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标题: [讨论帖]养平滑肌细胞及内皮细胞的群友请进 [打印本页]

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 11:17 标题: [讨论帖]养平滑肌细胞及内皮细胞的群友请进

[讨论帖]养平滑肌细胞及内皮细胞的群友请进（转载）

开题了，做兔基底动脉平滑肌细胞的原代培养，同时还会养内皮细胞。深谙摸索之艰辛。从“我为人人，人人为我”出发，得一想法：将各个类似培养的群友召集，以期达到以下的目的：

1、让自己走过的弯路其他群友不再重走，让自己犯过的错误提醒别人小心，能不再犯同样的错误。
2、把自己的心得体会告诉大家，能利于大家提高，找到共鸣的地方；有问题大家讨论，希望能有个交流的空间，大家一起帮助解决。
3、一起关注前沿和最新进展，能适时调整自己的研究内容。
4、有些资源能实现共享，不需浪费同时予人方便。
我也将在我能力范围内不遗余力为大家服务。现在文献检索方面可能能给大家一些帮助。但随着实验进行，我将会将我的过程随时写出来和大家交流，供大家借鉴。

同时希望各位高手能来此授法。

期待大家来此多交流，能结成一个互帮互助的团队。下一步或许可以寻求些赞助成立个什么细胞培养联盟的组织也行。

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 11:18

竟然还有卖人脑血管平滑肌细胞的：
cuturl('http://www.sciencellonline.com/products/1100.htm')
价格也不是太贵，$480/1ml，>>5 x 10^5 cells

作者: wu11998866 时间: 2011-12-10 11:18

我在养脐静脉内皮细胞，想和大家交流

作者: utt0989 时间: 2011-12-10 11:21

养的是大鼠胸主动脉内皮细胞。很好长。附一张免疫荧光照片给大家看看。

图片附件: 85535433.snap.jpg (2011-12-10 11:21, 43.4 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9826

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 11:21

大家只简单留这么一个联系方法不好，至少说说自己培养什么，在哪个城市，这样也许会有人对你有兴趣，会PM你。
能谈谈大家成功的经验和失败的教训那是泽被后世、恩泽万代。
哈哈，期待大家！

作者: lixi559 时间: 2011-12-10 11:22

养平滑肌，最近作了细胞鉴定，肌球蛋白，这是阳性吗？应该是胞桨着色。请高手指点

图片附件: 70485860.jpg (2011-12-10 11:22, 57.01 KB) / 该附件被下载次数 7
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9827

作者: dragonkilly 时间: 2011-12-10 11:23

我在养肺动脉平滑肌细胞,用的是大鼠的,取材简直是苦不堪言,各位大侠有没有这方面的经验?!

作者: lixi559 时间: 2011-12-10 11:24

哪位战友有平滑肌细胞电镜照片啊，我做了1次，等了3个星期，结果不理想，看不见肌丝，密班，密体，文献上的图片很模糊！很苦啊！
哪位战友能有平滑肌细胞action的图片啊，有文献说能看到棕色的肌丝，免疫组化能看到棕色的肌丝，会这么精确？！

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 11:25

最近培养平滑肌细胞时遇到最大的问题是将其剪成1mm3的小块后怎么才能以0.5cm的间距均匀摆置于瓶底，我用剪刀剪后发现会得到很多块块，每块以点点大，用镊子夹也不可能一次夹一块，而且会粘在镊子上，很多时候放不下来，郁闷，大家可有这方面的经验？

作者: 园丁## 时间: 2011-12-10 11:25

用玻璃棒，没必要太均匀。用新刀！最好用刀切！

作者: qqq111 时间: 2011-12-10 11:26

最近培养平滑肌细胞时遇到最大的问题是将其剪成1mm3的小块后怎么才能以0.5cm的间距均匀摆置于瓶底，我用剪刀剪后发现会得到很多块块，每块以点点大，用镊子夹也不可能一次夹一块，而且会粘在镊子上，很多时候放不下来，郁闷，大家可有这方面的经验？

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我用的是牙科探针，很老的那种，其实就是一根小木棒（筷子粗细），一端插一根细钢丝（要插紧），钢丝弯一点，就ok了。用前高压消毒。组织块剪好后，加一，两滴培养基，用吸管吸到瓶子里面，顺壁流下，然后用探针一块块摆好就ok,我每次贴都还可以。
祝早日养出细胞。

作者: loli 时间: 2011-12-10 11:26

我的经验是：在青霉素瓶里剪碎，D-Hanks冲洗1~2次，将上面漂浮的像粘液一样的浮快吸掉，这样小块就很干净，用弯头吸管种到培养瓶里就好摆了，用弯头吸管抹一下就可以了。

作者: nn255 时间: 2011-12-10 11:28

[color=Black正准备养人脐静脉内皮细胞（从ATCC购得细胞株），细胞还没有到货！期待中！
本人搞中医药复方的研究

作者: yes4 时间: 2011-12-10 11:30

我才开始原代培养人腹主动脉平滑肌细胞，在一个小木块上用手术刀切血管可以很容易的得到1-2mm的血管块，贴壁时采用接种针（细菌培养时也用过的，不过前面的铁丝弯成L型）将血管块移入培养瓶，还蛮好用的，大家可以试试。

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 11:30

大家可以在这里都谈谈所用的培养液和血清的类型，我用Gibco的DMEM高糖及四季青公司的胎牛血清，浓度15％，正在等待结果。

作者: duoduo 时间: 2011-12-10 11:31

我用20的血清，也用过25的，15的可能稍偏小。传代时不可锐减！！
dmem中加了hepes，ph好象稳定多了，原代细胞对ph要笱希?荒芗睿?取材过程慢了，损伤大了，以后再好的条件也不行，就会失败！细胞先天不足啦！
个人的1点体会，见笑！

作者: BOSS2011 时间: 2011-12-10 11:31

我用消化法原代培养兔胸主动脉平滑肌细胞的过程。与各位分享，也请指教。
用dmem配0.2%的1型胶原酶[用20的血清的dmem配可能更好，有类似文献}，分装于青霉素小并，每并2-3ml。1只免的胸主动脉置于1并消化液中消化，消化约10几个小时{消化程度的把握要体会}，离心后，接种{若见细胞量大，成功把握大}，绝对静置3天{没必要看，看多了无益}，8天可传代。

作者: lixi559 时间: 2011-12-10 11:32

我已经做了一个多月的大鼠主动脉内皮细胞的培养，已经试过消化法和机械刮法，效果不理想。消化法用的是有0.1％的的胶原酶、0.25％的胰蛋白酶以及胶原酶加胰蛋白酶三种消化，消化后还试着刮血管，对消化的时间也进行过比较30分钟、一个小时等都做过，对消化下来的东西不满意，养在培养瓶里好几天都不贴壁，杂质特多，可能是消化过了，希望能得到各位老师的指点

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 11:32

还有兄弟们，今天我贴块法养的平滑肌细胞，等了5个小时翻转时还是浮起一大片，不知道什么原因，大家分析分析呢，看有谁碰到过的。

作者: 一叶 时间: 2011-12-10 12:14 标题: 回复 #19 北风那个吹的帖子

块大了，不易贴。愈小愈易贴。开始加的培养基少点，能盖上块就行。不必怕细胞差营养，这时细胞在适应新环境，代谢较低。翻转时动作要慢而清。
浮起一大片，我还没碰到。起初我干涸3h，后来干涸缩短为1h，浮起也不多。
祝好运！

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 12:14 标题: 回复 #20 一叶的帖子

感谢一叶兄，我自己也在反思，可能原因我想大致就这些，
一个是块太大了，1立方毫米这个度我始终把握不准，我一直不改像他们做肝细胞培养那样放在培养皿中用剪刀一阵乱剪，总觉得这样剪出来的块太小，没有1立方毫米，而且极不整齐，我都是慢慢的看清楚一段一段逐渐像剪纸片一样的剪的。
第二就是培养基放的多了一些，像水一样漫过去，所到之处全部漂浮，不得已再次倒置，过几个小时再试，还是一样，都反复到了第二天。
第三我的那瓶盖子旋的紧了可能会有些影响
还有就是，我在考虑我的培养瓶都几年前用的，拿来洗，底面不光整，或许影响块贴上去。
最后我考虑的就是，平滑肌层的正反及内外膜处理的干净程度或许也有影响吧？

唉，现在做一次都要花上四五个小时，痛心啊，希望其他刚开始做朋友能有所借鉴，有所留心。

作者: loli 时间: 2011-12-10 12:15

犬胸主动脉平滑肌贴块法，方法成熟，比消化法好控制的多，要点：
1、取材过程要快，取好放4度储存的D-hanks液带入超净台，不然如liguofan战友所述，先天不足；
2、块大小密度影响不是很大（尽量小），关键是边缘要尽量整齐，选用快刀快剪；
3、一定要贴牢，翻瓶时间个人不一，有3－5小时的，也有贴块直接翻瓶的，关键还是贴牢，另外在贴牢的基础上尽量早接触培液，可以在剪块的时候加少量培液略湿润，镊子夹块到培养瓶后，用吸管之类的细长工具将块均匀铺好，加刚好覆盖组织块的培养液量（25cm2培养瓶大概2ml），半小时到一小时内就可翻瓶，动作要轻，从培养瓶一角试着翻，如果块飘起，则再过会翻；
4、贴块无内膜外膜面之分，亦无需刮除内膜，若内膜面向下，会有少量内皮细胞爬出组织块，但只要平滑肌细胞一旦爬出来，内皮细胞生长自然不占优势，会因为平滑肌细胞大量爬出、增殖而漂起来，换液可洗掉，另外传代可纯化平滑肌细胞。
5、培液Gibco的DMEM（高糖4500mg/L）加四季清新生牛血清20％。
一点点小经验，供各位群友参考。

另外，内皮细胞比较难养，至今没有找到成熟的方法，还望各位群友不吝赐教！

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 12:16

DMEM大家用的是高糖还是低糖？

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 12:29

DMEM大家用的是高糖还是低糖？

作者: 一叶 时间: 2011-12-10 12:30

高糖。
建议用1次性培养并，成功机会大于玻璃并。成功后再小心过度成玻璃并。
块愈小愈好。用新刀，快，损伤小。全过程越短越好，我看不必反复洗。

作者: nn255 时间: 2011-12-10 12:31

用牙科探针，牙科探针一头是弧型的，一头是带直角的沟型，而且这种牙科探针比较长，完全可以伸进培养瓶内。先进点的口腔医院应该有，他们用是一次性的。

作者: 盼盼 时间: 2011-12-10 12:40

我养的是鼠主动脉内皮细胞，现在采用灌注法消化，即把动脉血管取出来后一端结扎，再采用1ml的注射器吸取0.1％胶原酶灌注（在培养皿中），反复推抽注射器十分钟左右，消化液离心后培养液清洗，接种后在显微镜下可观察到细胞，×10下细胞亮圆，可见双环的细胞膜，中间一个小点的细胞核。但我尚不能完全确定此细胞为内皮细胞。另外，一根血管得到的细胞数极少，所以我们为保证细胞密度，只用0.2ml的培养液在培养瓶里局部接种。我想请教我是否真的把内皮细胞给消化下来了，每根血管的细胞产量是否还可以提高呢？由于灌注过程中可能暴露时间过长，两次培养都不幸长菌了，我还要继续努力。

作者: 分子式 时间: 2011-12-10 12:40

听说可以用植块法养内皮细胞，我想请教用植块法养平滑肌细胞的兄弟，你们在养的过程中一般什么时候可以见到内皮细胞爬出，什么时候可有平滑肌细胞爬出得到需要的数量呢？

作者: loli 时间: 2011-12-10 12:42

最近培养平滑肌细胞时遇到最大的问题是将其剪成1mm3的小块后怎么才能以0.5cm的间距均匀摆置于瓶底，我用剪刀剪后发现会得到很多块块，每块以点点大，用镊子夹也不可能一次夹一块，而且会粘在镊子上，很多时候放不下来，郁闷，大家可有这方面的经验？

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如果有接种环效果可能会更好,至少可以使剪碎的组织块能够均匀的涂布于培养瓶壁。

作者: loli 时间: 2011-12-10 12:43

组织块的边缘不齐整也不是什么很关键的问题，最重要的是组织块要尽量小，尽量能剪成小米粒大小；另外就是组织块要贴牢，其关键就是培养液可以在6小时后翻瓶的时间再加，这样就可以避免组织块贴不牢而悬浮起来的尴尬了

作者: 小野花 时间: 2011-12-10 12:45

用过内皮细胞株HMEC，如有需要可联系我。
目前正在战斗原代大鼠胸主动脉细胞，用的是急性酶解法，奋斗了很长时间，一直苦于得不到大量细胞。各位战友如有高招请帮一把，谢谢。

作者: 一叶 时间: 2011-12-10 12:48

你用胰酶？

作者: 小野花 时间: 2011-12-10 12:48

我用的是木瓜蛋白酶 0.5mg/ml, 冰箱过夜后， 37度孵育20min后吹散，但效果不好，细胞量较少。

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 12:50

昨日打开培养箱准备换液，但是拿出瓶子一看，乖，培养瓶底有像泥沙一样的东西，想这难道是传说中的污染，赶快取出几瓶发生这种情况的细胞，只剩下前天刚做的还好。一下子悲痛不已，这是我辛苦了半个月的成果啊。就这样付诸东流了。
好好的反思：
可能与我前次换了培养液有关，我的培养液是用时临时加胎牛血清的，上次那瓶用完了，这次换新的胎牛血清。
而且上次又取组织又换液的，可能无菌操作也有问题。
最后赶紧把培养液又过滤了一遍。
想请教群友的几个问题：
1、这种情况是不是就是污染？
2、我平时换了培养液，加入培养箱后培养液马上会变得偏黄，不是像在箱外那样的红的或紫红的，但一般并不浑浊，不知这个有没有问题，一直心存疑虑。

唉，半个月没日没夜的奋斗竟然招致如此后果。

作者: duoduo 时间: 2011-12-10 12:51

大家好
请原谅我以商业目的进入严肃的学术讨论区域，希望各位不要介意。
给大家留些网址方便查阅资料：cuturl('www.cascadebio.com')
cuturl('www.sciencellonline.com')
cuturl('www.cellapplications.com')
希望会有帮助，谢谢各位！

作者: loli 时间: 2011-12-10 12:51

我用的是木瓜蛋白酶 0.5mg/ml, 冰箱过夜后， 37度孵育20min后吹散，但效果不好，细胞量较少。

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有单用木瓜蛋白酶的文献吗，请告知文献名，谢了

作者: loli 时间: 2011-12-10 12:52

这种情况应该就是污染，我碰到多次。污染是头等大敌。只有扔。多少次，欲哭无泪！！！用酒精擦培养箱。
一般并不浑浊，不知这个有没有问题。没问题。

作者: loli 时间: 2011-12-10 12:55

这种情况应该就是污染，我碰到多次。污染是头等大敌。只有扔。多少次，欲哭无泪！！！用酒精擦培养箱。
一般并不浑浊，不知这个有没有问题。没问题。

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 12:55

但是我看司徒镇强的书上写污染应该是有飘浮物，我的泥沙样的物质是沉在瓶底的啊。
下次留照片，希望不要再污染了。

作者: loli 时间: 2011-12-10 12:57

我用消化法原代培养兔胸主动脉平滑肌细胞的过程。与各位分享，也请指教。
用dmem配0.2%的1型胶原酶[用20的血清的dmem配可能更好，有类似文献}，分装于青霉素小并，每并2-3ml。1只免的胸主动脉置于1并消化液中消化，消化约10几个小时{消化程度的把握要体会}，离心后，接种{若见细胞量大，成功把握大}，绝对静置3天{没必要看，看多了无益}，8天可传代。

作者: 04906 时间: 2011-12-10 13:00

我已经做了一个多月的大鼠主动脉内皮细胞的培养，已经试过消化法和机械刮法，效果不理想。消化法用的是有0.1％的的胶原酶、0.25％的胰蛋白酶以及胶原酶加胰蛋白酶三种消化，消化后还试着刮血管，对消化的时间也进行过比较30分钟、一个小时等都做过，对消化下来的东西不满意，养在培养瓶里好几天都不贴壁，杂质特多，可能是消化过了，希望能得到各位老师的指点，谢谢

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 13:01

还有兄弟们，今天我贴块法养的平滑肌细胞，等了5个小时翻转时还是浮起一大片，不知道什么原因，大家分析分析呢，看有谁碰到过的。

作者: 阿敏 时间: 2011-12-10 13:03

老板叫我做平滑肌细胞和内皮细胞，但做什么不知道，取什么地方的平滑肌和内皮细胞也不知道，只知道该药对心血管有作用，我现在一头污水，不知道怎么入手。
各位大侠，你们养平滑肌和内皮细胞做些什么药效呢，或者研究些什么？给我一点指点，不胜感激！

作者: 一叶 时间: 2011-12-10 13:04

培养瓶底有像泥沙一样的东西。
血清。
无菌操作。
过滤。
问题：
1、这种情况是不是就是污染？
2、我平时换了培养液，加入培养箱后培养液马上会变得偏黄，不是像在箱外那样的红的或紫红的，但一般并不浑浊，不知这个有没有问题，一直心存疑虑。

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1、泥沙样的东西是支原体污染，特征是培养液不变黄也不变浑浊。
2、支原体污染是不能通过过滤方法去除的的，因为支原体直径0.1um，滤膜一般为0.22um。支原体污染很难去除，如果可以，最好是扔掉不要了，我试过好多方法，现在觉得比较有效的是：环丙沙星。正常抑菌浓度是1：200，杀菌加大浓度即可。
3、一般来讲，操作造成的污染多为细菌污染（可带手套防止，如果不带手套，切记手不能从任何开口的培养瓶、皿等物正上方经过），支原体污染多数为培液和血清来源。新配的培液可放CO2孵箱48小时检测，如果没有污染即可排除培液和血清问题。
4、培液颜色变化是正常的，只要没有浑浊、没有沉淀、没有絮状漂浮物（有些血清有絮状物，是蛋白析出，不是污染）都是正常的，因为细胞本身代谢就会使培液变酸。

祝你和你的细胞们好运！

作者: 气泡 时间: 2011-12-10 13:05

20%胎牛血清+DMEM，玻璃瓶，组织块剪的很小，差不多一个小时贴壁
问题就是不见细胞爬出来，难道动作太慢造成先天不良？赫赫
培养过程中组织块周围有些胶状物铺展开，是细胞分泌的胞外基质吧？

作者: loli 时间: 2011-12-10 13:05

楼上最好用塑料并，
细胞分泌的胞外基质，我没见过，也没听过。
建议少动细胞，少看，让细胞自在的长。

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 13:06

大家有没有平滑肌细胞7天，10天或20天后生长情况的照片，能不能发到网上来。
现在我的问题就是小块周围爬出很多东西，不知道是不是平滑肌细胞，我想这不是我一个人的问题，很多人都会碰到。

我们我们建一个平滑肌细胞培养的图库，把各个阶段的图片集中在这里。

还是希望我们的斑竹能配合一下，加分方面通融一点。当然，兄弟们的图片不能贴太粗糙的。

作者: loli 时间: 2011-12-10 13:08

现在我的问题就是小块周围爬出很多东西.
当然就是平滑肌，可喜可贺啊

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-10 13:08

我养人脐静脉内皮细胞，发现应用中日友好医院临床研究所的内皮生长因子效果很好，细胞长得比进口因子好，而且便宜。20mg只需400元，可配置200ml培养液

作者: 分子式 时间: 2011-12-10 13:18

我养人脐静脉内皮细胞，发现应用中日友好医院临床研究所的内皮生长因子效果很好，细胞长得比进口因子好，而且便宜。20mg只需400元，可配置200ml培养液

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呵呵，用Roche的ECGF，15mg才650元，可以配750ml培养液(20ug/ml浓度)，而且发文章也好交代。

作者: ffooll 时间: 2011-12-10 13:27

我们培养的也是大鼠胸主动脉内皮细胞。但是最近半年出了一些问题，细胞在玻璃瓶里长的不是很好，必须在塑料瓶里养，而且还要铺一些辅助成分。原先不是这么糟糕的。我想请问高手怎么解决这个问题？希望得到大家的指导。

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 13:30

终于看到大片的平滑肌细胞了，但是这里一片那里一片的，有的地方没有，这可让我在什么时候传代啊？书上说是长满80％，不好控制传代时机了。

作者: 一叶 时间: 2011-12-10 13:31

终于看到大片的平滑肌细胞了，但是这里一片那里一片的，有的地方没有，这可让我在什么时候传代啊？书上说是长满80％，不好控制传代时机了。

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原代培养就是这样的，有的块爬出的细胞多，有的少，还可能有的根本就没有爬出来，都是有可能的。长满80%意思是细胞占培养瓶总面积的百分比了。。。如果每个块铺的很均匀，而且每个块都爬细胞出来的话就可以这样操作，胰酶消化，吹打的细胞传到新瓶，原瓶还可以继续培养；但实际情况是如上所述，各不相同，所以看到有几块周围爬的细胞很多（既典型的波峰－波谷状），而其他地方块爬细胞不多的时候就可以消化吹打，但不要移入新培养瓶，直接在原瓶培养，过几天细胞就分布均匀了！祝你好运！
另，爬出来的东西是不是细胞一看就知道了，细胞是有形状的，平滑肌是长梭行，刚爬出来是先露一个小小的三角从组织块出来，全爬出来就是梭行了，爬满就是峰－谷状。。。如果只说大堆的东西，没有形状，肯定不是细胞！

作者: ffooll 时间: 2011-12-10 13:33

我培养的是大鼠胸主动脉内皮细胞。但是最近半年出了一些问题，细胞在玻璃瓶里长的不是很好，必须在塑料瓶里养，而且还要铺一些辅助成分。原先不是这么糟糕的。我想请问高手怎么解决这个问题？是不是我们养的细胞污染了？急盼答复！！！

作者: 克隆鱼 时间: 2011-12-10 13:34

我也加入一个，我要养人卵巢微血管内皮，用消化法，效果不好

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 13:36

还有这些是什么细胞？脂肪细胞还是内皮细胞呢？
和上次我的细胞被污染时那些东西好像啊！

作者: guagua 时间: 2011-12-10 13:37

Cell Applications有各类哺乳动物的平滑肌细胞卖，可以登录cuturl('http://www.cellapplications.com')

作者: 铜雀 时间: 2011-12-10 13:40

最近培养平滑肌细胞时遇到最大的问题是将其剪成1mm3的小块后怎么才能以0.5cm的间距均匀摆置于瓶底，我用剪刀剪后发现会得到很多块块，每块以点点大，用镊子夹也不可能一次夹一块，而且会粘在镊子上，很多时候放不下来，郁闷，大家可有这方面的经验？

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我把自己的经验说一下: 如果剪成的组织块稍大可用吸管吸取,如果组织块偏小,不妨试试用不同的枪接不同的枪头吸吸看(我做过很多次了,很好用),当然,组织块周围最好有些液体更好吸一些(液体也不可太多,否则组织块会在液体里跑来跑去). 用枪头吸组织块在培养瓶做可能会难度大一些,我多数都是在圆形培养皿中做.

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 13:40

我把自己的经验说一下: 如果剪成的组织块稍大可用吸管吸取,如果组织块偏小,不妨试试用不同的枪接不同的枪头吸吸看(我做过很多次了,很好用),当然,组织块周围最好有些液体更好吸一些(液体也不可太多,否则组织块会在液体里跑来跑去). 用枪头吸组织块在培养瓶做可能会难度大一些,我多数都是在圆形培养皿中做.

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不知大家发现没有，不管是用滴管还是用枪，都有一个问题，组织块很多都粘在管壁上！对于组织本来不多的培养来说非常心疼的。我现在喜欢拿一根头端圆钝，一头弯的钢丝（直径1、2毫米吧）消毒后将组织块挑到瓶里，再拿它来摆放，方便的很，不粘组织的。不知算不算是发明创造。

作者: loli 时间: 2011-12-10 13:45 标题: 回复 #59 北风那个吹的帖子

你说的用你自制的钢丝操作很方便, 不知你如何操作?圆钝端和弯曲端各有何用图?请详细说明,我很感兴趣.多谢!!

作者: loli 时间: 2011-12-10 13:46

平滑肌细胞的鉴定问题：
我很想和大家一起讨论一下平滑肌细胞的鉴定问题，很多群友都在鉴定细胞内有无α-actin的表达，我想这远远是不够的，因为成纤维细胞和肌纤维母细胞也有α-actin的表达，所以α-actin对于平滑肌细胞而言并不是特异的，而且原代培养中很难说没有成纤维细胞的混杂生长。大家有没有想过，除了α-actin外，有无其他可以鉴定的方法？比如：检测肌凝蛋白重链等等。

作者: loli 时间: 2011-12-10 13:47

脐静脉内皮细胞原代培养

内皮细胞培养是体外研究内皮细胞功能的重要手段，人脐带静脉是人血管内皮细胞最易获取的来源，在内皮细胞的研究中被普遍采用。下面就脐静脉内皮细胞原代培养资料整理如下和大家共享：

原代培养方法：
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2004658&sty=3&keywords=%C4%DA%C6%A4%CF%B8%B0%FB+%BC%F8%B6%A8')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1671048&sty=3&keywords=%C4%DA%C6%A4%CF%B8%B0%FB+%BC%F8%B6%A8')

内皮细胞形态
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1942997&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#1942997')

内皮细胞鉴定
1．间接免疫荧光染色方法鉴定VIII因子相关抗原
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=68&id=1913259&sty=3&keywords=%C4%DA%C6%A4%CF%B8%B0%FB+%BC%F8%B6%A8+VIII')
免疫荧光照片
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1939365&sty=1&tpg=1&age=0')
2．免疫组化方法鉴定VIII因子相关抗原
免疫组化方法
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=266752&sty=1&tpg=1&age=0')

内皮细胞原代培养中的常见问题
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1528852&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#1528852')
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=1523237&tpg=1&ppg=1&sty=1&age=0#1523237')

分离\培养小鼠脑微血管内皮细胞加上鉴定的费用估算
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2599546&sty=3&age=0&tpg=1&ppg=1#2599546')

作者: one 时间: 2011-12-10 13:49

平滑肌细胞的鉴定问题：
我很想和大家一起讨论一下平滑肌细胞的鉴定问题，很多战友都在鉴定细胞内有无α-actin的表达，我想这远远是不够的，因为成纤维细胞和肌纤维母细胞也有α-actin的表达，所以α-actin对于平滑肌细胞而言并不是特异的，而且原代培养中很难说没有成纤维细胞的混杂生长。大家有没有想过，除了α-actin外，有无其他可以鉴定的方法？比如：检测肌凝蛋白重链等等。

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成纤维细胞应该没有action吧。而由成纤维细胞分化来的肌成纤维细胞应该有action,但无myosin
.而肌成纤维细胞可分化成平滑肌细胞。
国内最近的文献多用action,myosin双鉴定。也有鉴定缬蛋白的。
请高人指教

作者: loli 时间: 2011-12-10 13:52

成纤维细胞会有少量表达α-actin. liguofan" 提到的国内最近的文献多用actin,myosin双鉴定。也有鉴定缬蛋白的.",不知能否提供这方面的文章,不胜感激.

作者: hyuu 时间: 2011-12-10 13:53

小弟刚做小鼠平滑肌细胞培养不久，现在的状况很不满意，请教一下有关血管的分离，
看书上和人家做大鼠都是要仔细的分离外膜的，可是小鼠的外膜又薄，剥的仔细的话往往内膜都损伤比较多。对比剥和不剥的，我发觉还是后者容易爬出平滑肌样的细胞来。
现在细胞长的很慢，大多过了一周都爬不出来。希望有养过小鼠平滑肌的战友提点一下，谢谢

作者: hyuu 时间: 2011-12-10 13:53

我认为这不是污染，镜下你会看见有大的黑色颗粒，这在传3代后细胞涨势不太好时常见；而且不易冲下，传代后仍有，可以把这样的早做实验用。个人意见仅供参考。

作者: sunnyB 时间: 2011-12-10 14:05

有谁用过angiotensin 2，如何配置的？

作者: fsdd817 时间: 2011-12-10 14:06

一直在养海绵体平滑肌细胞，但是成纤维细胞长得太快了，像杂草一样。几次作了α-actin和vimentin鉴定，只见成纤维细胞占70～80％，原代的平滑肌细胞还占40～50％，一传代就不行了，巨烦。消化法和组织块法都试过，还是不行啊。
一些参考书上说成纤维细胞没有肌动蛋白，但也有这么说的：
“成纤维细胞可转化为具有特征性结构（α－平滑肌动蛋白）的肌成纤维细胞，具有收缩特性，与瘢痕形成、挛缩有关……”。
皮肤科及眼科常有一些抑制瘢痕形成的方法，还有抗肝纤维化的方法，想到有没有什么东西可以添加进培养基，比如激素，苦参碱什么的，来抑制成纤维细胞。
想听听各位的意见和建议，请指教

作者: 四福晋 时间: 2011-12-10 14:06

我在养儿童血管瘤内皮细胞两次都失败了现在进行第三次结果如何不知

作者: loli 时间: 2011-12-10 14:07

我有个问题想向各位高手请教，请各位不吝赐教：
看了上面的全部贴子，大家都没有谈到在养大鼠主动脉平滑肌时分离平滑肌的问题，我想问两个问题，看各位是怎么处理的：
1、取血管时是不是只取胸主动脉？我怎么每次总感觉标本很少？大家一般都取哪一段呢？
2、分离外膜和中膜时总是我最头疼的事，很小的一块长长的组织，放在培养皿内，如何能从上面顺利地把中膜取下来呢？我看文献上都有能取下中膜还是一整块的，我怎么好不容易扒下来，也只能是一小块一小块的碎块呢？根本没法用刀去切，只能放在培养液里用剪刀剪碎了。
请各位大侠说说经验，多谢！

作者: loli 时间: 2011-12-10 14:07

我们培养的也是大鼠胸主动脉内皮细胞。但是最近半年出了一些问题，细胞在玻璃瓶里长的不是很好，必须在塑料瓶里养，而且还要铺一些辅助成分。原先不是这么糟糕的。我想请问高手怎么解决这个问题？希望得到大家的指导。

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您做的是原代培养吗？我上周用兔子主动脉行内皮细胞原代培养，采用的是酶消化法，将兔主动脉翻转，两头结扎，于小瓶中用加0.25%的胰酶置37度水浴中消化10分钟后加入含20%胎牛血清的DMEM，离心10分钟，弃上清，加上述培养液后孵箱培养，可消化下来的细胞很少，48小时了也不贴壁，您能否就我的操作过程予以指正，多谢！

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 14:09

各位群友好！
因有些事情需要处理，所以我的培养停了一段时间，当然培养的细胞前功尽弃了，要从头再来，痛心疾首啊。
现在老板开始催的急了，要我尽快完成实验。但是根据我以前的经验，对于兔基底动脉平滑肌细胞的培养，一方面细胞从组织块爬出的数目少，长的速度慢，有成纤维细胞混杂，分离纯化是一个问题不说，更加要命的问题是：组织块爬出细胞时间就要半个多月，慢慢长至覆盖瓶底80％至少两三个月，如此速度实在太慢，要得到我需要的细胞数需哪年哪月啊，我必定无法如期完成实验了。所以有这些经验的战友但凡不吝指教。如果实验室有培养经验丰富的老师，代我向他（她）求教，我心急如焚，万分感谢，或者可以PM我提供一些信息和帮助。
另外，我们对于胸腹主动脉平滑肌的培养技术目前比较成熟，有需要帮助的我一定尽力，有问必答！
兄弟们，大家团结起来，祝大家实验顺利！

作者: 笑弯了腰 时间: 2011-12-10 14:10

一直在养海绵体平滑肌细胞，但是成纤维细胞长得太快了，像杂草一样。几次作了α-actin和vimentin鉴定，只见成纤维细胞占70～80％，原代的平滑肌细胞还占40～50％，一传代就不行了，巨烦。消化法和组织块法都试过，还是不行啊。
一些参考书上说成纤维细胞没有肌动蛋白，但也有这么说的：
“成纤维细胞可转化为具有特征性结构（α－平滑肌动蛋白）的肌成纤维细胞，具有收缩特性，与瘢痕形成、挛缩有关……”。
皮肤科及眼科常有一些抑制瘢痕形成的方法，还有抗肝纤维化的方法，想到有没有什么东西可以添加进培养基，比如激素，苦参碱什么的，来抑制成纤维细胞。
想听听各位的意见和建议，请指教

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终于找到一个同路人了
我也在养海绵体平滑肌细胞，虽然还没鉴定，但感觉成纤维细胞很多，因为细胞长得很快，3天左右就要传代
即往文献报导培养的海绵体平滑肌细胞纯度很高，我就觉得怀疑
很不幸昨天发现了一篇文章，这是今年3月份欧洲泌尿科学会年会上的一篇文章，这篇文章已经发表在了2005年5月份出版的欧洲泌尿科杂志上，文章摘要大意如下：
“即往报导培养的海绵体平滑肌细胞纯度很高，但作者未能重复出文献报导的结果。作者用123种不同的方法，包括磁性细胞分离技术(MACS)，对来自56名病人的阴茎海绵体平滑肌细胞进行了培养纯化，结果发现，对内皮细胞纯度可以达到98%左右，但对海绵体平滑肌细胞，普通的植块培养法纯度仅为不足5%，用某种酶处理后可以达到25%，最终用MACS技术也只能达到50%的纯度，其余均为成纤维细胞。”
看了这篇文章，真是欲哭无泪，按这篇文章的说法，海绵体平滑肌细胞根本是纯化不了的，那还做什么啊？
文章附后，不知高人有什么意见？

《 TION FOR BASIC RESEARCH AND TISSUE ENGINEERING》

作者: 彼岸花opp 时间: 2011-12-10 14:11

我有个问题想向各位高手请教，请各位不吝赐教：
看了上面的全部贴子，大家都没有谈到在养大鼠主动脉平滑肌时分离平滑肌的问题，我想问两个问题，看各位是怎么处理的：
1、取血管时是不是只取胸主动脉？我怎么每次总感觉标本很少？大家一般都取哪一段呢？
2、分离外膜和中膜时总是我最头疼的事，很小的一块长长的组织，放在培养皿内，如何能从上面顺利地把中膜取下来呢？我看文献上都有能取下中膜还是一整块的，我怎么好不容易扒下来，也只能是一小块一小块的碎块呢？根本没法用刀去切，只能放在培养液里用剪刀剪碎了。
请各位大侠说说经验，多谢！

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我养的是大鼠胸主动脉的内皮细胞，都是取主动脉弓到肾动脉分叉的地方。可以用刀切的，买几个吉列的刮胡刀片，用时高压消一下就ok了，切动脉贼好用。个人的一点体会，希望对你能有所帮助。

作者: tianmei001 时间: 2011-12-10 14:12

您做的是原代培养吗？我上周用兔子主动脉行内皮细胞原代培养，采用的是酶消化法，将兔主动脉翻转，两头结扎，于小瓶中用加0.25%的胰酶置37度水浴中消化10分钟后加入含20%胎牛血清的DMEM，离心10分钟，弃上清，加上述培养液后孵箱培养，可消化下来的细胞很少，48小时了也不贴壁，您能否就我的操作过程予以指正，多谢！

作者: tianmei001 时间: 2011-12-10 14:12

我们不用消化法，用的是机械刮取法，不过这种方法必须多多锻炼几次，技术要求很高的。我们没有做过兔子，都做大鼠的。有问题可以一起探讨的。

作者: 一叶 时间: 2011-12-10 14:13

我今天成功地分离了人脐动脉，外膜如文献所述，可以如袖套样剥脱，但在分离内膜与中膜过程中十分困难，用手术刀背刮去内膜过程中，往往与中膜一同损伤。希望高手指点。(我是先去除外膜，然后剪开血管)

作者: hot_hot_hot 时间: 2011-12-10 14:13

我做大鼠主动脉平滑肌细胞培养,我接种后第二天培养液全变黄了,怎么回事?请各位指教!

作者: 一叶 时间: 2011-12-10 14:21 标题: 回复 #78 hot_hot_hot 的帖子

很可能严重污染了！没在显微镜下看看吗？

作者: 一叶 时间: 2011-12-10 14:22

运气不错，种植的动脉环内皮细胞开始迁出了，终于成功了。^_^欣喜中..........

作者: 伊莎贝拉 时间: 2011-12-10 14:24

我做的是大鼠肺动脉平滑肌细胞培养，今天第一次做，还不知会如何，但感觉取材很麻烦，而且外膜＼内膜也不知道有没有剥干净，只是用刀片刮了几下，我用的培养皿培养原代，我看大家都用的培养瓶，会有什么不同吗？理论上说要把内膜面向下，可是剪完也分不清正反了，就随便放了

作者: eric930 时间: 2011-12-10 14:25

我是新手，请多关照！
我即将养原代,大鼠主动脉平滑肌,请问哪种胶原酶比较好?一般消化多长时间?

作者: mickeylin 时间: 2011-12-10 14:27

我养的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,各位师兄师姐有好的建议,能否指导,我用的组织块贴壁,已有8天了,仍未见血管平滑肌细胞爬出,不知是何原因?组织块也没浮起来!

作者: pengke1983 时间: 2011-12-10 14:28

各位师兄师姐:

我做RT-PCR,怎样把血管平滑肌细胞调整
细胞调整在G1期,G1中期,G1/S期,S期,G2期来表达基因情况变化,又怎样标时相点,具体药物浓度及剂量、时间怎样,请高手指导,多谢!

作者: 泡泡 时间: 2011-12-10 14:31

我准备要养牛脑血管内皮细胞，在广州。pm我就可以了

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朋友，我就要毕业，所用ECV304上当了，只有再找牛或鼠的血管内皮细胞，能否惠赠，购买，或提供相关购买信息，非常感谢，加急

作者: 西子 时间: 2011-12-10 14:52

我做的是元代培养的支气管平滑肌细胞,太难了！请问各位有内有知道这种细胞可不可以购买啊！

作者: 薄荷侠 时间: 2011-12-10 14:58

我现在正在养平滑肌和内皮细胞。
对于脐动脉平滑肌细胞采用植块培养法。分离外膜已经没问题，可怎样才能将内膜刮干净呢？
脐静脉内皮细胞采用消化法，具体如下：取回脐带20cm，找到静脉，一端接16号针注射器，PBS冲洗至流出液体清澈。用止血钳夹住另一端注入0.25％胰酶8ml，37度消化15～20min。抽出消化液，用含20％胎牛血清的培养基中止消化，1000r/min，8min离心。弃上清，用含20％胎牛血清的培养基悬浮沉淀，接种于培养瓶。
可是得到的细胞数目很少。书上说7天可扑满瓶底，我的已养15天了，前几天还可见少量细胞，今天满视野多是小黑点。难道细胞死了？
脐动脉内皮细胞采用植块法。第一天，细胞爬出得蛮多，第三天将组织块吸出。今天是第7天，满视野也是小黑点。这是怎麽回事？？
请大家多多指教.

作者: bohe221 时间: 2011-12-10 15:02

请养平滑肌细胞的高手指点:
我养大鼠血管平滑肌细胞,DMEM(高糖)系GIBCO产品,血清也是澳大利亚进口分装的,试剂配制也没有问题.我师兄与我是同样试剂,也是一起配制的.他的细胞长的很好,而我的却不长.不知什么原因,现在好着急.请高手指点.
谢谢!!

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-10 15:03

我现在正在养平滑肌和内皮细胞。

脐静脉内皮细胞采用消化法，具体如下：取回脐带20cm，找到静脉，一端接16号针注射器，PBS冲洗至流出液体清澈。用止血钳夹住另一端注入0.25％胰酶8ml，37度消化15～20min。

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我们用胶原酶消化，长的挺好的

我也养平滑肌和内皮细胞，大鼠的胸主动脉平滑肌和人的脐静脉内皮，感觉内皮比平滑肌好长多了@_@

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-10 15:03

有没有人养过小鼠内皮？

作者: wu11998866 时间: 2011-12-10 15:10

请教各位大侠有没有用消化法做大鼠主动脉平滑肌细胞培养的？摸索中，因时间紧急，找寻同路人

作者: hot_hot_hot 时间: 2011-12-10 15:11

我培养大鼠主动脉内皮细胞，请哪位高手指教一下，不胜感激：
1 培养液中加青霉素和链霉素的量分别是多少？
2 消化液中胰蛋白酶含量多少比较好？消化时间多少比较好？
3 培养的细胞有成纤细胞污染，用什么方法分离内皮细胞？
4 取出的主动脉是不是用无菌PBS液多洗几次就能保证无菌？

作者: duoduo 时间: 2011-12-10 15:11

cuturl('http://www.cellapplications.com/RAOEC.htm')请查看

作者: 小野花 时间: 2011-12-10 15:12

各位好！
我培养鼠脑皮质微血管平滑肌，参考”孙笃新芮耀诚曾国钱等。牛脑微血管平滑肌细胞的体外培养及其产生血小板激活因子的观察解剖学杂志，1992，15（1）：27－29“上的方法。作了3次都失败了。
请养脑皮质微血管平滑肌的战友赐教，你们用的什么方法，用的什么材料？多谢

作者: 西子 时间: 2011-12-10 15:12

我做小鼠的肝细胞原代培养，结果作了5次都失败了。惨！不是黑胶虫污染就是细胞全死亡，污染时候贴的细胞倒很多，原来我是全部过程在超净台上作，用普通级的，后来改为取出肝脏后在超净台上做，用清洁型的，我全过程用两副手套，耗时一小时左右，
用过原位灌注胶原酶法，机械法，酶加机械法，都归于失败，到底错在哪？？？？有同行的师兄师姐吗，你们可否遇过同样经历，还望指点一下新手，小妹这里不胜感激！

作者: 蒲公英 时间: 2011-12-10 15:13

我培养大鼠主动脉内皮细胞，请哪位高手指教一下，不胜感激：
1 培养液中加青霉素和链霉素的量分别是多少？
2 消化液中胰蛋白酶含量多少比较好？消化时间多少比较好？
3 培养的细胞有成纤细胞污染，用什么方法分离内皮细胞？
4 取出的主动脉是不是用无菌PBS液多洗几次就能保证无菌？
首先，青霉素80万u /瓶加4ml生理盐水溶解，链霉素100万u /瓶加5ml生理盐水溶解。两种溶液各取4ml混匀，-20度保存。用时在1升培养液里加1ml

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胰蛋白酶用0.25%。消化时间自己定。
我们一般用机械刮取法分离细胞。
无菌条件下取出的主动脉首先在10%1640培养液里洗三次，然后用20%1640配养液洗一次就好。
希望对你有帮助。

作者: milkdog 时间: 2011-12-10 15:14

还没有开始做试验呢！老板要先找些资料自己看看！找到个分离方法！资源共享啊！我是新手大家多多照顾啊！QQ:43387318
Isolation of endothelial cells, smooth muscle cells and fibroblasts.
The protocol is described briefly.
Requirements:
Endothelial Cell Medium : DMEM 500ml +50 ml FCS +5 ml P/S+ Supplement Pack without Amphotericin and Gentamycin.
Smooth Muscle Cell Medium with supplementary Packet
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium (DMEM),
Stop medium : M 199+ 100 Ml FCS +5 ml PS
DMEM with 10 % FCS was used instead of Stop medium
Procedure
1. Preparation of T Flask coated with Gelatin
0.1 % Gelatin Sigma (G-2500) was prepared by dissolving gelatin in Sterile Deionised Water.
2. Preparation of Collagenase A :
0.01 g of Collagenase A ( Roche, Cat No: 103578) was taken and dissolved in 10 ml PBS and was passed through a sterile filter.
A.Isolation of Endothelial Cell :
An artery was taken and washed thoroughly outside and inside with PBS. The artery was then clamped with Arterial Clamps. Collagenase was injected in the artery with a thin needled syringe till the artery was totally filled. The artery was incubated in PBS at 37° C for 30 minutes. The artery was taken out and the arterial clamps was removed and the fluid from the lumen was collected in a tube, which was then filled with 5 ml Stop Medium. The tube was centrifuged at 1200 rpm for 10 minutes to sediment the cells from the lumen. The supernatant liquid was removed and the cell pellet was resuspended in a 25 ml culture flask previously coated with gelatin. 10 ml EC media was pipetted in the flask to support the growth of the Cell. The Flask was incubated at 37 °C.

作者: milkdog 时间: 2011-12-10 15:14

B.Isolation of Fibroblast
After the fluid from the lumen was taken out from the incubated artery, the adventitia of the artery was pulled out and minced into small pieces in a petridish (6cm) and 6 welled culture vessel and left it for drying. DMEM was added in the petridish and 6 welled culture vessel and incubated at 37 C
C.Isolation of SMC
The artery was cut longitudinally to make the vessel flat like structure and the inner layer was cut into small pieces. The small pieces were put into petridish and 6 welled plates and left it for drying. SMC media was put into the dish or plate and incubated at 37°C in the incubator.
Observation
An area was marked in the culture dishes and observed carefully under the microscope. The following pictures are taken at a particular site from the expected endothelial cell culture.

After 5 days of culture After 6 days of culture

After 7 days of culture After 8 days of culture.

The idea
As the culture could be mixture of different cell types. It would be necessary to separate different cell type. This can be achieved by
1.Magnetic Bead Method
2.Single cell isolation Method.
For the Single cell isolation Using Micromanipulator.
The idea is to select a particular cell from the early colony which contains very less number of cell and where no or only single cell was seen earlier.
Proposed Procedure:
An ideal area is to be choosen and to be trypsinised with Trypsin-EDTA under the miscroscope with a micropipette (Standard Protocol). As the cell detach from the surface of the culture disc, a single cell is to be aspirated with a micropipetted and to be put in an appropiate media. The flask is to be incubated. Change of media is to be done every 24 hours till confluency. The cell type is to be determined with immnocytochemistry.

图片附件: 93579043.jpg (2011-12-10 15:14, 45.31 KB) / 该附件被下载次数 17
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9835

作者: eric930 时间: 2011-12-10 15:16

我今天成功地分离了人脐动脉，外膜如文献所述，可以如袖套样剥脱，但在分离内膜与中膜过程中十分困难，用手术刀背刮去内膜过程中，往往与中膜一同损伤。希望高手指点。(我是先去除外膜，然后剪开血管)

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我也取脐动脉平滑肌细胞，尝试了很多次都没有很好的去外膜的办法，能告诉我您具体是怎么做的吗？非常感谢！

作者: DNA 时间: 2011-12-10 15:17

用两个小号的有齿镊，一个夹紧剥离出的脐动脉，另一个小心地撕开外膜，不能太深，以免撕开中膜。一般可以有一段像袖套样剥下来，这一段的外膜成功剥离了。

作者: 了了 时间: 2011-12-10 15:18

想问下各位，有没有在生物材料上种过脐带静脉血管内皮细胞或者是平滑肌细胞的！
比如说在胶原蛋白纤维网上、甲克素纤维网上、或者是其他的生物材料上！我想了解下相关方法！请各位大侠赐教！多谢！

作者: qqq111 时间: 2011-12-10 15:18

我在生物材料上种植平滑肌细胞，效果不错，很容易贴壁，电镜照片很清晰

作者: 爱老虎游tt 时间: 2011-12-10 15:18

首先，青霉素80万u /瓶加4ml生理盐水溶解，链霉素100万u /瓶加5ml生理盐水溶解。两种溶液各取4ml混匀，-20度保存。用时在1升培养液里加1ml.
胰蛋白酶用0.25%。消化时间自己定。
我们一般用机械刮取法分离细胞。
无菌条件下取出的主动脉首先在10%1640培养液里洗三次，然后用20%1640配养液洗一次就好。
希望对你有帮助。
我用的是植块法,请问无菌条件取出胸主动脉的"无菌条件"是怎样达到的?我用的是M199培养液,必须用1640洗吗?谢谢指教

作者: 04906 时间: 2011-12-10 15:19

经过3个月的学习,终于养活了兔血管平滑肌细胞,附数码相机照片一张.

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作者: 04906 时间: 2011-12-10 15:19

再传一张,照相技术不好,请多指教

图片附件: 56648830.snap.jpg (2011-12-10 15:19, 24.62 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9837

作者: 04906 时间: 2011-12-10 15:20

3~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

图片附件: 33730439.snap.jpg (2011-12-10 15:20, 33.03 KB) / 该附件被下载次数 2
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9838

作者: 04906 时间: 2011-12-10 15:20

刻苦学习照相技术一天,有所长进,再发一张今天的照片

图片附件: 38435740.snap.jpg (2011-12-10 15:20, 34.79 KB) / 该附件被下载次数 9
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9839

作者: baidukk 时间: 2011-12-10 15:20

我也在养大鼠动脉内皮细胞，养了两次，效果不好，请教大家，培养基用什么样的好？其中加入生长因子吗？

作者: bohe221 时间: 2011-12-10 15:21

我们在处死大鼠后泡在酒精里5分钟，然后在操净台里取动脉，取得时候要再次用酒精棉将大鼠进行消毒，剪外面皮的手术器械和里面的要分开，手术器械也要严格消毒，每次操作完毕后将手术器械在酒精灯上烧一会儿，尽量保证无菌。我好几天没有上网，希望我们的方法能对你有所帮助。

作者: fqswdzd 时间: 2011-12-10 15:22

终于找到组织了！
我做了半年的兔VSMC的原代培养简直就是苦不堪言啊，在实验的开始阶段我用的是胶原酶消化法，消化的时间总是掌握不准确，对细胞的活力可能造成伤害，细胞总是贴壁的很少（后来考虑可能我用的血清不行，因为是国产的胎牛血清）。最近改用贴块法了，因为胶原酶的价格实在太高，想请教大家有什么好的方法在把组织块放进培养瓶的时候不会使膜的内外面弄反了。还有想请教各位你们都用的是哪个公司的血清啊？？

作者: ha111 时间: 2011-12-10 15:22

各位同道，大家好。我也准备做动脉内皮细胞和平滑肌细胞的共培养，难度很大，直接购买细胞株太贵，我准备从大鼠主动脉取内皮细胞和平滑肌细胞，不知难度如何？另外共培养体系采用transwell还是PET膜好？共培养体系中采用什么培养基？请各位大虾指点。我是苏州大学的，非常希望和大家共同交流学习，分享成功和教训。

作者: dragonkilly 时间: 2011-12-10 15:22

1.经去除外膜和内皮后所得组织块不需区分正反面，可用探针或吹打管直接放入陪养瓶。
2.用杭州四季清的血清的人较多。

作者: guagua 时间: 2011-12-10 15:23

我在养脐静脉内皮细胞一开始长不好现在状态很好长得也比较快
希望和大家多交流

作者: loli 时间: 2011-12-10 15:23

【原创】我觉得原代人脐静脉内皮细胞很好养，M199加10%小牛血清即可。关键，脐带要新鲜，最好取自健康产妇。胶原酶消化时间不要超过15-20分钟。传代后，营养要求就高了，必须加入生长因子，而且消化时一定要小心，千万不能过，否则就完蛋。以上是我的一些心得，愿与大家分享，共同进步。

作者: zhezhe 时间: 2011-12-10 15:24

我做了两个月,终于能做好原代长出细胞,可是一传就死!现在遇到的问题是污染,不知道出在哪个环节!今天过滤,结果滤膜破了,是请师兄安了,结果也不牢靠!现在我什么都没有了!!!5555

作者: toy 时间: 2011-12-10 15:24

请教各位：
大家在做血管平滑肌组织贴块法中细胞刚爬出组织快是什么摸样的啊？还有就是一般过几天可以见到典型的长梭状贴壁生长的平滑肌细胞呢？过多长时间可以长满呢？
根据我所做的，我最早在第六天就看到有长梭状贴壁生长的平滑肌细胞，但是细胞一直没有长满过，因为有部分组织快周围没有长出细胞，不知道这是什么原因？细胞刚开始的时候很符合资料介绍的针形的形态表现，但是过几天细胞就明显表现出营养不良的形态。我一直认为是我所用的杭州四季清的血清不行，就这个问题我也咨询了中国医学科学院的老师，他们一致认为国产的血清是不能满足培养血管平滑肌细胞的，所以我也想了解一下各位是否用的是国产血清，有没有原代做成功过的，可以传几代？

作者: 中国特色 时间: 2011-12-10 15:25

我现在养原代用的是国产血清，胎牛血清，一周左右能爬出较多细胞，练了两个月，基本上成熟，但是传代到三四代就会污染，我觉得国产血清还是可以的，当细胞长出后尽量不要在换液时洗去培养组织块，还有就是隔天换液，因为细胞长出后营养需要的多，不能较长时间才换！

作者: 小螺号 时间: 2011-12-10 15:26

我也想请教大家！原代时长的比较满，可传到三代就出现污染，培养液变混，但并不是变黄，而是往红色走，我估计是支原体污染，可是如果加药应该用哪种，量应该是多少！？我为了排除污染原因，将以前的培养液都试培养，并没有污染，可是为了保险，我全都不要了。现在没有培养基了！更疑惑的是，换液的和做原代的都是一样的培养基，怎么会到比较后面才出现这种情况！照理说，原代要长满也是半个月，出问题在原代就该有了！哎！郁闷呀！现在九号做的原代也长了，就是不知道能撑到何时。今天又做了一只！

作者: 伊莎贝拉 时间: 2011-12-10 15:26

呵呵，贴块法培养血管平滑肌细胞的一点小经验：

1。操作一定要快速，尽可能少牵拉血管。
2。严格的无菌观念。
3。事先准备好一块小木板，高压灭菌，以便在上面操作，提高处理血管的速度。
4。准备一把新的刀片，切血管时使血管端面整齐，切的也快。
5。贴片时尽可能的少带培养液或PBS，可以使小块很快粘到培养皿的底部，避免加液时贴块漂起。
总之，尽可能快的处理血管，在不使贴块飘起的前提下，早加培养液，细胞会长出更多、更快。

作者: zhezhe 时间: 2011-12-10 15:27

我在养肺动脉平滑肌细胞,用的是大鼠的,取材简直是苦不堪言,各位大侠有没有这方面的经验?!

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嘿嘿，偶养了好几年啊。要说取材嘛，真是有点难啊。说到经验，就是一个字：练。时间长了就好了，先不要培养，拿几只鼠的肺练习剥离肺动脉，尽可能的把细小的分支也剥离出来，还不能牵拉。然后练习动作熟练和快速。最后上超净台，培养细胞吧。不够培养细胞还要熟练一段时间，体会一段时间才能成功。呵呵，欢迎交流。

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-10 15:27

因为课题缘故，需要培养人血管平滑肌细胞．我希望从脐带血管中获得ＳＭＣ，但参考了教科书方法和文献方法，均告失败．我把收细胞过程写出，请大侠们会会诊吧，希望能早日养出细胞来．谢谢

组织块法：
１．剖宫产所取脐带，４度无菌带回，０．２５％氯霉素冲洗三次；
２．分离出脐动脉，解剖显微镜下剥除外膜，切为小段，ＰＢＳ洗净血渍；
３．以眼科剪将动脉剪为小块，再以显微外科剪将其剪为１mm3大小；
４．滴几滴培养液于培养皿中，均匀铺满底部，将组织块均匀分散于培养皿，间隔０．５cm，全过程保证组织块湿润状态．
５．过夜加液．（２０％ＦＢＳ的Ｍ１９９）
　以此方法，组织块贴壁后，边缘清楚，皿底清洁，但２周未见细胞爬出（７天时换一半液）

消化法：
剪碎方法同贴壁法，剪碎组织后，试过的消化方案如下：
Ｉ型胶原酶，以０．１％的浓度，分别消化０．５，１，１．５，２小时（３７度），过夜（４度），组织块已基本消化完全，滤网过滤后离心，收集，以２０％ＦＢＳ的Ｍ１９９培养，但２４小时未见细胞贴壁．仅看到大量的碎屑和少量红细胞，和众多类似细胞的亮圆点．

脐动脉的感觉是切碎后就象鼻涕一样，好象很难有＂块＂的感觉，不知各位养动脉平滑肌的战友有没有体会，请大家不吝赐教．

作者: whitesheep 时间: 2011-12-10 15:28

我给大家问个好，献上动脉平滑肌细胞Actin免疫组化图一张作见面礼。

图片附件: 52866709.snap.jpg (2011-12-10 15:28, 13.55 KB) / 该附件被下载次数 6
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9840

作者: 生物迷 时间: 2011-12-10 15:29

用来养脐静脉内皮的胶原本酶一定是Ｉ型的吗，ＩＶ型的行不行？

作者: 一叶 时间: 2011-12-10 15:29

完全可以，其实几型胶元酶的活性差不多，我都试过，感觉没有明显不同；我专门看过几种胶元酶的介绍，大致如下：1型：组分中各种酶的活性差不多；2型：活性最强，但也要防止消化过度；3型：记不太清了：4型：活性最弱，对于膜蛋白的损伤最小。

作者: 小鱼鱼 时间: 2011-12-10 15:34

我记得胶原酶的分型好象是根据其作用的胶原类型来分的，但不同的产家有不同的分类法，以SIGMA公司为例，其1-6型为粗制品，7-12为相对应的精制品；分型主要是根据其作用的胶原类型来分的，其中5型主要用于胰岛的消化。
1型胶原酶对应的胶原在细胞连接中存在，所以用其消化后常能得到分散的细胞，因而大多数组织细胞的消化都可用。
组分中各种酶的活性是因为在制剂时没有提纯（因为1-6都是粗制品），可在使用时添加不同的试剂来抑制不需要的酶，或提高需要的酶的活性。

作者: 园丁## 时间: 2011-12-10 15:39

血管可以顺管壁剪开，内皮面贴于培养皿上，上可盖一盖波片，前三天不要换液！

作者: ffooll 时间: 2011-12-10 15:40

请问,如何快速提取支气管平滑肌细胞,不用培养,而是直接分离出单个的细胞.

作者: 伊莎贝拉 时间: 2011-12-10 15:41

遇到问题,群友们看看我这个帖子:
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=4189828&sty=1&tpg=3&age=0')

作者: lixi559 时间: 2011-12-10 15:41

我所培养的平滑肌细胞所用血清是：Gibco的胎牛血清。

作者: ha111 时间: 2011-12-10 15:41

请教做平滑肌细胞实验可以用细胞株吗？与原带培养的平滑肌细胞有何不同？哪里有平滑肌细胞株?谢谢！

作者: caihong 时间: 2011-12-10 15:42

我以前养过HUVEC，是自己取的原代细胞，感觉就是这种细胞对胰酶比较敏感，而且养不了几代就要取新的

作者: toy 时间: 2011-12-10 15:42

做了一个多月的脐带血管平滑肌和内皮培养，结果很不理想！
相信这里一定有在这方面非常成功的学哥学姐，能不能让您的具体培养的方案发出来让我们好好学习下！
能否告知所用培养液的具体组分，血清的浓度和购买的公司，生长因子是否加了及公司, 还有其他相关的步骤！
万分感激！

作者: tieshazhang 时间: 2011-12-10 15:43

我看我是养内皮细胞最笨的一个了，养了20多根就没有成功，有什么好建议给我，希望大家不吝赐教。我开始是酶不行，消化的细胞数特少，现在是污染不断。真的很郁闷，我也没用ecgf，总之太笨，又太穷

作者: bohe221 时间: 2011-12-10 15:43

大家好，我最近在培养平滑肌细胞。用的是贴块法。等到一周看的时候已经长出细胞，但是在长细胞的地方都没有血管块了，而且好多块已经漂浮起来了。所以我不敢确定长出的细胞是不是平滑肌细胞。有哪位战友遇到过这样的问题么？还有我打算做鉴定，我看帖子里有好多高手，可以指导一下么？鉴定需要病理那边的人帮我们么？还是自己就可以做好？急盼回复，谢谢！

作者: 彼岸花opp 时间: 2011-12-10 15:44

我想做平滑肌细胞的鉴定,不知道哪个公司的a-actin抗体比较好?

作者: 彼岸花opp 时间: 2011-12-10 15:44

我想给平滑肌细胞传代，不知道胰酶用多大浓度的比较好？还加不加EDTA呢？在这里EDTA的作用主要是什么？看了很多文献，各种说法都有，搞的都头大了，希望各位高手多帮忙，谢谢！！

作者: yysr238 时间: 2011-12-10 15:46

大家好:
我是一个刚刚加入到细胞培养团队里的新手，感觉一头雾水，有谁能提供一些入门必读的细胞培养书目吗，非常感谢。我在上海，想做的是自发性高血压大鼠（SHR）的主动脉平滑肌细胞培养，希望各位高手指点

作者: 阿敏 时间: 2011-12-10 15:47

给平滑肌细胞传代，酶用得浓度0.25% 比较好，原代敏感，可适当降低酶的浓度，不必加EDTA即可。

作者: jrwyyplt 时间: 2011-12-10 15:48

我也加入。我来自哈医大，04级硕士。刚进实验室，养VSMC AND 巨噬细胞。VSMC 从鼠胸主动脉取材。

作者: jrwyyplt 时间: 2011-12-10 15:49

老板和师姐以前养VSMC用的是II型胶原酶来消化,刚进实验室，发现学哥学姐用的是I型胶原酶，不知哪个更好？

作者: jrwyyplt 时间: 2011-12-10 15:49

我有个问题想向各位高手请教，请各位不吝赐教：
看了上面的全部贴子，大家都没有谈到在养大鼠主动脉平滑肌时分离平滑肌的问题，我想问两个问题，看各位是怎么处理的：
1、取血管时是不是只取胸主动脉？我怎么每次总感觉标本很少？大家一般都取哪一段呢？
2、分离外膜和中膜时总是我最头疼的事，很小的一块长长的组织，放在培养皿内，如何能从上面顺利地把中膜取下来呢？我看文献上都有能取下中膜还是一整块的，我怎么好不容易扒下来，也只能是一小块一小块的碎块呢？根本没法用刀去切，只能放在培养液里用剪刀剪碎了。
请各位大侠说说经验，多谢！

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我建议只取胸主动脉，取腹腔段容易污染。
我现在的做法是先把血管段的外膜撕下，然后剪开血管，平铺，用刀片刮去内膜，按后剪碎。

作者: dotaaa 时间: 2011-12-10 15:50

我做大鼠内皮细胞的原代培养，用的是贴块法，块周围长满了密密麻麻的梭型细胞，但就是胞质中有大量空泡，培养液也很清澈，不像是污染了，请哪位高手指教一下，还有，怎样才能将其改良成正常细胞。

作者: BOSS2011 时间: 2011-12-10 15:52

我做大鼠主动脉原代培养觉得组织还是听多的，你可以从主动脉弓处开始取一直到膈肌上方。取出以后在超净工作台里剪掉外面的结缔组织，注意不要把血管剪掉太多的洞，否则会增加分离外膜的难度。另外分离外膜时用一个弯镊先在动脉的一个角压出一个痕迹，然后另一把镊子从这个痕迹处开始往下分离。如果能从膈肌段向主动脉弓段分离会比较顺。

作者: 薄荷侠 时间: 2011-12-10 15:52

我还做大鼠基底动脉平滑肌细胞的原代培养，我觉得之前的步骤都没有问题，就是我传代的时候，越往后传细胞变得越扁，也就是立体感越来越差，加入胰酶消化后细胞也不能变得很园，有时候是那种短棒状的。我的实验要用8－12代的细胞，我往往是养到第5代时，细胞状态就每况愈下了。哪位同行是养基底动脉的，交流一下。

作者: 薄荷侠 时间: 2011-12-10 15:53

大家:
我是一个刚刚加入到细胞培养团队里的新手，感觉一头雾水，有谁能提供一些入门必读的细胞培养书目吗，非常感谢。我在上海，想做的是自发性高血压大鼠（SHR）的主动脉平滑肌细胞培养，希望各位高手指点。email:yysy999@163.com

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司徒镇强和吴军正主编的《细胞培养》不错，可以看看。

作者: HP007 时间: 2011-12-10 15:53

我还做大鼠基底动脉平滑肌细胞的原代培养，我觉得之前的步骤都没有问题，就是我传代的时候，越往后传细胞变得越扁，也就是立体感越来越差，加入胰酶消化后细胞也不能变得很园，有时候是那种短棒状的。我的实验要用8－12代的细胞，我往往是养到第5代时，细胞状态就每况愈下了。哪位同行是养基底动脉的，交流一下

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我也养大鼠基底动脉平滑肌细胞,有一些问题还想请教你(为了说的清楚,已给你发了E-mail),我目前还没遇到你这种情况,因为我只用3-6代,不过我觉得基底动脉平滑肌细胞比较难消化,传代我都用0.25%胰酶+0.02%EDTA.养细胞我用的是20%血清的DMEM-F12,你的细胞状态不好是不是可以提高一下血清的浓度.

作者: 小鱼鱼 时间: 2011-12-10 15:55

我在养猪的主动脉血管内皮细胞和脐静脉内皮细胞，养的过程也不是很顺利，不过也养了一段时间了，有些问题可以和大家交流交流。

作者: 二丫头466 时间: 2011-12-10 15:55

我有个问题想向各位高手请教，请各位不吝赐教：
看了上面的全部贴子，大家都没有谈到在养大鼠主动脉平滑肌时分离平滑肌的问题，我想问两个问题，看各位是怎么处理的：
1、取血管时是不是只取胸主动脉？我怎么每次总感觉标本很少？大家一般都取哪一段呢？
2、分离外膜和中膜时总是我最头疼的事，很小的一块长长的组织，放在培养皿内，如何能从上面顺利地把中膜取下来呢？我看文献上都有能取下中膜还是一整块的，我怎么好不容易扒下来，也只能是一小块一小块的碎块呢？根本没法用刀去切，只能放在培养液里用剪刀剪碎了。
请各位大侠说说经验，多谢！

我也在养小鼠平滑肌细胞，每次取材是为了提高成功率我是胸主，腹主都取的，放入盛有D2Hanks 液的培养皿中,去除血污及周围组织,获干净光滑的血管段,转移入另一盛有D2Hanks 液的培养皿中,左手用眼科镊固定血管段端,右手用另一只眼科剪反复来回刮，刮去内膜层细胞,尽量刮干净。

作者: 二丫头466 时间: 2011-12-10 15:56

养平滑肌细胞的高手指点:
我养大鼠血管平滑肌细胞,DMEM(高糖)系GIBCO产品,血清也是澳大利亚进口分装的,试剂配制也没有问题.我师兄与我是同样试剂,也是一起配制的.他的细胞长的很好,而我的却不长.不知什么原因,现在好着急.请高手指点.
谢谢!!

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血清是进口的应该没问题，或许你可以改用20％的血清。既然你和你师兄用的是同样的试剂，那应该是小鼠组织块的问题吧，我也在养小鼠平滑肌细胞，个体之间的差异很大，从同一根胸主动脉剪下来的组织块种在6孔板里，有的孔5，6天的时候能明显见到从组织块上萌出来的细胞，可有的孔就长的很慢。建议你把组织块种到板里后，一周不要动培养板，第7天再拿出来观察。

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-10 15:57

我有个问题想向各位高手请教，请各位不吝赐教：
看了上面的全部贴子，大家都没有谈到在养大鼠主动脉平滑肌时分离平滑肌的问题，我想问两个问题，看各位是怎么处理的：
1、取血管时是不是只取胸主动脉？我怎么每次总感觉标本很少？大家一般都取哪一段呢？
2、分离外膜和中膜时总是我最头疼的事，很小的一块长长的组织，放在培养皿内，如何能从上面顺利地把中膜取下来呢？我看文献上都有能取下中膜还是一整块的，我怎么好不容易扒下来，也只能是一小块一小块的碎块呢？根本没法用刀去切，只能放在培养液里用剪刀剪碎了。
请各位大侠说说经验，多谢！

我也在养小鼠平滑肌细胞，每次取材是为了提高成功率我是胸主，腹主都取的，放入盛有D2Hanks 液的培养皿中,去除血污及周围组织,获干净光滑的血管段,转移入另一盛有D2Hanks 液的培养皿中,左手用眼科镊固定血管段端,右手用另一只眼科剪反复来回刮，刮去内膜层细胞,尽量刮干净。

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内膜层主要是内皮细胞，我们是用纱布在Hanks液中擦试就可以了，然后用眼科镊剥去外层，切碎或剪碎后消化。

作者: 蒲公英 时间: 2011-12-10 15:58

（1）将脐带剪成约4cm左右长度的小段，在烧杯内反复冲洗，将血冲掉；
（2）将脐带移入一盛有D-Hank’s缓冲液的平皿中，分离脐动脉；
（3）分离的脐动脉移入另一平皿中，眼科剪、镊除去血管外膜的结缔组织；
（4）纵行剪开血管，D-Hank’s缓冲液冲洗血管内壁数次，无菌刀片刮除内膜；
（5）撕下中膜平滑肌层，放入另一无菌的盛有DMEM/F12培养基的平皿中；
（6）眼科剪将血管剪成0.5～1mm3的小块；
（7）移入25ml培养瓶内，用玻璃分针以3～5块/cm2均匀种植于瓶底；
（8）慢慢翻转培养瓶，瓶底朝上，加适量培养基；
（9）放入37℃ 5%CO2培养箱内干涸2.5～3小时后，将培养瓶轻轻翻转，使植块刚好浸入培养基中。
这是我做平滑肌细胞元代的步骤，大家分享

作者: qqq111 时间: 2011-12-10 15:58

我在养人体心血管主动脉平滑肌细胞。用的是fisher 得专门培养这种细胞的培养液。很好用。缺点贵了点。

作者: yysr238 时间: 2011-12-10 15:58

大家好, 我也正在做大鼠胸主动脉平滑肌细胞培养, 贴块法, 取材比较顺利, 但不知为什么, 到现在等了14天了, 还没有明显的细胞爬出来? 我是用杭州四季清的胎牛血清, 也无污染, 想想也不至于到现在也爬不出来吧. 急盼各位高手指教, 分析一下原因, 多谢多谢! 析一下原因, 多谢多谢!

作者: vvmmoy 时间: 2011-12-10 15:59

平滑肌爬出来时的照片

图片附件: 30303356.jpg (2011-12-10 15:59, 19.71 KB) / 该附件被下载次数 4
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9841

作者: greenbee 时间: 2011-12-10 16:00

刻苦学习照相技术一天,有所长进,再发一张今天的照片

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这张片子不错，生长状态旺盛的平滑肌细胞就是这样的。再长多一些，融合后，再多层生长就可以看出峰－谷特征了。可惜偶当年养细胞时照像的条件太差，所以留下照片太少。

作者: 中国特色 时间: 2011-12-10 16:01

请教各位高手，请问脐静脉内皮细胞原代培养可以用组织贴块法吗？具体怎样操作？我用胰酶消化的脐静脉内皮细胞（作用25分钟），第一天细胞还很多，第二天大量贴壁，换液（过了28小时，全部换掉），第三天全浮起来了，不知这是什么原因？谢谢！

作者: 一叶 时间: 2011-12-10 16:01

我培养过膀胱平滑肌细胞，经对比自我感觉胶原酶消化法比组织块法容易且快，但最关键的是要掌握酶消化的程度。

作者: whitesheep 时间: 2011-12-10 16:02

我刚开始做大鼠脑动脉平滑肌细胞，传代时总是长得很少，还想请教怎么解决这个问题。

作者: 小鱼鱼 时间: 2011-12-10 16:02

请问有不用transwell 板/膜做内皮和平滑肌共培养的吗？

作者: 小鱼鱼 时间: 2011-12-10 16:03

做了一个学期的脐带血管平滑肌培养，结果很不理想！
相信这里一定有在这方面非常成功的学哥学姐，能不能让您的具体培养的方案发出来让我们好好学习下！
能否告知所用培养液的具体组分，血清的浓度和购买的公司，生长因子是否加了及公司, 还有其他相关的步骤！
万分感激！

作者: 了了 时间: 2011-12-10 16:07

我养肾微血管内皮细胞,刚开始做,还在摸索中,哪位前辈能指点下啊?不胜感激!

作者: zhezhe 时间: 2011-12-10 16:08

刚开完题，老板突然要我养大鼠内皮细胞和肺血管平滑肌细胞，以前的师兄师姐都没有做过，好郁闷！现在还不知道需要哪些特殊仪器和设备？有做这一方面的可以给我点帮助吗？小女子万分感激！

作者: zhezhe 时间: 2011-12-10 16:08

还想请教一下各位前辈，对肺动脉平滑肌细胞进行缺氧处理i必须要有缺氧保温箱吗

作者: 乌贼老弟 时间: 2011-12-10 16:09

最近培养平滑肌细胞时遇到最大的问题是将其剪成1mm3的小块后怎么才能以0.5cm的间距均匀摆置于瓶底，我用剪刀剪后发现会得到很多块块，每块以点点大，用镊子夹也不可能一次夹一块，而且会粘在镊子上，很多时候放不下来，郁闷，大家可有这方面的经验？

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我用的是接种细菌的探针,和楼上用的牙科探针差不多,在一个把手上接一根细铁丝,顶端弯成个小环.但是有必要每块组织之间间隔0.5cm那么精确吗?我不是很清楚.想请教

作者: 爱老虎游tt 时间: 2011-12-10 16:09

小牛肺动脉平滑肌细胞原代培养:
最近刚完成该实验,细胞指标都已测完,感觉有下面几个注意点:
1.贴块法较其他方法更容易长出细胞.
2.培养基必须加上双抗,
3.传到3-4代即可开始实验,后面几代细胞活力明显下降.
4.做流式时,一定要有充足的细胞(10*6/ml)

作者: toy 时间: 2011-12-10 16:10

大家好，我现在养微血管内皮细胞，不太顺利，杂细胞最主要是成纤维太多，请教大家如何高效分选？
再有请问哪有正常人微血管内皮细胞，想作为阳性对照。
谢谢！

作者: 月牙牙 时间: 2011-12-10 16:10

【求助】大家好,我正准备养脐静脉内皮细胞.版主提的Roche的ECGF是哪家公司代理的么?怎么联系到?急需ECGF.多谢!

作者: flower-201 时间: 2011-12-10 16:11

我马上要养脐静脉的内皮细胞了
要原代培养
请大家讲讲经验阿

作者: 克隆鱼 时间: 2011-12-10 16:16

我也加入，在养大鼠胸主动脉平滑肌细胞，贴块法和，酶消化法都有采用，目前酶消化法的细胞状态不好，很郁闷。我在广州

作者: 克隆鱼 时间: 2011-12-10 16:17

我在养大鼠的胸主动脉平滑肌和内皮细胞,可是贴块长出来的都是两种细胞都有,怎么把它分开呢?

作者: milkdog 时间: 2011-12-10 16:17 标题: 回复 #171 克隆鱼的帖子

不用特殊处理，传代后不适合于内皮细胞生长，内皮细胞就死掉了，最后就剩下平滑肌细胞，祝实验顺利

作者: 白白的 时间: 2011-12-10 16:18

我在养小鼠的血管平滑肌细胞，但是用贴块法的常规做法，没有长出来。小鼠8周大，血管很细，需要在解剖显微镜下操作进行剥离，刮去内皮，方可分离中膜和外膜，但是血管非常薄细小，取出5只小鼠的血管剥离后的中膜，放一个小皿，仍然不能够铺满皿底，2周过去，细胞一点也长不出来，不知道什么原因。有哪位高手做过小鼠的血管平滑肌细胞，用什么方法培养的？可否赐教？

作者: 缘yuan 时间: 2011-12-10 16:19

我养人脐静脉内皮细胞三月了，感觉原代培养难！做了十多根脐带，细胞都在半路上就死了，还没传代就死了。请高手指点。

作者: tieshazhang 时间: 2011-12-10 16:20

各位师兄师姐，我养的是大鼠胸主动脉平滑肌细胞，用组织贴块法，四天组织块周围就长出细胞，细胞长得还算可以，培养液变黄了（高糖DMEM），就给换了液，第六天时培养瓶中飘了一层白膜，培养液变黄了，但还是清凉的，细胞一个也找不到了。请问是污染了吗？还是其他原因？小弟急盼！

作者: one 时间: 2011-12-10 16:21

我培养人脐动脉血管平滑肌细胞，很难，培养瓶铺20左右块，有时只有1，2块长出来，大概10天左右长出来，不知那位战友有没有这种情况，有几块长出来。个人感觉组织快一定要小，1mm3。

作者: 969 时间: 2011-12-10 16:21

关键是养内皮细胞长出平滑肌怎么办?两种各占一半啊,

作者: 缘yuan 时间: 2011-12-10 16:22

我正准备养视网膜血管内皮细胞,但是现在还没有提出来,好郁闷呀!各位师兄师姐如果有养这个细胞得,交流一些心得,不甚感激呀
我好郁闷呀!

作者: DNA 时间: 2011-12-10 16:23

我养的是气道平滑肌细胞，每次胰酶消化传代后，细胞贴壁很慢，状态不好，比较郁闷，请高手指点，是不是消化过了。

作者: sunnyB 时间: 2011-12-10 16:24

我在分离大鼠主动脉内皮细胞，使用了三种方法，觉得灌注法能看到细胞，但离心后细胞很少，我想请教用这种方法的人这是什么原因，如何解决，或者有成功的经验者请赐教！

作者: abc816 时间: 2011-12-10 16:24

我马上就要开始试验了，两种细胞都要作，脐静脉内皮细胞的元代培养真的有那么难么？说的我一点点信心都没有了。希望以后可以多多的交流。

作者: duoduo 时间: 2011-12-10 16:26

我在分离大鼠主动脉内皮细胞，使用了三种方法，觉得灌注法能看到细胞，但离心后细胞很少，我想请教用这种方法的人这是什么原因，如何解决，或者有成功的经验者请赐教！

我也试过这种方法，也是细胞很少，估计是因为大鼠主动脉本来细胞就不多，消化下来的很少。也试过刮取法，细胞要多谢，长得也可以，但是就是有成纤维细胞，没有办法纯化

作者: 分子式 时间: 2011-12-10 16:26

我在养小鼠血管内皮细胞，取材过程实在痛苦，而且细胞量又少，不知各位虾能否援手。

作者: 盼盼 时间: 2011-12-10 16:28

大家好，我也刚开始养原代的脐静脉内皮细胞，现勉强传至第二代。想请教一下各位关于生长因子具体运用的情况，以及内皮细胞冻存和复苏的情况。现在一些文献中不用生长因子培养，常规冻存，好像是很成熟的技术似的，没有我们大家感觉的这么难啊。

作者: utt0989 时间: 2011-12-10 16:28

我也在养大鼠的主动脉平滑肌细胞，
细胞2--4周长出不等，
我认为跟大鼠状态，操作和气候条件有关。
我的细胞在第三代传代后出现大量团块，位于一簇细胞正中，低倍镜下成黑色，高倍镜下呈发亮团块。我以为是污染，请专业人士看了，说不像。但是也没有很好的办法去除。
恳请高手指点。

作者: lixi559 时间: 2011-12-10 16:29

我也准备做大鼠胸主动脉平滑肌细胞,刚取了材,做了一只比较小的大白鼠,取时相当费劲,剖开血管后,血管无法展平,分离平滑肌层时很难,可能是老鼠太小的缘故,大家有没有好的方法.我在潍坊,我用的也是Gibco的DMEM高糖及四季青公司的胎牛血清，浓度15％.

作者: jrwyyplt 时间: 2011-12-10 16:29

我也在养大鼠胸主动脉平滑肌,原代的,取材时很困难,可能是老鼠比较小吧,.主要是分离平滑肌层时难,大家有没有好的办法,我用也是Gibco的DMEM高糖及四季青公司的胎牛血清，浓度15％

作者: 一叶 时间: 2011-12-10 16:30

本人总结了下大鼠内皮细胞的培养方案
一，消化法。优点：获得的细胞比其他方法纯。缺点：获得细胞比较少。
常见问题及解决方法：1.消化的时间不好控制时，建议大家分两段时间消化，消化30分钟时收取消化液放入一个离心管，30分到45分钟段收集的放入另一离心管，离心后看看第二管是否有杂细胞，若没有就把两管混合用，若有就只用第一管的。2.消化液，我的经验是5份0.2％胶原酶和1份0.125％胰酶。
二，植快法。优点：获得细胞比较多。缺点：很多，动脉小不好操作，动脉快不好内面朝下，容易浮起来等等。而且成纤维细胞比较多也不好除去。
常见问题及解决方法：1.动脉太小不好移动时，把弯的吸管头在酒精灯上多烧一会，冷确后一块一块吸到培养瓶，30快就差不多了，1mm3大小。2.容易浮起来时，预先要铺明胶，把动脉快移进去后不要加培养液，直接放到培养箱，4到5小时后再加。因为吸动脉快时动脉块是湿润的。3.除成纤维细胞要用细胞刮刀慢慢刮了。
三，植环法。优点：获得细胞比较多，比植块法稍简单，除成纤维细胞也简单。缺点：有成纤维细胞。
常见问题及解决方法：环内是内皮细胞，环外成纤维细胞除去方法，一是切环前用60°的无菌pbs热休克法，二是在培养瓶上做记号用细胞刮刀刮除。

作者: 小野花 时间: 2011-12-10 16:30

请问一下,原代取材的平滑肌细胞如果血管外膜剥除的不干净,会不会培养时混有成纤维细胞啊!

作者: yychen 时间: 2011-12-10 16:30

自己解释一下吧,我查了一些资料,是有可能污染的,且成纤维细胞的生命力要比平滑肌细胞的强,所以应该注意,我养的细胞长出来许久了,就是不知是不是我想要的平滑肌细胞.

作者: 气泡 时间: 2011-12-10 16:31

我也在养大鼠主动脉内皮细胞，已经做了三次了，但都没有细胞长出来，要不就是动脉块没贴上，用消化法就是细胞不贴壁！我想请教各位，动脉块剪成１*１mm２后，怎样才能分清楚正反面啊？就是剪成小块了根本分不清血管内侧和外侧！而且８小时和２４小时看细胞总是圆形，而不是内皮细胞的不规则多边形！不知道什么原因！！

作者: 黄花菜 时间: 2011-12-10 16:33

我现在也在做大鼠主动脉内皮细胞原代培养，同样遇到你的问题：血管块在铺的过程中总是粘到止血钳或镊子上下不来，而且这样就　很难分清管腔内皮侧和外膜侧了，请问你是怎么解决的啊？总是做不好，好郁闷的哦！

作者: 911 时间: 2011-12-10 16:33

我正在培养的细胞有HLF,NIH3T3,Chang-Liver,hMSC,mBMEC,293T.其中hMSC,mBMEC为原代培养。曾经养过HUVEC细胞，但是不知道什么原因，老是不长。最后全部光荣了。不知道哪位战友能够赠送一瓶HUVEC，或者交换也可以。谢谢！

作者: hold住 时间: 2011-12-10 16:34

我是养PK-15细胞的，刚开始养。养了几次，总是生长不好，刚开始要来细胞是生长还可以，时间一长就不行了。总是以失败告终。有那位师姐师兄知道这种细胞怎么养？
我用的是DMEM培养液，内加2%的双抗，2%的Glu，2%的碳酸氢钠溶液（5.6%），新生牛血清。消化时用的时0.25%的胰酶，内含EDTA。细胞生长的很慢，过几天就基本上没有了。不知道什么原因？

作者: TAT 时间: 2011-12-10 16:35

我在养大鼠胸主动脉内皮细胞,Gibco的M199加杭州四季青的胎牛血清,浓度是20%,哈尔滨.

作者: BOSS2011 时间: 2011-12-10 16:35

SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞,原代培养,总长不起来,也是郁闷中!!

有养人视网膜内皮细胞(HRCEC)的朋友吗?

作者: 园丁## 时间: 2011-12-10 16:36

我是养PK-15细胞的，刚开始养。养了几次，总是生长不好，刚开始要来细胞是生长还可以，时间一长就不行了。总是以失败告终。有那位师姐师兄知道这种细胞怎么养？
我用的是DMEM培养液，内加2%的双抗，2%的Glu，2%的碳酸氢钠溶液（5.6%），新生牛血清。消化时用的时0.25%的胰酶，内含EDTA。细胞生长的很慢，过几天就基本上没有了。不知道什么原因？

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个人认为有以下几个方面的原因：
1.首先不是很清楚你培养液的PH值，这一点相当重要，多说细胞在PH7.2－7.4之间是生长最快。这一点可以通过加HEPES来解决；
2.消化时间的把握的。最好控制在细胞刚收缩的时候，如果消化时间过长，会对细胞造成不可逆的伤害；
3.减少对细胞生长不利的因素，如降低双抗浓度和可虑避免使用EDTA。
个人意见，仅供参考。

作者: 园丁## 时间: 2011-12-10 16:36

SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞,原代培养,总长不起来,也是郁闷中!!

有养人视网膜内皮细胞(HRCEC)的朋友吗?

想请教一下,刚刚开始养,觉得是困难多多阿 !!!

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不知道逆养的VSMC是采用什么方法，消化还是组织块法？所以不好解决你的问题。

作者: mickeylin 时间: 2011-12-10 16:37

我第一次培养平滑肌细胞，取材为大鼠胸主动脉和腹主动脉,组织贴块法，9天了没有任何向外爬的迹象,用的是塑料瓶,DMEM高糖，10%胎牛血清，无污染，培养基颜色无变化，请问高手什么原因啊？？有哪些因素能影响其爬出呢？另外有什么好的方法分离中膜和外膜呢？

作者: 笑弯了腰 时间: 2011-12-10 16:37

我养的是兔基地动脉的平滑肌细胞,我做这个很厉害,,随便做都能做出来,,,就算把组织放在培养基里半小时后再做我都没问题，,,,,,,,我可以一边做成前卫细胞的原带,一边做平滑肌的原带而且重来没污染过,我做这个真的比较牛,,,可以联系我 qq22248223,不过我希望大家告诉我,一个六孔板长满平滑肌细胞有多少个啊

作者: yes4 时间: 2011-12-10 16:38

小弟一直在作大鼠结肠平滑肌细胞培养。几个月来磕磕绊绊，从取材到分离走了不少弯路，现在好不容易能消化出完整的肌细胞了，培养后却见不到贴壁，原先完整的多个肌细胞在培养48h后似乎全都分解成碎块了，郁闷死了！
我用的是0.25％胰酶和0.01％胶原酶2混合（3：2）消化，消化过程中随时取上清作镜检，已经最大限度的保证了消化合理，滤出原液作镜检能见到不少肌细胞，用过国产瓶＋鼠尾胶和进口瓶，都不行！
是不是还是我消化过渡了？可如果不够时间肌细胞掉不下来还是不行啊？急盼各位群友指教啊！

作者: windy+++ 时间: 2011-12-10 16:38

我做了第三次取材，虽然只有一半的组织爬出来了，但还是很欣慰，和大家分享！
倒置显微镜 10倍

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作者: 西子 时间: 2011-12-10 16:39

　我即将养血管平滑肌细胞，没有经验，希望向大家多多学习！我看到好多人都是传代培养平滑肌细胞，不知道有没有SMC的细胞株卖，到哪可以买到好的SMC细胞株？谢谢

作者: 乌贼老弟 时间: 2011-12-10 16:39

我用一次性注射器贴块，很方便！

作者: ffooll 时间: 2011-12-10 16:39

我养的是大鼠肺微血管内皮细胞，只养成功一次，现在失败的原因主要是纯化困难，传代至3代是就变成了成纤维细胞
求助去掉成纤维细胞的方法。

作者: 小鱼鱼 时间: 2011-12-10 16:40

我做了第三次取材，虽然只有一半的组织爬出来了，但还是很欣慰，和大家分享！
倒置显微镜 10倍

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前两天我养出来的和你得很像，但是我感觉很像是成纤维细胞，于是索性，今天上午刚刚扔掉。。。郁闷阿！！！
那位高人指点一下，这到底是不是平滑肌细胞阿？？
平滑肌细胞和成纤维细胞在表型上有什么不同呢???
多谢·。。。。。

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作者: 小鱼鱼 时间: 2011-12-10 16:41

这张是我前几天养的，也就是被我刚刚扔掉的细胞。。。。。

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作者: 小鱼鱼 时间: 2011-12-10 16:41

还问个幼稚的问题
所谓的脐静脉的或者是其他血管的外膜是指的哪部分阿？？是那一大驮像是大肠样的脂肪组织么？？还是去除那些脂肪组织后的血管的外面还有一层膜呢？？真是不解，望高人速回复。。

作者: 气泡 时间: 2011-12-10 16:42

我养的是静脉内皮细胞,但分离出来后杂质很多而且细胞不贴壁啊.有什么好的办法没有?

作者: 一叶 时间: 2011-12-10 16:42

这张是我前几天养的，也就是被我刚刚扔掉的细胞。。。。。

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应该就是平滑肌细胞，不要扔，我在本话题中发过不少post，我以前用的网名是liguofan，你参考一下。我看，平滑肌细胞和成纤维细胞在表型上没有什么不同！
养了1年多细胞，现在上班了。哪时岁月，不堪回首。

作者: BUK 时间: 2011-12-10 16:43

老板刚换课题要我养平滑肌细胞，不知道该注意点什么？也不知道应该到哪买平滑肌细胞的细胞株？
　　还有不知道用１６４０培养液可不可以养平滑肌细胞？
　　希望得到大家的指点，不盛感激！

作者: sunnyB 时间: 2011-12-10 16:44

问一个弱智的问题：
原代平滑肌细胞和传带的平滑肌细胞在那些方面不同啊？
为什么大家都养原代而不直接从别人那分些细胞株来呢？

作者: 盼盼 时间: 2011-12-10 16:45

我下学期要养SD鼠主动脉平滑肌细胞了，新手
目前养的乳鼠背部成纤维细胞练手

作者: BOSS2011 时间: 2011-12-10 16:45

[求助]有哪位大人做过大鼠胸主动脉平滑肌原代培养（酶消化法），我用的是胶原酶消化。能否给一个成熟的具体的方法。真的多谢了

作者: 白白的 时间: 2011-12-10 16:45

我也养的是脐静脉内皮细胞,总觉得不能确定自己养的到底是不是,因为原代细胞取的时候容易被平滑肌细胞污染.听说养原代细胞都需要鉴定,不知道如何是好呢!

作者: 生物迷 时间: 2011-12-10 16:46

我现在养HUVEC，感觉还是挺好养的，只要不污染就能不断传下去。至于培养基，开始的时候我用的是1640，现在重新换了一批细胞后用低糖的DMEM，状态都还可以。
我还养过原代的大鼠和小鼠心肌细胞培养和原代的HUVEC，养的最长时间为
10天，后来不小心污染了，那个心痛啊！所以现在在培养基里加上双抗，保险一点吧！

我认为养原代细胞，关键在于消化的时间，尤其是内皮细胞，稍微过头，就把里面的平滑肌细胞也消化下来了，我采取37度消化10分钟左右的做法，再用培养基冲洗血管三次，收集后离心就行了。

现在打算做一下大鼠冠状动脉内皮细胞的原代培养，不知道有没有在做的战友，可以交流一下。

作者: guagua 时间: 2011-12-10 16:47

我在济南，养大鼠主动脉平滑肌细胞，已经成功，但下一步的钙化诱导却难了，谁可指教一下？

作者: glass 时间: 2011-12-10 16:47

内皮细胞和平滑肌细胞原代培养我都做过，但总是以失败告终。贴块的不长，消化的不贴壁，到底也不知道问题出在哪。不知道培养成功的站友们有没有人愿意指点迷津，有的话请PM我

作者: eric930 时间: 2011-12-10 16:48

请问有哪位高手用组织贴块法养气道平滑肌细胞,能不能指点一下,我正准备养小鼠的,没做过

作者: 04906 时间: 2011-12-10 16:48

养大鼠胸主动脉平滑肌细胞，半年以来尝尽酸苦辣，希望和大家交流。
我想请教的问题是：养VSMC时如何区分内皮细胞和VSMC？有时我那长的密密麻麻，如铺路石状，我怀疑是内皮细胞，如何分离，是否可以用差速贴壁法？

作者: loli 时间: 2011-12-10 16:51 标题: 回复 #222 04906 的帖子

如果是铺路石样,估计就是内皮细胞.我马上就要养内皮细胞,能不能请教下你是怎么养出这种细胞的.据说很难养的

作者: baidukk 时间: 2011-12-10 16:51

我也在养大鼠脑基底动脉平滑肌，以前完全没做过细胞培养，参考消化法培养大鼠脑血管平滑肌细胞，吕平，申海涛，张浩，王永利中国药理学通报Chinese Pharmacological Bulletin

作者: zhezhe 时间: 2011-12-10 16:52

求助:我最近养鼠主动脉内皮细胞,用植块法,细胞看见了,但很不纯,想问问,用什么方法能除去平滑肌,用不用进行细胞鉴定?

作者: 园丁## 时间: 2011-12-10 16:52

如果是植块法的话,可以用差速贴壁法,内皮细胞ms贴的快些,也可以在用玻璃针或毛细管挑除.内皮细胞是一定要做鉴定的.可以看看下面的文献

《大鼠主动脉内皮细胞的贴壁法培养》

作者: mickeylin 时间: 2011-12-10 16:53

最近又养了几次内皮，都是植块法，内膜贴壁，但最后还是平滑肌，怎么办呀，郁闷！见照片，我的内皮哪去了？？？

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作者: whitesheep 时间: 2011-12-10 16:54

我的SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞

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作者: whitesheep 时间: 2011-12-10 16:54

我的SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞

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作者: whitesheep 时间: 2011-12-10 16:55

我的SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞

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作者: 911 时间: 2011-12-10 16:56 标题: 回复 #230 whitesheep 的帖子

楼上好啊，想请教您大鼠胸主动脉平滑肌酶消化法的详细步骤啊，主要是胶原酶的问题：
1.消化时间，我看是各家说法不一啊，1-10个小时的都有，这应该如何掌握啊？
2.酶的浓度和类型，0.2%的混合型是否可以啊？
十分感谢！

作者: whitesheep 时间: 2011-12-10 16:56

我用的是组织贴块法，比较方便，成熟的方法啦。

作者: 911 时间: 2011-12-10 16:57

平滑肌吗?

图片附件: 49322079.snap.jpg (2011-12-10 16:57, 43.51 KB) / 该附件被下载次数 2
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作者: caihong 时间: 2011-12-10 16:57

有谁清楚酶消化法的麻烦赐教一下啊，十分感谢！

作者: 黄花菜 时间: 2011-12-10 16:58

我的SD大鼠胸主动脉平滑肌细胞

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你好
我也是贴块培养的SD大鼠主动脉平滑肌细胞
请问你是怎么纯化的？自然纯化吗
我传到第6代的时候，在低倍镜下可见很多黑色小颗粒组成的团状物，培养基变浑浊，瓶壁上是很多肉眼可见的白色小颗粒，细胞形态发生变化而且死亡，你遇到过这种情况吗？可以肯定不是霉菌或者葡萄球菌
刚准备种板，就发生污染了
有哪位群友可以指教一下

作者: whitesheep 时间: 2011-12-10 16:58

每次传代用差速贴壁法纯化。

作者: 薄荷侠 时间: 2011-12-10 16:59

我养的是大鼠颈动脉平滑肌细胞,采用的是组织块贴壁法,养了一个多月一次都没成功,郁闷啊,着急啊,惭愧啊..

作者: 乌贼老弟 时间: 2011-12-10 16:59

楼上好,我养的是胸主动脉内皮,刚开始也没见到细胞,别急,有几个地方你可以找找原因,
1.你用的什么清洗的血管,是pbs吗，ph值有没有问题，
２．一定把血管片铺平，保证翻瓶时，不漂起，
３．你可以尝试血管片植入培养瓶前用带血清的培养基湿润，很有效．

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作者: 乌贼老弟 时间: 2011-12-10 17:00

上一张是我养的平滑肌，但我想要的是内皮细胞，养了好久终于成功了，

图片附件: 71367875.snap.jpg (2011-12-10 17:00, 47.86 KB) / 该附件被下载次数 4
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作者: 园丁## 时间: 2011-12-10 17:00

我每次只用一只鼠，１７０克，第一次只要长几片就行了，就可以消化了，分散开后继续培养，带长满８０％后就可以传代了

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-10 17:01

我养小鼠，不知道多大年龄的合适？
我用组织块法，四五天都没有细胞长出来。
我在定酶，下周用酶消化法再试试，呵呵！

作者: 04906 时间: 2011-12-10 17:04

你好，养平滑肌细胞做激光共聚焦包内钙测定，需要平滑肌细胞的状态好，想问一下如何是状态好啊？谢谢啊

作者: hot_hot_hot 时间: 2011-12-10 17:05

开始养气道平滑肌细胞，请各位高手指教去除内外膜方法，多少只SD大鼠可以养一盘细胞呢？谢谢！

作者: 小螺号 时间: 2011-12-10 17:06

各位老大,我即将要原代培养结肠平滑肌细胞,我们实验室没人会养,能否给我传授点经验啊,谢谢啊

作者: 小鱼鱼 时间: 2011-12-10 17:06

我做了好几次组织块贴壁法，smc，ec都没看见影，正在不懈努力中

作者: 分子式 时间: 2011-12-10 17:07

我做气道平滑肌培养的，用酶消化法，只成功过一次还被我污染了，郁闷啊。组织块法也试过，组织块贴壁得很好，就是不见细胞爬出，晕，快2个月了，不知道什么时候才能成功，不知谁做这方面的，可以交流一下

作者: nn255 时间: 2011-12-10 17:08

我做气道平滑肌培养的，用酶消化法，只成功过一次还被我污染了，郁闷啊。组织块法也试过，组织块贴壁得很好，就是不见细胞爬出，晕，快2个月了，不知道什么时候才能成功，不知谁做这方面的，可以交流一下

作者: 泡泡 时间: 2011-12-10 17:08

我现在养人脐静脉内皮细胞株EAhy926, 但很想用原代细胞，不知有哪位好心人能提供，或我购买

作者: 中国特色 时间: 2011-12-10 17:09

大鼠大鼠胸主动脉平滑肌
原代培养出的还可以一传代就会有污染和前面几位一样出现

作者: 笑弯了腰 时间: 2011-12-10 17:09

我打算养大鼠血管平滑肌细胞！找不到合适的刺激增殖的因子啦

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-10 17:10

大家好，我现在正在做huvec的原代培养，我们每次用胶原酶消化下来总是看不到我们huvec细胞，不知道是什么回事。我们的胶原酶浓度是0.1%（gibco分装），在孵箱里面孵育15min。

作者: tianmei001 时间: 2011-12-10 17:10

我也做HUVEC的培养，用的也是胶原酶，不过配的时候是按照活力单位来配的，差不多50u左右，室温消化15min左右，我看你给的图片感觉好多杂质，细胞好像都有点凹陷的样子，很像红细胞，不知道我判断的对不对。另外，换液的时候不用PBS冲洗，就用原本瓶中的培养基轻轻冲洗2，3次就可以了。基本上消化的细胞状态好的话24小时后换液已经有不少贴壁并伸展开的细胞了。

作者: yes4 时间: 2011-12-10 17:11

我做动脉平滑肌细胞和成纤维细胞。倒是消化出来了细胞，长的非常少，只看见梭形的，还有三角形的细胞。望高手指教怎么区分是平滑肌细胞还是成纤维细胞

作者: abc816 时间: 2011-12-10 17:11

我在养大鼠胸主动脉内皮细胞，可是先长出平滑肌细胞了，郁闷！
之前各位高手说内皮细胞最好养，可我怎么养不出来呢？哪位高手可以指点下

作者: nn255 时间: 2011-12-10 17:11

如何将平滑肌细胞和成纤维细胞分开啊?

作者: 铜雀 时间: 2011-12-10 17:13

我也是前段时间用组织贴壁法养了大鼠的平滑肌细胞，分离的是胸主动脉，没有做鉴定。现在觉得好像越来越不像平滑肌细胞，贴几张图片请大家帮我看一看有没有问题，谢谢！
1.2 -1代
3.4 -4代。4代的细胞变得更加细长，有的细胞似乎老了，触角很细，中间变圆，折光率增强。

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作者: 铜雀 时间: 2011-12-10 17:14

2.高倍镜下的

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作者: 铜雀 时间: 2011-12-10 17:14

3 不会传图，只能这样，好麻烦啊

图片附件: 13639668.jpg (2011-12-10 17:14, 54.3 KB) / 该附件被下载次数 3
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作者: 铜雀 时间: 2011-12-10 17:15

4 好了，请帮我看看，谢了

图片附件: 25407226.jpg (2011-12-10 17:15, 31.11 KB) / 该附件被下载次数 4
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作者: qqq111 时间: 2011-12-10 17:15

我正准备养HUVEC呢，有好多好多的问题，比如HUVEC培养液选择那种更好？文献上关于HUVEC培养液及成分五花八门，到底那种方法更好呢？困惑呀！请各位高手多指导指导哦。

作者: hold住 时间: 2011-12-10 17:16

各位老师，我养的胃平滑肌细胞，提蛋白做WB，我用的内参就是BETA-actin，是单抗，曝出来了。我想问两个问题：1.文献上说BETA-actin主要用于非肌细胞的内参，肌细胞表达很少，但为什么我曝出来了呢，如果写文章会不会别人不承认呢？如果不承认，我要用什么作为内参呢？2、我的内参是齐的，能说明细胞数是一样的吗？我们实验室有人说，BETA-actin是管家基因，每个细胞内的量是一定的，如果内参齐就说明上的细胞数是一定的，是这样的吗？恳请高手的回答，谢谢先

作者: zhezhe 时间: 2011-12-10 17:16

老板让培养内皮细胞，但不知哪种方法好一些？

作者: 一叶 时间: 2011-12-10 17:17 标题: 回复 #262 zhezhe 的帖子

干细胞培养......

作者: 04906 时间: 2011-12-10 17:18

谁有大鼠或人的血管内皮细胞和平滑肌细胞株，买点。

作者: toy 时间: 2011-12-10 17:18

大鼠胸主动脉平滑肌 alpha-actin 图片请高手鉴定指教

图片附件: 11344937.gif (2011-12-10 17:18, 16.07 KB) / 该附件被下载次数 1
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9856

作者: milkdog 时间: 2011-12-10 17:19

最近培养平滑肌细胞时遇到最大的问题是将其剪成1mm3的小块后怎么才能以0.5cm的间距均匀摆置于瓶底，我用剪刀剪后发现会得到很多块块，每块以点点大，用镊子夹也不可能一次夹一块，而且会粘在镊子上，很多时候放不下来，郁闷，大家可有这方面的经验？

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用弯头吸管吸取一定量的组织块和培养液的混悬液，尽量让组织块分布均匀，然后吸去多余的液体，用弯头吸管把不适合间距的组织块重新摆放。

作者: 缘yuan 时间: 2011-12-10 17:19

养的是大鼠肠道微血管内皮细胞，目前对从肠道取内皮细胞的酶有很大困惑，养人的肠道微血管内皮有文献说用二型胶原酶，还有说用四型的，还有说直接胰蛋白酶消化的，资金不够，不能一个个试，有高手帮忙解决一下吗？

作者: 伊莎贝拉 时间: 2011-12-10 17:20

不知有没有哪位同仁培养过平滑肌祖细胞？

作者: loli 时间: 2011-12-10 17:20

I型胶原酶用什么配置呢？（gibco）

作者: hold住 时间: 2011-12-10 17:20

我用不加血清的DMEM配的

作者: 爱老虎游tt 时间: 2011-12-10 17:21

请问有人在养兔的肺动脉平滑肌细胞吗？

作者: flower-201 时间: 2011-12-10 17:21

谢谢大家的分享先
在别处提了个平滑肌细胞培养的问题没人回答，现转帖来这里，希望高手帮忙，谢谢！
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=15834448&sty=1')

作者: 白白的 时间: 2011-12-10 17:21

请问大家，怎么在培养时分离成纤维细胞和平滑肌细胞啊？
我只要脐带成纤维细胞，不要平滑肌细胞啊~
谢谢大家~

作者: 了了 时间: 2011-12-10 17:22

我也在养小鼠腹主动脉平滑肌细胞,组织快贴璧和酶消化法都做了，屡战屡败呀

作者: 一叶 时间: 2011-12-10 17:22

块大了，不易贴。愈小愈易贴。开始加的培养基少点，能盖上块就行。不必怕细胞差营养，这时细胞在适应新环境，代谢较低。翻转时动作要慢而清。
浮起一大片，我还没碰到。起初我干涸3h，后来干涸缩短为1h，浮起也不多。
祝好运！

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原代培养人血管平滑肌细胞也4、5个月了，感觉很多东西都是小马过河，特别是很多细节问题，需要自己一步步摸索。我一直用的是贴块法，也试过几次酶消法，经过一段时间的摸索出了一套规律，但是还有几个问题请教liguofan或者站内的其他高手，都是自己的体会，也希望多喝战友们交流。
首先是组块的大小。文献上都是说1cm3大小，我刚开始做的时候教我的人说是尽量剪成肉糜状，越小越能萌出细胞。但试了几次都没长出细胞，后来思考像这样一顿乱剪虽然能剪得很碎，但边缘很然保证平齐，细胞是不是也会溢出流失，后面我都是很规整的剪（用的是眼科剪和显微剪），主要保证边缘的平齐，发现果然有细胞萌出。但是面临一个问题就是整个培养皿/瓶萌出细胞的组块比例较低.总共贴的五六十块，多的话十几块能长出，少的话也就几块。（我看过一片国内文献报道贴块法能长出细胞的组块比例也就20%~30%）。各位高手实践下来的结果如何？是否组块越小（<1cm3）长出来就越多？我自己的体会是相对于大小和贴块的间距来说组块边缘是否平直更重要，但如何提高组块长出细胞的比例？
其次是干涸时间。文献上有说1~2h，有3~5h，有12h的，我现在掌握的是6~8h，加液以后绝对静置5d，浮起来的比较少。但看了本贴其余战友的经验，就我干涸的时间长，所以组块长出细胞不多是不是和我干涸时的间太长也有关，是否应该尽早接触营养为好？
第三个也是一直困扰我的问题。贴块法细胞生长速度、密度不均，有的组块细胞长的早、快、多，有的细胞长的晚、慢、少，还有的压根就长不出，这样如何把握传代的时机？只有少数几块长的密的时候传代吧怕细胞数量不够，其他长得还不不多传了也可惜。但等的时间一久，早先长出来的细胞状态就不行了，形态改变、贴壁性变差、凋亡，有时换液后贴壁的细胞被成片地卷起或是冲下来。我曾试过等到所有能长出细胞的组块周围都长密时需要6w左右（文献上说传代时间一般2~4w）,各位高手是如何把握这个传代时机的。
第四个问题是组块浸泡在培液时间久了就会掉丝状、片状的碎屑，有时是黑点状成团聚集附于细胞表面，整个培液肉眼上看是澄清的，但是镜下就觉得脏兮兮的。上次做TEM，电镜下看到细胞内都是一团团吞噬黑点的溶酶体，电镜老师说是支原体污染，后来想想是不是吞噬了黑点状的组织碎屑。各位高手有遇到这种情况吗？如何解决？
第五个问题是培液血清的浓度。我要做SMC表型方面的研究。有老师告诉我想要保持SMC的收缩表型用的培液血清浓度就不能高，而且浓度低的话组块反而能长出细胞，但文献上原代培养血清浓度用20%的多。我20%和5%都试过，同一标本的细胞都能长出，还试过先用20%长出细胞后换用5%的养，观察下来用20%的原代细胞增殖得挺快，也没见到明显的形态变化，用5%的细胞增殖的也不慢。但对于P1以后的细胞，出于保持表型稳定的考虑我就不敢用20%的了。我采用的方法是P0传代时用20%，贴壁后换用5%的培液（文献上好像P1以后用10%的多），P1细胞增殖的也挺好，但P1传P2时我直接用5%，第二天观察细胞根本不贴壁，请高手分析原因？就算细胞对培液有个适应的过程，那传代之前用5%也养了一段时间了，难道P1以后每次传代都要先用20%贴壁再换血清浓度低的培液？
第六个问题是有关酶消法。有感于贴块法虽然操作过程简单但耗时长、获得原代细胞数量少。因为还是涉及SMC表型的问题，不知道大家有没有体会，我是感觉时间越长、代数越久SMC肯定要从收缩型转化成合成型，所以我希望P3以内能获得尽可能多的细胞。文献上有关酶消法也是众说纷纭：比如酶的种类和浓度，种类有胶原酶、木瓜酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、胰酶，还有的是几种酶的组合；浓度从0.1%~0.5%不等，0.2%和0.25%较多；时间更是五花八门，少则15~30min，多则十几小时；消化状态有的把握至血管完全溶解，有的是组织边缘呈絮状；我试了几次，一开始用的酶浓度比较低，血管碎块在酶液里是纹丝不动啊，后来考虑人主动脉细胞外基质的含量肯定高于动物，昨天改用更高浓度的酶并分两步消化：0.25%I型胶原酶+2mg/ml牛血清白蛋白消化2h，0.25%I型胶原酶+0.5%弹性蛋白酶+2mg/ml牛血清白蛋白消化30min~1h，结果是血管块从肉眼上看变化不大，镜下看边缘似乎有絮状的感觉，酶液中有漂浮的小光亮点（不知道是不是消化下来的细胞，量不是特别多），其他步骤照葫芦画瓢，不知道最终结果如何。我觉得我的酶浓度很高了，但要想将人血管组织完全消化掉估计要得十几小时，这样消化下来的细胞估计也破坏了，请各位有经验的高手请指教。个人感觉酶消法条件的摸索好难，代价又大，像我这样的浓度，一支100mg的胶原酶和弹性蛋白酶都只能配20ml的酶液，用不了几次。

作者: zhezhe 时间: 2011-12-10 17:23

我用消化法原代培养兔胸主动脉平滑肌细胞的过程。与各位分享，也请指教。
用dmem配0.2%的1型胶原酶[用20的血清的dmem配可能更好，有类似文献}，分装于青霉素小并，每并2-3ml。1只免的胸主动脉置于1并消化液中消化，消化约10几个小时{消化程度的把握要体会}，离心后，接种{若见细胞量大，成功把握大}，绝对静置3天{没必要看，看多了无益}，8天可传代。

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你主动脉是剪碎还是成片放到酶液里，还有消化10几个小时后血管组织是完全消化溶解成匀浆状吗？

作者: zhezhe 时间: 2011-12-10 17:23

我认为这不是污染，镜下你会看见有大的黑色颗粒，这在传3代后细胞涨势不太好时常见；而且不易冲下，传代后仍有，可以把这样的早做实验用。个人意见仅供参考。

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你说的镜下有大的黑色颗粒是污染吗，还是组织碎屑，我现在也遇到这种情况。

作者: pengke1983 时间: 2011-12-10 17:24

我才开始做肺动脉内皮细胞培养，一直没找到合适的提取方法，哪位大侠有好的经验能否介绍下，发些肺动脉内皮细胞提取和培养的资料给我，万分感激！

作者: baidukk 时间: 2011-12-10 17:24

我养的是人血管平滑肌细胞，用的是细胞株，但生长好慢，求原因?

作者: jrwyyplt 时间: 2011-12-10 17:25

小弟在此先行谢过各路高人。问题如下：小弟用sigma公司的，I型胶原酶，浓度0.2%（用PBS配的），消化分离下来的肺动脉，消化时间约30-60分钟。离心后置显微镜未见单个细胞，只能见到消化下动脉碎片（本人培养的大鼠细胞这个阶段见到很多单个细胞了），培养2-3天仍未见细胞萌出。请教各路高人有无此方面的经验。小弟用以上方法已成功培养SD大鼠的肺动脉平滑肌细胞，两者培养过程中，所用的培养用液、酶完全一致。培养小鼠的小弟体会小鼠动脉较大鼠质地明显不如，较脆，稍用力就易拉断，基于此本人把消化时间从70分钟降至30-60分钟，但仍未成功培养出。

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