的洁净操作台里，并不是真正一个细菌都没有的，所以在操作的时候还是要尽量利索迅速地完成操作。尽量减少进入培养体系细菌的数量。

所以处理细菌污染的重要原则就是：无限地稀释细菌的浓度，无限地减少细菌的数量！

1）.将污染的培养液倒掉，转烧瓶口，加入10mlPBS，适当晃动清洗培养瓶，然后倒掉。转烧瓶口。
2）.继续加入10mlPBS，同样方法晃动，清洗培养瓶，然后倒掉。
3）.继续加入5mlPBS，同样方法洗瓶，主要是培养面，然后倒掉。
4）.重复步骤3再洗。
5）.重复步骤3再洗。
6）.加入3-5ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。
7）.加入3ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。
8）.再加入5mlPBS洗瓶，然后吸出。
9）.加入10ml培养液，加入2ml双抗，放置培养箱培养，5小时之后，倒掉培养基，加入PBS洗瓶两次，然后加入胰酶消化，吹打后置于离心机800-1000r/min离心，然后洗一次。置于新的培养瓶里培养，培养体系加入2ml双抗。
10）.24h之后，视情况换液，若仍然污染严重，培养基浑浊，重复以上步骤，若看不到污染物，则继续步骤1)、3）、4）、6）、8），然后加入培养液培养，培养体系加入2ml双抗.
11).24h之后，若仍污染严重，可再重复一次，若还污染只能弃之（不过一般没有出现这种情况），若镜下不见污染物，则换液PBS洗瓶，正常培养。

以上是对于细菌污染（常见为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌）；若为霉菌或者真菌污染，加入两性霉素B清洗和培养，终浓度一般为2.5μg/ml（在30μg/ml时会有细胞毒性）。另外也可以选择在培养基里加3ug/ml的制霉菌素或放线菌素D。其它操作同；若为支原体或者黑胶虫污染，因为这个太难处理，所以我基本上都是重新弄细胞了。处理的代价更大更麻烦。但是也是有专门针对黑胶虫和支原体污染的试剂的，但是我没有试过。比较贵呵呵。

有同学说用泰乐处理支原体污染效果比较好。大家可以试试，我下次也会试一试。至于黑胶虫的话，我觉得真的是没有办法了，还是需要你在无菌观念和无菌操作上下大功夫加强了，真的黑胶虫在科研领域还是很未知的啊。所以没有什么好的应对方法。预防为主！！还是要强调无菌操作啊！！尤其注意血清的质量！这个是主要来源。一般建议用北美血清，这个黑胶虫污染会概率小。

以上方法主要是针对贴壁生长的细胞，在操作的过程中，一定要小心操作动作，轻柔缓慢，切忌大动作鲁莽。防止细胞脱落。以上方法操作得当，基本上都能救活你的细胞（我还没有听到没救活的反馈）。当然如果你的细胞仍有富余或者冻存的，我还是建议你把污染的扔掉，再复苏方便省事。这个拯救细胞还是主要针对你就只剩这一瓶细胞无路可退的时候。欢迎大家讨论！

作者: loli 时间: 2011-12-8 16:20

无奈之下可以采用的方法。
但是，正如作者所说的，如果还有冻存的细胞，还是将污染的细胞扔了，不要去救了。因为这种拯救的过程本身就是对细胞的一种损伤，一种刺激，谁知道细胞对此有什么反映？而且更为重要的是，细胞污染了就相当于细胞与细菌共培养，两者之间一般就会产生相互作用，谁能估计到细胞会对这种共培养产生什么样的反映，所以细胞即使救回来了，不再污染了，那请问这细胞还是原来的细胞吗？细胞状态还是原来的状态吗？用这个细胞于后续的各种实验得到的结果还是可信的吗？

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:21 标题: 回复 #2 loli 的帖子

是啊。你的疑问是很正确的，这个就是在无路可走的状态下才做的。
不过我曾经有过两次的实验结果，还是一样的，MTT和PCR的结果都没有差别，所以我才敢这样说啊。。。

作者: 生物迷 时间: 2011-12-8 16:22

问一下。双抗是100x的？

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:23 标题: 回复 #4 生物迷的帖子

呵呵，是。我一般不注明的就是常规的规格哈。有特殊的我会格外注明的。。。

作者: caihong 时间: 2011-12-8 16:24

污染物是不见了，可是细胞的生长速度特别慢，连续的消化会不会影响细胞生长呢

作者: duoduo 时间: 2011-12-8 16:24

RAW264.7细胞，我听做过的同学说这个细胞很难消解的啊？楼主怎么说第二步就能把此细胞消下来呢

作者: 铜雀 时间: 2011-12-8 16:25

这个很好，不过我养的原代细胞经不起折腾，每次都得扔了。

作者: DNA 时间: 2011-12-8 16:25

其实有的时候双抗效果不太好的时候，我有用过50mg/ml氨苄青霉素或头孢类（就用的人用注射品，用过的有头孢米诺和头孢孟多），效果非常好，先用抗生素溶液洗涤5次，然后用加上述抗生素的培养基培养，每天换液，一般我只用2~3天，然后撤掉抗生素，换不加抗生素的培养基或加双抗的培养基。效果不错，就是不知道对细胞有什么不良作用，但目前没有发现。

作者: 969 时间: 2011-12-8 16:26

这里的2ML双抗是怎么加？1Ml青霉素和1ML链霉素吗？

作者: 中国特色 时间: 2011-12-8 16:26

请教楼主：实验室常见的细胞污染通常是细菌以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌多见，以及霉菌，黑蛟虫，支原体和真菌。其中真菌最难发现污染，也最难处理，而霉菌和支原体等不是双抗能解决的，请问您还有其他关于污染拯救的好东东和大家分享吗？

看了您整理的材料，觉得您是一个很仔细用心的人，也许污染不发生在你身边。

我曾经遇到贴壁细胞污染，经病原微生物的老师鉴定是金葡菌污染所致，处理方法和楼主大同小异，但相对简便，最后把从ATCC购买的原代细胞救过来了。

我简单把自己的操作步骤整理下;

1.倒掉培养液，用火烤瓶口和瓶盖大约1分钟
2 用大量的PBS反复冲洗每次约30ML 重复5次
在用火烤瓶口和瓶盖（如果是一次性培养瓶时间不能太长，以免软化变性）
3 加入5ML双抗 37度 5分钟
PBS冲洗两次
4 加入双抗2ML 室温5分钟
PBS冲洗两次
5 加入培养液10ml 双抗2ML 6小时后换液

6 重新加入培养液双抗浓度随污染情况调整连续5-7天

对于培养箱需要彻底全面消毒
碘伏消毒作用10分后酒精消毒10分钟重负两次
紫外照射一小时

污染的细胞因为是原代，根本没有冻存，上述方法处理后传到第3代，在后来的激光共聚焦显微镜检测没有见到细胞形态异常。

细胞污染除了自己注意外，还要严防实验室的'新手'，无菌观念不能马虎啊！

作者: 了了 时间: 2011-12-8 16:26

最近我的细胞被G—杆菌污染了，但我的培养液里原本就有100u/L的双抗，那请问再加青链双抗反复洗还有意义么？

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:27

污染物是不见了，可是细胞的生长速度特别慢，连续的消化会不会影响细胞生长呢

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要养一下细胞能够缓过来，大病初愈，你也是有气无力的嘛。。。呵呵，细胞也是生命，也一样的。
你可以给他点好营养啊，譬如把血清浓度加高一点啊或者换成顶级血清啊。。。这样都是可以的。哈哈，细胞马上就长起来啦。。。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:27

RAW264.7细胞，我听做过的同学说这个细胞很难消解的啊？楼主怎么说第二步就能把此细胞消下来呢

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你亲自养试试就知道了。我养这个细胞一向不用胰酶消化直接吹打传代的。效果比消化要好。不过，消化也是可以的，这是正规操作。我的是发现的经验方法。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:28

RAW264.7细胞，我听做过的同学说这个细胞很难消解的啊？楼主怎么说第二步就能把此细胞消下来呢

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你亲自养试试就知道了。我养这个细胞一向不用胰酶消化直接吹打传代的。效果比消化要好。不过，消化也是可以的，这是正规操作。我的是发现的经验方法。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:28

其实有的时候双抗效果不太好的时候，我有用过50mg/ml氨苄青霉素或头孢类（就用的人用注射品，用过的有头孢米诺和头孢孟多），效果非常好，先用抗生素溶液洗涤5次，然后用加上述抗生素的培养基培养，每天换液，一般我只用2~3天，然后撤掉抗生素，换不加抗生素的培养基或加双抗的培养基。效果不错，就是不知道对细胞有什么不良作用，但目前没有发现。

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呵呵，你这个方法可以啊。我也可以尝试一下。。。呵呵。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:29

请教楼主：实验室常见的细胞污染通常是细菌以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌多见，以及霉菌，黑蛟虫，支原体和真菌。其中真菌最难发现污染，也最难处理，而霉菌和支原体等不是双抗能解决的，请问您还有其他关于污染拯救的好东东和大家分享吗？

看了您整理的材料，觉得您是一个很仔细用心的人，也许污染不发生在你身边。

我曾经遇到贴壁细胞污染，经病原微生物的老师鉴定是金葡菌污染所致，处理方法和楼主大同小异，但相对简便，最后把从ATCC购买的原代细胞救过来了。

我简单把自己的操作步骤整理下;

1.倒掉培养液，用火烤瓶口和瓶盖大约1分钟
2 用大量的PBS反复冲洗每次约30ML 重复5次
在用火烤瓶口和瓶盖（如果是一次性培养瓶时间不能太长，以免软化变性）
3 加入5ML双抗 37度 5分钟
PBS冲洗两次
4 加入双抗2ML 室温5分钟
PBS冲洗两次
5 加入培养液10ml 双抗2ML 6小时后换液

6 重新加入培养液双抗浓度随污染情况调整连续5-7天

对于培养箱需要彻底全面消毒
碘伏消毒作用10分后酒精消毒10分钟重负两次
紫外照射一小时

污染的细胞因为是原代，根本没有冻存，上述方法处理后传到第3代，在后来的激光共聚焦显微镜检测没有见到细胞形态异常。

细胞污染除了自己注意外，还要严防实验室的'新手'，无菌观念不能马虎啊！

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呵呵，你的方法和我的基本一样。我只是把所需要洗的步骤细化详细下来了。呵呵。有时候是可以少其中洗的一两步的。譬如污染不是很大的时候。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:29

对于真菌污染，基本操作方法一样，我用的是加入两性霉素。
对于支原体和黑胶虫，我也没有好办法啦。我也是重新复苏换新的培养液。。。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:29

这里的2ML双抗是怎么加？1Ml青霉素和1ML链霉素吗？

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配好的双抗加2ml

作者: ha111 时间: 2011-12-8 16:30

对于支原体污染，请问您有什么办法吗？

作者: 爱老虎游tt 时间: 2011-12-8 16:30

您好！想问下如果细胞对双抗很敏感的话怎么办呢

再就是希望介绍一下黑胶虫的处理方法因为我感觉只要多注意一些污染会得到很好的抑制感觉黑胶虫比那些污染常见

非常感谢

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:31

对于支原体污染，请问您有什么办法吗？

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这个我也是一般就扔了，有试剂公司卖的有支原体污染的试剂，可以买了用。但是因为我至今也就遇到1次支原体污染，所以没有买过。。。呵呵。这个还真是经验不足了。。。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:31

您好！想问下如果细胞对双抗很敏感的话怎么办呢

再就是希望介绍一下黑胶虫的处理方法因为我感觉只要多注意一些污染会得到很好的抑制感觉黑胶虫比那些污染常见

非常感谢

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细胞如果对双抗敏感的话，那就只能靠洗把细菌洗到无限低的浓度。。。

黑胶虫其实一直没有很好的解决办法，我也很头疼这个问题。有试剂公司卖对付黑胶虫的试剂，我没有买过试过，不知道怎么样。我遇到黑胶虫的时候基本上就是PBS洗，无限洗，然后消化下来低速离心，用PBS洗。然后重新配制血清和培养基，配制完之后0.2um微孔滤膜过滤。然后培养。

作者: glass 时间: 2011-12-8 16:31

求教用两性霉素洗细胞时的浓度？之前我养细胞时培养液中加了100UI/ml的双抗，对细胞没有影响。我养的MDBK，最近有真菌污染的麻烦。。。

作者: 爱老虎游tt 时间: 2011-12-8 16:32

我在网上看到说是国产的血清产生黑胶虫的几率比进口血清大，用滤器过滤后血清里边的营养会减少的吧？

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:32 标题: 回复 #24 glass 的帖子

浓度一般是以终浓度为2.5ug/ml。超过30ug/ml会有细胞毒性。我已经在帖子里面写了。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:33

我在网上看到说是国产的血清产生黑胶虫的几率比进口血清大，用滤器过滤后血清里边的营养会减少的吧？

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能减少什么。。。。？可以99%滤过的。

作者: TAT 时间: 2011-12-8 16:34

请问楼主样的是什么细胞呀，希望能够多请教前辈！

作者: TAT 时间: 2011-12-8 16:34

非常感谢，很实用哈。
小弟在这里有个问题，我养的是7702（人正常肝细胞）。前段时间养细胞，也没有非常的小心翼翼，但是细胞长得挺不错的，不过最近出现了问题，不知是培养基的问题还是细胞本身问题。情况如下：正常细胞低倍镜我们都可以看到其细胞核、细胞膜和之间的细胞质，在细胞没有长到融合之前，细胞与细胞之间的没有东西的，像是在桌子上放了俩苹果似的，之间没有杂质。而目前我培养的几瓶细胞都是细胞膜不完整，不均匀，点点边装，细胞与细胞之间的有很多贴壁杂质，像是细胞碎裂之后的碎片一样。传代也没有效果，培养基也是清亮的，不像是污染造成的，很是烦恼。
请教，多谢了。

作者: wu11998866 时间: 2011-12-8 16:35

我最近原代的污染了，我养了三个月了，头痛死了，希望楼主的方法对我有用。对于支原体污染，我的经验是加泰乐，效果不错的。以前细胞状态不佳，出现黑点，加这个24-48h后就清了，楼主下次遇到可以试试。

作者: 乌贼老弟 时间: 2011-12-8 16:35

我最近原代的污染了，我养了三个月了，头痛死了，希望楼主的方法对我有用。对于支原体污染，我的经验是加泰乐，效果不错的。以前细胞状态不佳，出现黑点，加这个24-48h后就清了，楼主下次遇到可以试试。

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黑点？满布的还是个别的啊？

作者: 乌贼老弟 时间: 2011-12-8 16:35

传过，不过没有用啊。每次都是细胞半死不活的样子，细胞间杂质多多。

作者: HP007 时间: 2011-12-8 16:36

黑点？满布的还是个别的啊？

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比较均匀分布的，摇晃不会漂浮

作者: 乌贼老弟 时间: 2011-12-8 16:37

比较均匀分布的，摇晃不会漂浮

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貌似我的细胞也是这样，那是支原体污染造成的吗？如果加药，加到培养基中还是加到培养瓶里啊？25T的培养瓶多少量啊？

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:37

我最近原代的污染了，我养了三个月了，头痛死了，希望楼主的方法对我有用。对于支原体污染，我的经验是加泰乐，效果不错的。以前细胞状态不佳，出现黑点，加这个24-48h后就清了，楼主下次遇到可以试试。

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呵呵，好的，记下了。谢谢你啦。泰乐你用的是哪个公司生产的么？

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:37

传过，不过没有用啊。每次都是细胞半死不活的样子，细胞间杂质多多。

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那这样的话，应该就是支原体污染了。一般支原体污染你看不出来污染的迹象，不像细菌真菌污染那么明显，但是细胞的状态就是这样莫名其妙地不好起来，细胞内有黑色颗粒存在，感觉细胞贴壁的底面也有很多看似黑黑的颗粒状物存在。我一般是选择多洗几次，然后消化二传一次。如果还是这样，我就扔了。不过你可以试试上一位同学说的加泰乐试试。呵呵。这个我还真没有用过。
祝好运了。

作者: pengke1983 时间: 2011-12-8 16:38

你好，我想请问一下加双抗的最终浓度是多少呢？PG100u/ml,S 100μg/ml，这样的最终浓度可以吗？因为你帖子里面提到的只有双抗的体积3 or 5ml，不知道最终加入培养基之后起作用的浓度是多少呢？谢谢帅哥高手！
还想问问你，养过HUVEC没？这个细胞应该是比较好养的，可是在我们实验室怎么就很容易污染，很多养这个都污染了，好像复苏贴壁的时间还比较长。针对这个细胞有没有比较好的经验和心得体会呢？谢谢！

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:38

你好，我想请问一下加双抗的最终浓度是多少呢？PG100u/ml,S 100μg/ml，这样的最终浓度可以吗？因为你帖子里面提到的只有双抗的体积3 or 5ml，不知道最终加入培养基之后起作用的浓度是多少呢？谢谢帅哥高手！
还想问问你，养过HUVEC没？这个细胞应该是比较好养的，可是在我们实验室怎么就很容易污染，很多养这个都污染了，好像复苏贴壁的时间还比较长。针对这个细胞有没有比较好的经验和心得体会呢？谢谢！

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这个不需要太固定双抗的浓度的。这是在挽救，不是在培养。一般培养用就是100U/ml.我现在是要高浓度一点挽救。你就直接加3-5ml进去就可以了，12ml培养基就加3ml，15ml培养基就加4ml。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:39

你好，我想请问一下加双抗的最终浓度是多少呢？PG100u/ml,S 100μg/ml，这样的最终浓度可以吗？因为你帖子里面提到的只有双抗的体积3 or 5ml，不知道最终加入培养基之后起作用的浓度是多少呢？谢谢帅哥高手！
还想问问你，养过HUVEC没？这个细胞应该是比较好养的，可是在我们实验室怎么就很容易污染，很多养这个都污染了，好像复苏贴壁的时间还比较长。针对这个细胞有没有比较好的经验和心得体会呢？谢谢！

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HUVEC我觉得重要的一点就是传代的时候动作一定要轻。换液的时候用PBS或者Hank's洗是很必要的。这个细胞会长得比较摊，松软。所以消化的时候保持细胞的单个是很必要的。
另外很重要的一点就是一定不能造成氧化损伤，所以换液一定要勤快。另外培养的这个PH值的控制是很必要的。

作者: 蒲公英 时间: 2011-12-8 16:40

楼主对黑胶虫有啥感情没有？现在很多人不认黑胶虫，而且基本没有什么应对方法！

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-8 16:40

貌似我的细胞也是这样，那是支原体污染造成的吗？如果加药，加到培养基中还是加到培养瓶里啊？25T的培养瓶多少量啊？

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我没看到细胞，所以无法判断污染。加泰乐到培养瓶中，我的终浓度为50ug/ml,可以用到100ug/ml.

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-8 16:41

呵呵，好的，记下了。谢谢你啦。泰乐你用的是哪个公司生产的么？

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sigma,粉剂

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:41

楼主对黑胶虫有啥感情没有？现在很多人不认黑胶虫，而且基本没有什么应对方法！

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黑胶虫，我有一段时间专门对他进行了研究，可惜啥也没有研究出来，感觉就还是那样，更像是支原体污染之类的。。

作者: TAT 时间: 2011-12-8 16:42

细胞复苏后，生长情况挺好，出差一天后，在显微镜下看不到细胞，也看不到细胞碎片，培养基轻微的浑浊，好像有白色粉状东西，取部分液体涂血平板后，生长成片的菌落，挑菌染色为革兰氏阳性球菌，想请教下可能是什么菌，这是第二次出现这种情况，冻存的备用细胞已不多了，不知道该怎么处理，也担心复苏后还会发生类似的事情？希望您能帮帮忙，谢谢啦！

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:42

细胞复苏后，生长情况挺好，出差一天后，在显微镜下看不到细胞，也看不到细胞碎片，培养基轻微的浑浊，好像有白色粉状东西，取部分液体涂血平板后，生长成片的菌落，挑菌染色为革兰氏阳性球菌，想请教下可能是什么菌，这是第二次出现这种情况，冻存的备用细胞已不多了，不知道该怎么处理，也担心复苏后还会发生类似的事情？希望您能帮帮忙，谢谢啦！

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光这样，谁也看不出来是什么菌啊。
据经验，应该是葡萄球菌。。。

作者: BOSS2011 时间: 2011-12-8 16:43

啊我从华西拿回的293T出现污染了，初步怀疑是真菌，但是没看到菌丝，培养基肉眼看颜色正常但是稍有混，镜下观察则有特别多的细沙状物质，我死的心都有了，等着做转染呢，细胞死了，而且还是唯一的，关键我这个细胞一换液细胞就往下掉，贴壁性很低。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:43 标题: 回复 #46 BOSS2011 的帖子

是细菌污染。
这个倒是很好救啊。你就按我的方法试一试。
贴壁性低不怕，你就少洗几次，轻轻洗2次吧。第三次顺便都给洗吹下来，洗完离心。再洗一次，再离心。然后加PS培养。

作者: 阿敏 时间: 2011-12-8 16:44

请教下楼主用的双抗是多大浓度的？我们平时是把买来的双抗稀释一百倍在培养液中使用的，楼主提到的用双抗3-5ml洗培养面，是工作浓度吗？

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:44

请教下楼主用的双抗是多大浓度的？我们平时是把买来的双抗稀释一百倍在培养液中使用的，楼主提到的用双抗3-5ml洗培养面，是工作浓度吗？

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20万单位每毫升。。。

作者: 西子 时间: 2011-12-8 16:44

请教一下，第9步：“培养体系加入2ml双抗”，双抗是跟培养液按比例加的吗？我们一般每次换液加4-5ml培养液，那双抗应该加几ml？

PS：我们配出来的是100X的双抗，换算过来也只是10000IU/ml。只有楼主建议的浓度1/20...是否应该延长作用时间？

作者: 彼岸花opp 时间: 2011-12-8 16:45

我们平常配的双抗就是链霉素100WU加5ml血清稀释，青霉素80WU加4ml血清稀释，然后各取0.25ml加入500ml的培养基里···不知道这样可不可以

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:45

请教一下，第9步：“培养体系加入2ml双抗”，双抗是跟培养液按比例加的吗？我们一般每次换液加4-5ml培养液，那双抗应该加几ml？

PS：我们配出来的是100X的双抗，换算过来也只是10000IU/ml。只有楼主建议的浓度1/20...是否应该延长作用时间？

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你浓度低就多加几毫升。5ml。。。
关键在于洗，而不在于双抗。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:46

我们平常配的双抗就是链霉素100WU加5ml血清稀释，青霉素80WU加4ml血清稀释，然后各取0.25ml加入500ml的培养基里···不知道这样可不可以

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只要浓度控制到就可以。。。

作者: loli 时间: 2011-12-8 16:46

只要浓度控制到就可以。。。

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你说的浓度，是配制时的浓度还是加到培养基里的终浓度啊？要多少比较好？

我看还有人加三抗的，不知道第三种是啥？

另外有人说加双抗其实对细胞生长不好，大意是容易有其他隐形污染之类的，而且对后续试验可能也会有结果，不知道各位的看法怎么样？

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:46

你说的浓度，是配制时的浓度还是加到培养基里的终浓度啊？要多少比较好？

我看还有人加三抗的，不知道第三种是啥？

另外有人说加双抗其实对细胞生长不好，大意是容易有其他隐形污染之类的，而且对后续试验可能也会有结果，不知道各位的看法怎么样？

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终浓度。这个经过我的双盲实验结果显示，双抗并未有影响，结果没有显著性差别，而不加双抗的却容易污染。。。

作者: 小螺号 时间: 2011-12-8 16:47

楼主大人，我做MTT时，复孔之前的OD值相差比较大，我想应该是细胞铺板时不均匀。铺板之前吹匀细胞我知道，可能是用排枪加细胞这一个动作没做好，因为我发现每次加完细胞枪头总是有些残余，而且每次残余量还可能不一样。所以怎么加细胞才能使复孔之前尽量均匀呢？

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:50 标题: 回复 #56 小螺号的帖子

你的枪或者你的枪头的问题吧。。。细胞要用吹管吹打均匀。然后再用枪吸。

作者: BUK 时间: 2011-12-8 16:51

谢谢楼主分享。那么悬浮细胞有没有什么比较好的办法呢？

作者: 笑弯了腰 时间: 2011-12-8 16:51

呵呵，不错，但是决定黑胶虫还是一个比较麻烦的东西，目前我们实验在做杂交瘤培养的时候一直能看到，貌似这个与无菌操作无关。一般情况下数量还是不多的，但特别是换了血清的批次后有时候会多点，觉得和血清的质量有很大关系。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 16:52 标题: 回复 #59 笑弯了腰的帖子

是这样的。黑胶虫最主要是来源于血清，尤其是澳洲血清和新西兰血清。北美的血清我没有发现过有疑似黑胶虫的污染。南美血清质量也不如北美血清。

作者: dotaaa 时间: 2011-12-8 16:52

请教楼主，我用腹腔巨噬细胞测NO，LPS 100ng/ml,1640培养液，碧云天试剂盒检测NO，结果LPS刺激组合正常组没什么差别，不知道什么原因，楼主做过这个吗？希望指教。

作者: duoduo 时间: 2011-12-8 16:58

楼主好，请教一下，把血清或者培养基放在紫外线消毒灯下照，会对血清或者培养基有影响吗？

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 17:00

请教楼主，我用腹腔巨噬细胞测NO，LPS 100ng/ml,1640培养液，碧云天试剂盒检测NO，结果LPS刺激组合正常组没什么差别，不知道什么原因，楼主做过这个吗？希望指教。

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做过。我的差别很明显的啊。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 17:01

楼主好，请教一下，把血清或者培养基放在紫外线消毒灯下照，会对血清或者培养基有影响吗？

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这个我具体也不知道，但是我也这样照过，没有发现有什么影响。

作者: caihong 时间: 2011-12-8 17:01

谢谢，感觉非常有用。目前我养的细胞存在一个问题，就是从外观看培养基都是非常清澈的，但是在显微镜下看就可以看见培养基里面漂浮着挺多的黑色大小不等的不明物，用PBS清洗后可以基本把这些漂浮的东西洗掉，但是第二天又重新出现了，这个是污染吗？

作者: HP007 时间: 2011-12-8 17:02

楼主的经验值得学习，虽然我没试过楼主的方法，不过污染问题曾经也困扰我很久，幸好当时还有备份。

作者: 969 时间: 2011-12-8 17:02

请问楼主用的两性霉素B是怎么配的

作者: tianmei001 时间: 2011-12-8 17:02

我前段时间细胞污染了，在别的地方看到有人转了楼主的这篇攻略。就试了一下，真的救活了。经验来看，如果是早期的细菌污染，还是可以救活的，但是细胞状态多少会变得差一点。但是提取DNA做PCR结果没有差别，所以还是很有用的。感谢楼主！

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 17:03

我前段时间细胞污染了，在别的地方看到有人转了楼主的这篇攻略。就试了一下，真的救活了。经验来看，如果是早期的细菌污染，还是可以救活的，但是细胞状态多少会变得差一点。但是提取DNA做PCR结果没有差别，所以还是很有用的。感谢楼主！

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呵呵，污染救活之后可以二传。。。同样可以筛选出很好的细胞。。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 17:03

请问楼主用的两性霉素B是怎么配的

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这个应该不用我说了吧。。。常规配制双抗的方法这不都是一样的么。。。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 17:04

请教楼主：实验室常见的细胞污染通常是细菌以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌多见，以及霉菌，黑蛟虫，支原体和真菌。其中真菌最难发现污染，也最难处理，而霉菌和支原体等不是双抗能解决的，请问您还有其他关于污染拯救的好东东和大家分享吗？

看了您整理的材料，觉得您是一个很仔细用心的人，也许污染不发生在你身边。

我曾经遇到贴壁细胞污染，经病原微生物的老师鉴定是金葡菌污染所致，处理方法和楼主大同小异，但相对简便，最后把从ATCC购买的原代细胞救过来了。

我简单把自己的操作步骤整理下;

1.倒掉培养液，用火烤瓶口和瓶盖大约1分钟
2 用大量的PBS反复冲洗每次约30ML 重复5次
在用火烤瓶口和瓶盖（如果是一次性培养瓶时间不能太长，以免软化变性）
3 加入5ML双抗 37度 5分钟
PBS冲洗两次
4 加入双抗2ML 室温5分钟
PBS冲洗两次
5 加入培养液10ml 双抗2ML 6小时后换液

6 重新加入培养液双抗浓度随污染情况调整连续5-7天

对于培养箱需要彻底全面消毒
碘伏消毒作用10分后酒精消毒10分钟重负两次
紫外照射一小时

污染的细胞因为是原代，根本没有冻存，上述方法处理后传到第3代，在后来的激光共聚焦显微镜检测没有见到细胞形态异常。

细胞污染除了自己注意外，还要严防实验室的'新手'，无菌观念不能马虎啊！

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双抗本身的浓度是多少呢？加入在培养液之后，终浓度又是多少呢？我们是自己配置的双抗，所以想要知道确切的浓度，以前我的实验室遇到污染的时候使用过类似的办法，可以最后都没有成功~~

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-8 17:04

请问楼主，我培养基中原本本就有100单位/ml 的双抗，现在染菌了，直接用培养基来溶解双抗，使终浓度位20万单位/ml来处理自己的细胞吗，这样对细胞有损伤吗，浓度直接扩大了2000倍可以吗

作者: 分子式 时间: 2011-12-8 17:05

。。。早点看到你这篇帖子就好了，前一阵子几乎被逼到无路可退的地步，还好在最后倒数第三瓶冻存细胞成功复苏无污染，死划分有帮助！

作者: fsdd817 时间: 2011-12-8 17:05

我想请教一下，您说的用PBS可以把细胞传代时分开，您用的PBS是4度拿出来就用还是放置室温的啊？谢谢。

作者: 四福晋 时间: 2011-12-8 17:06

今天刚刚发现筛选出来的细胞有点儿细菌污染的苗头。培养基还没出现浑浊现象，正愁着怎么办呢，因为我细胞很宝贵，看到了这个帖子，救星啊，大哥。小妹先试哈子，谢谢啊！！！！

作者: guagua 时间: 2011-12-8 17:06

楼主太牛了，我是有一个关于自己的实验问题请教，请问楼主养过EAHY926细胞吗？

作者: 白白的 时间: 2011-12-8 17:07

我养的细胞有时会出现莫名奇妙的污染只是在少数几皿其他的没事郁闷啊

作者: 克隆鱼 时间: 2011-12-8 17:07

现在我们养的两种细胞都存在问题。

一是小胶质细胞还是存在问题。就是传代传了四五代之后细胞就死了。我不知道这是什么原因。培养基我们都已经换成进口的了。进口的DMEM，进口的澳洲胎牛血清。但就是传代的时候会发现每传一代死亡的细胞都在增多。最后就剩下一点点细胞还贴在皿的底部，但已经不会增殖了。我想请问是不是跟我们传代的融合度有关啊？你们做一般是到多少融合度就传代啊？是否还存在其他问题？
二是我们养的脑微血管内皮细胞，传代的过程中会出现很多黑点，而且会随着传代过程中黑点增多，然后细胞也是在传几代后就很不好了。实验室其他人养的细胞也会有一些黑点，但是不会像我们细胞这么多，影响这么大。
我是养细胞的新手，现在有点傻住了。希望大家能给我些建议。非常感谢。

作者: zhezhe 时间: 2011-12-8 17:07

我想请问楼主，我的细胞污染了，但细胞状态一直还行。

我试剂也都是用的新的，不知道为什么还是污染。。

作者: zhezhe 时间: 2011-12-8 17:08

我的细胞污染了，但细胞状态还行，就是看到那些不明漂浮物不爽，而且就像上面那位楼主一样，用PBS洗了以后，干净了，但培养了一段时间又出现了。

作者: loli 时间: 2011-12-8 17:08

写的真好。。。细胞总污染，每次都丢掉，好麻烦的说

作者: 乌贼老弟 时间: 2011-12-8 17:09

楼主您说RAW264.7小鼠巨噬细胞很好吹打下来，我是用胰酶消化的，怎么感觉还是不很好呢，有人建议用细胞刮直接刮，不知道楼主试过没啊！

作者: 乌贼老弟 时间: 2011-12-8 17:09

请问楼主是哪里的？你那里是不是有RAW264.7小鼠巨噬细胞啊！不知道方便的话是否可以馈赠，我本来托别人从香港带回来几管，接连着污染了几次，因为是新手还不知道竟然还可以抢救就都丢了，偶尔看到了楼主的帖子，想看看楼主是不是可以帮一下，谢谢........

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 17:09

我的细胞污染了，但细胞状态还行，就是看到那些不明漂浮物不爽，而且就像上面那位楼主一样，用PBS洗了以后，干净了，但培养了一段时间又出现了。

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这个应该不是污染，应该是细胞分泌的一些物质。有些细胞特别喜欢分泌这些东西，然后黏附在细胞表明。建议你二传。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 17:10

楼主您说RAW264.7小鼠巨噬细胞很好吹打下来，我是用胰酶消化的，怎么感觉还是不很好呢，有人建议用细胞刮直接刮，不知道楼主试过没啊！

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仔细看帖。。。胰酶消化很好吹打。

作者: bohe221 时间: 2011-12-8 17:10

前辈啊，拜读之后受益匪浅。我的细胞也刚污染，是从上海细胞库刚买回来的，传了一代发现污染了，正在犹豫该怎么做，看到你的帖子，仿佛看到了一线希望，谢谢！
大侠，还有个问题想请教一下，这个洗必须用PBS吗，有没有其他可以代替的洗液？万分感谢！^_^

作者: bohe221 时间: 2011-12-8 17:11

楼主大人，还有个问题想请教啊，我细胞污染后去看了下用的培养基，发现培养基貌似也污染了，有絮状的东西，我是买的现成的液体1640、FBS、双抗这些直接配的，你说如果配好的培养基污染的话，是不是这些原液也可能污染了？恳请楼主指点一些排查污染的方法好不好？顶礼膜拜，万分谢谢啊！

作者: bohe221 时间: 2011-12-8 17:11

如果培养基、血清污染的话有得救么？过滤之后用行不行？

作者: lixi559 时间: 2011-12-8 17:11

我前一阵救过一次染菌细胞，很幸运地救成功了，但没有这么多步。大体上思路都是一样的嘛，就是稀释稀释再稀释，然后加抗生素。我那次用PBS洗了几次，然后加了2倍于正常量的双抗，可能是因为之前养细胞时培养基里没有过加抗生素，加完的效果很好，然后就救活了。
我感觉处理的步骤太多对于细胞的状态不利。而且，个人意见，如果不是一定要救活时还是不要救了，又费时又费力的。有时还救不活，救活了状态还受一些影响。当然我也是刚开始养细胞，没什么经验。向大家学习~~~

作者: 月牙牙 时间: 2011-12-8 17:12

刚把霉菌污染的全扔了才看到楼主的帖子，原来还能这样子挽救的啊！

作者: 缘yuan 时间: 2011-12-8 17:12

我刚才用楼主的方法处理下污染的细胞，可是问题来了，原先细胞瓶中的细胞还蛮多的，可是用PBS反复洗了后，细胞少了好多，只剩零散的一些了，是我洗的时候晃动的太厉害了？？现在这些剩下的细胞，我已经不抱希望了，太少了，估计长不满就死光光了。
我现在疑问的是，你们用PBS反复冲刷细胞瓶的时候，难道原来的贴壁细胞都没变化？没少么？

作者: glass 时间: 2011-12-8 17:13

我想知道贴壁细胞在反复冲洗消化再冲洗，细胞数量也是在减少又减少，太少的话细胞也是长不起来啊楼主？该怎么才好呢？

作者: glass 时间: 2011-12-8 17:13

请问楼主细胞在冻存时需要加入的血浆成分有没有严格的把握啊？初次学习冻存技术，很多具体成分不知道，还望给予详细指教！谢谢！

作者: glass 时间: 2011-12-8 17:21

望楼主接下来能够详细的多讨论一下有关细胞的复苏与冻存的技术，谢谢！很期待噢！

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 17:22

前辈啊，拜读之后受益匪浅。我的细胞也刚污染，是从上海细胞库刚买回来的，传了一代发现污染了，正在犹豫该怎么做，看到你的帖子，仿佛看到了一线希望，谢谢！
大侠，还有个问题想请教一下，这个洗必须用PBS吗，有没有其他可以代替的洗液？万分感谢！^_^

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Hank's洗液也可以，但是配起来更麻烦。或者你可以用灭菌的生理盐水。不过我还是推荐用PBS。这个是和细胞内液的离子浓度电势位最接近的。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 17:22

楼主大人，还有个问题想请教啊，我细胞污染后去看了下用的培养基，发现培养基貌似也污染了，有絮状的东西，我是买的现成的液体1640、FBS、双抗这些直接配的，你说如果配好的培养基污染的话，是不是这些原液也可能污染了？恳请楼主指点一些排查污染的方法好不好？顶礼膜拜，万分谢谢啊！

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你可以把培养基配成完全培养液放进培养箱培养3天。如果污染的话，瓶子里会浑浊。但是你要保证你的再次操作要是无菌的。不要再引入新的污染源。这和你的无菌操作是很有关联的。尽量简化操作和快速操作。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 17:23

我想知道贴壁细胞在反复冲洗消化再冲洗，细胞数量也是在减少又减少，太少的话细胞也是长不起来啊楼主？该怎么才好呢？

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有 2个方面：
1.贴壁细胞贴壁紧的可以反复冲洗，没有问题，仅仅会把一些贴壁不牢的老化细胞死细胞洗下去。
2.贴壁不牢的细胞洗的时候是有要求的，要少，1-2次即可。还要轻柔操作。尽量避免细胞流失。
这些我都在帖子里详细叙述过。
至于消化，那是为了更好的消化。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 17:23

请问楼主细胞在冻存时需要加入的血浆成分有没有严格的把握啊？初次学习冻存技术，很多具体成分不知道，还望给予详细指教！谢谢！

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一般细胞冻存浓度都是10%。特殊细胞有用到20%和15%甚至更高。这要看你培养的细胞的自身要求。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 17:23

我刚才用楼主的方法处理下污染的细胞，可是问题来了，原先细胞瓶中的细胞还蛮多的，可是用PBS反复洗了后，细胞少了好多，只剩零散的一些了，是我洗的时候晃动的太厉害了？？现在这些剩下的细胞，我已经不抱希望了，太少了，估计长不满就死光光了。
我现在疑问的是，你们用PBS反复冲刷细胞瓶的时候，难道原来的贴壁细胞都没变化？没少么？

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你要学会举一反三的啊！不是所有细胞都是一样的啊。要根据你的实际情况来定啊。
我在帖子里反复强调一点就是，细胞和细胞不一样，一定要根据自己的实际情况来定！污染的程度不一样，情况也不一样，细胞也不一样，贴壁的程度当然也不一样，我的可能洗5次都没有什么明显的减少，但是你的可能2次就减少很多了。这是根据当时的情况而来的，所以在第一次的时候你要轻轻地加，轻轻地晃，轻轻地洗一次，观察细胞情况怎样，再决定要洗多少次，什么程度！

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 17:24

如果培养基、血清污染的话有得救么？过滤之后用行不行？

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0.2um过滤之后可以用。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 17:24

现在我们养的两种细胞都存在问题。

一是小胶质细胞还是存在问题。就是传代传了四五代之后细胞就死了。我不知道这是什么原因。培养基我们都已经换成进口的了。进口的DMEM，进口的澳洲胎牛血清。但就是传代的时候会发现每传一代死亡的细胞都在增多。最后就剩下一点点细胞还贴在皿的底部，但已经不会增殖了。我想请问是不是跟我们传代的融合度有关啊？你们做一般是到多少融合度就传代啊？是否还存在其他问题？
二是我们养的脑微血管内皮细胞，传代的过程中会出现很多黑点，而且会随着传代过程中黑点增多，然后细胞也是在传几代后就很不好了。实验室其他人养的细胞也会有一些黑点，但是不会像我们细胞这么多，影响这么大。
我是养细胞的新手，现在有点傻住了。希望大家能给我些建议。非常感谢。

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这个脑微血管内皮细胞，一旦养的过程中有些许差池，受过损伤，就是会产生这样的粘附物，类似黑点。我也遇到过。之后很难再挽救回来。我一般是通过二传筛选出来细胞，然后养起来一大批之后，冻存一部分，过2周然后再重新复苏。这样会筛选出来比较正常的细胞。

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 17:25

我前一阵救过一次染菌细胞，很幸运地救成功了，但没有这么多步。大体上思路都是一样的嘛，就是稀释稀释再稀释，然后加抗生素。我那次用PBS洗了几次，然后加了2倍于正常量的双抗，可能是因为之前养细胞时培养基里没有过加抗生素，加完的效果很好，然后就救活了。
我感觉处理的步骤太多对于细胞的状态不利。而且，个人意见，如果不是一定要救活时还是不要救了，又费时又费力的。有时还救不活，救活了状态还受一些影响。当然我也是刚开始养细胞，没什么经验。向大家学习~~~

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你说的很对。

作者: 了了 时间: 2011-12-8 17:25

请问，你用来拯救细胞的双抗用的什么配方？

作者: hyuu 时间: 2011-12-8 17:25

请问，你用来拯救细胞的双抗用的什么配方？

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一万单位的青霉素，一万单位的链霉素。

作者: lixi559 时间: 2011-12-8 17:26

我最近也在拯救污染的细胞,用的方法和楼主不同:我是先用1XPBS冲洗3遍,然后用10X的PS冲洗两遍,再用100X的PS泡一遍,最后加入含1XPS的培养基培养.前三天还好,到了第四天,污染物又出现了.
我的污染物是我以前没有见过的,比一般的细菌还要小,然后在培养基中跳得很欢快,就像跳蚤那样跳,有哪位好心人知道这是什么菌么?我实验室的人都没见过这样的菌.现在做实验很痛苦,每次都要洗上好几遍.
还有,如果我还想拯救,有没有可能因为我用100X的PS冲击过了,导致细菌产生了抗药性,用PS已经没法去除污染物了?

作者: lixi559 时间: 2011-12-8 17:26

我想请问楼主，我的细胞污染了，但细胞状态一直还行。

我试剂也都是用的新的，不知道为什么还是污染。。

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我的细胞污染,细胞状态也不错.我也郁闷哪!

作者: tieshazhang 时间: 2011-12-8 17:27

您好，学长，我想请教您一个问题，我养的是RWPE-1细胞，之前传十几代都很好，可是最近突然出现了大批污染的情况，不明白原因，最让我郁闷的是六孔板里污染的东西竟然不一样，起初怀疑是培养基出问题了，现在培养基在培养箱里孵育了24小时没有任何变化，我们复苏的细胞刚开始挺好，但是等到换液的时候发现被污染了，请学长指点迷津啊！谢谢您了。

作者: wu11998866 时间: 2011-12-8 17:27

真的不错，我养的是贴壁细胞，总是上清有很多混混的黑东西，但细胞照常长

作者: 彼岸花opp 时间: 2011-12-8 17:27

楼主要向您请教一个问题啊，我最近养的细胞，也不知道是不是种子有问题（从师兄师姐那分的细胞），刚复苏看细胞形态好、背景也干净，传了两代后细胞贴壁时间延长，漂浮的死细胞增多，最要命的是背景变的很脏，但培养基还是清澈透亮，不像是污染。不知道是什么问题，有没什么挽救的方法。

作者: flower-201 时间: 2011-12-8 17:28

借问一下，LZ是否在显微镜下看到过一些小亮点，比细胞小很多，散在细胞之间，培养基无混浊现象，这些小亮点是什么呢？

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-8 17:28

同问。而且也不呈爆发迹象。在高倍镜下可以看到在动，不知道是布朗运动还是自己本身在动

作者: 铜雀 时间: 2011-12-8 17:29

背景：INS-1大鼠胰岛细胞，购入公司，ATCC，复苏好寄给我的，自己不断传代冻存，一个多月都很好，细胞长势很快，状态很好，冻存阶段结束。开始实验。半月后，从新复苏细胞，一周后，发觉细胞长势不好，同细胞房的出现污染。顺势全部丢掉，开始复苏其他的。半个月，复苏了8、9管了，各个代数都复苏过。有的第二天就污染，有的一传代就污染。操作上面，毫无问题，也请其他同学帮忙操作，也换了细胞房，也换了培养箱。还是如此，请高手指点。

细胞的背景：成团贴壁生长。
培养的背景：全部为进口产品

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作者: 铜雀 时间: 2011-12-8 17:30

背景：INS-1大鼠胰岛细胞，购入公司，ATCC，复苏好寄给我的，自己不断传代冻存，一个多月都很好，细胞长势很快，状态很好，冻存阶段结束。开始实验。半月后，从新复苏细胞，一周后，发觉细胞长势不好，同细胞房的出现污染。顺势全部丢掉，开始复苏其他的。半个月，复苏了8、9管了，各个代数都复苏过。有的第二天就污染，有的一传代就污染。操作上面，毫无问题，也请其他同学帮忙操作，也换了细胞房，也换了培养箱。还是如此，请高手指点。

细胞的背景：成团贴壁生长。
培养的背景：全部为进口产品

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