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标题: [讨论帖]巨噬细胞RAW264.7的经验总结 [打印本页]

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 16:52 标题: [讨论帖]巨噬细胞RAW264.7的经验总结

[讨论帖]巨噬细胞RAW264.7的经验总结 (转载)

看到很多同学在问关于RAW264.7细胞的一些问题，基于我对该细胞一年的培养经历和以前我发的贴，现在索性总结一下关于该细胞的经验以及注意事项，希望能对大家有所帮助！
培养条件：1640培养液+四季青10%新生牛血清。PH：2gNaHCO3每1L 1640培养液。

在我培养的过程中，从来没有用过胰酶消化传代。我一直是直接用弯嘴滴管吹打的。只要按照顺序一片片地吹打，很容易就能够把该细胞吹打下来。吹打一遍之后，置镜下观察哪里还有未吹下的细胞，再着重吹打。吹打过程中，注意用力，要比常规稍加力度以能够吹下细胞。当然，用胰酶消化也是可以的，但是细胞的生长状态就是没有不用直接吹打下来的好。

对于RAW264.7细胞，他的生长时喜欢扎堆的。正常的生长状态应该是一小片一小片地生长。片片之间不连接，等到长的更多更密的时候就会连成大片，并且会叠加成层。所以，要很好地控制好细胞的生长速度，不要等到叠加成层的时候再传代。一般，在细胞小片小片地铺满瓶底而未连成大片的时候就该传代了。并且一旦有片细胞叠加成层就要进行传代。否则该处细胞必老化。影响整体生长状态！

该细胞的生长速度比较快，常规留种下，一般3-4天传代。有时生长旺盛的时候甚至2天就需要传代，所以在你传新瓶的时候，尽量少留种，我们在平时维持的时候，一般都是只在新瓶里用滴管口蘸一下而已。能够维持4-5天再传代。如果是一次性大塑料瓶，则可以维持7天左右。过节假日时可以用此方法维持。

RAW264.7细胞传代后贴壁时间比较短，半小时就能贴很多，刚贴壁时细胞呈圆形，折光度很好，镜下观察明亮如小珍珠状一个个地散落于瓶底面。生长一段时间后，部分细胞会变为类似四角形或多边形，伸出伪足之类的吧。这个时候其实就是提示你注意传代了，这部分细胞如再不传代，很容易就老化掉。

RAW264.7细胞生长速度非常得快，贴壁速度很快，对生长空间的要求比较敏感。所以传代的时候以及培养的时候都要注意不要太多的细胞在培养瓶里，这样细胞状态会比较好。很多反而不利于该细胞生长。并且巨噬细胞比较喜欢扎堆生长，而堆与堆之间是有空间的。如果长成相连在一起的一满片的时候，细胞形态基本上就会差了，老化的会比较多，对后期实验结果是不好的。所以在养细胞的时候应该把我好该细胞喜欢的生长空间密度。

对于细胞生长状态不好的时候，可以采取“二传”的方法，是我在另一帖子里写到的，现在转述如下：

【对于有些人总是会遇到养的细胞形态怎么都不好的问题。这个其实是有一个方法可以改善的。对于贴壁细胞，如果细胞形态不好，（或者细胞形态不清晰，表面似有异物等）可以在传代的时候进行如下操作：

首先，倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清的都可）洗涤一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培养基，进行预吹打，控制吹打力度，轻轻地大概沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时侯再开始正式的消化、吹打。（巨噬细胞我们只吹打，不消化的）

其次，把吹打下来的细胞悬液加入到新的培养瓶内，培养瓶事先加入培养基，放入培养箱内培养，按时间点观察细胞贴壁情况。10分钟观察一次，20分钟，30分钟观察一次。选择一个时间点，已经有部分细胞贴壁的情况下，重新置于洁净台，底面朝上迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次。然后加入完全培养基培养。后续观察细胞生长情况以及形态。我称之为“二传”。呵呵。

如果一次效果还不理想，可重复多次。直到找到细胞完美形态。其中要注意，结合细胞喜欢的生长情况。喜欢多一点数量长得好的细胞你就等贴壁细胞比较多点的时候再传。反之亦然。】

RAW264.7细胞本身就会呈不规则状的多边形，所以当细胞呈现这种形状的时候，不必大惊小怪，在培养瓶里多数细胞呈现出此种形状之时，其实就是提示你他的生长状态即将趋于不好了，有些老化了，该传代或者优化筛选了。

暂时总结这么多，后面有想到的会继续补充！另外一篇帖子“如何把细胞养的更漂亮！”大家可以补充着看。祝各位好运！

作者: 乌贼老弟 时间: 2011-12-15 16:52

总结的不错！
以前我也养过，是用细胞刮刀将细胞刮下后传代，感觉不是很满意！下次试试LZ的方法！

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 16:53 标题: 回复 #2 乌贼老弟的帖子

怎么你们都觉得这么难传代呢，还用细胞刮？我真的只是每次直接吹打的，按照顺序一点点地吹打觉得很好传代啊。

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-15 16:53

啊的，在做原代的单核巨噬细胞的培养。
现在RAW264.7的细胞是不是到处都有啊？我们实验室没呢。。。。

作者: 园丁## 时间: 2011-12-15 16:54

买一个又不贵的，细胞这个东西不是细菌，建议还是别蹭别人的，到头来吃亏的是自己。替老板省别的也别省这个钱。

作者: 二丫头466 时间: 2011-12-15 16:54

很详细哦，谢谢分享！

老化的细胞或者成层的细胞再传，会变好吗？谢谢！

作者: loli 时间: 2011-12-15 16:55 标题: 回复 #6 二丫头466 的帖子

细胞一旦老化成层再传下去不会再好了。我养过的好几种细胞都是这样，包裹RAW。

作者: loli 时间: 2011-12-15 16:56

对于RAW264.7细胞，他的生长时喜欢扎堆的。正常的生长状态应该是一小片一小片地生长。片片之间不连接，等到长的更多更密的时候就会连成大片，并且会叠加成层。所以，要很好地控制好细胞的生长速度，不要等到叠加成层的时候再传代。一般，在细胞小片小片地铺满瓶底而未连成大片的时候就该传代了。并且一旦有片细胞叠加成层就要进行传代。否则该处细胞必老化。影响整体生长状态！

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成片生长是因为传代的时候太稀了。传代密度稍微高一点就很均匀。

一般100mm dish 1:4 OR 1:5传代比较合适。

作者: 园丁## 时间: 2011-12-15 16:56

根据细胞的本能学术:肥大等细胞遇冷有释放炎症介质的本能,炎症介质有引起组织不同程度变性的本能,组织的不同程度的变性.可诱发白细胞的不同程度的自杀性攻击的本能出现!

所以临床各种不同的炎症就出现!

高于体温的外热如喝热水,能诱发血细胞的御热本能出现!肺大等免疫细胞与白细胞及吞噬细胞御热释放胞内热液,并邹缩减少面积而御热自保而进攻态停止而休息的储能态开始.这就是中医喝热水治疗外感发烧的原理!

作者: abc816 时间: 2011-12-15 16:57

很有意思。我伺候巨噬细胞RAW264.7快8年了，从来都没有觉得这个细胞容易消化，直接吹打更是只能吹下很少量的细胞。理论上看，巨噬细胞是容易贴壁、贴壁很牢的细胞，我做腹腔巨噬细胞培养就是用贴壁法排除杂细胞，所以我认为能够直接吹打下来的细胞应该恰好说明是状态不是最好的巨噬细胞。我从来都是用胰酶消化细胞，放在孵箱中3-5 min后再吹打，很多文献也都是使用这种方法。
关于老化的问题，我赞成，也有教训。巨噬细胞RAW264.7一定不能太满，否则老化，对LPS等的刺激也不敏感了，所以我从来都是较稀的传代、铺孔做实验。以后再交流，很有收获的。

作者: 铜雀 时间: 2011-12-15 16:57

这个细胞很好养的，胰酶消化很方便，1640和dmem都能养，是我目前培养过的最好养的细胞

作者: 气泡 时间: 2011-12-15 16:58

我们实验室也在养这种细胞，把自己的经验与大家分享一下，由于细胞来源可能不一样，所以方法只供参考。

由于细胞是从生物物理所引进的，所以培养方法沿用物理所的。

细胞用10％ FCS＋DMEM培养，细胞的形态应该是又圆又亮，要是长了触角，可能就说明已经分化了，不建议继续培养。大家可以参见ATCC的网站。

我们发现直接用培养基不能吹下细胞。由于细胞贴壁很牢，可以先去除培养基，再用生理盐水洗一遍，弃掉，再加入适量的生理盐水，轻轻把细胞吹下来。离心后用培养基重悬后，按比例传代。这样细胞很容易就能下来。

一般1：10传，细胞2-3天长满一皿（常规用培养皿培养便于吹吸细胞）。

不建议用胰酶消化，因为容易使巨噬细胞分化（物理所传授没有试验过）。

用的培养基一定要用不含内毒素的去离子水配制。避免细胞分化。我们现在用hyclone配制好的DMEM还可以，有条件的最好自己配制，现在的假冒培养基特别多。

作者: loli 时间: 2011-12-15 16:58

不用胰酶消化是RAW对胰酶消化有抵抗吧？

作者: 克隆鱼 时间: 2011-12-15 16:59

RAW 264.7细胞可以作为很多基础医学领域和药理学领域的研究模型，由于每个人的研究方向不同，所以细胞培养方式也有差别。

这个细胞属于单核/巨噬细胞，会在各种刺激下分化，成巨噬细胞样。因此在传代过程中要尽量避免各种刺激。所以经典的培养方法中推荐用热灭活血清，传代用细胞刮刀轻轻刮下，而不用胰蛋白酶消化。

如果反复刺激RAW 264.7细胞，在某些实验中，细胞的造模成功率会降低。比如在LPS诱导后Griess试剂法测定亚硝酸盐以考察细胞分泌一氧化氮，可能会失败。
另外，1640培养基中含有的硝酸盐很多，如果做硝酸还原酶偶联Griess试剂法检测总一氧化氮分泌量，培养基中的硝酸盐会被还原成亚硝酸盐，导致实验结果不准确。而且一般在Griess试剂法测定亚硝酸盐的实验中，要用无酚红培养基。

所以做炎症相关研究的同道尽量不要采用楼主推荐的方法，可能会走很多弯路。

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:00

成片生长是因为传代的时候太稀了。传代密度稍微高一点就很均匀。

一般100mm dish 1:4 OR 1:5传代比较合适。

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巨噬细胞的本性就是小片扎堆生长，与密度的稀浓无关。巨噬细胞有细胞间信使系统互相调节的。

作者: 969 时间: 2011-12-15 17:00

ATCC上该细胞类型确实是用1640培养的，但我用GIBCO 的DMEM它也长得很好。

呵呵，胰酶消化也是可以的，0.125%，37度4分钟就OK了

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:01 标题: 回复 #17 969 的帖子

同意，呵呵。其实培养液很多细胞都是可以共用的，但是，实验结果确实不一样的。因为细胞的生长状况不一样了，所以，还是要按照标准的培养液走。

作者: whitesheep 时间: 2011-12-15 17:02

我也在养这种细胞，可是养的一直都不好。我用DMEM+10FBS，每次传代都用胰酶消化，很难消化，几乎每次都是用滴管刮下来的，传几代后细胞就变形了，有变长条形的，有伸出很多伪足的，给为看看我的培养方法有没有要更正的呀？

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:02 标题: 回复 #19 whitesheep 的帖子

这个细胞我一直养的很好养的啊。我就是按照我所写的方法养的，你可以仔细看一看。

作者: ffooll 时间: 2011-12-15 17:03

我想问一下在做实验中巨噬细胞RAW264.7和使用从血液中单核细胞分化而来的巨噬细胞有何不同？

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:03 标题: 回复 #21 ffooll 的帖子

Raw264.7是单核细胞分化成的巨噬细胞与白血病细胞转染而成的。单独分化成的巨噬细胞不容易建立细胞株。

作者: ha111 时间: 2011-12-15 17:03

RAW264.7能不能用alpha-MEM养啊？

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:04 标题: 回复 #23 ha111 的帖子

这个还真是没用过。我也不确定。一般都是用的1640或者DMEM。

作者: 园丁## 时间: 2011-12-15 17:05 标题: 回复 #23 ha111 的帖子

在诱导破骨样细胞的时候，就是用的alpha-MEM,其中加入M-CSF和RANKL

作者: tieshazhang 时间: 2011-12-15 17:05

发两张ATCC的图片

图片附件: 39214168.snap.jpg (2011-12-15 17:05, 44.31 KB) / 该附件被下载次数 19
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9920

作者: tieshazhang 时间: 2011-12-15 17:06

ATCC complete growth medium: The base medium for this cell line is ATCC-formulated Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Catalog No. 30-2002. To make the complete growth medium, add the following components to the base medium: fetal bovine serum to a final concentration of 10%.
Atmosphere: air, 95%; carbon dioxide (CO2), 5%
Temperature: 37.0°C

cuturl('http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=TIB-71&Template=cellBiology')

作者: sunnyB 时间: 2011-12-15 17:06

最近正在养这种细胞正在头疼消化时间的把握呢。。。

作者: abc816 时间: 2011-12-15 17:07

个人感觉，
难消化
生长快
贴壁快
对培养基和血清要求低
不管怎么养都有好多长脚的，ATCC的照片也是这样的，所以可能他就这种性质
至于老化，老化的不一定就不圆，没证据不好说，毕竟老化这个词也不算一个正式的官方（学术）概念

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:08

大家加油。这个细胞养好的话是很乖的。。。。呵呵。他现在非常听我的话喔，我叫他长什么速度就什么速度。哈哈。。。

作者: duoduo 时间: 2011-12-15 17:08

这个细胞养了快三年了，我用这细胞做两个药物的协同抗炎作用，差点把我折磨死，感觉很不稳定，重复性较低。还好这个细胞很好养，就是不大好用！

作者: 中国特色 时间: 2011-12-15 17:09

我们实验室经常使用胰酶（0.25%）消化加冷激（4度8min.后转入负20度冷激1.5min),胰酶消化在37度温箱内10min。细胞状态稳定，老化现象少发，不妨一试！！

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:09

这个细胞养了快三年了，我用这细胞做两个药物的协同抗炎作用，差点把我折磨死，感觉很不稳定，重复性较低。还好这个细胞很好养，就是不大好用！

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严重同意！！！呵呵！我也快被折磨死了。

作者: windy+++ 时间: 2011-12-15 17:10

我们实验室也在养这种细胞，把自己的经验与大家分享一下，由于细胞来源可能不一样，所以方法只供参考。

由于细胞是从生物物理所引进的，所以培养方法沿用物理所的。

细胞用10％ FCS＋DMEM培养，细胞的形态应该是又圆又亮，要是长了触角，可能就说明已经分化了，不建议继续培养。大家可以参见ATCC的网站。

我们发现直接用培养基不能吹下细胞。由于细胞贴壁很牢，可以先去除培养基，再用生理盐水洗一遍，弃掉，再加入适量的生理盐水，轻轻把细胞吹下来。离心后用培养基重悬后，按比例传代。这样细胞很容易就能下来。

一般1：10传，细胞2-3天长满一皿（常规用培养皿培养便于吹吸细胞）。

不建议用胰酶消化，因为容易使巨噬细胞分化（物理所传授没有试验过）。

用的培养基一定要用不含内毒素的去离子水配制。避免细胞分化。我们现在用hyclone配制好的DMEM还可以，有条件的最好自己配制，现在的假冒培养基特别多。

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ATCC的照片长了好多脚啊，而且传代是1：3-1：6

他们推荐的是细胞刮刀，不知什么原因

作者: 阿敏 时间: 2011-12-15 17:10

我们这里有人就是用细胞刮刀刮得，可是她的往往传了几代之后，细胞就很容易变形分化了，变形得很夸张。而我用胰酶消化，就好一些。虽然也有分化的情况，但分化得没有那么夸张。

作者: windy+++ 时间: 2011-12-15 17:10

最近发现一个比较奇怪的现象

用培养皿或培养板时，细胞几乎都是圆的，长触角的很少

而用培养瓶时，第二天触角就长出好多来

大家可以试试

作者: tianmei001 时间: 2011-12-15 17:11

我想做264.7和C57小鼠提取的原代淋巴一起培养，但是不知道细胞系和原代提取的能不能放到一起培养。请问各位大侠有没有做过类似的或者知道的指点一下。

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:11 标题: 回复 #36 windy+++ 的帖子

长触角也是其正常的生长形态。

作者: windy+++ 时间: 2011-12-15 17:12 标题: 回复 #38 zwsyrt 的帖子

问题是圆形细胞会由70% 减少到30%

作者: jujuba 时间: 2011-12-15 17:12

大家好，我也在养这种细胞，我事先没有查阅过资料，直接从同学那要来，按照她的方法养的。

我是用5%的小牛血清加1640养，隔天换液，胰酶消化，弯管吹打。

感觉和大家说的有些不一样，我们是要让它变成泡沫细胞。

细胞很多都不是圆圆的，有少部分圆圆的同学说是泡沫细胞，而且她还说用10%的培液养会很容易都泡沫化···

向大家请教一下···

补充一下，细胞的形状大部分都是是长梭形，长长的椭圆形，同学说刚买回来的时候就是这种样子，是正常形态。

作者: 小鱼鱼 时间: 2011-12-15 17:12

我也养这种细胞半年了，感觉还是比较好养的，培养基DMEM+10%FBS，我一般两天传代，三天要冻存，长的很快，消化时用吸管吹打可以，胰酶消化也行，复苏时细胞状态没什么特别的差别。
可是我现在用它做细胞转染，怎么都不成功，向各位大虾请教，我现在很郁闷呀，谢谢。

作者: abc816 时间: 2011-12-15 17:13 标题: 回复 #40 jujuba 的帖子

血清浓度太低了，另外你还是要注意细胞的生长密度。细胞圆圆的是正常状态，成梭形也是其正常状态，一般细胞呈梭形的比较多的话就提示你该传代了，这个细胞贴壁久了就会有圆形伸出触角成梭形。。

作者: 薄荷侠 时间: 2011-12-15 17:14

如果这个细胞传完代之后几个小时之内还有要贴壁的迹象，可是隔夜之后就开始浮起来，再养一天就看起来跟悬浮细胞一样，是什么原因呢？

作者: 一叶 时间: 2011-12-15 17:14 标题: 回复 #43 薄荷侠的帖子

悬浮起来基本就要死了，不能再要了，对后面的实验不利。你要把他换液换掉。
细胞浮起来，你要考虑你的培养条件。刚开始贴壁，证明细胞是正常的，而隔夜浮起来，那就是趋于死亡。你的培养基有问题，或者是其他培养条件有问题。

作者: flower-201 时间: 2011-12-15 17:15

看ATCC上是用DMEM啊
最近做这个细胞，长的的确快。可是我养的很少扎堆啊，都很独立，除非是点的太稀了，就会一堆一堆的。
还有形态，我是直接用刮子刮的，刚刮下来形态都很好，可是一段时间后就会长出触角神马的，再长一段时间比较满了，大概70,80%的样子反而又圆了，这是咋回事啊

作者: 小鱼鱼 时间: 2011-12-15 17:15

cuturl('http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=TIB-71&Template=cellBiology')
今天无意去ATCC看了一下，RAW264.7的推荐培养基换成了DMEM！
各位同学在养它时加不加HEPES?浓度是？

作者: nn255 时间: 2011-12-15 17:15

我在养RAW264.7,准备将其诱导为破骨细胞，看到有人配制破骨细胞诱导液ex， 1，25（OH
)2VD3,请问一下有人用过这种方法吗？？1，25（OH)2VD3如何获得，谢谢指教

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:16

看ATCC上是用DMEM啊
最近做这个细胞，长的的确快。可是我养的很少扎堆啊，都很独立，除非是点的太稀了，就会一堆一堆的。
还有形态，我是直接用刮子刮的，刚刮下来形态都很好，可是一段时间后就会长出触角神马的，再长一段时间比较满了，大概70,80%的样子反而又圆了，这是咋回事啊

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呵呵，差不多吧，干嘛要用刮子啊，很伤细胞。

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:16

cuturl('http://www.atcc.org/ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default.aspx?ATCCNum=TIB-71&Template=cellBiology')
今天无意去ATCC看了一下，RAW264.7的推荐培养基换成了DMEM！
各位同学在养它时加不加HEPES?浓度是？

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1640完全没问题的。dmem更好。

作者: hot_hot_hot 时间: 2011-12-15 17:17

听师兄说用物理方法比用消化液对细胞的伤害小呢。。。

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-15 17:17

开始养这个细胞了，就是觉得贴壁快，长的快，难消化，哎，0.25%胰酶37度10多分钟还有好多没消化下来，索性当留种的了……不知道明天会咋样，加长消化时间吧，又有先被消化下来的了，怕消化久了，对这些细胞也不好……很难搞啊

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:17 标题: 回复 #51 北风那个吹的帖子

1：那就是你的胰酶不行！
2：吹打要用弯头滴管吹打。直的吹不下来。

作者: 克隆鱼 时间: 2011-12-15 17:18

我养的细胞不仅喜欢扎堆，而且吹打也吹打不下来……

作者: zhezhe 时间: 2011-12-15 17:18

这细胞系刚买的时候说是很难消化，确实要用胰酶消化好久才能吹下来，不知道为什么最近发现不用消化也能吹下来！！！感觉细胞状态还不差，不知道这细胞还正常吗？？？

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:19 标题: 回复 #54 zhezhe 的帖子

它本来就是这样子嘀。。。

作者: yes4 时间: 2011-12-15 17:19

请教一下楼主，你能不能发张镜下未染色的巨噬细胞图片我看一下，还有做好细胞爬片的方法，谢谢，不胜感激！

作者: 小野花 时间: 2011-12-15 17:19

我是分离痰巨噬细胞，有些时候都不确定是不是巨噬细胞，所以想看下图片，谢谢

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:20

请教一下楼主，你能不能发张镜下未染色的巨噬细胞图片我看一下，还有做好细胞爬片的方法，谢谢，不胜感激！

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不好意思，暂时没拍。

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:20

最近正在养这种细胞正在头疼消化时间的把握呢。。。

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不用头疼呵呵，加油吧！消化其实很短时间就可以了。

作者: mickeylin 时间: 2011-12-15 17:22

我们实验室经常使用胰酶（0.25%）消化加冷激（4度8min.后转入负20度冷激1.5min),胰酶消化在37度温箱内10min。细胞状态稳定，老化现象少发，不妨一试！！

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胰酶消化那么久？细胞破坏的情况怎么样？

作者: mickeylin 时间: 2011-12-15 17:22

最近传了一皿长满触角的细胞，发现传代后的细胞状态不好！细胞也是用胰酶消化下来传代的，可能的确像上面战友提到的那样，长满触角的细胞都已经分化了，传代状态就不那么好了！

作者: greenbee 时间: 2011-12-15 17:23

各位战友，我也开始头疼这个问题了。照给我细胞的那个实验室的方法，我养出来的就是长触角的，真是郁闷了。我DMEM+10%FBS, 去培养基后+PBS冲洗，刮刀刮，700rpm离心后接种。

我真郁闷啊！！！！！

作者: greenbee 时间: 2011-12-15 17:23

我现在细胞的状态跟ATCC官方给的那个高密度的状态差不多了，楼主还有各位战友，你们看能不能做炎症模型呢？急啊！

作者: jrwyyplt 时间: 2011-12-15 17:24

我们这边消化是用冷的含0.05%EDTA的PBS，消化2分钟左右，很容易消化下来，状态也很稳定，只是传代时吹打力度要轻柔，机械力也会对细胞产生影响，导致触角。

作者: 黄花菜 时间: 2011-12-15 17:24

现在很迷茫了，到底是刮刀好，还是消化好？

作者: sunnyB 时间: 2011-12-15 17:25

我也在样RAW细胞，感觉这个细胞相对还是比较容易养，我也是用的10%胎牛血清+DMEM培养基，刚开始养的时候，细胞的确像楼主所说的那样，圆圆的堆在一起，中间可以看到少量张牙舞爪的细胞，传代的时候用胰酶消化，两三代以后，张牙舞爪的细胞慢慢就变多了，而且细胞里面出现了不少颗粒，感觉还是细胞状态不是那么好了，的确可能想前面的战友提到的那样，胰酶可能对细胞有影响，导致细胞出现了分化。今天我试了一下楼主的方法，直接加2-3ml培养基，我用的巴氏管，斜着进行吹打，细胞还是很容易就下来了，个人认为不用胰酶消化应该是可行的，至于这样分下来的细胞生长怎么样，好需要等两天看。我会及时报告给大家。

作者: 分子式 时间: 2011-12-15 17:25

好成活是好成活，就是要养成圆圆亮亮的得下功夫，至少我现在在进行“苦难的行军”

作者: hot_hot_hot 时间: 2011-12-15 17:26

我的RAW264.7消化两个小时都不会掉下来，现在我都加三毫升胰酶消化15-20min,然后直接用那三毫升胰酶来吹打细胞，就算这样还是很难吹

作者: hot_hot_hot 时间: 2011-12-15 17:26

我现在在用LPS诱导RAW264.7测定NO，正常培养的时候培养基用DMEM，铺板的时候用无酚红的1640，请问这样影响会很大不？主要是我们只有1640是无酚红的，听说1640里的亚硝酸盐很多，不适于用来做这个实验是吗？

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:26

各位战友，我也开始头疼这个问题了。照给我细胞的那个实验室的方法，我养出来的就是长触角的，真是郁闷了。我DMEM+10%FBS, 去培养基后+PBS冲洗，刮刀刮，700rpm离心后接种。

我真郁闷啊！！！！！

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你可以试试我的方法啊。。。

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:27

我现在细胞的状态跟ATCC官方给的那个高密度的状态差不多了，楼主还有各位战友，你们看能不能做炎症模型呢？急啊！！！！

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我看可以了，你可以试着做一下预试先。

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:28

我们这边消化是用冷的含0.05%EDTA的PBS，消化2分钟左右，很容易消化下来，状态也很稳定，只是传代时吹打力度要轻柔，机械力也会对细胞产生影响，导致触角。

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的确，PBS洗一洗，消化一下就很轻松的吹下来了。

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:28

我们这边消化是用冷的含0.05%EDTA的PBS，消化2分钟左右，很容易消化下来，状态也很稳定，只是传代时吹打力度要轻柔，机械力也会对细胞产生影响，导致触角。

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的确，PBS洗一洗，消化一下就很轻松的吹下来了。

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:30

现在很迷茫了，到底是刮刀好，还是消化好？

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你自己亲自试试，对比一下试验结果不就知道了。用得着在这郁闷么？实验要亲自做啊。

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:30

在论坛看到很多筒子养过RAW264.7，我现在在用脂多糖诱导RAW264.7建立细胞炎症模型，然后用ELISA测细胞分泌的前列腺素E2.现在出了点问题，我做ELISA时标曲的显色很正常，可是我的样品几乎都没有颜色。。。以下是我的细胞培养步骤
小鼠巨噬细胞按细胞浓度为100000 个/mL接种到24孔板，待生长密度为60%时更换为无血清培养基进行同步化；待密度为80%时换液，并分为如下两个组别：对照组（只加培养基），脂多糖组（浓度为10μg/mL），于37℃下5%CO2培养24h，实验结束后取上清3000r/min离心5min，取上清进行测定（即取即测）。我用的培养基是DMEM高糖培养基，有酚红。因为不检测COX酶活性，所以没加花生四烯酸（也试过加，同样没有显色。。。）
相向各位大虾请教，究竟是我的培养过程出了问题，还是试剂盒有问题？脂多糖的诱导应该是成功的，因为同时做的一氧化氮检测显示脂多糖组一氧化氮的浓度很高。。。

现在实验卡住，又要找工作，实在是不知道如何解决啊请各位指教。。。

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不要着急，哥们，这个我也出现过。建议你更换试剂盒，我用的是罗氏的试剂盒，进口的。
还有可能就是你把细胞一定要培养好做实验。结果比较灵敏。

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:31

我的RAW264.7消化两个小时都不会掉下来，现在我都加三毫升胰酶消化15-20min,然后直接用那三毫升胰酶来吹打细胞，就算这样还是很难吹

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1，你吹打的工具不行，力度不够。
2，你的胰酶不行。

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:32 标题: 回复 #78 kent 的帖子

是啊，我换了试剂盒又做了两次，结果很很好啊。就是那个试剂盒的问题。

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:33

纠正一下，确实是很好养的，我养其它的细胞做实验一难的不能做的时候，就那这个来玩玩，信心立马倍增啊，然后就所向披靡了。哈哈。这个Raw264.7是我的福将来的。呵呵。

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:34

唉给个破烂试剂盒拖了进度，新换的还是这样就杯具了，贪便宜的下场，唉

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检测PGE2我就遇到一次不好的，就是试剂盒有问题，换了就好了。
但是我做PLA2的活性检测就遇到了怎么都检测不出来，最后换成了检测它的量。。。最后发现活性检测的试剂盒过期啦，哇靠，气炸我了。真想@#@#@#@#！

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:34

话说还要注意你的试剂盒的种属来源问题，上一次我做的是鼠的PGE2检测，结果发现那个公司给我的试剂盒是Human。怪不得我做不出来。。。

作者: yes4 时间: 2011-12-15 17:34

养了一年RAW了
有2点体会：
第一，这细胞比较奇怪，不用胰酶的话很容易就能吹下来，但是一旦加了胰酶反而会贴得很牢，不容易吹打
第二，这细胞对环境比较敏感，很容易伸出伪足，同时各细胞因子指标也出现变化，这一点比较让人头痛

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:35 标题: 回复 #84 yes4 的帖子

知音呐。。。
呵呵，我就是靠“二传”应对的啊。。。效果还不错，指标比较重复性一致。

作者: bamboo16 时间: 2011-12-15 17:35

我在养这个细胞，时间不长，才半个月吧，把前面几位的方法都实验了一下，体会如下：
这个细胞生长快，条件好时24h内能分裂两次至少。而且喜欢扎堆，所以2天就要传代，不是真的空间不够，而是细胞都挤在一起。所以，如果瓶子里细胞密度小，培养基2天还是很好，可是细胞却扎堆，需要传了，这样培养基就浪费了，我觉得应该保持瓶中的细胞密度在20~40%左右，分裂2~3次就传代，这时刚好培养基发黄。细胞太少就浪费培养基了。
这个细胞是巨噬细胞，就是M0，未分化的巨噬细胞，外观是圆形高折光，贴壁非常快，10min内能贴80%，也容易脱落，无胰酶拍打200下或者胰酶室温30s轻轻拍打都能下来60~80%，不过无胰酶吹打是吹不下来的。
如果培养条件不好，它会分化，变成多边形，从高折光的小圆亮点变成灰色的一小片，变得粘附非常紧，所以我觉得应该控制消化时间和拍打力度，不要过分追求把所有细胞都弄下来，这样一来影响状态好的未分化圆形细胞活力，另一方面会把状态不好的分化细胞弄下来，不如缩短胰酶时间到1min内，把分化过的高粘附细胞留在瓶里，正好起到对细胞分化状态的选择作用。
我传代时首先无胰酶拍打，能弄下来约50%的细胞，然后加胰酶拍打30s，镜下观察，一般30s刚刚好，剩下未脱落的都是分化的形态不好的细胞，这种细胞继续培养，如果要回到圆形，可以用胰酶消化后传代。

作者: 西子 时间: 2011-12-15 17:35

你好，不知道你现在还养不养RAW细胞，不治之前是否用raw诱导多核破骨细胞的产生？我诱导了半年了，从高糖培养基换到a-MEM培养基，养几天就漂起来了。

作者: zhezhe 时间: 2011-12-15 17:36

~~~~(>_<)~~~~ ，

方法那么多，都不知道怎么做了。我是从中科院上海细胞库买的raw.264.7，但他们不提供具体详细培养方法。这个细胞到底是好消化还是难消化啊？？？

作者: duoduo 时间: 2011-12-15 17:36

请问，有没有哪位做过LPS刺激巨噬细胞，再测NO含量，我用100ng/ml LPS刺激腹腔巨噬细胞，测NO，没什么变化，用的是碧云天试剂盒，1640培养液，有做过这个实验的大侠指点下？

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:37

请问，有没有哪位做过LPS刺激巨噬细胞，再测NO含量，我用100ng/ml LPS刺激腹腔巨噬细胞，测NO，没什么变化，用的是碧云天试剂盒，1640培养液，有做过这个实验的大侠指点下？

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我做的挺明显得。。。

作者: BUK 时间: 2011-12-15 17:37

分了化合物正想养细胞试试做活性，谢谢大家了

作者: 伊莎贝拉 时间: 2011-12-15 17:38

感谢LZ，我们实验室养RAW已经5年了，这个细胞从其他实验室接过来后，我们做了oxLDL诱导的泡沫细胞染色，开始非常明显，后面随着传代次数的增加，细胞形态呈梭形，且难消化，诱导的模型很不稳定。最近从CTCC买的细胞株很漂亮，形态和ATCC差不多，效果很不错。老师说这是个单核/巨噬细胞株，细胞呈团状生长，但是满了以后，细胞会漂浮一部分，可以洗出重新接种，因为早期是单核细胞，是悬浮的。如果做巨噬细胞实验，最好还是分化的比较好，炎症和泡沫化比较明显，有问题再向LZ请教。

作者: 911 时间: 2011-12-15 17:39

在诱导破骨样细胞的时候，就是用的alpha-MEM,其中加入M-CSF和RANKL

是的，我们就是用的a-MEM诱导OCs，我之前用DMEM怎么都变得不好改了medium就好了。

作者: @STAR@ 时间: 2011-12-15 17:39

想问问楼主：“只要按照顺序一片片地吹打，很容易就能够把该细胞吹打下来。”

这个是什么意思呢？我昨天刚刚用胰酶消化了细胞。可是不怎么好。看到楼主这个，有点想试用下下。但是不明白“顺序”是什么意思呢

作者: zwsyrt 时间: 2011-12-15 17:40

想问问楼主：“只要按照顺序一片片地吹打，很容易就能够把该细胞吹打下来。”

这个是什么意思呢？我昨天刚刚用胰酶消化了细胞。可是不怎么好。看到楼主这个，有点想试用下下。但是不明白“顺序”是什么意思呢

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就像你扫地一样，从上向下，从瓶口到瓶底。

作者: hold住 时间: 2011-12-15 17:40

我也在做这种细胞，有前辈做过annexin、PI凋亡检测吗。细胞处理后出现少量漂浮，是已经凋亡了吗

作者: zhezhe 时间: 2011-12-15 17:40

我养这个细胞半年多啦，以前感觉很难消化，但是用PBS洗后，很好消化。

这个细胞算是很敏感啦，消耗比较大，几乎每天都得换下培养基。

作者: 北风那个吹 时间: 2011-12-15 17:41

兄弟，我用你的好细胞摸索出了新的消化传代方法，很好用，用0.1%的edta消化，好使。等我忙完这阵子，来北京会你致谢

作者: tieshazhang 时间: 2011-12-15 17:42

兄弟，我用你的好细胞摸索出了新的消化传代方法，很好用，用0.1%的edta消化，好使。等我忙完这阵子，来北京会你致谢

作者: 一叶 时间: 2011-12-15 17:44

兄弟，我用你的好细胞摸索出了新的消化传代方法，很好用，用0.1%的edta消化，好使。等我忙完这阵子，来北京会你致谢

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哦。我找个时间试一下。。。但是EDTA对细胞是用很大的损伤作用的，血清也不能终止他的消化作用，所以必须要离心洗干净才可以，否则细胞会越来越差啊。。

作者: 911 时间: 2011-12-15 17:44

我们实验室也在养这种细胞，把自己的经验与大家分享一下，由于细胞来源可能不一样，所以方法只供参考。

由于细胞是从生物物理所引进的，所以培养方法沿用物理所的。

细胞用10％ FCS＋DMEM培养，细胞的形态应该是又圆又亮，要是长了触角，可能就说明已经分化了，不建议继续培养。大家可以参见ATCC的网站。

我们发现直接用培养基不能吹下细胞。由于细胞贴壁很牢，可以先去除培养基，再用生理盐水洗一遍，弃掉，再加入适量的生理盐水，轻轻把细胞吹下来。离心后用培养基重悬后，按比例传代。这样细胞很容易就能下来。

一般1：10传，细胞2-3天长满一皿（常规用培养皿培养便于吹吸细胞）。

不建议用胰酶消化，因为容易使巨噬细胞分化（物理所传授没有试验过）。

用的培养基一定要用不含内毒素的去离子水配制。避免细胞分化。我们现在用hyclone配制好的DMEM还可以，有条件的最好自己配制，现在的假冒培养基特别多。

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我想要请问一下，这样消化传代不会影响这个细胞的分泌或者是其他的生物活性吗？有什么依据吗？谢谢

作者: 911 时间: 2011-12-15 17:44

哦。我找个时间试一下。。。但是EDTA对细胞是用很大的损伤作用的，血清也不能终止他的消化作用，所以必须要离心洗干净才可以，否则细胞会越来越差啊。。

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如果是成瓶买来的胰酶，是需要买含有EDTA的还是不含的呢？我也需要马上使用这个细胞来进行试验了，很像多知道一些你们的经验，这样可以少走一些弯路，谢谢你的帖子和大家的分享了，受用了~~~

作者: 911 时间: 2011-12-15 17:45

RAW 264.7细胞可以作为很多基础医学领域和药理学领域的研究模型，由于每个人的研究方向不同，所以细胞培养方式也有差别。

这个细胞属于单核/巨噬细胞，会在各种刺激下分化，成巨噬细胞样。因此在传代过程中要尽量避免各种刺激。所以经典的培养方法中推荐用热灭活血清，传代用细胞刮刀轻轻刮下，而不用胰蛋白酶消化。

如果反复刺激RAW 264.7细胞，在某些实验中，细胞的造模成功率会降低。比如在LPS诱导后Griess试剂法测定亚硝酸盐以考察细胞分泌一氧化氮，可能会失败。
另外，1640培养基中含有的硝酸盐很多，如果做硝酸还原酶偶联Griess试剂法检测总一氧化氮分泌量，培养基中的硝酸盐会被还原成亚硝酸盐，导致实验结果不准确。而且一般在Griess试剂法测定亚硝酸盐的实验中，要用无酚红培养基。

所以做炎症相关研究的同道尽量不要采用楼主推荐的方法，可能会走很多弯路。

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您好，我准备要使用RAW264.7细胞来做一些炎症因子的检测，荧光定量PCR检测一些基因的表达，还有信号通路，我想要向您请教一下关于这个细胞的培养问题，不知道是不是可以加您呢？

所以要做上面的这些实验，请问培养基要使用什么呢？看到您说要使用不含酚红的培养基？有这样的吗? 是使用含有高糖的？需要谷氨酰胺吗？

消化这个细胞需要使用胰酶吗？看到有人推荐生理盐水？还是使用传统的胰酶+EDTA的呢?

焦急等待您的回复，谢谢~~~~~

作者: 911 时间: 2011-12-15 17:45

1640完全没问题的。dmem更好。

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如果是DMEM是要高糖的还是非高糖的呢？还需要添加HEPES吗？

直接使用吸管吹打细胞至脱落也会伤害细胞吧？

由于后面要使用这个细胞来研究基因的表达还有蛋白质的表达，还有信号通路，我想要请教一下，在细胞的培养过程中有什么成分或者是什么操作可能会导致这个细胞在后续的试验中重复性不好吗？

作者: yychen 时间: 2011-12-15 17:46

最近发现一个比较奇怪的现象

用培养皿或培养板时，细胞几乎都是圆的，长触角的很少

而用培养瓶时，第二天触角就长出好多来

大家可以试试

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我也有这个问题。而且我是参照文献用的“未处理的培养板”，我发现细胞会在我换液的时候被吹走一部分或者被吹到板子边缘，不知道大家有没有同样问题存在。

作者: 911 时间: 2011-12-15 17:46

我也有这个问题。而且我是参照文献用的“未处理的培养板”，我发现细胞会在我换液的时候被吹走一部分或者被吹到板子边缘，不知道大家有没有同样问题存在。

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未处理的培养板指的是？

作者: 911 时间: 2011-12-15 17:47

各位高手，你们培养这个细胞的时候有没有是使用国产血清的？是使用的那一种？

我们买的无噬菌体，低内毒素的，今天电话咨询他们的这个血清的内毒素含量是≤5eu/ml。应该是目前他们的最少的了。

那么如果之后的试验要使用LPS刺激这个细胞造模的话，会有影响吗？有没有高手可以分享一下这方面的经验呢？？？

因为实验室使用的是国产的胎牛血清~~所以不可能更换进口的了~~不知道这对实验的影响有多大，貌似今天在GIBCO的网站看到他们的其中一个新西兰产地的血清的内毒素含量是≤100eu/ml,其他的资料，网站打不开，暂时看不到~~~

作者: nn255 时间: 2011-12-15 17:47

您好，看了您的两个细胞培养的帖子，确实很受用，但是细胞消化特别不容易，每次消化都特别困难，您说的方法我都试了用胰酶消化液还是不行，我也试过国外进口的消化液，结果也不好，我看了有的文献说胰酶对巨噬细胞作用不大，反而对细胞有损害作用，是胰酶消化液中的EDTA有作用，于是我采用4℃消化（避开胰酶37℃对其的损害作用，利用EDTA的作用）结果还是不好，基本所有的方法都试过了，各种消化液也用了，还是不行，光是消化的问题解决不了，什么都白搭，细胞都被我养死2株了，细胞是从协和买的，虽然老师不怪罪，但是心里很内疚，毕竟都是钱啊。。。。是不是细胞在传代前注意啥不让其贴壁过于牢固？玻璃瓶和塑料瓶对其有影响吗，用哪个好？

作者: 伊莎贝拉 时间: 2011-12-15 17:48

未处理的培养板指的是？

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untreated polystyrene plates 非处理的聚乙烯孔板

作者: 一叶 时间: 2011-12-15 17:48

您好，看了您的两个细胞培养的帖子，确实很受用，但是细胞消化特别不容易，每次消化都特别困难，您说的方法我都试了用胰酶消化液还是不行，我也试过国外进口的消化液，结果也不好，我看了有的文献说胰酶对巨噬细胞作用不大，反而对细胞有损害作用，是胰酶消化液中的EDTA有作用，于是我采用4℃消化（避开胰酶37℃对其的损害作用，利用EDTA的作用）结果还是不好，基本所有的方法都试过了，各种消化液也用了，还是不行，光是消化的问题解决不了，什么都白搭，细胞都被我养死2株了，细胞是从协和买的，虽然老师不怪罪，但是心里很内疚，毕竟都是钱啊。。。。是不是细胞在传代前注意啥不让其贴壁过于牢固？玻璃瓶和塑料瓶对其有影响吗，用哪个好？

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我就是用的GIBCO的胰酶。

作者: wu11998866 时间: 2011-12-15 17:52

我看了各位的帖子，觉得是不是加胎牛血清细胞贴的紧，不易消化下来，而用小牛血清较易吹打下来？

请说该细胞容易传代消化的筒子说说是否是用的小牛血清? 而不容易传代消化的筒子说说是否是用的是胎牛血清?

大家讨论了用1640 和DMED的问题，没人发表血清的影响问题

作者: sunnyB 时间: 2011-12-15 17:53

我们实验室就是用生理盐吹下来的，细胞生长良好。有什么道理我也说不清楚。检测细胞因子表达都没有问题。

隔壁实验室用胰酶消化养的细胞，也没有关系，而且用lip2000转染都有很好的效率，非常的奇怪。可能是来源不同吧。

我觉得如果能用生理盐水洗下来，是不是对细胞损伤要小些吧。大家不妨试一试。

该细胞特别容易分化，传代不要太多。及时传代，千万不要养过了，要不然非常容易死。

作者: 一叶 时间: 2011-12-15 17:53

我们实验室就是用生理盐吹下来的，细胞生长良好。有什么道理我也说不清楚。检测细胞因子表达都没有问题。

隔壁实验室用胰酶消化养的细胞，也没有关系，而且用lip2000转染都有很好的效率，非常的奇怪。可能是来源不同吧。

我觉得如果能用生理盐水洗下来，是不是对细胞损伤要小些吧。大家不妨试一试。

该细胞特别容易分化，传代不要太多。及时传代，千万不要养过了，要不然非常容易死。

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用生理盐水哪比得上用培养基直接吹啊！！！

还是建议正规胰酶消化，然后吹打传代。吹打的物理损伤操作不好的话远大于胰酶。

作者: jrwyyplt 时间: 2011-12-15 17:54

我真是觉得奇怪了，为什么楼上的RAW264.7细胞这样容易吹打下来？通常该细胞是贴壁很紧很难消化的呀。

作者: 969 时间: 2011-12-15 17:54

本人现在也在养这个细胞，很难消化，所以也是试了各种方法，并且到处查找资料。目前我的细胞状态也不好，着急！

今天看到一老外用悬浮方法培养RAW264.7，感觉很有道理，也很有启发，只是缺乏相应的装置。因我的细胞不多且状态不好，暂不能尝试，现链接于此。希望大家一起探讨能否用改良的装置进行悬浮培养试试。

cuturl('http://www.protocol-online.org/biology-forums-2/posts/17919.html')

cuturl('http://www.protocol-online.org/biology-forums/posts/26394.html')

作者: yychen 时间: 2011-12-15 17:55

我真是觉得奇怪了，为什么楼上的RAW264.7细胞这样容易吹打下来？通常该细胞是贴壁很紧很难消化的呀。

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不用奇怪，操作的问题。

作者: whitesheep 时间: 2011-12-15 17:55

大家好，我才开始养RAW264.7，上海中科院买的，

1、寄到后先用吹管吹，然后1000转5分钟，细胞10%DMEM重悬，在歪口培养瓶（标记为瓶1）中生长;

2.、对于没有吹打下来的，用0.25%胰酶消化1分钟后，再种到另一培养瓶（瓶2）中，不知大家是不是也是这样处理的。

3、两天后观察细胞：

瓶1中细胞比较小，比较圆，是成片生长的，但是比昨天的飘起来的细胞多了，培养基颜色发黄，飘起来细胞比处理完第一天后观察时的多了，不知道细胞飘的原因。

瓶2飘起来的细胞比较少，

处理：分别给两瓶细胞换液。

不知道我表述是否清楚，请大家帮我看看细胞这样生长、处理正常否。还有一个培养瓶我加了4毫升培养基，一般一个培养瓶可以什么比例传啊。

还有大家都是用歪口瓶养吗？可以用普通的6厘米培养皿吗？

谢谢了啊。。。

10%DMEM 中和中和中和另一培养瓶培养

作者: milkdog 时间: 2011-12-15 17:56

请教前辈们，帮我看看我的RAW细胞是否有问题？

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9922

作者: milkdog 时间: 2011-12-15 17:56

间隙里有些颗粒，细胞这样能用于实验吗？非常感谢！

图片附件: 60241262.snap.jpg (2011-12-15 17:56, 63.39 KB) / 该附件被下载次数 50
http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9923

作者: jrwyyplt 时间: 2011-12-15 17:57

版主及各位同仁好！
最近在版内看到这个关于Raw 264.7 细胞培养的帖子。而我刚买了ATCC 的Raw 264.7 细胞，是个新手，细胞才传了三代就状态不太对，十分焦急，请指导。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9924

作者: jrwyyplt 时间: 2011-12-15 17:57

2~~~~~~~~~~~~~~~~~~

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9925

作者: jrwyyplt 时间: 2011-12-15 17:58

求各位解答！这大泡泡是什么啊？培养条件如下：GIBCO DMEM (高糖）+ 10% FBS +双抗；消化用胰酶温箱内5分钟，可以吹下。

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http://bbs.antpedia.com/attachment.php?aid=9926

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作者: 缘yuan 时间: 2011-12-15 17:59

可能是黑蛟虫污染

作者: 分子式 时间: 2011-12-15 18:00

应该是分化了细胞变大颗粒变多有空泡触角变多都是分化的表现可以血清饥饿一下（比如我有一次把10%胎牛加成10%小牛）看看可不可以让它们状态变好点

作者: 彼岸花opp 时间: 2011-12-15 18:00

大家好，我也是刚养此细胞的新手，郁闷老是长的不好。
9月3号，在别的实验室当天上午10点左右传代，一瓶是自己的培养基，一瓶是他们的，比较着拿回来养。回来发现，我自己培养基养的细胞要好点，细胞折光度好，有触角，生长速度也不错，培养基颜色发黄，5号下午细胞密度约在50%（各个细胞堆之间有空隙较多，大体估计的，没计数）换液。6号下午，我发现含有黑色细颗粒东西圆细胞变多，感觉细胞比昨天的差点，有增长也不是很明显。我看筒子们说，要是细胞状态不太好时，就要及时传代，怕养过了。我担心，这边细胞扎堆有点变老，等不及铺满就传代了，现在想想，细胞密度也就70%那样，可能还不到。
我用的胰酶是碧云天的，0.25%胰酶+0.02%EDTA,75ml的玻璃细胞瓶，加了1ml，镜下观细胞变缩了，作用了有1-2min了，我就加入培养基吹打，离心1500rpm 5min，发现离心沉淀细胞不是很多，然后就加入新培养基分在2个125ml的细胞瓶中。（事后看了原来的消化的瓶子，部分细胞没吹打下来，我不敢太用力，怕细胞有损伤）。4个小时后观察，贴壁没问题，就是蛮少的。
今天8号，我发现我细胞长的没前面的好，有颗粒的圆的多，触角的少，细胞密度低，培养基中有悬浮死细胞。
哎哎，我现在就担心，我细胞长着长着就死了，这样子，我心里实在不安。但，我也不知道，我哪里出了问题，是因为接种的时候密度太低，所以到现在都不起色么？我打算今晚换个液，其实培养基没那么黄，隐约还是红的，但是，我担心悬浮的死细胞以及状态不好的细胞，影响其他的好的，所以我打算用培养基轻吹下贴得不牢的，然后再彻底换新液，这样行不行呢？
还有，为什么我传代后离心的细胞就超少，有次直接肉眼看不见沉淀，但是镜下，细胞是脱落了。我就纳闷，我那些脱落的细胞都哪去了呢？？

作者: 伊莎贝拉 时间: 2011-12-15 18:01

请教各位在行的同仁，我们实验室的RAW状态不是很好，稍有分化，我养RAW想通过热休克蛋白，LPS刺激，检测TNF-a水平，发现就连阴性对照组值都特别高，和加药组一点差异都没有。还想请教各位常养细胞的，哪个细胞系表面高表TLR4受体，通过LPS刺激能够较好的检到TNF-a的表达？

作者: loli 时间: 2011-12-15 18:04

敢情楼主把自己养的最拿手的几种细胞照片晒给大家看看，好让我们也结合观察一下生长状态较好的细胞事什么样子？

作者: 园丁## 时间: 2011-12-15 18:04 标题: 回复 #121 milkdog 的帖子

你的细胞已老化严重。
你的培养条件营养比较好，细胞生长速度比较快，所以你应该把握好细胞的传代速度。

作者: 园丁## 时间: 2011-12-15 18:05

请教各位在行的同仁，我们实验室的RAW状态不是很好，稍有分化，我养RAW想通过热休克蛋白，LPS刺激，检测TNF-a水平，发现就连阴性对照组值都特别高，和加药组一点差异都没有。还想请教各位常养细胞的，哪个细胞系表面高表TLR4受体，通过LPS刺激能够较好的检到TNF-a的表达？

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脑血管内皮细胞

作者: yychen 时间: 2011-12-15 18:05

脑血管内皮细胞

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谢谢，那再请问，在用RAW的过程中你有没有遇到背景值非常高的情况呢，我是检TNF-a

作者: 园丁## 时间: 2011-12-15 18:05 标题: 回复 #133 yychen 的帖子

我没有遇到过，但是论坛里有问过我的也遇到过。这个是需要你培养中的控制的。培养基尽量选择超低内毒素的胎牛血清。低于5的。

作者: 铜雀 时间: 2011-12-15 18:06

刚开始养这个细胞，传了几代后，有一次忘了传，细胞长得满满的，再传代时胰酶都消化不下来了，只好用细胞刮子。传代后的细胞贴壁后就开始变形，出现很多伪足，有什么办法可以让它们恢复原来的椭圆形吗？另外我是做细菌被巨噬细胞吞噬后的存活状态观察，我是用椭圆形的细胞做比较好还是用有伪足的细胞呢？因为有人说有伪足的细胞吞噬功能会更强一些。请不吝赐教啊。

作者: duoduo 时间: 2011-12-15 18:06

您好，楼主，我想请教一下这个细胞的冻存液你是怎么配的？复苏的时候是怎么复苏的，需要注意什么，谢谢

作者: ladyhuahua 时间: 2011-12-15 18:07

大家讨论这个细胞一直持续了这么长时间啊，呵呵

我也说说我的吧，我最近养的细胞超多，还就是这个RAW很让我郁闷，本人自问养细胞技术不错的。
我复苏Raw，第二天观察细胞状态良好，基本都是球状透亮的细胞，第三天进行传代，直接吹打，没有用胰酶消化，很好吹。用Hyclon的DMEM加上10%的FBS进行培养，结果两天后观察，细胞变成空泡状，伸出了很多小细足。培养基也同时培养了其他细胞，A431，是没有问题的。

我已开始进这个实验室的时候也养了这个细胞的，当时一直用胰酶消化，没有出现过问题，最近复苏了几次养都不行。

作者: abc816 时间: 2011-12-15 18:07

刚开始养这个细胞，传了几代后，有一次忘了传，细胞长得满满的，再传代时胰酶都消化不下来了，只好用细胞刮子。传代后的细胞贴壁后就开始变形，出现很多伪足，有什么办法可以让它们恢复原来的椭圆形吗？另外我是做细菌被巨噬细胞吞噬后的存活状态观察，我是用椭圆形的细胞做比较好还是用有伪足的细胞呢？因为有人说有伪足的细胞吞噬功能会更强一些。请不吝赐教啊。

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的确是伪足的细胞吞噬功能更强一些，伸出伪足本身就是这个细胞的正常状态，在细胞没有完全伸展和贴壁的时候会成圆形的亮点状，适应了之后细胞会伸展的。

作者: abc816 时间: 2011-12-15 18:08

您好，楼主，我想请教一下这个细胞的冻存液你是怎么配的？复苏的时候是怎么复苏的，需要注意什么，谢谢

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冻存液：培养液+20%血清+10%DMSO。
复苏就是常规复苏，39度迅速融化，加培养基离心，高浓度种瓶。

作者: guagua 时间: 2011-12-15 18:08

非常感谢LZ给大家提供RAW264.7细胞培养的讨论平台，看完以后收获很大，同时还有一些疑惑：1.该细胞到底是贴壁强还是贴壁弱，我看说法不一。我的细胞是管别人要的，贴壁挺强的，用胰酶得消化10min才能吹下来；2.胰酶消化与直接吹打哪种对细胞损害较小？3.该细胞系是单核/巨噬细胞，是不是开始是单核细胞，养着养着就分化为巨噬细胞了，传代次数多了就很容易活化伸出很多伪足？4.我从别的实验室要的细胞，是否需要鉴定，如何鉴定？5.该细胞是不是很容易就活化了(伸出很多伪足，张牙舞爪的，而且细胞散开生长，不再扎堆生长，个头也变大如下第二个图）谢谢大家！下面的图片是6孔板上，传代后13小时，40×，大家帮我看看细胞形态对着没。

作者: guagua 时间: 2011-12-15 18:08

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作者: guagua 时间: 2011-12-15 18:09

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作者: guagua 时间: 2011-12-15 18:09

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作者: jrwyyplt 时间: 2011-12-15 18:09

养巨噬细胞DMEM用无糖的？低糖的？还是高糖的啊？
培养板选几孔的？细胞的密度是多少？

作者: jrwyyplt 时间: 2011-12-15 18:10

如果实验用培养板每孔的巨噬细胞细胞的密度是1乘以10的五次方，那该选几孔的培养板？或者规格多大的塑料培养瓶？

作者: jrwyyplt 时间: 2011-12-15 18:10

顶LZ!!!
我最近也在培养这个细胞啊,难道我的细胞状态不好是因为血清浓度太高吗?
实验中因为也需要用到LPS等刺激,如果细胞状态不好会影响结果的,感觉培养一段时间后细胞就不是那么透亮了,而且会有伪足,请问LZ在刮细胞前有没有将培养瓶先放到4度一段时间再传代呢?

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