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标题: [求助]单个核细胞分离出现很多小颗粒 [打印本页]

作者: moonlight45 时间: 2011-12-15 14:59 标题: [求助]单个核细胞分离出现很多小颗粒

[求助]单个核细胞分离出现很多小颗粒

各位大家好，我们用Ficoll分离液分离脐血单个核细胞，稀释脐血以2：1的比例加于分离液上，2000rpm，离心30mins。取中间白膜层，用含0.6ACD-PBS洗涤2次。分离出来的单个核细胞在镜下有很多小颗粒，见附图。请问这些是什么，应该如何来预防这些小颗粒。

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作者: 911 时间: 2011-12-15 14:59

我的也有，可能是血小板。我分离时界面层不是太清楚，你的清楚吗？

作者: moonlight45 时间: 2011-12-15 15:00 标题: 回复 #2 911 的帖子

挺清楚的，不过吸的时候会吸到部分上层血浆。

作者: hot_hot_hot 时间: 2011-12-15 15:00

是血小板，楼主是用什么分离液分离什么的单核细胞呀！

作者: abc816 时间: 2011-12-15 15:01

应该就是血小板,我用国产的淋巴细胞分离液也避免不了这种情况.在吸取白膜层时不可避免的会吸到血浆层.不过不用为此担心的,细胞培养3-4天后血小板就自己消失了.

作者: moonlight45 时间: 2011-12-15 15:02

我们用的是天津颢洋的人淋巴细胞分离液

作者: moonlight45 时间: 2011-12-15 15:02

但我培养了七天后还是没有消失呀，有时还会更多，根本没法用来拍照，背景太不干净

作者: hot_hot_hot 时间: 2011-12-15 15:05 标题: 回复 #7 moonlight45 的帖子

“人淋巴细胞分离液”分离人血的话，不应该有很多的血小板；但如果是分离动物的血，由于比重上的些微差异，就会有血小板。

作者: 缘yuan 时间: 2011-12-15 15:05

我也有这种情况，不知道怎样才能避免

作者: loli 时间: 2011-12-15 15:06

是血小板，洗涤的时候调整速度血小板就会少很多。我第一次洗涤速度1500，8分钟。第二次洗涤速度1200转，8分钟，就好很多。请问大家培养的时候有没有加刺激因子？我的单个核细胞培养的第二天就会有条状的细胞出现，在400倍下看好像有点在动。不知道大家有没有碰到这样的情况。请问楼主的是在多少倍下看的。

作者: greenbee 时间: 2011-12-15 15:06

我也有碰到楼上说得条状的东西，是会动的，但从大小上看，我觉的不像是细胞，感觉还是应该是血小板，不知道大家认为是什么

作者: moonlight45 时间: 2011-12-15 15:08 标题: 回复 #11 loli 的帖子

这张图片是在400倍下看的。洗涤的速度是1500转，10分钟，两次都一样。下次我也调整一下速度试试。我们最终目的要分离CD34＋，曾分离了好几次并培养，但都在当时就能发现条状、黑色的东西在蠕动，而且培养过程中会慢慢增多，老师说可能是黑胶虫，很难预防。不知道你说的是不是这种情况。

作者: 分子式 时间: 2011-12-15 15:08

楼主你有"黑胶虫"的照片吗,可不可以传上来我们看看

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-15 15:09

分离出PBMC后确实有时视野很不清楚，可以多洗涤两次去除血小板。但个人觉得离心次数太多对细胞也会有些影响。还会出现一些片状或者月牙状的细胞，培养后逐渐有增多。那是不是细胞碎片或者凋亡的细胞？

作者: 一叶 时间: 2011-12-15 15:10

条状、会动的？不应该是血小板。
楼主照片中的应该是血小板，低速洗两遍是会除去大部分的。1500rpm,5分钟，不过还要根据你的离心机而定。

作者: moonlight45 时间: 2011-12-15 15:11 标题: 回复 #15 分子式的帖子

据老师说，黑胶虫的一个主要来源是血清，培养过程中和细胞共生，当细胞状态很好的时候，可以抑制黑胶虫；听说目前世界上还没有找到太好的方法来预防黑胶虫污染。

作者: moonlight45 时间: 2011-12-15 15:11 标题: 回复 #17 一叶的帖子

条状、会动的很小，约相当于单个核细胞十到二十分之一，在光镜呈黑色的，400倍下可以看到它们蠕动，可能是黑胶虫。
我们洗涤的速度是2000rpm，460g；2次。以后可能要下调一点速度。

作者: 中国特色 时间: 2011-12-15 15:11

温度高的时候，我的单个核细胞就分离的不太好。不知道是不是温度的缘故，大家有这种情况吗

作者: HP007 时间: 2011-12-15 15:12

我看到的条状会动的东西是发亮的并不是楼上各位看到的是黑色的，而且根据我问的一个师兄他们感染黑胶虫后，细胞都死掉了，不会说是两者共存的样子，不知道这个到底是什么。

作者: moonlight45 时间: 2011-12-15 15:12 标题: 回复 #20 中国特色的帖子

怎么不好呢，是分离不出来吗，还是杂质太多？

作者: moonlight45 时间: 2011-12-15 15:14 标题: 回复 #21 HP007 的帖子

是什么颜色的，你们考虑像什么？

作者: BUK 时间: 2011-12-15 15:16

是分离不出来，白摸层很薄。原来分离的还可以的，不知道什么原因？今天我请细胞培养的老师看了我的细胞，他说小黑点是细胞碎片，或血小板，是会动的。

作者: duoduo 时间: 2011-12-15 15:16

是发亮的呀，看不到什么颜色，跟细胞差不多，形状上条状略弯，会动，

作者: 蒲公英 时间: 2011-12-15 15:17

我最近分出的PBMC也不太好，细胞数量不多，视野也不清楚。不知道又出了什么问题

作者: 911 时间: 2011-12-15 15:17

请教各位：
我分离的也是外周血单个核细胞，为什么白膜洗涤后会有团状物吹打不散，不知该团状物是细胞团呢还是纤维蛋白原？有办法解决吗？

作者: BUK 时间: 2011-12-15 15:17

楼上说的团状物是细胞团，因为血小板的存在，白细胞很容易聚集，所以操作过程一定要快，另外要避免血小板的存在，实在吹不开的细胞团建议直接丢掉，

作者: moonlight45 时间: 2011-12-15 15:18

我最近分出的PBMC也不太好，细胞数量不多，视野也不清楚。不知道又出了什么问题

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你用哪种分离液？有照片吗，也发上来看看？

作者: 西子 时间: 2011-12-15 15:19

这里的精英都是培养单核细胞的吧？
小妹我碰到难题了，请教各位大侠：我分离PBMC还凑合吧，有点血小板（我想的），37度5％CO2培养贴壁2小时，然后弃去未贴壁细胞，镜下贴壁细胞应该85％是单核细胞，请问镜下单核细胞啥样的。我的细胞当时贴得很好，但是第二天一换液就全没了。贴壁细胞多长时间再换液呢？我的1640未加谷氨酰胺，一定需要吗

作者: 阿敏 时间: 2011-12-15 15:19

我分离的PBMC再37度5％CO2孵育2小时，贴壁细胞是单核细胞，贴得很好，但第二天一换液就什么也没有了，咋搞的？我的1640没加谷氨酰胺，有影响吗？

作者: moonlight45 时间: 2011-12-15 15:20

我们换液一般通过离心把培养基去掉，再用新的培养基重悬后转移到培养瓶或培养板。有些培养基本身有谷氨酰胺，就不用再加了，1640应该也有，你好好看看说明书。

作者: 小螺号 时间: 2011-12-15 15:21

这应该是红细胞吧。
不用管它，经过几次换液后会自动去除的。

作者: BOSS2011 时间: 2011-12-15 15:21

楼上说的团状物是细胞团，因为血小板的存在，白细胞很容易聚集，所以操作过程一定要快，另外要避免血小板的存在，实在吹不开的细胞团建议直接丢掉。

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谢谢，你所指的操作过程是指哪个操作过程，吹打细胞的过程？
还有将吹不开的细胞团丢掉，对细胞计数影响大吗？

作者: 气泡 时间: 2011-12-15 15:22

整个操作步骤操作都要快才行，可以适量的加一些EDTA1mM，但最后要去除，吹不开的丢掉当然影响最后获取的细胞数，但有成团细胞存在会影响你的后续试验，不管你做流式或刺激细胞，对成团的细胞都是无法作用到的

作者: hold住 时间: 2011-12-15 15:22

我最近几次分离的大鼠淋巴细胞也有楼上几位说的那种黑色短棒状，会动；而且细胞到了第2天就死得差不多了。郁闷啊～～

作者: 气泡 时间: 2011-12-15 15:23

不一样的，我看到的是亮的条状物，而且对细胞没有影响，如果楼上的细胞都死了，那可能是污染了。

作者: baidukk 时间: 2011-12-15 15:23

我分离的脐血，我在离心后怎么云雾层不明显，有大量的红细胞呢，离心速度为2000r/min,20min,这是为什么呢？上面的同学你是怎么离的呢

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